CZ297680B6

CZ297680B6 - Farmaceutický prostredek s obsahem protilátek anti-CD40L nebo jejich derivátu

Info

Publication number: CZ297680B6
Application number: CZ0244499A
Authority: CZ
Inventors: L. Kalled@Susan; W. Thomas@David
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1997-12-31
Publication date: 2007-03-07
Also published as: TR200001248T2; TR200001247T2; TR200001249T2; EP0948355A1; HUP0000833A2; KR20000070034A; CN1247472A; TR200001251T2; EP1357131A3; IS5100A; CN1572325A; WO1998030240A1; HUP0000833A3; US20030031668A1; EP1357131A2; BR9714523A; IL130784A0; PL190663B1; NO993274D0; KR100618081B1

Abstract

Resení se týká pouzití protilátek anti-CD40L pro výrobu léku pro lécení imunokomplexové glomerulonefritidy, a to protilátek anti-CD40L, které vází ligand pro povrchovou molekulu CD40 B bunek a nekterých dalsích bunek, nebo jejich derivátu. Léky jsouurceny pro lécení nebo alespon zpomalení ci utlumení symptomu nefritidy spojené s onemocnením imunitního systému, jako je napr. lupus nebo léky zpusobená sérová choroba. Konkrétne jsou léky s obsahemprotilátek anti-CD40L nebo jejich derivátu uzitecné a) k potlacení progrese nefritidy, b) ke stabilizaci nefritidy nebo c) k reverzi nefritidy. Pouzití protilátky anti-CD40L pro výrobu léku pro podání pacientovi s imunokomplexovým poskozením, který má ledvinný alostep, aby se potlacil vývoj imunokomplexové glomerulonefritidy v transplantované ledvine.

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká použití protilátek anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení imunokomplexové glomerulonefritidy, a to protilátek anti-CD40L, které váží ligand pro povrchovou molekulu CD40 B buněk a některých dalších buněk, nebo jejich derivátů. Léky jsou určeny pro léčení nebo alespoň zpomalení či utlumení symptomů nefritidy spojené s onemocněním imunitního systému, jako je např. lupus nebo léky způsobená sérová choroba. Konkrétně jsou léky s obsahem protilátek anti-CD40L nebo jejich derivátů užitečné a) k potlačení progrese nefritidy, b) ke stabilizaci nefritidy nebo c) k reverzi nefritidy. Použití protilátky anti-CD40L pro výrobu léku pro podání pacientovi s imunokomplexovým poškozením, který má ledvinný aloštěp, aby se potlačil vývoj imunokomplexové glomerulonefritidy v transplantované ledvině.

Farmaceutický prostředek s obsahem protilátek anti-CD40L nebo jejich derivátů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká protilátek anti-CD40L pro léčení imunokomplexové glomerulonefritidy. Vynález se týká protilátek anti-CD40L, které váží ligand pro povrchovou molekulu CD40 B buněk a některých dalších buněk, nebo jejich derivátů, pro léčení nebo alespoň zpomalení či utlumení symptomů nefritidy spojené s onemocněním imunitního systému, jako je např. lupus nebo léky způsobená sérové choroba. Konkrétně jsou protilátky anti-CD40L nebo jejich deriváty užitečné a) k potlačení progrese nefritidy, b) ke stabilizaci nefritidy nebo c) k reverzi nefritidy.

Dosavadní stav techniky

Příčinou imunokomplexového poškození (nemocí způsobené imunitními komplexy) je ukládání imunitních komplexů v určitých tkáních, včetně ledvinných glomerulů a cévních stěn. Tyto komplexy jsou tvořeny agregáty antigenů a protilátek. Antigeny mohou být jednak autoantigeny, kdy tělo tvoří protilátky proti složkám vlastních tkání, nebo to jsou exogenní antigeny, jako jsou např. infekční agens nebo různé látky. V každém případě je známo, že ukládání imunitních komplexů může způsobit kožní vyrážky, perikarditidu a vaskulitidu. Depozit imunitních komplexů v glomerulech může narušovat filtrační schopnost ledviny, což v extrémním případě může vést k selhání ledvin a případně k smrti.

Systémový lupus erythematodes (SLE) je život ohrožující autoimunitní onemocnění, charakterizované tvorbou autoprotilátek proti různým tkáním, a často také proti DNA. SLE trpí přibližně 140 000 lidí ve Spojených státech a 150 000 v západní Evropě, zejména žen v plodném věku.

SLE je charakterizovaná zánětem postihujícím pojivovou tkáň a kůži, klouby a celé orgánové systémy, často postihuje orgány jako ledviny, srdce, plíce a centrální nervovou soustavu. Ke klinickému obrazu SLE patří často generálizované onemocnění, bolest, vyrážka, kognitivní dysfunkce, trombóza, anémie, zánět pohrudnice, gastrointestinální dysfunkce a ztráta plodu u těhotných žen. U většiny pacientů se imunoglobuliny a imunitní komplexy spojené s lupus ukládají v ledvinných glomerulech, kde způsobují zhoršení funkce ledvin. Ό poloviny pacientů se střední až těžkou formou SLE, kteří představují 70 % všech pacientů s lupus, se vyvine klinická nefritida, charakterizovaná přítomnost proteinů v moči. Ačkoliv někteří z těchto pacientů mohou být úspěšně léčeni imunosupresivními a cytotoxickými přípravky, klinická odezva na tyto přípravky je přechodná, přípravky způsobují nežádoucí vedlejší účinky, a navíc mnoho pacientů vůbec nereaguje na dostupnou farmakoterapii. U většiny těchto pacientů pokračuje selhání ledvin, a musejí se pak po celý život podrobovat opakované dialýze nebo prodělat transplantaci ledvin. Přitom i transplantát může mít jen krátkodobou životnost, neboť nová ledvina je také citlivá k poškození neustupujícími autoprotilátkami, které jsou přítomné v krvi pacientů s SLE. Střední věk, kdy pacienti s SLE začínají dialýzu, je 35 let. Mnoho pacientů s SLE nakonec zemře, ať už jako přímý nebo nepřímý důsledek nefritidy.

Léčení používají k léčení SLE spadají do různých tříd: jednak se užívají léčiva jako salicyláty a nesteroidní protizánětlivá agens, steroidní protizánětlivá agens (Systémové kortikosteroidy), imunosupresivní agens nebo cytotoxická léčiva, antimalarická léčiva, a také dialýza, transplantace, ozařování lymfoidu nebo plazmaferéza. Většinou však působí jako symptomatická agens, která zmírní zánět a jsou zaměřena na symptomy nemoci s účinkem po podání nebo v průběhu celé léčby. K příkladům takových symptomatických agens patří kyselina salicylová, glukokortikoidy a nesteroidní protizánětlivá agens jako je indometacin. Jiná léčiva působí na základě patogeneze nemoci a inhibují autoimunitní reakce, ale jsou účinná jsou v prvních týdnech podávání, i když mají jistý přetrvávající účinek i po skončení léčby. V takových agens patří např. imuno

- 1 CZ 297680 B6 supresiva jako chemoterapeutikum azathioprin a cyklofosfamid, a také kortisony jako např. prednison.

Obecná imunosupresiva nyní užívaná k léčení SLE mají často nepříznivé vedlejší účinky, jako je např. zvýšení citlivosti pacienta k infekcím, což je kontraindikací k dlouhodobému užívání takových agens. Užívání selektivních imunosupresiv, která jsou zacílena na specifické kroky v patogenezi nemoci, začalo se snadno snížit nebo normalizovat koncentraci imunoglobulinů u pacientů s SLE, což podle očekávání mělo mít prospěšný účinek na ledvinné příznaky nemoci.

Jednou z nezbytných reakcí při vytváření protilátek je interakce CD40 na B buňkách s ligandem CD40 (CD40L) na aktivovaných T buňkách, což je krok, který je nutný pro růst B buněk a následnou tvorbu protilátek. CD40L byl také v literatuře nazýván „gp39“ a „molekula T buněk aktivující B buňky (T-BAM)“. Budiž tedy jasné, že v tomto textu CD40L gp39 a T-BAM označují jednu a tutéž molekulu. Jak bude ještě dále popsáno, byla připravena řada sloučenin antiCD40L, a některé byly dokonce testovány na zvířatech, zda a s jakou účinností ovlivňují průběh nemoci spojených s protilátkami. Tak např. PCT publikace WO 93/09812 (27. květen 1993) popisuje myší monoklonální protilátku označenou 5c8, které se specificky váže na T-BAM na povrchu aktivovaných T buněk, čímž inhibuje aktivaci B buněk T buňkami.

Durie et al. (1993, 261 Science, 1328-1330) publikovali studii na myším modelovém systému týkající se prevence chronických poruch imunitního systému, kolagenem indukované artritidy, tím, že se podávala anti-CD40L monoklonální protilátka MR1. Myší modelový systém zahrnuje indukci artritidy tím že se myš imunizuje kuřecím kolagenem typu II (Cil) a pak se stimuluje o tři týdny později dalším CIL Až po této stimulaci lze pozorovat příznaky nemoci. Durie et al. zahájili léčení myší protilátkou MR1 jeden týden po počáteční imunizaci a pak pokračovali v léčení podáváním MR1 jednou za čtyři dny. Durie et al. popsali, že terapie s MR1 zabránila klinickým projevům nemoci (artritidě) u všech léčených myší, a tudíž došli k závěru, že zablokování CD40L má potenciálně prospěšný léčebný účinek při ovlivnění vypuknutí autoimunitního onemocnění.

Dvě skupiny blokovaly interakci CD40-CD40L pomocí monoklonální protilátky (mAb) u mladých myší z křížení NZB a zkoumali účinek na následující rozvoj nefritidy (Mohan et al.,

J. Immunol. 154: 14701480, 1995; Early et al., J. Immunol, 157: 3159-3164, 1996). U samic potomstva z křížení novozélandské černé myši (NZB) buďto s novozélandskou bílou myší (NZW) nebo normální myší SWR (označovaných (NZB X NZW)F1 a (SWR X NZB)F1) se rozvinul syndrom v noha aspektech podobný SLE u lidí (Steinberg et al., Ann. Int. Med. 115: 548, 1991; Wofsy and Seaman, J. Exp. Med. 161: 378, 1985). U samic Fl zobou křížení se začaly se stárnutím objevovat abnormální autoprotilátky a glomerulonefritida.

Mohan et al. (viz výše) prováděli studii, kde mladé samice myší (SWR X NZB)F1 byly léčeny dávkami 250 mg MR1, podávanými tři měsíce starým myším obden po tři dny. Poté, co se u zvířat rozvinula nefritida, definovaná jako proteinurie nejméně 300 mg/dl po dva po sobě jdoucí týdny, byla zvířata usmrcena. U neléčených zvířat se začala vyvíjet nefritida ve stáří šesti měsíců, v deseti měsících mělo nefritidu 60 % zvířat. U prvního ze zvířat léčeného MR1 se vyvinula nefritida až v 9 měsících a ve 12 měsících, kdy studie končila, pouze 40 % zvířat mělo nefritidu. Léčení bylo také spojeno s prodlouženým snížením sérové hladiny autoprotilátek proti jednořetězcové DNA (anti-ssDNA) a dvouřetězcová DNA (anti-dsDNA): u 7 měsíců starých zvířat, buďto neléčených nebo po 4 měsících léčení MR1, byly hodnoty mediánu anti-ssDNA 4,5 U/ml a 0,6 U/ml a medián pro anti-dsDNA 2,2U/ml a 0,4U/ml. Léčení nemělo žádný účinek na sérovou hladinu celkového imunoglobulinu.

Ve studii, kterou publikovali Early et al. (viz výše) byly samice myší (NZB X NZW)F1 léčeny křeččí protilátkou anti-muCD40L MR1 (Noelle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 650, 1992), podávanou i.p. v dávce 200 mg MR1 dvakrát týdně od stáří 4 měsíce do 10 měsíců. Podávání bylo zahájeno ještě v takovém stáří, než se u každého zvířete vyvinula těžká nefritida, jak doklá

-2CZ 297680 B6 dají hladiny proteinurie nejméně 500 mg/dl (u prvního z deseti neléčených kontrolních zvířat se rozvinula těžká nefritida ve stáří 4,5 měsíce (Early et al., viz výše, 3161). Léčení MR1 podstatně inhibovalo rozvoj nefritidy u léčených zvířat a prodloužilo dobu přežívání: zatímco u poloviny neléčených zvířat Fl se vyvinula nefritida do šestého měsíce a do desátého měsíce všechna zvířata uhynula, ze zvířat léčených MR1 méně než polovina měla nefritidu a pouze 35 % zvířat uhynulo do stáří 10 měsíců, kdy bylo léčení MR1 ukončeno. Léčení MR1 také způsobilo, že se titr protilátek anti-DNA stabilizoval po několik měsíců od zahájení léčby, zatímco u neléčených kontrolních zvířat titr protilátek anti-ssDNA narostl na mnohem vyšší hladinu během stejného období.

Jelikož výsledky této studie jsou informativní, mají omezený význam pro využití analogických terapií u pacientů se spontánní SLE, a sice z následujících důvodů: nejdůležitější je, že ve výše zmíněné studii léčení myší monoklonální protilátkou anti-CD40L bylo zahájeno dříve, než se projevila proteinurie. Přestože by se na základě výsledků studie bylo možné domnívat, že léčení pomocí anti-CD40L by mohlo zabránit rozvoji nefritidy, pokud je léčení zahájeno předtím, než se objeví symptomy nemoci, z výsledků nijak nevyplývá, co se stane v klinicky relevantní situaci, když už subjekt má rozvinutý, symptomatický lupus. Navíc model použitý v publikaci Early et al., tj. myš (NZB X NZW)F1, nemá patogeneze nefritidy dostatečně podobnou s lidskými pacienty trpícími SLE, aby byly výsledky studie dostatečně prediktivní z hlediska účinků takové léčby. Tak např. myši (NZB X NZW)F1 mají vysokou hladinu retrovirového proteinu v krvi, která společně se sérovými protilátkami, jak se domníváme, je příčinou nefritidy u zvířat. Jelikož většina pacientů nemá v krvi retrovirové proteiny a vliv sloučenin anti-CD40L na hladinu retrovirů není znám, účinek sloučenin anti-CD40L na lidský lupus nephritis spojený s autoprotilátkami není předvídatelný na základě výsledků léčení myší (NZB X NZW)F1.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu léčení, reverze a stabilizace nebo zabránění rozvoje nefritidy u pacientu s imunokomplexovou poruchou (nemocí způsobenou imunitními komplexy) nebo symptomatickou SLE, a to tím, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L. Termínem „symptomatická SLE“ se zde rozumí, že pacient má jeden nebo několik z následujících symptomů: proteinurie větší než 150 mg/1, protein v moči celkově za den více než 150 mg/den, sérová hladina protilátek anti-dsDNA vyšší než je norma. Aktivní nefritida je indikována hladinou proteinurie vyšší než 300 mg/1.

Sloučenina anti-CD40L je jakákoliv sloučenina, která se váže na CD40L na povrchu buněk exprimujících CD40L, jako jsou např. aktivované T buňky. V jednom provedení předkládaného vynálezu je sloučenina protilátka anti-CD40L, výhodně monoklonální protilátka. Monoklonální protilátkou může být protilátka 5c8 (ATCC č. BH 10916).

Sloučenina anti-CD40 může být formulována v léčebném přípravku, který obsahuje také terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L a farmaceuticky přijatelný nosič. Terapeutický přípravek může obsahovat také druhou terapeuticky účinnou sloučeninu.

Předkládaný vynález se také týká způsobu, jak zlepšit funkci ledvin u pacienta s nemocí způsobenou imunitními komplexy, a to tím že se pacientovi podávají terapeuticky účinná množství sloučeniny anti-CD40L, a pak se měří hladina proteinu v moči, která je nižší než hladina proteinu v moči před podáním sloučeniny anti-CD40L.

Vynález dále poskytuje léčebný produkt, který obsahuje léčivý přípravek, který obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L a farmaceuticky přijatelný nosič, sterilně zabalený v nádobce, společně s návodem pro použití při léčení lupus nephritis nebo jiné imunokomplexové poruchy. V tomto přípravku je sloučenina anti-CD40L monoklonální protilátka, např. 5c8.

-3CZ 297680 B6

Jiný aspekt vynálezu se týká způsobu zabránění vývoje nebo progrese nefritidy u ledvinného aloštěpu u pacienta s imunokomplexovou poruchou. V tomto způsobu se podává pacientovi terapeuticky účinné množství sloučeniny anti-CD40L. Způsob může být užitečný u pacientů s SLE a sérovou chorobou. Sloučenina anti-CD40L se může podávat pacientovi před transplantací, v době transplantace nebo po transplantaci, periodicky po transplantaci aloštěpu a následně po období jednoho nebo několika těchto dávkovačích režimů.

Popis obrázků

Obr. 1 Časový průběh některých měřených charakteristik krve a moči kontrolních a ošetřovaných (SWR X NZB) F, myší v pokusu II. Monoklonální protilátka anti-CD40L MR1 byla podána jednou v i.p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, pak znovu v 7 měsících a znovu v 9 měsících, a pak opakovaně v měsíčních intervalech. Pět horních řádků tabulky označených AR až BN obsahuje data pro kontrolní zvířata, a spodních 6 řádků označených CL až CR obsahuje údaje o jednotlivých ošetřovaných zvířatech. Stude byla zahájena v únoru 1996, když byla zvířata ve stáří 4 měsíců. Vertikální dvojité čáry oddělují 4 skupiny údajů, kdy každá skupina představuje údaje o krvi v moči naměřené k jednomu datu odběru uvedenému v záhlaví. Hladina proteinurie (PU) je hodnocena od hladiny „stopy“ až po hodnocení 4. Hodnocení 1 odpovídá hladině albuminu v moči 30 mg/dl, hladina 2 odpovídá 100 mg/dl, hladina 3300 mg/dl a hladina 4 více než 2000 mg/dl. Hladiny protilátek anti-MRl (uvedené ve sloupci označené „anti-MRl“), protilátek anti-ssDNA a anti-dsDNA jsou uvedeny v pg/ml krve. Kde je to vhodné, jsou hodnoty uvedeny jako průměr a směrodatná odchylka ve tvaru průměr (s. odchyl.). Čárka indikuje, že vzorek nebyl odebrán/změřen, zpravidla kvůli smrti zvířete. ND znamená „neprovedeno“.

Obr. 2 Tabulka měření proteinurie v závislosti na čase u zvířat v pokusu II. V prvním sloupci jsou uvedena čísla zvířat podobně jako v tabulce 1. V úvodu každého sloupce jsou uvedena data dnů, kdy se odbíraly vzorky. NC znamená „neodebrány“.

Obr. 3 Charakteristiky krve a moči kontrolních a ošetřovaných myší v pokusu V, kde bylo léčení zahájeno ve stáří 4,5 měsíce. MR1 byla podána i.p. v dávce 500 pg/zvíře ve stáří 4,5 měsíce, a pak opakovaně měsíčně v i.p. dávce 500 pg. Horních 7 řádků označených AR až BLR obsahuje data jednotlivých kontrolních zvířat, sedm spodních řádků byla zahájena v květnu 1996, kdy zvířata byla stará 4,5 měsíce. Ostatní informace v tabulce jsou stejné jako v tabulce 1.

Obr. 4 Tabulka měření proteinurie v závislosti na čase u zvířat v pokusu V. Čísla zvířat jsou stejná jako na obr. 3. Ostatní popisy jsou shodné s obr. 2.

Obr. 5. Tabulka charakteristik krve a moči kontrolních a léčených myší v pokusu VII, kde ošetřování bylo zahájeno ve stáří 5,5 měsíců. MR1 byla podávána i.p. v dávce 500 pg/zvíře jednou týdně po dobu 6 týdnů, a pak opakovaně měsíčně v i.p. dávce 500 pg. Horní tri řádky tabulky označené AN a BL uvádějí data pro jednotlivá kontrolní zvířata (jak je poznamenáno u obr. 6 některá kontrolní zvířata uhynula předtím, než byly naměřeny údaje uvedené na obr. 5) a každý ze 7 dolních řádků označených CR až DN obsahuje data pro léčená zvířata. Studie byla zahájena v červnu 1996, kdy zvířata byla stará 4,5 měsíce. Ostatní informace v tabulce jsou stejné jako v tabulce 1.

Obr. 6 tabulka měření proteinurie v závislosti na čase u zvířat v pokusu VII. Každý ze 7 horních řádků označených AR až BN obsahuje data jednotlivých kontrolních zvířat, sedm spodních řádků označených CR až CD uvádějí data pro jednotlivá léčená zvířata. Ostatní informace v tabulce jsou stejné jako na obr. 2.

Obr. 7. Tabulka charakteristik krve a moči v závislosti na čase u kontrolních a léčených myší v pokusu X, kde ošetřování bylo zahájeno ve stáří 5,5 měsíců. MR1 byla podávána i.p. v dávce

-4CZ 297680 B6

500 pg/zvíře jednou týdně po dobu 4 týdnů, a pak opakovaně měsíčně v i.p. dávce 200 pg. Horních 8 řádků tabulky označené AR až BLR uvádějí data pro jednotlivá kontrolní zvířata a 8 dolních řádků označených CR až DLR obsahuje data pro jednotlivá léčená zvířata. Stude byla zahájena v říjnu 1996, kdy zvířata byla stará 5,5 měsíce. Ostatní popisy jsou stejné jako v tabulce 1.

Obr. 8 tabulka závislosti proteinurie na čase zvířat v pokusu X. V prvním sloupci jsou uvedena čísla zvířat shodně s obr. 7. Ostatní popisuje shodný s obr. 2.

Obr. 9. Tabulka charakteristik krve a moči v závislosti na čase u kontrolních a léčených myší v pokusu VI, kde ošetřování bylo zahájeno ve stáří 7 měsíců. MR1 byla podávána 4 zvířatům i.p. v dávce 500 pg/zvířete jednou týdně po dobu 6 týdnů, a pak opakovaně měsíčně v i.p. dávce 500 pg. Každý ze 4 dolních řádků označených DN až EN obsahuje data pro jednotlivá léčená zvířata. V době sběru dat pro tuto studii všechna kontrolní zvířata uhynula, jak je zmíněno na obr. 10. Studie byla zahájena v červnu 1996, kdy zvířata byla stará 5,5 měsíce. Ostatní popisy jsou stejné jako na obr. 1.

Obr. 10. Tabulka závislosti proteinurie na čase u zvířat v pokusu VI. Každý ze 4 horních řádků tabulky označených AR až CN uvádí data pro jednoho z kontrolních zvířat a každý ze spodních 4 řádků označených DN až EN obsahuje data pro jednotlivá léčená zvířata. Ostatní popisy jsou stejné jako na obr. 2.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká léčení, reverze nebo stabilizace nefritidy u pacienta trpícího buďto imunokomplexovou poruchou (onemocněním způsobeným imunitními komplexy) nebo prokázanou SLE. Pacienti se léčí sloučeninou, která blokuje interakci CD40L na T buňkách s CD40 na B buňkách. To, jak se domníváme, inhibuje produkci patologických protilátek, což zase snižuje hladinu patogenních autoprotilátek spojených s vývojem a exacerbaci nefritidy spojené s imunitními komplexy.

Sloučeniny

Terapeutické sloučeniny vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují jakékoliv sloučeniny, které blokují interakci CD40 na B buňkách s CD40L exprimovaným na povrchu aktivovaných T buněk. Ke sloučeninám anti-CD40L specificky patří polyklonální protilátky a monoklonální protilátky (mAb), a také protilátkové deriváty jako jsou chimérické molekuly, humanizované molekuly, molekuly s redukovanou efektorovou funkcí, bispecifické molekuly a konjugáty protilátek. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je použita protilátka 5c8, která je popsána v patentu US 5 474 771, na jehož popis se tímto odkazujeme. K dalším známým protilátkám proti antigeny 5c8 patří protilátky ImxM90, ImxM91 a ImxM92 (získané od firmy Immunex), monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy Ancell (Bayport, MN, klon 24-31, katalog, č. 353-020), a monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy Genzyme (Cambridge, MA, katalog, č. 80-3703-01). A také monoklonální protilátky anti-CD40L komerčně dostupné od firmy Pharmingen (San Diego, katalog, č. 33580D). Mnoho dalších protilátek anti-CD40L bylo připraveno a charakterizováno (viz např. dokument WO 96/23071, Bristol-Myers Squibb, na který se zde odkazujeme).

Předkládaný vynález se také týká anti-CD40L molekul jiných typů, jako jsou např. celé fragmenty Fab, sloučeniny F(ab')₂, úseky VH, úseky Fv, jednořetězcové protilátky (viz např. WO 96123071), polypeptidy, fúzní konstrukty polypeptidů, fúzní konstrukty CD40 (jako např. CD40Ig, viz Hollenbaugh et al., J. Immunol. Meth. 188: 1-7, 1995, na nějž se plně odkazujeme) a sloučeniny s malými molekulami jako jsou např. malé semipeptidové sloučeniny nebo nepeptidové sloučeniny, které jsou přitom všechny schopné blokovat interakci CD40-CD40L. Způsoby

-5CZ 297680 B6 pro projektování, screening a optimalizaci malých molekul jsou popsány v patentové přihlášce PCT/US96/110664 (podané 21. června 1996 a publikované 9. ledna 1997 jako dokument WO 97/00895), na kterou se tímto odkazujeme.

Různé formy protilátek lze také připravit pomocí standardních metod rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-99, 1991). Tak se např. mohou připravit „chimérické“ protilátky, ve kterých je doména vážící antigen ze zvířecí protilátky spojena s lidskou konstantní doménou (protilátka původně pocházející ze savce jiného než člověka, ve které se metodami rekombinantní DNA nahradily buďto části nebo všechny části kloubové oblasti a kontrolních úseků těžkého řetězce a/nebo konstantního úseku lehkého řetězce odpovídajícími úseky z lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, viz např. Cabilly et al., Patent US 4 816 567; Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984). Chimérické protilátky redukují immunogenní odpověď vyvolanou zvířecími protilátkami, když se používají v humánní klinické praxi.

Navíc je možné syntetizovat i rekombinantní „humanizované“ protilátky. Humanizované protilátky jsou protilátky původně pocházející ze savce jiného než člověka, ve kterých se metodami rekombinantní DNA nahradily některé nebo všechny aminokyseliny, které nejsou nezbytné pro vazbu antigenu, aminokyselinami z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (chiméry obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy úseky odpovídající za specifickou vazbu antigenu, viz např. patentová přihláška PCT WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje odpovídající protilátka a část sekvencí variabilního úseku odpovědných za specifickou vazbu antigenu se vyjme. Úseky vázající antigen pocházející ze zvířecí protilátky se pak klonují do vhodných míst v genech lidských protilátek, ze kterých byly úseky vázající antigen deletovány (odstraněny). Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách a s mnohem menší pravděpodobností vyvolávají imunitní rekci u léčeného subjektu.

Pro přípravky a použití podle předkládaného vynálezu jsou také užitečné protilátky primátů nebo tzv. primatizované protilátky.

Fragmenty protilátek a univalentní protilátky s také mohou použít v přípravcích a způsobech předkládaného vynálezu. Univalentní protilátky představují dimer obsahující těžký řetězec a lehký řetězec navázaný na úsek Fc („stonek“) druhého těžkého řetězce. „Úsek Fab“ znamená takové části řetězců, které jsou zhruba ekvivalentní nebo analogické sekvencím které obsahují úsek těžkého řetězce větvící se ve tvaru Y, a celému lehkému řetězci, a které společně (jako agregáty) vykazují protilátkovou aktivitu. Protein Fab obsahuje agregáty jednoho těžkého řetězce a jednoho lehkého řetězce (obecně známé jako Fab'), a také tetramery odpovídající rozvětveným segmentům protilátky ve tvaru Y (obecně známé jako F(ab)₂), ať jsou agregovány kovalentními nebo nekovalentními vazbami, pokud jsou agregáty schopny selektivně reagovat s daným antigenem nebo antigenovou rodinou.

Navíc je možné použít standardní techniky rekombinantní DNA k tomu, aby se změnily vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny, a to tím, že se zamění aminokyselinové zbytky v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita k antigenu u humanizované protilátky může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 10029-33, 1989; patentová přihláška PCT WO 94/04679). Může být žádoucí zvýšit nebo snížit afinitu protilátek k CD40L, v závislosti na cílové tkáni a zamýšlenému konkrétnímu rozvrhu léčby. Toho lze dosáhnout metodou „phage display“ (viz např. Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455, 1994; Schier et al., J. Mol. Biol. 255: 28-43, 1996, na které se tímto odkazujeme). Např. může být výhodné podávat pacientovi konstantní hladinu protilátek se sníženou afinitou k CD40L jakožto semi-profylaktické opatření. A podobně zase protilátky se zvýšenou afinitou k CD40L mohou být výhodné pro krátkodobé léčení.

-6CZ 297680 B6

Subjekty

Subjekt, pro který je zamýšleno využití vynálezu, trpí imunokomplexovou poruchou. Takové nemoci jsou charakterizovány přítomností cirkulujících imunoglobulinů a imunitních komplexů v krevním oběhu. Jedna třída těchto poruch/nemocí je zvána sérová choroba, a je způsobena imunitní reakcí ne exogenní antigen, jako je např. nějaké infekční agens, léčivo, cizorodé antisérum nebo krevní deriváty. Nemoc způsobená imunitními komplexy se může vyskytnout také, když pacient tvoří autoprotilátky, což jsou protilátky proti pacientovým vlastním tkáním. K. příkladům takových autoimunitních onemocnění způsobených imunitními komplexy patří SLE, revmatoidní artritida, Goodpastureův syndrom, Wegenerova granulomatóza, mikroskopická polyarteritida, polyarteritis nodosa, syndrom Churg-Straussův a řada vaskulitid. Nefritida spojené s imunitními stavy, které nespadají do výše uvedených kategorií, se mohou také léčit pomocí předkládaného vynálezu. V takovým nemocem patří Henoch-Schónleinova purpura, esenciální (smíšená) kryoimunoglobulinémie, glomerulonefritida spojená s ANČA a monoklonální gamapatie, jako je mnohočetný myelom, benigní monoklonální gamapatie a Waldenstrómova makroglobulinémie.

Termín „pacient“ se užívá k označení jakéhokoliv savce, kterému se podávají sloučeniny antiCD40L. Termín pacient, pro kterého je specificky vynález zamýšlen, zahrnuje člověka a také ostatní primáty, ovce, koně, krávy, kozy, prasat, kočky, psy, králíky, morčata, křečky, pískomily, krysy, myši, ale také jednotlivé orgány, tumory a buňky pocházející z takových hostitelů.

Subjekt, pro který je vynález určen, trpí nemocí související s tvorbou protilátek.

Způsoby podávání

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou podávat jakýmkoliv způsobem, který je lékařsky přijatelný. K takovým způsobům patří parenterální podání injekcí jako např. injekce intravenózní, intravaskulámí, intraarteriální, subkutánní, intramuskulámí, intratumorové, intraperitoneální, intraventrikulámí, intraepidurální, a dále podání perorální, nazální, oftalmické, rektální nebo topické. Podání ve formě přípravku s prodlouženým uvolňováním léčiva spadá také do předmětu vynálezu, např. v podobě depotních injekcí. Některé formy sloučenin anti-CD40L mohou být vhodné pro perorální podávání, a mohou být formulovány jako suspenze nebo pilulky.

Dávkování a frekvence podávání

Velikost a frekvence dávek jakékoliv sloučeniny, která se podává pacientovi s určitou nemocí imunitního systému, je důsledkem úsudku ošetřujícího lékaře, který vychází z mnoha faktorů. Základní dávkování se stanoví v předklinických a klinických studiích, kdy se provádějí velmi extenzivně pokusy ke stanovení prospěšných a škodlivých účinků různých dávek na pacienta. Ale dokonce i když takovéto doporučení existuje, lékař často upraví dávkování pro různé pacienty v závislosti na faktorech, které zváží, jak je např. věk pacienta, zdravotní stav, hmotnost, pohlaví a souběžné léčení jinými léky. Stanovení optimální dávky pro každou zanti-CD40L sloučenin použitých k léčení je pro odborníka z oboru farmacie a lékařství rutinní záležitostí.

Pro léčení lupus nebo jiných nemocí spojených s autoimunitními komplexy se mohou užít různé léčebné režimy podle předkládaného vynálezu. Obecně řečeno, frekvence dávkování bude stanovena ošetřujícím lékařem, a může se jednat o jedinou dávku, nebo dávku podávanou denně, v intervalech 2 až 6 dnů, týdně, jednou za dva týdny nebo jednou za měsíc.

Abychom uvedli nějaký příklad dávkování, uvádíme příklad strategie podávání pro monoklonální protilátku anti-CD40L. Dávky se mohou snadno upravit pro jiné typy anti-CD40L sloučenin. Obecně lze říci, že jednotlivé dávky jsou mezi 0,05 a 50 mg/kg hmotnosti pacienta, nejčastěji v rozmezí 1 až 20 mg/kg. Pro akutní léčení je účinná dávka protilátky v rozmezí od 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 20 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaná denně po dobu 1 až 5 dnů, výhod

-7CZ 297680 B6 ně, jako bolusová intravenózní dávka. Stejná dávka a dávkovači rozvrh se mohou užít v zátěžové fázi podle schématu zátěž-udržování, kdy se v udržovací fázi podávají protilátky intravenózně nebo intramuskulámě v rozmezí od 0,1 mg/kg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, s intervaly po období léčení v rozmezí jednoho týdne až po 3 měsíce. Chronická léčení se mohou provádět také v udržovacím režimu, kdy se podávají protilátky intravenózně nebo intramuskulámě v rozmezí od 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti až 100 mg/kg tělesné hmotnosti s intervaly mezi následujícími podáními v délce 1 až 6 měsíců. Kromě případů intermitentního bolusového režimu se mohou protilátky podávat také způsobem perorálním, pulmonálním, nazálním nebo subkutánním.

Obecně se léčení provádí nízkými dávkami protilátek. Např. počáteční dávka protilátek se podá pacientovi injekcí nebo infuzí. Tato počáteční dávka může obsahovat mezi 1,0 až 30 mg protilátek na den pro 70kg pacienta. Pro opakované podávání po několika dnech lze podávat denně, každý druhý až šestý den, jednou týdně, jedenkrát za dva až čtyři týdny nebo jednou za měsíc, dokud se nepozoruje požadované potlačení příznaků nemoci. Ovšem i jiné režimy podávání mohou být užitečné. Když se symptomy potlačí na požadovanou úroveň, léčení se může ukončit. Avšak pacient může dlouhodobě vyžadovat občasné léčení pokud se znovu objevují symptomy nemoci.

Podle jiného provedení vynálezu při léčení lupus nebo jiných onemocnění souvisejících s protilátkami může být účinnost protilátek zvýšena pravidelných podáváním nebo kombinaci s konvenčními přípravky a léčivy pro léčení lupus, jako jsou např. salicyláty, kortikosteroidy nebo imunosupresiva. Alternativně mohou být protilátky konjugovány s konvenčními přípravky. To pak výhodně umožňuje podávání konvenčního přípravku v množství menším než je obvyklá dávka např. méně než 50 % obvyklé dávky, když by se podával přípravek v monoterapii. Tudíž lze zabránit mnohým vedlejším účinkům spojeným s konvenčním přípravkem.

Kombinované terapie podle předkládaného vynálezu pro lupus zahrnují použití protilátek antiCD40L společně s činidly zaměřenými na B buňky, jako jsou protilátky anti-CD19, anti-CD28 nebo anti-CD20 (nekonjugované nebo radioaktivně značené), antagonisté IL—14, LJP394 (blokátor receptorů firmy LaJolla Pharmaceuticals), IR—1116 (malá molekula firmy Takeda) a anti-lg idiotypové monoklonální protilátky. Alternativně mohou kombinace obsahovat činidla cílená na T buňky/B buňky, jako jsou např. CTLA4Ig, antagonisté IL-2, antagonisté IL^4, antagonisté 1L6 antagonisté receptorů, monoklonální protilátky anti-B7, TNF, LFA1/ICAM antagonisté, VLA4/VCAM antagonisté, brequinar a konjugáty toxinu IL-2 (např. DAB), prednison, cyklofosfamid a jiná imunosupresiva. Kombinace mohou také zahrnovat činidla namířená na T buňky jako jsou antagonisté CD4, antagonisté CD2 a IL—12.

Kombinovaná terapie pro pacienty s jiným onemocněním imunitního systému než je lupus může obsahovat podávání sloučenin anti-CD40L a také činidel, která by se normálně typicky podávala v případě daného onemocnění imunitního sytému.

Jakmile je jednou dosaženo zlepšení pacientova stavu, podávají se udržovací dávky protilátek anti-CD40L, buďto samotných nebo v kombinaci s konvenčními přípravky (proti lupus), pokud je to třeba. Následně se může redukovat dávka nebo frekvence podávání, nebo obojí, v závislosti na míře příznaků, na úroveň, která umožňuje udržet zlepšený stav. Když byly příznaky potlačeny na požadovanou úroveň, léčení se může ukončit. V ostatních případech, podle úseku ošetřujícího lékaře, porušované léčení může být potřebné např. v intervalech čtyř týdnů nebo delších. Pacient však může vyžadovat i dlouhodobé přerušení léčení pokud se příznaky znovu objevují.

Přípravky

Sloučeniny anti-CD40L použité podle předkládaného vynálezu se podávají ve farmaceuticky účinném množství, což je množství, které vyvolá léčebně prospěšný účinek na ledviny pacienta s imunokomplexovou porucho, zejména pak SLE.

-8CZ 297680 B6

K léčebně prospěšným Účinkům patří buďto zabránění zhoršení nebo zlepšení pacientova zdravotního stavu nebo funkce ledvin. Zdravotní stav a renální funkce lze monitorovat jedním nebo několika laboratorními testy, které měří koncentraci příslušných látek v moči nebo krvi, případně sledovat další charakteristiky moči nebo rychlost clearance příslušných látek z krve do moče. 5 Hodnoty získané v těchto testech, buďto samostatně nebo v kombinaci, slouží lékaři k hodnocení funkce nebo poškození ledvin. Příkladem takových hodnot jsou koncentrace močoviny v krvi, koncentrace kreatininu nebo proteinů v krvi, koncentrace proteinů v moči, koncentrace různých krevních buněk jako jsou erytrocyty nebo leukocyty v moči, měrná hmotnost moči, obsah močoviny, rychlosti clearance inzulínu, kreatininu, močoviny nebo kyseliny aminohippurové, a také 10 přítomnost hypertenze nebo edému. K léčebně prospěšným účinkům také patří snížení hladiny autoprotilátky, jako jsou např. anti-dsDNA protilátky v séru u pacientů s lupus.

Sloučeniny anti-CD40L podle předkládaného vynálezu se podávají pacientovi ve farmaceuticky přijatelné lékové formě, která může obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič. Takový nosič je 15 relativně netoxický a neškodný pro pacienta v koncentracích, které jsou v souladu s účinnou aktivitou sloučeniny anti-CD40L nebo jinou účinnou složkou, čily žádný z vedlejších účinků způsobených nosičem neruší prospěšný účinek účinné složky v přípravku. Přípravek může obsahovat ještě další kompatibilní látky, přičemž termín kompatibilní v tomto případě znamená, že složky farmaceutického přípravku jsou schopné se mísit se sloučeninou anti-CD40L a navzá20 jem, a to takovým způsobem, že nedochází k žádné interakci, která by podstatně snížila terapeutickou účinnost přípravku. Přípravek ve formě nazálního spreje obsahují purifikované vodné roztoky účinné látky s konzervačními a izotonickými činidly. Takové přípravky jsou výhodně upraveny na hodnotu pH a izotonický stav kompatibilní s nosními sliznicemi. Přípravky podle předkládaného vynálezu vhodné pro perorální podávání mohou být ve formě diskrétních jednotek 25 jako jsou tobolky, škrobové tobolky, tablety, pilulky nebo pastilky, přičemž každý z nich obsahuje předem stanovené množství sloučeniny anti-CD40L v podobě prášku nebo granuláty, nebo ve formě lipozomů, nebo jako suspenze ve vodné kapalině, nebo také v jiné kapalné formě jako je sirup, tinktura, emulze nebo výluh.

Přípravky podle předkládaného vynálezu se mohou dodávat v nádobkách, které jsou vhodné pro uchování sterility, poskytují ochranu účinnosti aktivní látky během vhodné distribuce a skladování, a umožňují, že přípravek pro podávání pacientovi je pohodně a účinně dostupný. Pro injikovatelné přípravky obsahující sloučeniny anti-CD40L se může přípravek dodávat ve vhodných viálkách uzavřených zátkou, která je uzpůsobena k nasátí obsahu pomocí jehly a injekční stříkač35 ky. Taková viálka může být buďto pro jednorázové použití nebo pro opakované použití.

Přípravek může být také dodáván v předem naplněné stříkačce. V některých případech může být obsahem stříkačky kapalný přípravek, jindy bude v suchém nebo lyofilizovaném stavu, což vyžaduje rekonstituci standardním nebo současně dodávaným ředidlem, aby se získal kapalný přípravek. Pokud se přípravek dodává jako kapalný přípravek pro intravenózní podávání, může se 40 podávat ve sterilním vaku nebo lahvi, které jsou uzpůsobeny k napojení na infuzní soupravu nebo katétr. V případech, kdy je sloučenina anti-CD40L podávána perorálně jako tablety nebo pilulky, bude se přípravek dodávat v lahvičce s odstranitelným uzávěrem. Nádoby na uchování přípravku jsou označeny a opatřeny informací s uvedením typu sloučeniny, jména výrobce nebo distributory, indikace, dávkování, pokynů ke správnému skladování a návodu k užívání.

Příklady provedení vynálezu

Použití sloučenin anti-CD40L k léčení lupus nephritis u subjektů kromě člověka

Testovali jsme působení křeččí monoklonální protilátky anti-muCD40L MR1 na průběh nefritidy u samců myší (SWR X ZNB) Fl v několika studiích popsaných v následujících příkladech. Kontrolní zvířata dostala buďto injekci polyklonální křeččí protilátky Ig nebo protilátky Ha4/8, což je monoklonální protilátka arménského křečka namířená proti KLH. Hladina proteinurie (PU) byla 55 hodnocena od hladiny „stopy“ až po hladinu 4. Hodnocení 1 odpovídá hladině albuminu v moči

-9CZ 297680 Β6 mg/dl, hladina 2 odpovídá 100 mg/dl, hladina 3 odpovídá 300 mg/dl a hladina 4 více než 2000 mg/dl. Hladina 2 je považována za slabou nefritidu a od hladiny 2,5 výše se jedná o silnou nefritidu.

Pokud nebyly léčeny, nebo byly léčeny podáváním nespecifické křečci protilátky kontrolním zvířatům, uhynuly normálně myši ve věku 12 měsíců. Zatímco nástup proteinurie u neošetřovaných zvířat byl proměnlivý, ve věku 3 měsíců měla většina zvířat slabou nebo mírnou proteinurii, která jevila tendenci zhoršovat se s rostoucím věkem. Ve věku 5 měsíců měla typicky všechna zvířata detekovatelné protilátky anti-DNA a většina měla detekovatelné i anti-ssDNA, což je v kontrastu s nedetekovatelnou hladinou těchto protilátek u normálních myší, jako jsou samice (SWR) rodičovské generace myši (SWR X ZNB) F1.

Příklad 1

Pokus II: Léčení bylo zahájeno ve stáří 4 měsíce (obr. 1, 2).

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 4 měsíců. MR1 byla podána jednou v i.p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, pak znovu v 7 měsících, znovu v 9 měsících, a pak opakovaně v měsíčních intervalech. Po 4 měsících léčení 4 z 5 kontrolních myší uhynuly, ale 4 ze 6 léčených zvířat byl ještě naživu. 3 z těchto přeživších léčených zvířat uhynuly, a sice ve stáří 12, 13 a 13,5 měsíců. Jedno zvíře přežilo déle než 15 měsíců, což je mimořádná délka života pro myši z tohoto křížení. Velmi zajímavé je to, že toto přežívající zvíře (označení DN na obr. 2) mělo mírnou nefritidu (proteinurie 2+) ve věku 8 až 13 měsíců, která se snížila na hladinu detekovatelných stop proteinurie po následující dva měsíce. To je první demonstrace funkční reverze nefritidy u myší tohoto kmene.

Příklad 2

Pokus V: Léčení bylo zahájeno ve stáří 4,5 měsíce (obr. 3, 4).

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 4,5 měsíce. MRI bylo podána jednou v i.p. dávce 500 pg/zvíře, když byla myš stáří 4 měsíce, a pak opakovaně dostávala jednu i.p. injekci s 500 mg v měsíčních intervalech. Po 4,5 měsících léčení 6 ze 7 kontrolních myší uhynulo, ale šest ze sedmi léčených přežilo. Po 8 měsících byly všechny kontroly mrtvé, ale ze 7 léčených myší zhynuly jen 3. Jak je ukázáno na obr. 4, u čtyřech ze sedmi léčených myší došlo k obratu v nefritidě, což dokumentuje trvale se snižující hladina proteinurie. Tato zvířata byla stále ještě na živu ve stáří 12,5 měsíce.

Příklad 3

Pokus VII: Léčení bylo zahájeno ve stáří 5,5 měsíce (obr. 5 a 6).

Léčení MRI bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 5,5 měsíce. MRI byla podávána po dobu šesti týdnů jednou týdně v i.p. dávce 500 pg/zvíře, a pak opakovaně dostávala jednu injekční dávku v měsíčních intervalech. Po 5 měsících léčení ve stáří 10,5 měsíců 6 ze 7 kontrolních myší uhynulo, ale všechna kontrolní zvířata byla živá ještě ve stáří 12 měsíců. Následující hodnoty byly změřeny po 3,5 měsících léčení na zvířatech která byl naživu ještě po 8,5 měsících:

- 10CZ 297680 B6

	ar.r:-sí.':A ΐ arr.i-dsCNA	PU
Kcr.lrola	— í **	0	•1
o, 8	6, 3	4
c , 3	10,1	4
?r'jmér smér. odchyl. i	5, 8(2, 6;	5,4 (4,1)	t v ‘J !
MR1	2,7	0	•
2,0	0	- 5
2,0	1,5	3
e	u	2
X / '	0
0	0	2
3, 5	0	i, 5
Průměr(směr. odchyl.)	1,8(1,2)	0,2(0,5)	1,7()

Příklad 4

Pokus X: Méně intenzivní léčení zahájené ve stáří 5,5 měsíce (obr. 7 a 8).

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši byly ve stáří 5,5 měsíce. MR1 byla podávána po dobu čtyř týdnů jednou týdně v i.p. dávce 500 pg/zvíře, pak v měsíčních intervalech v dávce 200 pg i.p. Ze 16 zvířat ve studii (po 8 v každé skupině kontrolních a léčených zvířat) do stáří 8,5 měsíce uhynula pouze jedna myš, a sice kontrola ve stáří 7,5 měsíce. Jak je ukázáno na obr. 8, sedm z osmi kontrolních zvířat mělo pretoinurii trvale rostoucí k vysokým hodnotám, v průběhu +3,4 pro 7 přeživších myší. Až na jednu z osmi, MR1 léčené myši udržovaly nízkou proteinurii, a sice s průměrem +2 pro 8 léčených myší na konci sledování. Jak je uvedeno na obr. 7, šest léčených zvířat, ale jenom jedno z kontrolních, mělo nedetekovatelnou hladinu anti-dcDNA protilátek.

Příklad 5

Pokud VI: Léčení bylo zahájeno ve stáří 7 měsíců (obr. 9, 10).

Léčení MR1 bylo zahájeno, když myši bylo ve stáří sedm měsíců. MR1 byla podávána 4 léčeným zvířatům po dobu šesti týdnů v i.p. dávce 500 pg/zvíře jednou týdně, a pak opakovaně dostávala jednu i.p. injekci s 500 mg v měsíčních intervalech. Ve věku 10 měsíců všechny 4 kontrolní myši uhynuly. Zatímco dvě léčené myši uhynuly ve stáří 11 měsíců a třetí ve stáří 13 měsíců, jedna ze čtyř léčených myší byla stále ještě naživu ve stáří 14 měsíců, tj. po 7 měsících léčení. Přežívající léčené zvíře (č. VLER) mělo na konci sledování hladinu proteinurie hodnocenou 1 a detekovatelné protilátky anti-dsDNA a anti-ssDNA.

Výsledky pokusů uvedených v příkladech ukazují, že léčení myší (SWR x NZB)F1 monoklonální protilátkou anti-CD40L významně a konzistentně prodloužilo přežívání ve srovnání s kontrolními zvířaty a zpomalilo rozvoj nefritidy, jak je ukázáno hladinami proteinurie. U některých zvířat dokonce léčení vedlo k reverzi (zvratu) nefritidy, jak ukazuje snížení hladiny proteinurie. Z celkového počtu 32 léčených zvířat u 11 došlo ke snížení hladiny proteinů v moči při léčení mono

-11 CZ 297680 B6 klonální protilátkou anti-CD40L, ale u žádného kontrolního zvířete nedošlo k podobnému snížení. Z celkového počtu 24 zvířat,u kterých se měřila hladina močovinového dusíku v krevním séru (BUN), u 3 se hladina BUN snížila po ošetření, což se nestalo u žádného kontrolního zvířete. Kromě toho, léčení MR1 často vedlo ke snížení protilátek anti-dsDNA a anti-ssDNA, které se normálně tvořily u neošetřovaných zvířat.

Ačkoliv předkládaný vynález byl popsán podrobně pomocí ilustraci a příkladů, aby byl jasně a úplně vyložen, odborníkovi je zřejmé, že lze vynález do jisté míry modifikovat, aniž by došlo k odchýlení od předmětu vynálezu, který je vymezen pouze následujícími patentovými nároky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití protilátky anti-CD40L nebo jejího derivátu pro výrobu léku pro a) potlačení progrese nefritidy, b) stabilizaci nefritidy nebo c) reverzi nefritidy u pacienta, kterým je člověk, přičemž lék je formulován v lékové formě pro podávání dávky mezi 0,05 mg/kg a 50 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
2. Použití podle nároku 1, kdy lék obsahuje množství protilátky anti-CD40L nebo jejího derivátu, které je účinné k tomu, že u pacienta způsobí a) potlačení progrese proteinurie, b) stabilizaci proteinurie nebo c) reverzi proteinurie.
3. Použití podle nároku 2, kdy pacient má před podáním protilátky anti-CD40L nebo jejího derivátu hladinu proteinurie a) přes 150 mg/1 nebo b) přes 300 mg/1.
4. Použití podle nároku 1, kdy lék obsahuje množství protilátky anti-CD40L nebo jejího derivátu, které je účinné k tomu, že u pacienta a) potlačí zvýšení sérové hladiny protilátek anti-DNA, b) stabilizuje sérovou hladinu protilátek anti-DNA nebo c) snížení zvýšenou sérovou hladinu protilátek anti-DNA.
5. Použití podle nároku 1, kdy lék obsahuje množství protilátky anti-CD40L nebo jejího derivátu, které je účinné k tomu, že u pacienta stabilizuje nebo sníží klinický parametr vybraný ze skupiny obsahující: a) koncentrace močoviny, kreatininu nebo proteinu krvi pacienta, b) koncentrace proteinu nebo krevních buněk v moči pacienta, c) měrná hmotnost moči pacienta, d) množství moči pacienta, e) rychlost clearance inzulínu, kreatininu, močoviny nebo kyseliny Δ-aminohippurové, f) hypertenze pacienta, g) edém u pacienta, a h) hladina cirkulujících autoprotilátek pacienta.
6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy protilátka anti-CD40L je monoklonální protilátka.
7. Použití podle nároku 6, kdy monoklonální protilátka je protilátka 5c8 produkovaná ATCC č. HB 10916.
8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy protilátka je humanizovaná protilátka.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy derivát protilátky anti-CD40L je vybrán ze skupiny sestávající z: (a) fragmentů Fab, (b) sloučenin F(ab)₂, (c) úseků V_H, (d) úseků (d) a (e) jednořetězcových protilátek.