DE10023665A1 - Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Das Peptid mit nachfolgender Aminosäuresequenz: DOLLAR A Z¶1¶-LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF-Z¶2¶ (VIRIP) DOLLAR A sowie seine biologisch aktiven Fragmente und/oder Varianten und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide, welche die biologische Aktivität von VIRIP besitzen, DOLLAR A darin repräsentiert Z eine Anzahl von 0 bis zu 10 Aminosäureresten.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid (Eiweißstoff) mit inhibierenden Eigenschaften auf die virale Infektion von Zellen: Humanes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine therapeutische und diagnostische Verwendung. Die Erfindung umfasst die natürlich vorkommende Form des VIRIP sowie abgeleitete Fragmente und/oder Analoga bzw. Derivate sowie schließlich ein Arzneimittel enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Indikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Die Erfindung umfasst darüber hinaus modifizierte Formen des VIRIP, die eine besonders günstige therapeutische Wirksamkeit aufweisen. Des weiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für VIRIP oder eines seiner Fragmente und/oder Derivate und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen VIRIP oder eines seiner Fragmente und/oder Derivate zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken, insbesondere bei viralen Erkrankungen und zur Behandlung von Infektionen mit HIV-1 und HIV-2.

Die VIRIP konnte überraschenderweise mit Hilfe von chromatogra­ phischen Methoden und mit Hilfe eines biologischen Assays aus humanem Hämofiltrat isoliert werden. Die biochemische Charakterisierung des erfindungsgemäßen Peptids erfolgte durch Massenspektrometrie und vollständigen Sequenzierung aller Aminosäuren.

Das Peptid besitzt die folgende Aminosäuresequenz:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF

Die Molekularmasse des erfindungsgemäßen Peptids VIRIP beträgt:
2303 Da

Das erfindungsgemäße Peptid ist überraschenderweise ein 20 Aminosäuren umfassendes Fragment des bekannten humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No. P01009), welches in seiner prozessierten Form aus 394 Aminosäuren besteht. Die Funktion des Alpha-1-Antitrypsin wird vornehmlich als Hemmstoff für die Enzyme Elastase sowie Thrombin und Plasmin beschrieben. Die erfindungsgemäße Peptidsequenz des VIRIP beginnt hinter der Aminosäure 352 des Alpha-1-Antitrypsin und umfasst somit die Aminosäuren 353 bis 372 des Alpha-1-Antitrypsin.

Überraschenderweise bewirkt das erfindungsgemäße Peptid eine Unterdrückung der HIV-1-Infektion und/oder -Replikation von bzw. in humanen Blutzellen. Das erfindungsgemäße Peptid ist überraschenderweise koppelbar mit einem Adapterprotein, was eine Aufnahme in infizierte und nicht-infizierte Zellen gewährleistet.

Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.

Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1.5 bis 3.5, insbesondere 2.5 bis 3.0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP- 650 (M), Merck, Darmstadt). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0.5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.

Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher- Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH- Werten.

Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien überprüft.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des gereinigten Peptids erfolgte mittels eines Elektrospray Massenspektrometers (ESI-MS). Die Sequenzanalyse des nativen Peptids erfolgte über einen Edman-Abbau mit einem ABI 473A Sequenzer. Die erfindungsgemäße Peptidsequenz wurde chemisch synthetisiert und die Struktur des synthetisch hergestellten Peptids wurde ebenfalls aufgeklärt. Dieses synthetisch hergestellte VIRIP bewirkt ebenfalls eine dosisabhängige Unterdrückung der HIV-1-Infektion und/oder -Replikation von bzw. in humanen Blutzellen.

Das erfindungsgemäße Peptid sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie Antikörper, welche die Wirkung des VIRIP aufheben, können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der Virus-inhibierender Substanzen. Dabei kann vermutet werden, dass VIRIP aufgrund seiner kurzen, hydrophoben Sequenz in die Blutzellen aufgenommen wird und dort als Hemmstoff von Virus-Enzymen oder als Hemmstoff von Enzymen der Blutzellen wirkt.

Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal­ topisch, subkutan oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichendem Peptid beträgt 1 mg bis 1 g pro Darreichungsein­ heit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren/Antagonisten gehemmt werden.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklo­ nale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfin­ dungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting.

Fig. 1: Aufreinigung von VIRIP. Die Aufreinigungsschritte sind im Text beschrieben. (b) Inhibition der Replikation von HIV-1 NL43 in humanen Blutlymphozten durch die Fraktion 1-20. Die Zellen wurden 2 Tage mit PHA stimuliert, mit Virusstocks die 10 ng p24 enthalten infiziert und die Reverse Transkriptase-Aktivität im Kultur­ überstand 9 Tage nach Infektion bestimmt. Dargestellt ist das Ergebnis Infektionsexperimente.

Fig. 2: Einfluss von synthethischem VIRIP auf die Infektion von CEMx174-SEAP Indikatorzellen (links) und die Replikation in humanen PBMCs (rechts). Die Zellen wurden in Gegenwart der auf­ geführten Mengen an VIRIP infiziert und kultiviert. Zur Bestimmung des viralen Eintritts wurde die Aktivität der sekretierten Alkalinen Phosphate in Kulturüberstand der CEMx174-SEAP Zellen drei Tage nach der Infektion bestimmt.

Fig. 3: Die V3-Schleife des X4-tropen NL43 Klons wurde gegen die entsprechenden Sequenzen der dargestellten HIV-1 Isolate aus­ getauscht. Die rekombinanten Viren unterscheiden sich somit aus­ schließlich in der V3-Schleife. Im rechten Panel ist der beobachtete inhibitorische Effekt (%), die Gesamtladung der V3-Region und der Korezeptortropismus dargestellt.

Fig. 4: Dosis-abhängige Hemmung der X4-tropen P59S und der R5- topen 92TH HIV-1 NL4-3 Rekombinanten durch VIRIP. P4R5 Indikatorzellen wurden in Gegenwart der dargestellten Konzentrationen an VIRIP infiziert und die β-Galaktosidase-Aktivität im Zellextrakt 2 Tage nach Infektion gemessen.

Fig. 5: VIRIP hemmt die Vermehrung verschiedener HIV-Isolate mit unterschiedlichem Zell- und Korezeptor-Tropismus in humanen PBMC. Vorstimulierte PBMC wurden in Gegenwart der dargestellten VIRIP Konzentrationen mit den diversen HIV-1 Isolaten (10 ng p27 antigen) oder einem chimären Onko-Lentivirus (Mu-HIV). Die Virus­ vermehrung wurde durch die Messung der Reverse Transkriptase- Aktivität im Zellkulturüberstand bestimmt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrie­ ben.

Beispiel 1 Isolierung des antiviral wirksamen VIRIP 1. Schritt Hämofiltrat-Batch-Extraktion

800-1000 L Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2.7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm verdünnt und mit einer Flussrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.

Chromatographiebedingungen

Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluss: 3 L/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Puffer B: 0.5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)

Nach Auftrag der insgesamt 1.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0.5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6.8-7.2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.

2. Schritt Erste präparative Auftrennung (Charae 01/1998)

Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in einer Menge von 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2.7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.

Chromatographiebedingungen

Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluss: bis zu 3 L/min während des Auftrages 0.5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)

Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0.01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern

Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet (s. Abb. 1a). Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.

3. Schritt Zweite präparative Auftrennung

Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt

Chromatographiebedingungen

Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm 10 × 12.5 cm (FineLine 100)
Fluss: 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen,

Nach Auftrag der einzelnen pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert. Aliquots der entstandenen Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktion 20 aus pH-Pool I enthielt das erfindungsgemäße Peptid (s. Abb. 1b, c).

4. Schritt Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie

Insgesamt 500 mg der im Assay bioaktiven Fraktion 20 aus pH-Pool I wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufge­ trennt. Die Fraktion 27 enthielt die erfindungsgemäße Substanz (s. Abb. 1d).

Chromatographiebedingungen

Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å Puffer A: 30% Methanol, 70% Wasser, 0.1% TFA Puffer B: 100% Methanol, 0.1% TFA Gradient: 0-60% B in 2100 ml Fluss: 40 ml/min Detektion: 214 nm und 280 nm Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems Fraktionen: á 50 ml ab Start des Gradienten

5. Schritt Analytische Reverse-Phase C4-Chromatographie

Die bioaktive Fraktion 27 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über eine analytische Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Aliquots wurden im Bioassay getestet. Die Fraktionen 33+34 enthielten die erfindungsgemäße Substanz in aufgereinigter Form.

Chromatographiebedingungen

5 µm, 100 Å, 20 × 250 mm;
Säule: 2 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: RP-C4, 5 µm, 100 Å, Biotek Silica, Östringen, Germany
Puffer A: Wasser, 0.1% TFA
Puffer B: 80% Acetonitril, 20% Wasser, 0.1% TFA,
Gradient: 20-60% B in 80 min. 60-100% B in 2 min
Fluss: 8 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1.5 min ab Start des Gradienten

Die erfindungsgemäße Reinsubstanz wurde daraufhin in dosisabhängiger Weise im Bioassay untersucht und peptidchemisch charakterisiert.

Beispiel 2 Massenbestimmungen

Die Massenbestimmungen des aus Hämofiltrat isolierten Peptids (aus den Fraktionen 33 + 34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und des chemisch synthetisierten Peptids (Beispiel 3) wurden auf einem ESI Massenspektrometer durchgeführt (s. Abb. 1f). Die Molekülmasse der Peptide wurden entsprechend der nachfolgend gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt:
VIRIP, isioliert aus humanem Hämofiltrat: 2303 Da
IRIP, chemisch synthetisiertes Peptid: 2303 Da

Sequenzbestimmung

Die aufgereinigten nativen und chemisch synthetisierten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben wer­ den auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. Es ergaben sich sowohl für das aus Hämofiltrat isolierte Peptid (aus den Fraktionen 33 + 34 des 5. Schritts in Beispiel 1) und das chemisch synthetisierte Peptid (Beispiel 3) folgende identische vollständige Aminosäuresequenz:

LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF Datenbankvergleich

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR- Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Daten­ banken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundertprozen­ tige Identität zu dem aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren 353- 372 des humanen Proteins Alpha-1-Antitrypsin (Accession No. P01009).

Beispiel 3 Chemische Synthese von VIRIP

Die chemische Synthese von VIRIP wurde mittels konventioneller Festphasensynthese auf einem Peptid-Synthesizer 9050 unter Ver­ wendung der bekannten Fmoc-Chemie durchgeführt. Das erhaltene Peptid wurde über Reverse-Phase Chromatographie aufgereinigt, seine Identität und Reinheit wurde mittels analytischer RP-HPLC sowie der unter Beispiel 2 beschriebenen Massen- und Sequenzbe­ stimmung festgestellt.

Beispiel 4 Bestimmung der antiviralen Aktivität von VIRIP

Die Isolierung der VIRIP erfolgte aufgrund ihrer inhibitorischen Wirkung auf die Vermehrung von HIV-1 in einem Assay, der die Replikation von HIV-1 in peripheren humanen Blutlymphozyten (PBMCs) misst. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat-Äquivalent zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.

Humane periphere Blutlymphozyten (PBMCs) wurden aus Vollblut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll gewonnen. Die Zellen wurden für zwei Tage vorstimuliert (RPMI-Medium, 20% FKS, 100 U/ml IL-2, 5 µg/ml Phytohämagglutinin [PHA]. Anschließend wurden die PBMCs durch Zentrifugation für 5 min bei 1200 rpm sedimentiert, in PHA-freiem RPMI-Medium aufgenommen (20% FKS, 100 U/ml IL-2) und in einer Konzentration von etwa 150.000 Zellen pro Loch in 96- Well-Flachboden-Platten in einem Volumen von 80 µl ausgesät.

Am folgenden Tag wurden Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen in Mengen von 10 ml bis zu 1 L Hämofiltrat-Äquivalent zugeführt. Dazu wurden die gefriergetrock­ neten Chromatographiestufen in Wasser aufgenommen und in ver­ schiedenen Konzentrationen in einem Gesamtvolumen von 10 µl zu den PBMCs pipettiert. Nach 2stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen durch die Zugabe von 10 µl HIV-1 Virusstock, der 0,1 bis 10 ng p24 Antigen enthält, infiziert. Im folgenden wurden 50 µl des Kulturmediums alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt, welches zusätzlich die korrespondierenden Peptid-Fraktionen enthält. Die Produktion an HIV-Partikeln zu verschiedenen Zeitpunkten (9, 12 und 18 Tage) nach der Infektion der Zellen wurde im Reverse- Transkriptase(RT)-Test quantifiziert. Der RT-Test misst die Aktivität der Reversen-Transkriptase im zellfreien Kulturüberstand und ist somit ein Maß für die Produktion an Viruspartikeln und die virale Ver­ mehrung in den PBMC-Kulturen. Alternativ wurde die Virusproduktion im p24 Antigen-ELISA bestimmt. Fraktionen, die im Vergleich zu An­ sätzen ohne potentiell stimulierende oder inhibitorische Peptide zu einer mindestens 90%igen Reduktion der RT-Produktion führten (s. z. B. Abb. 1b) und somit die Vermehrung von HIV-1 in humanen PBMC effizient hemmten, wurden weiter aufgereinigt.

Das aus Hämoflltrat aufgereinigte VIRIP (Beispiel 1) als auch das chemisch synthetisierte VIRIP (Beispiel 3) zeigten eine dosisab­ hängige Inhibition der HIV-1 Infektion von CEMx174-SEAP Indikator­ zellen und der Replikation in PBMCs (Abb. 2). Das erfindungsgemäße VIRIP besitzt dagegen keine zytotoxische Wirkung auf die Blutzellen.

Beispiel 5 Die Effizienz der VIRIP-spezifischen Inhibition ist abhängig von der Sequenz der V3-Schleife im HIV-1 Hüllprotein

Die Ergebnisse belegten, dass sowohl VIRIP aus Hämofiltrat, als auch das synthetisch hergestellte Peptid die Replikation von HIV-1 NL43 wirksam blockieren. Um herauszufinden, ob VIRIP spezifisch für X4-trope Varianten ist oder auch andere Formen inhibiert, welche den Korezeptor CCRS be­ nutzen oder dual-trop (X4/R5) sind, wurde eine Reihe von V3-Varianten des molekularen NL4-3 Klons untersucht (Abb. 3). Der V3-Loop des X4- tropen NL4-3 Klons wurde durch die entsprechende Region einer Reihe von primären HIV-1 Isolaten ersetzt. Funktionelle Tests mit verschiedenen Indikatorzellinien zeigten, dass diese V3-Rekombinanten einen unter­ schiedlichen Zell- und Korezeptor-Tropismus aufweisen. Um den inhibito­ rischen Einfluss von VIRIP auf diese Varianten zu untersuchen wurden P4R5 Indikatorzellen verwendet. P4R5-Zellen exprimieren sowohl CCR5 als auch CXCR4 und enthalten das Luziferasegen unter der Kontrolle der HIV-1 LTR. Diese Zellinie wurde in Gegenwart und Abwesenheit von VIRIP mit den diversen rekombinanten Viren infiziert (50 ng p24) und die Infektion mit Hilfe des Luziferasetest quantifiziert. Wie in der Fig. 3 dar­ gestellt inhibierte VIRIP sowohl X4-, als auch R5- und X4/R5-trope Varianten. Insgesamt wurden jedoch X4-trope Varianten mit stark positiv geladenem V3-Loop effizienter gehemmt als R5- oder dual-trope Isolate.

Um den inhibitorischen Effekt der erfindungsgemäßen Substanz genauer zu quantifizieren, wurden P4R5 Indikator Zellen in Gegenwart verschiedener Dosen von VIRIP mit dem X4-tropen HIV-1 P59S und dem R5-tropen 92TH Isolat infiziert. Wir in der Abb. 4 dargestellt, inhibierte VIRIP das HIV-1 P59S Isolat bei einer Konzentration von 40 µg/ml um 50%, und bei einer Konzentration von 180 µg/ml um 90%. Zur Hemmung des X-tropen 92TH Isolates waren etwa 2-fach höhere Konzentrationen an VIRIP erforderlich (Fig. 4).

In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass VIRIP die Replikation von X4-tropen und dual-tropen HIV-Varianten in humanen PBMC bei Kon­ zentrationen von 1000 µg/ml komplett und bei Konzentrationen von 100 µg/ml zumindest partiell unterdrückt (Abb. 5, oben). Die inhibitorischen Effekte auf R5-trope Formen waren geringer. Ein chimäres Onko-Lenti­ virus (Mu-HIV), welches das MLV-Hüllprotein trägt, wurde nicht inhibiert (Fig. 5, unten).

Claims (22)

1. Das Peptid mit nachfolgender Aminosäuresequenz:
Z₁-LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF-Z₂ (VIRIP)
sowie seine biologisch aktiven Fragmente und/oder Varianten und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide, welche die biologische Aktivität von VIRIP besitzen, darin repräsentiert Z eine Anzahl von 0 bis zu 10 Aminosäureresten.

2. Das Peptid VIRIP nach Anspruch 1, wobei einzelne oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenzfolge ausgetauscht, deletiert oder zugefügt werden, sowie chemische Modifizierungen an einzelnen Aminosäuren des VIRIP, die eine verbesserte biologische Aktivität von VIRIP zur Folge haben.

3. Polynukleotide kodierend VIRIP nach Anspruch 1 und Anspruch 2 und/oder dessen Fragmente, Varianten, Derivate und Analoga.

4. Polynukleotide nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus DNA, RNA, genomischer DNA oder PNA aufgebaut ist.

5. Ein Vektor enthaltend die Polynucleotide aus Anspruch 3.

6. Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 5.

7. Polynucleotide hybridisierend mit einem Polynucleotid aus Anspruch 3, das für ein Polypeptid mit VIRIP-Aktivität kodiert.

8. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und 2.

9. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und 2.

10. Polypeptide aus Anspruch 1 und 2 in Verbindung mit einem Adapterprotein, das die Aufnahme in Virus-infizierbare Zellen gewährleistet.

11. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die VIRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen der Polypeptide aus Anspruch 1, 2 und 10.

12. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition des des VIRIP benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors.

13. Galenische Formulierung bestehend aus Polypeptiden nach Anspruch 1, 2 und 10 und einem verträglichen Carrier.

14. Verfahren zur Behandlung von Patienten wobei eine therapeutische Wirkung des Polypeptids durch die Gabe von DNA kodierend für VIRIP und seine Expression in vivo beim Patienten erreicht wird.

15. Verfahren zur Herstellung von VIRIP gemäß Anspruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen-Chromatographie.

16. Verfahren zur Herstellung von VIRIP gemäß Anspruch 1 und 2 durch Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese sowie Flüssig­ phasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit ge­ schützten Aminosäuren und dessen Aufreinigung.

17. Verfahren zur Herstellung einer VIRIP gemäß Anspruch 1 und 2 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechnologischer Vektoren.

18. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 8 oder enthaltend für die VIRIP nach Anspruch 1 und 2 kodierende Nukleinsäure oder mRNA.

19. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 oder Polynucleotide nach Anspruch 3 für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Substanz.

20. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 als Marker für virale Erkrankungen, bakterielle und Pilz-Infektionen, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Wachstumsstörungen, Erkrankungen des Immunsystems sowie als Marker bei Knochenerkrankungen.

21. Arzneimittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1, 2 und 10 als wirksamen Bestandteil von galenischen Formen zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, subcutanen, intrathekalen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.

22. Verwendung der Peptide aus Anspruch 1, 2 und 10 sowie der Poly­ nucleotide nach Anspruch 3 sowie der Antikörper/Antagonisten aus Anspruch 8 und 9 sowie einer galenischen Formulierung aus Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viralen Erkrankungen, dabei insbesondere HIV-1, HIV-2, Herpes-simplex-Virus, Varicella-Zoster-Virus, Hepatitis-A- und Hepatitis-B-Virus, Zytomegalie-Virus, Influenza-Virus, Polio-Virus, Rhino-Virus, Röteln-Virus, Masern-Virus, Tollwut-Virus, Rous- Sarcom-Virus, Epstein-Barr-Virus sowie zur Behandlung von bakte­ riellen und Pilz-Infektionen, entzündlichen Prozessen, gestörten Ent­ zündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Wachstumsstörungen, neuronalen Erkrankungen, Erkrankungen der Blutgerinnung und Blutbildung, Gefäßerkrankungen, Erkrankungen des Immunsystems, sowie zur Wund- und Knochenheilung.