JPH03197499A - 腫瘍壊死因子結合蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １可史欠１ 本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＥ）の細胞毒性作用を阻
害する能力、及び／又はぞの有益な作用を長期間維持覆
る能力を有する、腫瘍壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ　）結合蛋
白■（以後１−１３　Ｐ　−［と表示する）と呼ばれる
新規蛋白、その塩、官能基誘導体、前駆体、活性画分、
及びこれらの任意の混合物に関する。本発明はまた、Ｔ
ＢＰ−Ｈの精製法、実質的に精製された蛋白、そのりＤ
−ニング及び組換えＤＮＡ法による産生法に関する。本
発明はよた、’ｒ　Ｂ　Ｐ−ｎとそのＦ　（ａｂ）断片
に対する抗体に関する。さらに本発明は、ＴＮＦの有害
作用に拮抗するための、及び／又はその有益な作用を長
期間雑持号るための、Ｔ　Ｂ　Ｐ−１、その塩、官能基
誘導体、前駆体又はこれらの活性画分、及びこれらの任
意の混合物の使用、診断測定法におりる抗体の使用、そ
して細胞に対する１”ＮＦの効果を阻害又は模倣するた
めの物質としての抗体の使川に関する。

発明の背景 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びリンフォトキシン（Ｔ
　Ｎ　Ｆ−β）（以後１−Ｎにとは１″Ｎト−αとＴＮ
Ｅ−一βの両方を意味する）は細胞に対して多くの作用
を有するサイト力インである（デイ−・ワラーシ］（Ｗ
ａｌｌａｃｈ、　ｏ、　）　、（１９８６年）のインタ
ーフェロン７　（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　７）（イオ
ンブレラ−ＩＪ−−（Ｉｏｎ　Ｇｒｅｓｓｅｒ　）編）
、８３−１２２頁、アカデミツクブレス社（八ｃａｄｃ
ｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、及びど−・ボイトラ
ーとニー・セラミ（Ｂｅｕｔｌｅｒ　　Ｂ、　ａｎｄ　
ＣｃｒａＩｌｌｉ　　＾、）　　　（１９８７升）、ニ
ューイングランドジャーナルオブメゲイシン（Ｎｅｗ　
Ｅｎｏｌａｎｄ　Ｊ、　Ｒｅｄ、　）　、第３１６巻：
３７９−３８５頁）。ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βはとも
に特異的細胞の表面リセプターに結合してその作用を開
始する。その作用は生物に対して有益なこともある：例
えばそれらは腫瘍細胞やウィルス感染細胞を死滅さ駐た
り、顆粒球の抗細菌性作用を増強させたりする。このよ
うにＴＮＦは生物０ の感染体に対する防御や毒性からの回復に貢献している
。しかし明らかに１’　Ｎ　Ｆ−α及びＴＮＦβはとも
に、非常に有害な作用をりることもある。

いくつかの疾患でＴＮＦ−αの過剰産生が主要な病因に
なっているという証拠がある。例えば主に脈巻構造に対
するＴ　Ｎ　Ｆ−αの作用が、敗血症ショックの主要原
因ぐあることが知られている（ケー・ジェイ・トレーシ
ー（Ｔｒａｃｙ、に、Ｊ、）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　）第２３４巻、４７０−４７４頁、（１９８６
年））。ある疾患ではＴＮＦは含脂肪細胞の活性を抑制
して食欲不振を引き起こすことにより、極邸の体重減少
を引ぎ起こしく悪液質）、そのため「Ｎ［−αは力へク
チン（ＣａＣｈｅＣｔｉｒｌ　）と呼ばれている。ｌ’
　Ｎ　Ｆはまたリウマチ疾患において組織毒性のメデイ
エータ−とされており（ボイトラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ　
）　、前述）、対宿主移植片反応で見られる毒性の主要
なメデイエータ−であるとされている。

従って内因性に形成された又は外因性に投与されたＴＮ
Ｉを除去又は拮抗する方法を児つＩ」る必１ 要がある。この方向の最初の試みは、ヒト尿からのＴ　
Ｂ　Ｐ　−ｉと呼ばれる最初のｌ−Ｎ　１結合蛋白の単
離である、これはＴ’　Ｎ　Ｆの作用に拮抗することが
証明される。この拮抗作用は、１−ＮＩＩの細胞ｔｊ性
活性の減少を測定することにより、そしてＴ　Ｎ　Ｉ−
のりセプターへの結合の妨害を測定することにより証明
された。

この蛋白下１３１）−ｉはわれわれの日本特訂出願第２
２８３０７　／　８８号（１９８８年９月１２日に出願
）に記載されており、この特許には、ＣＭ−セル１コ１
−スのりＬｌｌマッグフィーの次に、モノＱとモノ８カ
ラムでの高速液体り［］−７トグラフイー（ＨＰＬＧ）
、そして逆相高速液体り［］マドグラフィーにより、ヒ
ト１ボからこの蛋白を均一・になるまで精製Ｊる方法が
記載されている。こうして得られたｒ　１３　Ｐ　−Ｉ
は、還元化条件及び非還元化条件のいずれにおいてもド
デシル硫１’１ノ１〜リウム（ＳＯ８）−ポリアクリル
７ミドゲル“電気泳動（Ｐ　Ａ　Ｇ　ト）で、児か１９
の分子量は約２７，０００であった。精製蛋白の均一性
はマイクロ配ケ１２ 解析により確認され、単一のＮ末端配列：ＡＳＤ−３ｅ
ｒ−Ｖａｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−を示した。

ＴＢＰ−Ｉは数ｎＭａｌ！の濃度で１’　Ｎ　Ｆ毒性か
ら細胞を守り、ＴＮＦ−α及び１−Ｎｌ−−βとともに
適用するとき、これらのサイト力インの細胞への結合を
妨害することが証明された。Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ｉの作用機
構をさらに調べることにより、ＴＢＩ”Ｉは標的細胞と
は相ｎ作用をせず、ＴＮＦに特異的に結合することによ
りＴＮＦの機能を阻止する（即ちＴ　Ｎ　Ｆリセプター
に対してＴＮＦと競合する）ことがわかった。

この知見に引続きわれわれが試みたｒ　Ｂ　Ｐ　−Ｉの
別の精製法では、尿性蛋白又はその画分をＴ　Ｎ　Ｆを
固定したカラムにかけ、結合しない蛋白を除去し、ｐＨ
を下げることによりカラムに結合した蛋白を生物活性の
ある形で溶出した。ＳＤＳ−１’）　Ａ　Ｇ　Ｅ：で覧
よ、溶出液中のほとんとの蛋白は、見かけの分子置駒３
０．０００±２，０００の単一の広いバンドとして移動
した。

３ Ｔ　Ｎ　Ｆ固定カラムから溶出した蛋白をさらに逆相高
速液体クロマトグラフィーで分画すると、２つの活性成
分が証明された：１つは予想されたようにアセトニトリ
ル２７％で溶出するｌ−１３１）　−Ｉであり、もう１
つは少し高いアセトニトリル１１１１（３１％）で溶出
する第２のＴＮＦ結合蛋白である１、このＴ’ＮＦ結合
蛋白は新規て゛あり、ここではＴ　１３　Ｐ−ＩＩと呼
ぶ。両方の蛋白ともインごトロ（試験管内）で１　Ｎ　
Ｆの細胞毒＋！１作用に対する防御を与え、いずれも−
１−Ｎ　Ｆ−βに対する結合はＴ　Ｎ　Ｆ−αに対する
結合より弱かった。ＳＤＳ−ＰＡ　Ｇ　Ｅ：分析では、
口の２つの蛋白は分子量がよく似ているが、免疫的交差
反応性がないこと、Ｎ末端アミノ酸配列が異なり、アミ
ノ酸組成が異なることにより明瞭にト別される。

発明の要約 本発明は１’　Ｎ　Ｆに特責的に結合して１’　Ｎ　Ｆ
の毒性作用に拮抗ことかでき、及び／又はその有益な作
用を長期間＠持する１’　Ｎ　Ｆ結合蛋白（ここで「Ｂ
Ｉ３−■と表示りる）、その塩、官能基誘導体、４ 前駆体、活性画分、及びこれらの任意の混合物を与える
。Ｔ　Ｎ　Ｆに対する拮抗作用は、ＴＮＦの細胞毒性作
用は減少せせるが、ある程度ＴＮＦの作用を模倣する他
の化合物〈例えばヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１
））の細胞毒性作用は減少させないことを選択的に測定
することにより証明される。

本発明は、実質的にに精製された形の、蛋白性不純物を
含ます逆相高速液体クロマトグラフィーで単一・のピー
クとして移動する、Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ＩＩに関する。

本発明はまた、ヒト体液（例えば尿）からのＴ　Ｂ　Ｐ
−Ｉ［の精製法に関する。

本発明の伯の目的は、ＴＢＰ−ＩＩ又はそれと実質的に
に同一の蛋白を］−ドするＤＮＡ配列の調製、それらを
含む発現ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ　）　、そしてその
発現ビヒクルにより形質転換された宿主細胞の作成、組
換え’Ｔ’　Ｂ　Ｐ　−ＩＩ又はこれと実質的に同一の
蛋白を産生きせるための、この形質転換細胞の適当な培
地中での培養よりなる、組換え５ ＤＮＡ法による一ＴＢＰ−用の産生である。

本発明のさらに別の目的は、診断薬と使用され、Ｔ　Ｎ
　Ｆの毒性作用をｔｉｌｌ害し、またＴＮＦと類似の細
胞に対して有用な作用をさせるための医薬品として使用
される、Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ＩｔとそのＦｌａｂ）断片に特
異的な抗体を与えることである。

本発明のＴ　Ｂ　Ｐ−ＩＩ　、その塩、官能基誘導体、
前駆体、活性画分、及びこれらの任意の混合物番よ、１
゛Ｎ「と共に使用するとき、ＴＮＦの有害作用がら哺乳
動物を防御し、及び／又はその有益な作用を長期間維持
する薬剤組成物を活性成分として使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、逆相高速液体クロマトグラフィーカノムの尿
性−Ｉ　Ｎ　Ｆ結合蛋白の溶出パターンを示す。 第２図は、１’　Ｂ　Ｐ−ＩとＴ　Ｂ　Ｐ−１［の粗調
製物と精製物のＳＤＳ−−ＰＡＧＥ分析の結果を示ず。 第３図は、１’ＢＰ−１ＩＩのいくつかのトリプシン分
解ペプチドの配列を示す。 第４図は、２種のＴＢＰについて、Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ｉ６ とＴ　Ｂ　Ｐ　−ＩＩに対する抗面清の結合のＥＬＩＳ
Ａをポす。 第５図は、Ｔ　Ｂ　Ｐ−ＩとＴＢＰ−ＩＩに対する抗白
清による、異なる細胞株に対するＴＮＦの結合の阻害を
示す。 第６図は、健常人及び全身性■リテマトーデス（ＳＬＥ
）患者の面清中の１−Ｂ　Ｐ−ＩＩ濃痕を示す。 第７図は、線帷芽細胞のステイムレータ−（刺激物）と
してのＴＮＦの有益な作用を長期間維持させることに対
する、ＴＢＰ−ＩＩｆｆ）異なる濃度の影響を示す。 第８図は、ＴＮＦの生物活性に対するＴＢＰ■の効果の
経時的影響を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、ＴＮＦの細胞毒性作用を選択的に阻害し、及
び／又はその有益な作用を長期間維持する１−Ｎ　Ｆ結
合蛋白ＩＩ、その塩、官能基誘導体、前駆体、活性画分
、及びこれらの任意の混合物を与える。 本発明においてＴＢＰ−ｎはＴＮＦの細胞島性７ 作用を阻害できることが発見され、従って本発明はＴ　
！−３Ｐ−ＩＩによるＴＮＦの細胞毒性作用の阻害を包
含する。さらにＩ　Ｂ　ｔ）−１はＶＮＦｋ：結合する
特異的担体として追加的な役割をはたし、その有益な作
用を長期間維持させることもわかった。 従って１−　＋３　Ｐ−１［結合ＴＮＦ複合体は、活性
ＴＮＦの標的細胞に対する持続的放出（徐放ｆｉ）を与
える貯蔵場所として働くことができる。この点も本発明
により包含され、ＴＮＦの有益な作用（例えば、抗腫瘍
活性、抗ウィルス活性、杭軸菌活性、抗菌性、又はＷＡ
帷曳細胞増殖刺激活ｆＩ）を長期間維持させるために、
Ｔ　Ｎ　Ｆと共に１−１−３　Ｐ・■を低！痕で使用す
ることも含む。この場合、この混合物はいくつかの臨床
的応用（例えば傷の治癒の促進）が旬能である。 本発明のｌ−Ｂ　Ｐ−１［はヒト尿から単離された。 実質的に精製された形の蛋白（実質的に蛋白性不純物を
含まない）はＳ　ｌ）　Ｓ−ＰへＧしにより還元化条件
で分析するとき、約３　Ｑ　ＫＤａの分子部を有し、逆
相高速液体クロマトグラフィー上で単一の８ ピークとして移動する。その活性は、マウスへ９細胞に
対するＴＮＦ−αの細胞＠ｔ！を作用の阻害能力により
測定できる。 １−　Ｂ　Ｐ−ｎはざらにＮ末端配列の解析により得ら
れた下記の配列により特徴づけられる：Ａ　ｌ　ａ−Ｇ
　ｌ　ｎ−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−ＰｈｅＴｈｒ−Ｐ
ｒｏ−丁ｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒ。 Ｇ　Ｉ　ｕ　、　ｌ）　ｒ　ｏ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−８ｅ　ｒ
−’ｌ’　Ｆ）ｒｃｙｓ−△ｒｑ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇ
　Ｉ　ＵＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ｇｌｎ、−Ｍｅｔ−ＣＶＳ−ＣＶＳ−実際、１
’　Ｂ　Ｐ−ＩＩの試料にはＮ末端配列の不均一性が見
られ、すべての実験でこの配列の末端が切れた形が見ら
れた。末端の切れた異なる配列のｉと互いの比率はバッ
チ毎に異なっていた。従って上記の配列と共に５個のア
ミノ酸が少ない配列、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌ
　ａ−Ｐｒ。 Ｇ　ｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−８ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ
、、　。 及び末端のアミノ酸の４個がない配列、Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ９ Ｐｒｏ−Ｇ　　ｌ　　ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　　ｌ　　ｙ−８
ｅｐＴｈｒ、、。 も認められるであろう。 本発明は上記配列よりなる蛋白（ここでは１’　Ｂ　Ｐ
　−１と呼ぶ）、及びヒト−ｒ’　Ｂ　Ｐ−ＩＩ活竹を
有する限り、他のポリペプチド（ここでは天然のＴ　Ｂ
　Ｐ　−ＩＩの構造の１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠
失しているか、又は他のアミノ酸（゛置換されているか
、又は１つ又はそれ以上のアミノ酸がイ」加されている
）　ｔ３含む。 本発明はまたヒト体液（例えば泳）からのＴ　Ｂ　Ｐ　
−’［の単離法と精製法に関する。、１゛つの好適な態
様において、本発明の実質的に精製され１ｃ蛋白は以下
の段階よりなる方法により産生きれる：ａ）健常人の尿
の透析濃縮物から粗蛋白画分を回収し； ｂ）段階（２）の粗蛋白画分を、ＴＮＦを同定したアフ
イ三デイクロマトグラフィーにか（プて；Ｃ）段閉（ｂ
）のアフィニディ精製した活性］Ｎ１結合蛋白を、逆相
高速液体クロマトグラフィー０ （ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけて、Ｉ−Ｎ　Ｆ結合蛋白の実質
的に精製された活性画分（ＴＮＦの細胞毒性作用を阻害
する能力により規定する）を得て：ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより還元化条件で分析するとき、約３　Ｑ　ＫＤａ
の分子量を有し、逆相高速液体クロマトグラフィーで単
一ピークとして移動し、「Ｎ１：の細胞毒性作用を阻害
する能力を有する、段階に）の実質的に精製された１−
ＢＰ−■蛋白を分離し； ｅ）アセトニトリル３１％で溶出し実質的に精製された
Ｔ　Ｂ　Ｐ−ｎを含有する画分を回収する。 本発明はさらに遺伝子工学法によるＴＢＰ−ＩＩの調製
に関し、この方法に使用される全ての手段を含む。即ち
本発明は、１−　Ｂ　Ｐ−１又は実質的にそれと同一の
蛋白をコードするメクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子
に関する。これらのＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、合成りＮＡ、及びそれらを組み合わせたものでのよ
い。 ＴＢＰ−１ＩＩのクローニングは異なる方法により実施
される。１つの方法は、ＴＢＰ−１に対する１ 特質的抗体（ポリクロ−・ナル抗体又はモノクロナル抗
体）を産生じ、これを用いて免疫蛍光法又はウェスタン
プロット法によりＴＢＰ−ｎを産生する細胞を捜づこと
である。次にｒ−１３Ｐ　−［１産生細胞からｍ　ＲＮ
　Ａを抽出し、ｃＤＮＡを作成するのに適した時間及び
条件で、リバーストランスクリプターゼと接触させてＣ
ＤＮＡに変換する。このｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａをラムダ９ｔ
１ＩＩのような発現ベクター中でクローン化し、抗体を
用いでスクリーニングする。ラムダ０１１１発現ベクタ
ーは、ベータガラクトシダーゼ停止］トンの５３塩基上
流にある単一のヒｃ　ｏ　ＲＩ部位に、７ｋｄまでの長
さの１）ＮＡを挿入するのに使用される。従って外来Ｄ
ＮＡ配列はこの部位に挿入され、適当な条件で融合蛋白
として発現される。ラムダ！１ｔｌ１発現ベクターは、
抗体プローブを用いてスクリーニングされるｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａの作成に特に有用である（ティー・ブイ・ヒユー　
（ｌｌｕｙｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、）ら、デーピッドグロー
バー（Ｄａｖｉｄ　Ｇｌｏｖｅｒ）編、ＤＮＡり［ｌ−
ニング法：ブラクティカルアッブローチ（Ｄ　Ｎ　Ａ　
　Ｃ１ｏｎｉｎ。 ２ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　：＾Ｐｒｒａｃｔｉｃａｌ＾ｐ
ｐｒｏａｃｈ）、アイアールプレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ　）　、オックスフォード、４９−７８員（１９８４
年））。 別の方法では、蛋白のアミノ酸配列（例えばＮ末端アミ
ノ酸配列）より得られた配列である、合成オリゴヌクレ
オチド、又はその混合物を産生じ、ＣＤＮＡ又は［Ｂを
］−ドするゲノムＤＮＡのクローニング用プローブとし
て使用する。ヒトゲノムＤＮＡのような適当なりＮＡ調
製物を制限酵素により酵素的に切断するか又はランダム
に切断し、断片を適当な組換えベクターに挿入し遺伝子
ライブラリーを作成する。次にＴＢＰ−ｎをコードする
配列を同定するために、このようなベクターを合成オリ
ゴヌクレオチドでスクリーニングすることができる。 又はＴ　Ｆ３　Ｐ−ｎを発現する細胞からｍＲＮＡを単
離し、精製後１記したようにｃｌ）ＮＡに変換する。Ｃ
ＤＮＡは公知の方法により二本鎖ＤＮＡに変換し、クロ
ーン化し、得られるクローンを、所期の配列を］−ドす
るｃＤＮＡの適当なプローブ３ でスクリーニングする。目的のＣ’ＤＮＡを単離した後
は、ゲノム１）ＮＡと実質的に同様の方法でｃ　ｌ）　
Ｎ　Ａを操作する。しかしＣＤＮＡにはイントロンや介
在配列はない。 本発明はまた、Ｔ’　Ｂ　Ｐ−ｕをコードするＤＮＡに
対するプローブとして使用される合成オリゴヌクレオチ
ドに関する。これらはＴ　Ｂ　Ｐ−Ｉｔの断片のアミノ
酸配列に基づき公知の方法で合成される。 この目的のために、ＴＢＰ−，１ＩＩの配列を完全に解
析するか、又はそのペプチド断片を得てアミノ酸配列を
解析することかできる。このペプチド断片は当業者に公
知の方法で、トリプシン、キモトリプシン、又はパパイ
ンなとのプロテアーゼで消化することにより、精製され
た蛋白調製物を断片化することにより得られる（ワイ・
Ａイケ（ＯｉｋＯＹ、）ら、ジャーノール第１バイオロ
ジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、
）第２５７巻、９７５１９７５８頁（１９８２））。こ
れらは逆相高速液体り０マドグラフイーで分離し、自動
アミノ酸配列解析法で配列を決定する。 ４ １つの又はそれ以上の適当なペプチド断片の配列又は該
断片の部分的配列が解析されたら、それらをコードする
ことができるＤＮＡ配列を調べる。 遺伝子］−ドは分解していくために、１つのアミノ酸を
コード化するのに１つ又はそれ以上の］トンが使用され
ることもあり、その各々がＴＢＰ−■ペプチド断片を」
−ドすることができる１つ又はそれ以上のオリゴヌクレ
オチドを産生ずることもできる、（ジェイ・デイ−・ワ
トソン（Ｊ、　０Ｗａｔｓｏｎ）　、遺伝子の分子生物
学（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｂｙ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｇｅｎｅ　）　、第３版、ダブリュー・１−・ベンジ
ャミン社（Ｗ、　Ａ、　Ｂｅ１ｌｌｊａｌｌｌｉｎ）　
、メンロパーク（Ｈｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ）　、カリフォ
ルニア、３５６−３５７頁（１９７７年））。しかし遺
伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有
するのは、この集団のうち１つのみである。集団の中に
このヌクレオチド配列が存在すること、及びたとえこの
集団に他のものが存在してもＤＮＡをハイブリダイズす
ることができることにより、ペプチドをコードする遺伝
子をクローン化するの５ に１つのオリゴヌクレオブトを使用するのと同じ方法で
、このオリゴヌクレオチドの分画していない集団を使用
することができる。Ｔ　Ｂ　Ｐ　−１遺伝予断片をコー
ドすることかできる「最も可能性の高い」オリゴヌクレ
オチド又はオリゴヌクレオチドの集団（アール・ラーゼ
（Ｌａｔｈｅ、　１１．　　）ら、ジャーノールオブエ
レキュラーバイオロジー（Ｊ。 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）第１８３巻、１−１２頁（１
９８３年）に記載されている［」トン使用規則］　（”
Ｃ０ｄＯｎ　ｕｓａＱｅ　ｒｕｌｅｓ　＋＋　）　）を
使用することにより、ＴＢＰ−１又は少なくともその一
部をコードする「最も４）能性の高い１配列、又はこの
ような配列の集団をハイブリダイズすることができる相
補的オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの集団
の配列を四定することができる。次にこのような相補的
配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、プローブ
として使用して、ＤＮＡライブラリーから本発明の［Ｂ
Ｐ−■をコードするＤＮＡ分子を同定し単離する（ティ
ー・マニア７−　イス（Ｈａｎｉａｔｉ３．■、）ら、
モレキュラーク口−６ ニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ　）　、ｍｌ−ルドスブリングハーバー出版（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）　、］
　−ルドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ）、ニュー］−り（１９８２年））。 本発明の１つの態様において、１−　Ｂ　Ｐ−ＩＩの遺
伝子はストリンジャント（５ｔｒｉｎＢｎｔ　）な条件
下の］〇ニーハイブリダイゼーション法により単離され
る。核酸のハイブリダイゼーシ」ン法は公知であり、例
えばティー・マニアｉイス（Ｈａｎｉａｔｉｓ。 Ｔ、）ら、モレキュラークローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　　Ａ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　　（前述）や、
ビー・デイ−・ハイムズ（Ｈａｙｇ＋＋ｅｓ　Ｂ、　Ｔ
、）ら、核酸ハイブリダイゼーション二ノラクテイカル
アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ　：　Ａ　ＰｒｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒ
ｏａｃｈ　）　、アイアールプレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ　）　、オックスフォード、イングランド（１９８５
年）に開示されている。上記ヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチド１０−ブの集団とハイブリダイズさせること
により、７ ＣＤＮＡ又はゲノムライブラリー中のこのようなハイブ
リダイゼーションが可能なＤＮＡ配列を同定することが
でき、次にこれを解析して、これらがとの程度まで本発
明のｌ−Ｂ　Ｐ　−ＩＩの」−ド配列を含有しているか
を決定づ−ることができる。 次に当業者Ｎｌ公知の方法（マニアテイス（Ｈａｉａｔ
ｉＳ　）ら、前述）で適当に作成した発現ベクター中に
陽性のり１］−ンのｌ）　Ｎ八を挿入する。 二重鎖ＤＮＡは、ホモポリメリックフィリング法（ｈｏ
ｍｏｐｏｌｉｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｏ　）　、又は
合成１）　Ｎ　Ａリンカ−又はプラント末端結合法を用
いる制限結合法ににす、プラスミツドベクターに結合さ
れる。 ＤＮＡ分子を結合させるのにＤＮＡリガーゼが使用され
、アルカリ性ホスノ７ターピで処理して好ましくない結
合を連番ノる。 目的の蛋白を発現するには、発現ベクターは遺伝子の発
現と蛋白の産生を可能に覆るために、に１的の蛋白を＝
１−ドするｌ）　Ｎ　Ａに結合した、転写及び翻訳制御
情報を含む特ｙ−的なヌクレオチド配列を含有していな
Ｃノればならない。まず第一に遺伝８ ｆが転写されるために、ポリメラーゼが結合しており従
って転写過程を開始させる、ＲＮＡポリメラーゼに認識
されるプロモーターが先行していなければならない。こ
のようなプロモーターは種々のものが使用されており、
これらは異なる効率（強いプロモーターと弱いプロモー
ター）で機能し、原核生物と真核生物で異なる。シャイ
ン−ダルガル／　（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配
列（ＳＤ配列）のようなりボゾーム結合部位を使用する
ことにより、原核生物において高レベルの遺伝子発現を
達成することができる。真核生物宿主細胞では、宿主細
胞の性質により、異なる転写及び翻訳制御配列を使用す
ることができる。これらはウィルス（例えばアデノウィ
ルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルス（Ｓ
ｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ）など）由来のこともあり、調
節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に
関連している。その例としてはヘルペスウィルスのＴＫ
プロを一ター、ＳＶ４０アーリープロモーター、Ｍ母の
ｇａｌ　４遺伝子プロ王−ターなどがある。遺伝子の発
現が調節でき９ るように、抑制と活性化ができる転写開始調節シグナル
を選択することもできる。 シグナルペプチドと機能的に結合している転７１及び翻
訳調節シグナルのヌクレオチド配列が先行する、本発明
のＴ　Ｂ　Ｐ−Ｈのアミン、酸配列を含む蛋白を］−ド
するヌクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子を、［１的の
遺伝子配列を宿主細胞染色体に取り込むことができるベ
クター中に挿入する。 発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１
つ又はそれ以上のマーカーを導入することによっても、
染色体中にＤＮＡを安定的に取り込んだ細胞を選択する
ことができる。 好適な態様において、導入されたＤＮＡ配列は、受容宿
主細胞中で自己複製可能なプラスミツト又はウィルスベ
クターの中に取り込まれる。原核生物及び真核生物プラ
スミツトは文献中で公知である。特定のプラスミツドや
ウィルスベクターの選択に重要な因子は、ベクターを含
まない受容細胞からベクターを含む受容細胞を認識し選
択することの容易性；特定の宿主細胞中での目的のベク
タ０ −のコピー数；そして異なる種間でベクターを「シャト
ル」　（行き来）させることが好ましいか否かというこ
とである。 作成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（ｓ））を含有Ｊるベクタ
ー又はＤＮＡ配列が発現用に調製されたら、ＤＮＡ作成
物を任意の方法で適当な宿主細胞中に導入することがで
きる：形質転換、トランスフ１クシコン（ｔｒａｎｓｒ
ｅｃｔｔｏｎ＞　、結合（ＣＯｎｊＬＩ（ｌａｔｉＯｎ
　）　、原形質融合、エレクトロボレーシコン（ｅｌｅ
ｃｔｒ。 ｐｏｒａＮｏｎ）　、リン酸カルシウム沈澱、直接マイ
クロイフジ１クシ］ン（ｄｉｒｅｃｔ　ｍ１ｃｒｏｉｎ
ｊｅｃｔｉｏｎ　）など。本発明で使用する宿主細胞は
、原核生物でも真核生物でもよい。好適な原核生物宿主
細胞としては、大腸菌、バシルス、放線菌、シュードモ
ナス、ザルモネラ菌、セラチア菌などがある。最も好適
な原核生物宿主細胞は大腸菌である。このような条件で
は、蛋白はグリ〕シル化されない。 原核生物宿主細胞は発現プラスミツト中のレプリコンや
調節配列に対して融和性がなければならない。蛋白分子
に対する翻訳後の改変（正しい折り１ 畳み（ｔｏＩｃｌｉｎｏ　）と正しい部位でのグリ−１
シル化）を可能にするため、哺乳動物細胞（例えばヒト
、ナル、マウス、チーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
）は、好適な真核生物害１−細胞である。 酵母細胞もグリ：］シル化なとの翻訳後の改変が可能で
ある。 ベクターの導入後宿主細胞を選択培地で１ｔ！１１１ｔ
１させて、ベクター含有細胞の増殖を選択覆る。りＤ−
ン化遺伝子ＤＮＡ配列の発現にＪ、す、目的のｒ　Ｂ　
１）−ｎ又はその断片が産生される。次に本明細書に記
載の精製法又は他の従来法〈例えば抽出、沈澱、クロマ
トグラフィー、電気泳動なと）により、発現蛋白を単離
し精製する。 本発明の蛋白に優先的に使用される精製法は、産生後ゲ
ルマトリックス中に同定化された抗ｒ　Ｂ　Ｐ　−ＩＩ
モノクローナル抗体を使用するアフイ二７−イク口マト
グラフィーである。組換え蛋白を含む不純物調製物をこ
のカラムに通す。特異的抗体により蛋白はカラムに結合
し、不純物は通過していく。洗浄後ｐＨ又はイオン強麿
を変えてゲルか２ ら蛋白を溶出する。 本明Ｉｌｌ書における「塩−１という語は、当業者に公
知の手段で形成された蛋白分子のカルボキシル基の塩及
びアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩
としては、無機塩（例えばナトリウム、カルシウム）、
及び有機塩基（例えばトリエタノールアミン、アルギニ
ン、リジン）との塩がある。酸付加塩としては例えば無
機酸との塩や有機酸との塩がある。 本明細書における「官能基誘導体」とは、当業者に公知
の方法で、残基の側鎖又はＮ末端又はＣ末端上に存在す
る官能基から調製される誘導体を意味し、薬剤として許
容される限り（即ち蛍白の活性を破壊せず、これを含有
する組成物に毒性を与えない限り）本発明に含まれる。 これらの誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エス
テル又はアミド、及びアシル分子（例えばアルカノイル
基又はカルボサイクリックアロイル基）と形成される遊
離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又は遊離ヒドロキシ基
のＯ−アシル誘導体がある。 ３ 「前駆体」とは動物及びヒトの体の中で１’ＢＰ■の前
にあってｌ−１３Ｐ　−１１に変換される化合物である
。実質的に精製された蛋白の「活性画分」としては、本
発明は蛋白分子のみのポリペプチド鎖の断片又は前駆体
、又はぞの画分がＴ’　Ｎ　Ｆ−の細胞に封する細胞毒
性作用を阻害する能力があり、及び／又はその長期の右
詰な効果を維持する能力がある限り、そこに結合した残
基（例えば糖残基又はリン酸塩残基、蛋白分子又は糖分
子自身の凝集物）を含む。 本発明はさらに１−ＢＰ＝Ｉ［とその１（ａｂ）ｌｔｉ
片、その塩、官能基誘導体、及び／又は活性画分（前記
で定義したもの）に対Ｊる抗体に関する。 これらの抗体はＩ　Ｎ　Ｆの活性の調節のための新しい
手段を与え、細胞の特異的１ナブセツトに対するＴＮＦ
の作用（抗体の分子型により異なり、具体的には抗体の
結合価により異なる）を阻害したりＴ　Ｎ　Ｆの効果を
模倣するために使用される。１価の抗体（例えばＦ　（
ａｂ＞断片）は阻害作用を示し、多価のｂのはｒＮＩ＝
の作用の少なくとも一部４ を模倣することができる。従ってこれらは細胞に対する
ＴＮＦの作用を模倣したり阻害したりするのに使用する
薬剤として過当である。 本発明の抗体のＴＢＰ−ＩＩとの官能基相ｎ作用は、あ
る疾患における生体中の細胞によるＴＢＰ■の過剰又は
過小な産生の検出のための免疫測定法（例えば放射免疫
定量法、ＥＬＩＳＡなど）の新規な診断手段を与える。 即ち異なるタイプの癌又は自己免疫疾患（例えば全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ））の患者の血清中のＴＢＰ
−ＩＩの濃度はこうして測定される。逆の方法により生
体中で内因性に産生きれるＴＢＰ−１に対する抗体は、
精製Ｔ　Ｂ　Ｐ−［を使用して測定できる。抗体がＴＮ
Ｆの作用を模倣し１＝り阻害したりできることはある柿
の疾患の病態に非常に深い関係があるため、このような
疾患で産生される自己抗体を検出することは、非常に重
要である。 抗体はポリクローナル抗体でも（ツクローナル抗体でも
よい。またそれらはウサギ、マウス、又は他の動物、又
はそれらに由来する培養組繊細胞、３５ 又はヒトの細胞由来の産生物でもよい。これらは天然の
抗体と同じ形か又はキメラ分子（ヒ１〜の抗体と動物の
抗体の組換えにより作成される）の形、又は抗体を治療
に最ら適した形にして、組換えＤＮＡ法により産生され
る。 抗体の調製には、精製したＴＢＰ−Ｉ又はその断片（例
えばＮ末端缶口配列）の既知の配列と向−の、１つ又は
それ以ｊ〜の合成ペプチドを使用して動物を免疫する。 別の可能性はｉ　Ｂ　Ｐ−ＩＩのＩｌｉ片の配列をコー
ドするヌクレオチド配列の１つを、ブ［１デインＡをコ
ードする遺伝子と融合させて、融合プロティンΔ−１−
）３　Ｐ−１［遺伝子を大腸菌中で発現させ、融合缶口
をＩｏＧセファ［１−スカラムのアノイニテイクロマト
グラフイーで精製し、これを用いて動物を免疫り−るこ
とである。 本発明のモノクロ−ノール抗体は従来のハイブリドーマ
技術により調製される（コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、
ネーチｖ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、第２５６巻、４９５
貞（１９７５年）、コーラ−（にｏｈｌｅｒ）ら、ヨー
Ｏビアンジャーナル第１イミュノロジー（口１ｒ、Ｊ６ Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、第６巻、５１１頁、（１９７６
年））。 免疫後稗臓細胞を単独で又は免疫動物のリンパ節細胞と
共に単離し、適当なミエローマ細胞株と融合させる。融
合後得られたハイブリドーマ細胞をＨＡｒ培地中で選択
的に維持した後クローン化する。次にこの選択により得
られたハイブリドーマ細胞を測定して、ＴＢＰ−ＩＩに
結合可能な抗体を分泌するクローンを同定づ゛る。同定
後、［１的のクローンを、浮遊培養液として、又は適当
な宿主マウスの腹膜に注射して腹水として大間に増殖さ
せる。次にハイブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体を単離し精製する。 前述したように、モノクローナル抗体は固定させて、免
疫吸着カラムを使用するアフイニテイクロマトグラフイ
ー精製法でのＴＢＰ−Ｉｆの精製に使用できる。 ＴＢＰ−Ｉとその塩、これらの官能基誘導体、前駆体、
活性画分、及びこれらの任意の混合物は、哺乳動物にお
けるＴＮＦの有害作用に拮抗する（即ち内因性に産生さ
れたか外因性に投与された７ か又は過剰のＴ　Ｎ　Ｆのある状態の治療に使用できる
）ことが示唆されている。これらはまた低濃度で及びｒ
−Ｎ　Ｆとの混合物として、ＴＮＦの有益な作用を長期
間に持続させる担体として使用できることも示唆されて
いる。 本発明はさらに、薬剤として￥１容される担体と共に、
活性成分として本発明のより　Ｐ　−ＩＩとその塩、こ
れらの官能基誘導体、前駆体、活性画分、及びこれらの
任意の脱合物を含有する薬剤組成物に関する。この組成
物は内因性Ｔ’　Ｎ　ｌ−の過剰産生がある状態（例え
ば敗血症ショック、悪液質、対宿主移植片反応、リウマ
チ様関節炎なとの自己免疫疾患）に使用できる。その投
与法は類似の薬剤について一般的に受は入れられている
方法を使用することができ、治療すべき状態により異な
る（例えば敗血症ショックの場合は静脈内に、リウマチ
様関節炎の場合は、例えば膝に１４所注射で、又は注入
により連続的に投与される）。この組成物はまた、過剰
量の１−Ｎ「の外因性の投与によるＴＮＦ中毒に使用す
ることもできる。該組成物は８ ＴＮＦを含有してもよく、この場合ＴＮＦは長期にわた
って調節された速度で放出される。 本発明の薬剤組成物は、蛋白又はその誘導体を薬剤とし
て許容される担体、安定化材、賦形剤と混合し、服用さ
れる形（例えば服用バイアル中で凍結乾燥）で、投与用
に調製される。投与される活性化合物の量は、投与方法
、治療すべき疾患、及び患者の状態により異なる。リウ
マチ様関節炎の炎症性状態で局所投与に使用する量は、
敗面症ショックで静脈内注入する量より、体重当りの吊
は少なくてすむ。 以下の非限定的実施例で本発明を説明する二友凰■」 １．１　　尿濃縮物の調製 健常な男性又は健常な閉経後の女性から集めた２００リ
ツトルの尿のプールを、孔径０．４５μ瓦のぺり］ン（
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）膜でマイクロ濾過した。分子量カッ
トオフが１０ＫＤａのペリコン（Ｐｃｌｌｉｃｏｎ）膜
を用いて濾液を限外濾過し、最終液恒を５００ｆｄとし
た。１ｍＨのベンズアミジンと９ ０．１％のアジ化ナトリウムを含有ジるリン酸緩衝化生
理食塩水で濃縮物を透析した。 組換え１　Ｎ　Ｆ−αを７．２１Ｒｇ／ｄにしＩＣ後、
０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰ　１３８と平衡
化さけ、７）イゲル１０　（３，６から０．５７！のピ
ーズ）に結合させた１１段階１．ＩＩの尿蛋白の濃縮試
料２５０ｍを、４℃で流速０．２−０．３ａｅ／分で、
Ｔ　Ｎ　Ｆを固定しＩこビーズから作成したカラムにか
りた。Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄して結合しなかった蛋白を除去
し、次ニ２５　ｍＨり、Ｔ−ン酸、１００ａＨＮａｃｌ
、０．０２のアジ化ナトリウムの溶液（ｐＨ２，５）を
流して、結合した蛋白を溶出させた。溶出した蛋白の特
異的生物活性（ＴＮＦ毒性の阻害）は、尿の粗蛋白の約
２００倍であった（表１）。Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ
　Ｅ分析では溶出液中のほとんとの蛋白は、見かけの分
子置駒３０，０００：）２，０００の甲−の広いバンド
として移動した。 　０ １．３　　逆相高速液体クロ７トグラフイー（ＨＰ　ｌ
−Ｃ） 段階１．２のアフイニテイ精製した蛋白を、アクアポア
（八ｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ　３００カラム（４，６Ｘ
３０履、ブラウンリーラボズ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ｔａ
ｂｓ））の逆相高速液体クロマトグラフィーでさらに分
画し７ｊ：０．３％トリフルオ［１酢酸水溶液（緩衝液
Ｆ）でまず平衡化させた後、フルオレスカミン検出系で
安定なベースラインが得られるまで洗浄した。段階１．
２のアフィニテイＴＮＦカラムから溶出した活性画分の
プールをこのカラムにかけ、緩衝液Ｆ中のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配を用いて０．５Ｉｔｇ／Ｉｎ！！、の
流速で３分間溶出させた後、８０％アセトニトリルでカ
ラムを１５分間洗浄した。 ０．５ｄの画分を集め、図１に示すように蛋白含１（−
）、生物活性（■）について調べた（−ｍ−は緩衝液Ｆ
中のアセトニトリルのＩＩ匪勾配による溶出を示す）。 Ｔ　Ｂ　Ｐ　−Ｉ用に開発されたバイオアッセイを用い
て生物活性を測定した。これはシクロヘキシミ１ ド（ＣＭ　Ｉ　）感作細胞に対する−１−　Ｎ　Ｆの細
胞毒性作用と、ニュートラルレッド摂取法（ｎｅｕｔｒ
ａｌ−ｒｅｄ　ｕｐｔａｋｅ　ｍｅｔｈｏｄ　）　　（
デイ−・ワラシュ（Ｗａｌｌａｃｈ、　Ｄ、　）　、ジ
ャーナルオブイミュノ０ジー　（Ｊ、　ｌｍｌ１ｌｕｎ
ｏｌ、　）第１３２巻、２４６４−２４６９負（１９８
４年））による定量法に基づく。 これは本発明においてＴ　Ｂ　Ｐ　−ＩＩの活性を追跡
するのに使用される。 蛋白の存在について試験１−る試料を、ダルベツコ−の
改変イーグル最小基本培地（Ｄｕ　Ｉ　ｂｅｃｃｏ　’
　ＳＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａ
ｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　）（ＤＭＥＭ
＞で連続的に２倍希釈し、４０Ｕ／ｒｄの°ＴＮＦ−α
と４００μＳ？／ｄのシクロへキシミド（ＣＭＩ）を含
有する同じ培地を等量加えた。 細胞に対する一Ｉ　Ｎ　Ｆ−αの最終濃度は、５Ｕ／ｄ
でＣＨＩのそれは５０μｇ／ａｆｆｉであっＩｃ　６９
６穴の平底マイクロタイタープレートに、１００　　μ
Ｊ！（７）ＤＭＥＭ−Ｃ８（５％ウシ胎兇血清と５％子
ウシ血清を含むＤＭＥＭ）と共にマウスＡ９細胞を添加
した（ウェル１個当り　１．５×２ １０４個の細胞）。 一連続希釈した蛋白ＴＮＦ−α−ＣＨＩ況合物を１００
μｍずつ各ウェルに入れ、細胞をさらに１４時間インキ
ュベートした。 細胞をニュートラルレッドと２時間インキュベートして
、過剰の色素を洗い流し、ソレンセン（５ｏｒｅｎｓｅ
ｎ　）のクエンＭ緩衝液−エタノール混合液で細胞が取
り込んだニュートラルレッドを抽出し、これをマイクロ
エライザオートリーダーで５７Ｑｎｍで比色定量した。 ＴＮＦ死滅に対する統計的に有意な （ｐ＜０．０５）防御を与える希釈率を、１　　ｔＪ／
ｄ　　のＴＮＦ阻害活性と定義した。 表１：　　ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−１ＩＩの精製精製段階 蛋白　　保護活性 比活性 精製 尿性粗蛋白 ＩＩｔｆＩ　　　中位　　　％　　中位累／ｍｌ　　倍
率９４００　１１１２００　　　１００　　　１２．４
アフイニテイ 精製 流出液 溶出液 ９．３００　　　検出限界以下 ０．３６ ９８．６００ ８４．２ ２７３８００ ２０００ 逆相トＩＰＬｃ 合計　　　　０．２１１　　３１．２００１−ＢＰ−Ｔ
　　Ｏ，０７０２２，３００−ＴＢＰ−Ｉ　　０１１４
７　　８．９００６６ １９、Ｏ ７，６ １４３４００１１，６００ ３１８６００ ０７００ 累　１単位の防御活性は、その存在下で１”ＮＦ細胞毒
性作用に対する蛋白の防御作用の測定条件下で生存しＣ
いる細胞の数が２侶になる、’Ｔ’ＮＦ結合蛋白の量と
定義した。 ３ ４ 図１に示すように活性蛋白は、約２７％のアセトニトリ
ル（ＴＢＰ−Ｉ）と約３１％のアセトニトリル（ＴＢＰ
−Ｉ［）に対応する画分に２つの明瞭な蛋白のピークと
して、ＨＰＬＣカラムから溶出されることが明らかにな
った。両方の蛋白ともＴＮＦ毒性に対して防御効果があ
ったが、ＴＢＰ■の非活性はＴＢＰ−Ｉの非活性よりも
低かった（表１）。 アイ・オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ、　　Ｉ　）らの方法（
ヨーロピアンジャー天ルオグヘ７トロジ−（Ｅｕｒ、　
Ｊ。 １１ｅｍａｔｏ　Ｉ　、　）第４２巻、２７０−２７５
頁（１９８９年））に従い、放射標識−ＴＮＦの細胞へ
の結合に対するＴＢＰ−ＩＩの阻害効果について調べた
。 ＴＢＰ−Ｉと同様に、ＴＢＰ−ＩＩは １２５１−ＴＮＦ−αと共に細胞に適用した時のみ１２
５１−ＴＮＦ−αの細胞への結合を減少させ、ＴＢＰ−
ＩＩをまず細胞に適用しＴＮＦ−αの適用前に除去した
時は効果がなかった。これは、細胞へのＴＮＦ−αの結
合の阻害は１−　ＢＰ−Ｉ［の細胞への作用によるもの
ではなく、Ｔ　Ｂ　Ｐ−１と５ ＴＮＦ−αのなんらかの相互作用を反映するものである
ことを示している。 蛋白の放（ト）ｔｌＲ識調製物を使用して、固相測定法
でＴＢＰ−Ｉと１−１３　Ｐ　−Ｉｆの結合活性につい
て調べた。いずれもＴＮＦ−αに結合し、この結合は過
剰量のＴ　Ｎ　Ｆ−αで競合され、効率は低いがＴ　Ｎ
　Ｆ−βとも競合した。しかしこれは試験した他のいく
つかのザイトカイン（１ｍ−１，１１−６、ＩトＮ−ガ
ンマ、表２）とは競合しなかった。 　６ 表２　１’ＮＦ ＴＢＰ結合に対する 競合のために 使用した蛋白Ｘ ヒトｌ”ＮＡ−α ヒトＴＮＡ−β １１−１α １−６ ＩＩＮ−ガンマ ＴＢＰ−Ｉ Ｔ’ＢＰ−ＩＩ αへの”ＴＢＰ ■とＴＢＰ ■の結合 １２５１　　ＴＢＰ−４１２５１ＴＢＰ−ＩＩ〈結合し
た（Ｊ）Ｍ） ２７７（）０　（−１−２０００） １０５０　（±１４０） ２１０００　（±８５０） ２８１００　（±４６０） ２７０５０　（±５７０） ２８０５０　（±１０５０） １９００　（±１１０） 検出されず １１６３４　（±１２３０） ２４００　（±１１４） ６２４０　（±２３０） １１８４０（±８９０） １８５７０　（±１１２０） １８４７０　（±１４３０） ２２４０　（±１６０） ２００５　（±１５０） Ｘ蛋白はづべて１０μ９／ａｆの濃度で使用した。 ７ １．４　３ＤＳ−ＰＡＧＥ ニー・ケー・リームリ（Ｌａｅｗ＋ｌｉ　Ｕ、に、）ら
（ネーチ１＞　−（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻、６８０
頁（１９７０年））の方法に従い、精製の結果を追跡す
るために、ドデシル硫酸ノー１ヘリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。図２
八では、ア゛ノイニティ精製段階の還元条件下での分析
結果が示しである：レーン１未分画尿性蛋白；レーン２
−低ｐＨ緩衝液によりＴＮ１カラムから溶出した蛋白１
１図２Ｂでは、逆相高速液体クロマトグラノィーから溶
出りる活性画分の還元条件下での分析結果が示しである
。試料ヲ、６％ＳＤＳ　（Ｗ／Ｖ　）　ト１５％　Ｖ／
Ｖβメルカプトエタノールを含有する３×濃縮試料用緩
衝液と混合し、１２％アクリルアミドゲルにかけｋ　（
レーン１−４　：　ＴＢＰ−Ｉ　；レーン５−９：Ｔ　
Ｂ　Ｐ−ＩＩ　）。分子量のＩａ単品どじで分子量マー
カーの混合物（αラクトアルブニン１４．４ＫＤａ。 大豆トリプシンインヒビター２０．１ＫＤａ、カルボニ
ックアンヒドラーゼ３０ＫＤａ、Ｊバルミン４８ ３ＫＤａ、ウシ血清アルブミン６７　ＫＤａ　、ホスホ
リラーゼｂ９４ＫＤａ）を使用した。試料用緩衝液のブ
ランクをレーン１０に入れた。ゲルに１６０ボルトの電
圧をかり、蛋白バンドを銀染色により視覚化した（ビー
・　アール・オークレイ（Ｏａｋｌｅｙ、　Ｂ、　Ｒ，
）ら、アナリＴ−１’カルバイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１０５巻、３６１頁）。 １．５　Ｎ末端配列解析 本発明の実質的に精製したＴ’　Ｂ　Ｐ−１試料（１−
５μび、各５０−２００μｍｏりを、前処理した、ビオ
ブレン（ｂｉｏｂｅｎｅ　）−被覆ガラスファイバーデ
ィスクに適用した。乾燥ディスクを、オンラインドＩＰ
Ｌｃ　　ＰＴＨ−アミノ酸分析ｍｌ（モデル１２０）と
データ取得処理装置モデル９００を備えた自動パルス化
液体気体相マイクロシークエンサー（モデル４７５）（
いずれもアブライドバイオシステムズ社（＾ｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂ１０３ｖＳｔｅｌＳ　Ｉｎｃ、）、フォスター（
Ｆｏｓｔｅｒ）市、カリフォルニア、米国）中で、反復
サイクルエドマン分解を行った。コン９ ピュターより得られた配列を生データと比較し、必要な
場合は補正した。配列データを確認するために全部で３
回異なる実験を行った。最初の収率は４０％以上であり
、調製物中の主要屯白（３０ＫＤａバンド）は得られｌ
ｃ配列に関連していることを示していた。 画分２７の蛋白（図１）のＮ末端配列分析から以下の配
列が得られた： Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。 Ｔｙｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−ｐｒ。 Ｇ　ｌ　ｙ−８ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｃｙｓ−△ｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｕ−王ｙ　ｒ　−’ｒ　ｙ　ｒｓ
ｐ と、より多量のアミノ酸３個分短い配列：Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−ｒｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｇ
　Ｉ　Ｖ−３ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒそしてさらに多量の、末
端アミノ酸が２個欠如した配列 Ｐ　ｈ　ｅ−Ｔ　ｈ　ｒ−Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｔ’　ｙ　ｒ
−△１ａＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−８ｅｐ０ １−　ｈ　ｒ　０ 一方画分２８では、配列　Ｖａ　ｌ　−Ａ　Ｉ　ａＰｈ
ｅ−１’ｈｒ−Ｐｒｏ−、、、が主要なものであり、さ
らに低１度で短い配列ｐｈｅ−Ｔｈｒｐｒｏ−，，，が
、そしてさらに低ａ度で配列Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−，，がＩ
Ｉｉ　ラレｔｃ。 精製１’ＢＰ−［の異なるバッチから得られた蛋白の、
端の切れ方の最も少ない配列は以下のものであった： Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｎ＝Ｖａ　ｌ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｐｈ
ｅ　−Ｔ　ｈ　ｒ−ｌ）　ｒ　ｏ−１’　ｙ　ｒ　−Ａ
　ｌ　ａ　−Ｐ　ｒ　。 Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−ＬＴｈｒ−ｃｙｓ−
△ｒｇ−１ｅｕ−Δｒｇ−Ｇｌｕ”ｒｙｒ−Ｔｙｒ−Ａ
Ｓ＋）−Ｇｌｎ−ＴｈｒΔＩ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｍｅ　
ｔ−ｃｙｓ−ｃｙｓ実施例２：ＴＢＰ−Ｈのトリプシン
分解ペブチ゛の調製 精製ＴＢＰ−ｎ　（１８０μ３）をピー・シー・アント
リユースとジエイ・イー・デイクソン（Ａｎｄｒｅｗｓ
、　Ｐ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ、　Ｊ、　Ｅ、　）
のｂ法１ （アナリテイカルバイＡケミストリー（八［１ａＩＢｉ
ｏｃｈｃｍ、　）第１６１巻、ｂ２１−ｂ２８頁（１９
８７年））に従い、還元しアルキル化した。次に還元ア
ルキル化試薬の残渣を除ムするｌ〔めにアクアボア（八
ｑｕａｐｏｒｃ）　ＲＰ　３００カラム（実施例１．３
を参照）にかけた。次に精製Ｔ　Ｉ３　Ｐ　−ＩＩを、
ｐＨ８，０でトリプシンで一晩消化（呈賀／酵索比は２
０＋１）して断片化した。百られたペプチドを０．−１
８シンクロパツク（５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ”　）ＲＰ−
Ｐカラムの逆相高速液体り１］マドグラフイで￥ｉ４製
しＦＣＱ画分４４，５０．５３．５３’６０．８４の６
個のペプチド配列を、実施例１．５のように決定し、そ
れを図３にポしである。 実施例３　：　Ｔ　Ｂ　Ｐ−Ｈに対重るボリク［１−ナ
ル抗体の調製 ウリーギの免疫のために、完全フロインドアジュバント
の懸濁液として２０　ＩＩ　’ｊの１−　）３１−’　
−ＩＩを皮下に注射した。３週後、不完全７０インドア
ジユバントの懸濁液としてもう一度筋肉内に注（ト）し
、次に１′ＩＭ置きにＰ　Ｂ　Ｓの溶液として２回皮下
に投２ 与〔）だ。最後の免役後１０日後にウサギを放血させた
。 ウサギの血清から免疫グ［１プリンを精製するために、
１０ａｉ！の血清に飽和硫酸アンモニウムを最終濃度が
５０％飽和になるように加えた。４℃で一晩インキュベ
ー１−１．遠心分離により免疫グロブリンを沈澱させた
。ペレットを５０％飽和硫酸アンモニウムで２回洗浄し
た後、Ｏ、’　０２％のアジ化ナトリウムを含有する１
０ＰＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）で０１溶化させた。 次に溶液をホウ酸アザイド溶液で充分透析した。、そし
てこれをＨＰ　Ｌ　Ｇ七ノーＱカラムでクロマトグラフ
ィーをして、上記ホウ酸アザイド溶液中のＯ−５００ｍ
１４ＮａＣＩの濃度勾配により、蛋白を溶出しＩＬ　６
免疫グロブリンは塩濃度的７０ｍＨＮａ１ｌで溶出した
。 Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ＩＩに対する抗血清は１：６４００希釈
２５ で、ｔＪ−９３７細胞に対する　　１−ＴＮＦの結合を
約５０％抑制した。１１じ条件でウサギでＴ　Ｂ　Ｐ−
ＩＩの抗血清を産生させ、ウェスタンプ３ ０ット分析により両抗血清の交差反応性を調べた。 その結果”ｒ　Ｂ　Ｐ　−１とｒ　Ｂ　ｌ）　−１［は
免疫学的に異なっていた：各抗血消は、抗血清の作成に
使用したｒ　Ｂ　Ｐのみを有意に認識した。 同様にＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ△で抗血清と缶口の相Ｔ１作用を
調べると、Ｔ　Ｉ３１）　−ｉの抗血清は１　：２！ｊ
、ｏ。 Ｏまでの希釈で”ｌ’　１３　Ｐ−１と反応するが、Ｔ
　Ｂ　Ｐ■とは１：１００の希釈でも反応しなかった。 。 図４はＴ　Ｂ　Ｐ　−ＩとＴ　Ｉ３　Ｐ　−ＩＩの抗血
清の２つの「１３Ｐに対する結合のＥＬＩＳＡの結末を
小している。１Ｆ３Ｐ−ｉに対するＴ　Ｂ　ｌ）　−ｎ
抗血清の結合（）丁１−３Ｐ−■に対するｒ　１３　＋
）　−ｉ抗血清の結合（）、ＴＢＰ−Ｉに対するＴ　Ｂ
　Ｐ−Ｉｔ抗血清の結合（）、’ｌ−Ｂ１”ｌＩに対す
るＴ　Ｉ３Ｐ　−、ＩＩの抗血清の結合（）を、西汀ワ
ザビペルＡ４シダーゼ定量法の着色生成物の吸光度で示
しである。 ＢＳ八で被覆したつ１ルに抗体を適用しだ対照試験の読
みを引いである。（図２で見られるＴＢＰＩに対するＴ
ＢＰ−ｎ抗血清の若干の結合は、免疫に使用したｒ　Ｂ
　Ｐ−１［の調製物中に少量の４ ｒ　１３　Ｐ　−Ｉが存在１．ていたことによる、少量
のＴ　Ｉ”３　Ｐ　−Ｉ抗血清による抗血清の汚染に起
因していることが証明されるであろう。） Ｔ　Ｂ　Ｐ　−ＴとＴ’　Ｂ　Ｐ−１１に対する抗血清
を、０．５％ＢＳＡと０．１％のアジ化ナトリウムを含
有するダルベツコ−のバランス塩溶液（ＰＢＳ＋＞（Ｐ
［３Ｓ／ＢＳ△）で希釈した後、直接、又は競合実験で
ｒ　１３　Ｐの試料と共にインキュベートした後、Ｈｅ
１ａ、　Ｍ　ＣＦ　７、Ｋ２Ｏ２及びＵ９３７９３７細
胞験細胞に２時間適用した。 次に細胞を洗浄しＴ　Ｎ　Ｆの結合について調べた。 図５は放射標識１−Ｎ「のＵ９３７、Ｋ２Ｏ２、Ｈｅ１
ａ、　Ｍ　Ｇ　Ｆ　７細胞への結合に対】る、ＴＢＰｌ
（Ｏ）とＴ−ＢＰ−１ｆ（ロ）の抗血清による阻害を示
している。抗血清が存在しない場合の真の結合（１００
％）はＵ９３７細胞は２５００Ｃ１）Ｒ１゜Ｋ５６２細
胞は１５００ｃｐｍ　、　Ｈｅ１ａ細胞は２４００ｃｐ
ｍ、ＭＣＦ７細胞は１ｌ１００ｃｐであった。 ５ １−　Ｎ　トの細胞への結合を妨害し：それぞれ細胞株
にまり程疫が異なることを示している。ｌ−Ｂ　ＰＩに
対する抗血清はＨｅ１ａ細胞とＭＣＦ７細胞に対する［
Ｎ１：の結合を有効に阻害するが、１−　Ｎ　ＦのＵ９
３７細胞への結合には全く効果がなく、ＴＮＦのに５６
２細胞への結合にはほとんど効果がない。逆にｉ　Ｂ　
Ｐ　−Ｈの抗血清はに５６２細胞とＵ９３７細胞に対１
−Ｎ１−の結合を有効に１０ツクＪるが、１ｌｃｌａ細
胞とＭ　ＣＦ　７細胞へのＴＮＦの結合は高濃度でのみ
阻害する。後者の細胞に対するＴＢＰの抗血清の効果は
、白油に純粋のＴＢＰｌと純粋の［Ｂ１０−■を加える
競合実験で、ＴＢＰ−Ｉの抗血清調製物中のＴＢＰ−Ｈ
に対する抗体の汚染に起因することが証明できた。 完全フ［１インドアジユバントの懸濁液として１μ９の
精製Ｆ　Ｂ　Ｉ）　−１［を、メスの１３ＡＬＢ／Ｃマ
ウス（８週令）の後ろ足に注射し、３週後不完全６ フ［１インドアジユバントで背中の皮下に注射した。 別にＰ　Ｒ３Ｓ中で皮下に１週置きに別の注射をした。 ＰＢＳ中９．０μ９の１−　Ｒ３Ｐ−Ｉで融合する前４
日（ｉ、ρ、）と３日（ｉ、ｖ、　）に最後の追加免疫
を行った。、　ＰＩＩｌ臓と融合パートナ−としての後
ろ足の局所リンパ球から調製したＮＳＯ／Ｍｒ細胞とリ
ンパ球を使用して融合を行った。ＨＡＴ、１５％ウマ血
清及び２／１ｇのゲンタンイシンを加えた１）　ＭトＭ
でハイブリドーマを選択した。ＴＢＰｌの抗血清を産生
するハイブリドーマを限界希釈法で畳ナブク［」−ニン
グし、腹水産生のためにプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ
）でプライムしたＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射した。硫酸
アンｔニウム沈澱（５０％飽和）により免疫グロブリン
を単離した後、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有Ｊ
る１”　Ｂ　Ｓで透析した。Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ△Ｇヒ分
析とクマシーブルー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）
による染色で推定した純度は約６０％であった。抗体の
イソタイプは重版のヒＬＩＳＡキット（アマージャム社
（Ａｗ＋ｃｒｓｈａｍ）　、英国）を用いて規定した。 ７ いくつかの陽性クローンを得て、さらに研究し性状解析
するためにサブクローニングした。単離したいくつかの
サブクローンのイソアイプと逆ＲＩＡでの１’　Ｂ　ｌ
）　−Ｉｔの結合を表３１こホす。 ８ １１０−２は、パスツールＴｉ＋究所のコレクションナ
ショナナール・ド・クリディール・ド・ミクロオルガニ
スム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄ
ｅＣｕｒｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｈｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｓ、　ＣＮＣＨ）　　（りゆド・トクテールル、７
５７２４パリ、ＣＥＤＥＸ１５．７５ンス（２５、ｒｕ
　ｄｕ　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｉｔｏｕｘ。 ７５７２４　　Ｐａｒｉｓｃｅｄｅｘ　１５．　Ｆｒａ
ｎｃｅ）　、１９９０年３月１２日、寄託番号はそれぞ
れ■−９２９と１−９２８）に寄託した。 ０ 免疫したマウスの血清中の抗ＴＢＰ抗体の濃度を推定す
るためと、ハイブリドーマによる抗体の産生をスクリー
ニングするために、この測定を行った。アフイニテイ精
製したヤギ抗マウスＦ（ａｂ）免疫グロブリン（バイオ
マコール（Ｂ　ｔ　ｏｍａｋｏｒ　）、イスラエル、０
．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中１０μｇ
／ａｔりで、ＰＶＣ９６穴マイクロタイタープレート（
ダイナチック社１ （Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　、１−２２０−２５＞を、４℃
で１２時間被覆した後、０．０５％ツイーン２０（シグ
マ社）と０．０２％のアジ化ナトリウムを含む＋Ｄ　Ｂ
　Ｓ中の０．５％ＢＳＡ　（ブ［ｌキング緩衝液）で、
３７℃で２ｈ間ブ【」ツクした。次に０．０５％ツイー
ン２０と０．０２％のアジ化ナトリ「ンムを含むＰＢＳ
（洗浄用緩衝液）で３回洗浄した。 連続希釈した血清試料とハイブリドーマ増殖培地の試料
（５０μｌ）を３７℃で２時間添加した。 ２５ 洗浄用緩衝液でプレートを洗い、穴に　　ｌ標識ＴＢＩ
”−Ｉ　（ブロッキング緩衝液中１０００００ＰＭ）を
加えた。３７℃でさらに２時間インキュベートした後、
プレートを洗浄し６穴に結合した標識物の量をガンマカ
ウンター中で測定した。 以十の方法に従い、アフィニティクロマトグラフィーに
よるＴ　Ｂ　Ｐ−ｎの精製のために、Ｔ　Ｂ　Ｐ■に対
する抗体が使用できる。内相放射免疫定量法で放射標識
抗原の結合量を試験することによ２ す、アフィニティクロマトグラフイー用のモノクローナ
ル抗体が選択できる。すべてのハイブリドーマの腹水を
、５０％飽和で硫酸アンモニウム沈澱した後、ＰＢＳで
充分透析しで精製した。 ＰＶＣ９６穴プレートを精製したモノクローナル抗体で
被覆し、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０（シ
グマ社）と０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ
でブロッキングの後、ウニ２５ ル（穴）を５０．ＯＯＯＣＩ）Ｍ　　　Ｉ　ｌ”ＮＦを
用いて３７℃で２時間インキコベートした。次にプレー
トを洗浄し、各ウェルに結合した放射能をガンマカウン
ターで測定した。結合能の最も高い抗体について免疫ア
フィニティクロマトグラフィーで性能を調べた。 樹脂としてポリアクリルヒドラジドアカ０−スを用いて
抗体を固定した。半端製した免疫グロブリンを濃縮し、
ウイルシエツクとミロン（Ｗｉ　１ｃｈｅｋａｎｄ　Ｈ
ｉｒｏｎ　）の方法（メソッズインエンザイモロジ−（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第３
４巻、７２７６負（１９７９年））で樹脂に結合させた
。 ３ この実験でＴＢＰ−Ｉ　（クローン１６．２０．３４）
に対する３種類のモノクローナル抗体を試験した。１１
ｄベツドの抗体カラムを作成した。使用前に溶出緩衝液
でカラムを１０回洗浄した（毎回洗浄後にＰＢＳで中和
した）。次にカラムに０．０２％のアジ化ナトリークム
を含むＰ　１３　Ｓ中の濃縮尿蛋白１２０Ｉｄをかりた
。カラムの流速は毎分０．２から０．３ｄに調節した。 次にＦを５０ｄのＰ　Ｂ　Ｓで洗浄した後、５ＱｉＨク
エン酸、ｐＨ２，５，１００ｍＨＮａｃｌ、０．０２％
のアジ化ナトリウムを含有する溶液で溶出した。１−の
画分を集めた。のせた尿蛋白、洗浄後の最後の部分（１
ａｅ）を取って、蛋白製置と、バイオアッセイによるＴ
ＢＰ−Ｉｆの活性を調べた。ヒドラジドアガロースに結
合した前後の蛋白の測定から、カラムに結合した免疫グ
ロブリンの両派７から１０〜／ｄアガロースの範囲であ
った。全ての蛋白の測定は、１００μｇＬ３ｓＡ／−を
含有する標準溶液と比較してマイク［１フルオレスカミ
ンの方法で行った。（ニス・スタインとジエイ・モジエ
フ４ （Ｓｔｅｉｎ、　Ｓ　ａｎｄ　Ｈｏ５ｃｈｅｒａ、　Ｊ
）　、メドッズインＴンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第７９巻、７−１６
真（１９８１年） 実施例８：抗Ｔ　Ｂ　ｒ−’　−１を　いの測定 健常人、癌患者、全身性エリテマトーデス患者そして妊
ｔＦＲ満期の妊婦の血清中のＴＢＰ−１［の濃度を、Ｔ
　Ｂ　Ｐ−ＩＩのモノクローナル抗体を被覆したプレー
トを用いるＥＬＩＳＡで測定した。各試料５０μｌを添
加し、３７℃で２．５時間インキュベートした後、ウェ
ルをＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０．０．０２％のア
ジ化ナトリウムで洗浄し、ウサギ抗Ｔ　Ｂ　Ｐ−ｎポリ
クローナル抗体を３７℃で２．５時間加えた。次にウェ
ルを洗浄しくアジ化ナトリウムなし）、ヤギ抗ウサギ西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を２時間加えた。 このインキュベート、洗浄の後、Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ緩衝液
を加え、３０分後６００　ｎｎ＋ｒ光学密度（０，Ｄ、
）を測定した。 ＥＬＩＳＡ法で測定した健常人の血清中の５ ＴＢＰ−ＩＩの正常濃度は、１．４８±０．４６ｎＱ／
　ｒｔｔｆｌである。 全身性Ｊリテマトーデス患者４６名の血清中のＴＢＰ−
１［濃度は、４．０４±３．７５ｎｏ／＃ｄ！であり、
正常値と比べて高度に有意であった（ｐ＜０．００１）
。ＳＬＥ患者４６人うち２９人はＴＢＰ−ｎ値が正常値
＋２ＳＤより高かった。 われわれはＦ　Ｂ　Ｉ）−ＩＩ　１度とデイ−・ピー・
１ム・シモンズの開発した疾患活性インデックス（クオ
ータリージャーノールオプメディシン（Ｑｕａｒｔｅｒ
ｌｙ　Ｊ、　ｏｆ　Ｈｅｄ、）第６９巻、９２７−９３
７頁（１９８８年））の間に高度に有意の相関があるこ
とを見いだした：　ｒ＝０．６２゜ｐ＜ｏ、００１ｏＴ
ＢＰ−１［とＳＬＥ活性の古曲的マーカーである、抗Ｄ
ＮＡ抗体との間（ｒ＝０．６４．ｐ＜０．００１）にも
、またＳＬＥ活性の主要な臨床症状である関節痛とＴ　
Ｂ　Ｐ　−ｌの間（ｒ＝０．５４．ｐ＜０．００１）に
も同様の相関が見られた。 これらの結果はｌ　Ｂ　Ｐ　−Ｉｔは疾患の活性の感度
６ の高いマーカーとして、そしてＳＬＥ患者の病状の悪化
の予知できるものとして使用可能であり、従ってＳＬＨ
の患者や対するの自己免疫疾患の患者の免疫活性度を測
定するのに有用である。 上記の方法を用いて異なる癌患者の血清中のＴＢＩ”−
Ｉ濃度を調べた。種々の癌患者３４人のうち２０人（５
８，８％）でＴＢＰ−１濃度は正常値±２８Ｄの外であ
った。癌患者（４，１６±０．８３ｔ＋ｏ／ｍ）と健常
人（１，４８±０．４６ｎｉｌ／ｄ）の−ＴＢＰ−ＩＩ
の差は統計的に高度に有意であった（Ｐ＜０．００１）
。 これらの結果はＴＢＰ−ＩＩが種々のタイプの癌の有用
で普遍的なマーカーであり、癌の早期検出に応用できる
ことを示唆している。癌切除語ＴＢＰ−ＩＩ濃度の標準
化は疾患の治療のマーカーになり得る。最初の標準化の
後のＴ　Ｂ　Ｐ−ｎの増加は、疾患再発の早期及び感度
の高い普遍的マーカーである。 子瘤又は前子腕を有する妊娠満期の１４人の妊婦（２，
９１±０．９６ｎｏ／ｄ）は１６人の血圧７ 正常の婦人（１，５８±０．５２μＭｍ）より１’　Ｂ
　Ｐ　−Ｉが統計的に有意に高かった（Ｐ＜０．００１
）。 実施例９　：　”ｌ　Ｂ　ｒ−’　−ＩｔとＴ’　Ｎ　
Ｆの　ＡせＴ　Ｎ　Ｆの有益な作用を延長させる丁Ｂ　
Ｐ　−ＩＩの活性を調べるため以下の実験を行った：Ｆ
Ｓ１１繊帷芽細胞（９回継代培養）を最初の濃度１００
００細胞／つ１ルでマイクロウェル（９６穴プレート）
中で培養した。２４時間後−定濃度（５ｎ（１／ｄ）の
ｒ　ｉ−Ｎ　Ｆと異なる濃度のＴＢＰ−Ｉｆ（３から１
０１Ｅ／ｍｅ）を各つ■ルに加えた。対照ウェルには丁
Ｎ　Ｆは加えず、培地、ｒＴＮＦのみ、又は各１’　Ｂ
　Ｐ　−ｎ濃度液を加えた。 培養７日後に細胞の上清を集め、残存ＴＮＦ細胞毒性作
用と残存ＴＢＰ−ｎの測定のために直ちに一２０℃に凍
結した。上積を除去した後ＦＳ１１プレートに１１３−
チミジンを８時間加え、［ツイーン、１プレートにはニ
ュウートラルレッドダイを加えた。 その結果を図７に示す。図７（Ｄ）はＴＮＦ８ ５μＭｄの存在下でＴＢＰ−ＩＩ濃度が増加していく場
合、繊維芽細胞の増殖は有意に上昇するにュウートラル
レッドダイ摂取、又は１」３−チミジン取り込み（Ｆ）
により測定）ことを示している。凍結ＦＳ１１上清のバ
イオアッセイ（Ａ９マウス細胞株）による残存ＴＮＦ細
胞毒性の測定結果は、残存細胞毒性はＴ　Ｂ　Ｐ−１１
濃度の増加に平衡しており（Ｆ、、）、ＴＢＩ”ｌがこ
の系における王Ｎ　Ｆ分解を防いでいることを丞唆して
いる。 この現象をさらに調べるため、ｒＴＮＦ−１ＴＢＰ−Ｉ
Ｉそして各対照を異なるプレートの培養ＦＳ１１繊維芽
細胞に２時間、２．５．７．９日間加えた。次に上清を
除去し直ちにＴ　Ｎ　Ｆ細胞毒性を測定した。 図８に示すようにＴＢＰ−Ｉｔの存在下でｒ　Ｔ　Ｎ　
Ｆ　５　ｎｏを加えたものの２時間目に０．６ｎ。 のみが生物活性があり、残りはＴＢＰ−１に結合され中
和された。しかし２日と９日の間はｒＴＮＦｒ単独」で
は生物活性を急速に失ったが、ｒｓｐ−ｎの存在下にお
けるｒ　Ｔ　Ｎ　Ｆの細胞毒性９ は１０倍高かった。即ちｒ　Ｂ　ｌ）　、−１［は最初
高１’ＮＦＩｉ１度を中和したが、残りの生物活性ＴＮ
Ｆがその生物活性を７ノロ速的に失うのを防いだ。これ
らの結果はＴＢＰ−Ｉ［はＴＮＦに結合してその天然の
分解又は活性の喪失を防ぐため、王ＮＦの有益な作用を
延長さＶる担体として有用であることを示している。 ＰＶＣ９６穴マイクロタイタープレートをＴ　１３１）
−ｎに対する精製したモノクローナル抗体（２５μｇ／
Ｉｄ）で前述したように被覆した。洗浄とブロッキング
の後、’ｒ　Ｂ　ｌ）　−Ｈに対する同じか又は異なる
モノクローナル抗体（１μｇ／ａｔりでブレインキュベ
ートした　１２５Ｉ標識１Ｂｆ”Ｉ［（１００，ＯＯＣ
ＰＭ／１クエル）の試料をウェルに入れたニブレートは
４℃で一晩インキユベートし、洗浄し各ウェルに結合し
た／＋５［１能をガンマカウンティングで測定した。結
果は対照値（競合モ０ ツクローナル抗体がない場合のＴＢ、Ｐ−ＩＩの結合）
のパーセントとして表示しである。 結果は表４に示しである。モノクローナル抗体は第−行
と左側の列にりＯ−ン番号で示しである。 結合パーセント値が低いものは、２つの抗体がＴＢＰ〜
Ｈの各エピトープに競合し、この値が高いものはエピト
ープが異なることを示している。 非競合抗体にはドブルサンドイッチＥＬＩＳＡが適当で
ある（例えばクローン１３とりＯ−ン７０）。 １ ■の効果の経時的影響を示づ°。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の細胞毒性作用を阻害す
   る能力、及び／又はその有益な作用を長期間維持する能
   力を有する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合蛋白II（以下
   ＴＢＰ−IIと表示する）、その塩、官能基誘導体、前駆
   体、活性画分、及びこれらの任意の混合物。（２）実質
   的に精製された形の、特許請求の範囲第１項に記載のＴ
   ＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II。 （３）実質的に精製された蛋白をＳＤＳ− ＰＡＧＥにより還元化条件で分析するとき、約３０ＫＤ
   ａの分子量を有する、特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載のＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II。 （４）逆相高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）で単一のピークとして移動する、特許請求
   の範囲第１項又は第２項に記載のＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ
   −II。 （５）マウスＡ９細胞に対するＴＮＦ−αの細胞毒性作
   用を阻害する能力を有する、前記特許請求の範囲のいず
   れかに記載のＴＮＦ結合蛋白 ＴＢＰ−II。 （６）Ｎ−末端解析により得られた下記のアミノ酸配列
   ： 【遺伝子配列があります】 及びその末端が切れた形態を有する、前記特許請求の範
   囲のいずれかに記載のＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II。 （７）実質的に生成されたＴＢＰ−II蛋白の産生法にお
   いて； （ａ）ヒトの尿の透析濃縮物から粗蛋白画分を回収し； （ｂ）段階（ａ）の粗蛋白画分を、ＴＮＦを固定したア
   フィニティクロマトグラフィーにかけて、ＴＮＦ結合蛋
   白の精製された活性画分（ＴＮＦの細胞毒性作用を阻害
   する能力により規定する）を得て； （ｃ）段閉（ｂ）のＴＮＦ結合蛋白の精製された活性画
   分を、逆相高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）にかけて、ＴＮＦ結合蛋白の実質的に精製
   された活性画分（ＴＮＦの細胞毒性作用を阻害する能力
   により規定する）を得て； （ｄ）段階（ｃ）の実質的に精製されたＴＢＰ−II蛋白
   （該蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元化条件で分析す
   るとき、約３０ＫＤａの分子量を有し、逆相高速液体ク
   ロマトグラフィーでアセトニトリル約３１％に相当する
   画分で単一のピークとして移動し、ＴＮＦの細胞毒性作
   用を阻害する能力を有する）を回収することよりなる上
   記方法。 （８）特許請求の範囲第７項に記載の方法により産生さ
   れる、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のＴＮＦ
   結合蛋白ＴＢＰ−II。 （９）特許請求の範囲第２項又は第６項に記載のヒトＴ
   ＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II。 （１０）組換え蛋白である特許請求の範囲第１項に記載
   のＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II。 （１１）特許請求の範囲第１項に記載のＴＮＦ結合蛋白
   ＴＢＰ−II又はその同族蛋白をコードするヌクレオチド
   配列よりなるＤＮＡ分子。 （１２）特許請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ分子よ
   りなり、形質転換体宿主細胞中で、特許請求の範囲第１
   項から第６項までのいずれか１項又は第１０項に記載の
   ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−IIを発現できる、複製可能な発
   現ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）。 （１３）特許請求の範囲１２項に記載の複製可能な発現
   ビヒクル（ｖｃｈｉｃｌｅ）で形質転換させた原核細胞
   及び真核細胞より選択される宿主細胞。 （１４）ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−IIの産生方法において
   ； （ａ）特許請求の範囲第１３項に記載の形質転換宿主細
   胞を適当な培地で培養し、（ｂ）該ＴＮＦ結合蛋白ＴＢ
   Ｐ−IIを単離することよりなる、上記方法。 （１５）薬剤として許容される担体とともに、活性成分
   としてＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II、その塩、官能基誘導
   体、前駆体又はこれらの活性画分、及びこれらの任意の
   混合物を含有する薬剤組成物。 （１６）哺乳動物におけるＴＮＦの有害作用を拮抗（特
   にＴＮＦが内因性に過剰に生成されるか、外因性に過剰
   に投与された状態の治療に使用）するために使用する、
   ＴＮＦ−結合蛋白ＴＢＰ−II、その塩、官能基誘導体、
   前駆体又はこれらの活性画分、及びこれらの任意の混合
   物。 （１１）外因的に投与したＴＮＦと一緒に使用する場合
   、哺乳動物におけるＴＮＦの有益な作用を長期間維持す
   るために使用する、ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−II、その塩
   、官能基誘導体、前駆体又はこれらの活性画分、及びこ
   れらの任意の混合物。 （１８）ＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−IIを特異的に認識する
   、ヒトＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−IIに対する抗体。 （１９）Ｕ９３７細胞及びＫ５６２細胞へのＴＮＦの結
   合を阻止することを特徴とする、特許請求の範囲第１８
   項に記載の抗体。 （２０）Ｈｅｌａ細胞及びＭＣＦ７細胞へのＴＮＦの結
   合を阻害しないことを特徴とする、特許請求の範囲１８
   項又は第１９項に記載の抗体。 （２１）ポリクローナル抗体である特許請求の範囲１８
   項から第２０項に記載の抗体。 （２２）モノクローナル抗体である特許請求の範囲第１
   ８項から第２０項に記載の抗体。（２３）ＴＢＰ−IIで
   あらかじめ免疫したマウスの脾臓細胞とリンパ球と、ミ
   エローマ細胞との融合により生成したハブリドーマ（ｈ
   ｙｂｒｉｄｏｍａ）により産生される、特許請求の範囲
   第２２項に記載のモノクローナル抗体。 （２４）寄託番号１−９２９でＣＮＣＭに寄託されたハ
   イブリドーマＴＢＰ−II１３−１２により産生される、
   特許請求の範囲第２２項に記載のモノクローナル抗体。 （２５）寄託番号 I −９２８でＣＮＣＭに寄託された
   ハイブリドーマＴＢＰ−II７０−２により産生される、
   特許請求の範囲第２２項に記載のモノクローナル抗体。 （２６）ＴＮＦの細胞への結合を阻止、及び細胞への作
   用を阻害するための、特許請求の範囲第１８項から第２
   ５項までのいずれかに記載の抗体又はそのＦ（ａｂ）断
   片、又は抗体又はその断片の塩、官能基誘導体又は活性
   画分の使用。 （２７）内因性に形成されたＴＮＦ、又は外因性に投与
   されたＴＮＦ−の効果に拮抗するような状態の治療のた
   めの、特許請求の範囲第１８項から第２５項までのいず
   れかに記載の抗体又はその Ｆ（ａｂ）断片、又は抗体又はその断片の塩、官能基誘
   導体又は活性画分の使用。 （２８）ＴＮＦの細胞に対する有益な効果を模倣する（
   ｍｉｍｉｃｋ）ための、特許請求の範囲第１８項から第
   ２５項までのいずれかに記載の抗体又はそのＦ（ａｂ）
   断片、又は抗体又はその断片の塩、官能基誘導体又は活
   性画分の使用。 （２９）ＴＮＦの細胞毒性効果を模倣する （ｓｉｍｕｌａｔｅ）ための、特許請求の範囲第１８項
   から第２５項までのいずれかに記載の抗体又はそのＦ（
   ａｂ）断片、又は抗体又はその断片の塩、官能基誘導体
   又は活性画分の使用。 （３０）特許請求の範囲第１８項に記載の抗体との相互
   作用を測定することよりなる、体液中のＴＮＦ結合蛋白
   ＴＢＰ−IIの免疫測定法。 （３１）数種類の疾患（例えば自己免疫疾患）の患者の
   血清中で、内因性に産生されるＴＢＰ−IIに対する抗体
   の濃度を測定するための診断測定法における、ＴＢＰ−
   IIの使用。（３２）特許請求の範囲第１８項から第２５
   項に記載の適当な抗体を使用して、ヒトＴＮＦ結合蛋白
   ＴＢＰ−IIを精製する方法において； ａ、該抗体を適当な樹脂に結合させて免疫アフイニティ
   カラムを作成し； ｂ、該蛋白を含有する溶液を該免疫アフィニティカラム
   にかけ； ｃ、結合しなかった蛋白を適当な洗浄緩衝液で洗浄する
   ； ｄ、結合したＴＮＦ結合蛋白ＴＢＰ−IIを適当な溶出液
   で溶出させ； ｅ、該ＴＢＰ−IIの濃縮された画分を集めることよりな
   る、上記方法。