ES2307549T3 - Peptido inhibidor del virus circulante humano (virip) y su uso. - Google Patents
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Abstract
Péptido (VIRIP) con la siguiente secuencia de aminoácidos: LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF así como fragmentos del péptido y/o derivados amidados, acetilados, sulfatados, modificados con polietilenglicol (PEG), fosforilados y/o glicosilados del péptido que suprimen la infección y/o replicación de o en células sanguíneas humanas por VIH-1.
Description
Péptido inhibidor del virus circulante humano
(VIRIP) y su uso.
El objeto de la presente invención es un
polipéptido (proteína) según la reivindicación 1 y su uso según la
reivindicación 2 con propiedades inhibidoras en la infección viral
de células: péptido inhibidor del virus humano (VIRIP) y su uso
terapéutico y diagnóstico. La invención comprende la forma de
procedencia natural de VIRIP, así como fragmentos y/o análogos
derivados o derivados según las reivindicaciones, así como
finalmente un fármaco que contiene los péptidos naturales,
recombinantes y sintéticos para uso para indicaciones médicas y
para uso como un agente diagnóstico. La invención comprende además
formas modificadas del VIRIP según la reivindicación 1 que
presentan una eficacia terapéutica especialmente favorable. Además
de uno de sus fragmentos y/o derivados para fines diagnósticos o
terapéuticos, especialmente en enfermedades víricas y para el
tratamiento de infecciones por VIH-1 y
VIH-2.
Sorprendentemente, el VIRIP pudo aislarse con
ayuda de procedimientos cromatográficos y con ayuda de un ensayo
biológico a partir de hemofiltrado humano. La caracterización
bioquímica del péptido según la invención se realizó mediante
espectrometría de masas y secuenciación completa de todos los
aminoácidos.
El péptido posee la siguiente secuencia de
aminoácidos:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
La masa molecular del péptido según la invención
VIRIP asciende a 2303 Da cuando Z_{1} y Z_{2} no significan
residuos de aminoácidos.
Como derivados del VIRIP son de mencionar
derivados amidados, acetilados, sulfatados, modificados con
polietilenglicol (PEG), fosforilados y/o glicosilados que suprimen
la infección y/o replicación de o en células sanguíneas humanas por
VIH-1.
El péptido según la invención comprende un
fragmento que comprende 20 aminoácidos de la proteína humana
conocida alfa-1-antitripsina (nº de
registro P01009) que en su forma procesada está constituida por 394
aminoácidos. La función de la
alfa-1-antitripsina se describe
principalmente como inhibidor de la enzima elastasa, así como de
trombina y plasmina. La secuencia de péptidos según la invención del
VIRIP empieza preferiblemente detrás del aminoácido 352 de la
alfa-1-antitripsina y por tanto
comprende los aminoácidos 353 a 372 de la
alfa-1-antitripsina.
El péptido según la invención produce
sorprendentemente una supresión de la infección y/o replicación de
VIH-1 de o en células sanguíneas humanas.
El péptido según la invención puede obtenerse
mediante un procedimiento de purificación partiendo de hemofiltrado
humano. Este hemofiltrado se obtiene en grandes cantidades en la
ultrafiltración de la sangre de enfermos renales.
También son objeto de la invención
polinucleótidos que codifican el péptido según la invención
sintetizándose estos polinucleótidos preferiblemente a partir de
ADN-ARN de ADN genómico o ANP. Otro aspecto de la
invención son vectores que contienen los polinucleótidos según la
invención, así como células huésped genéticamente manipuladas que
contienen el vector según la invención.
El péptido según la invención también puede
acoplarse a una proteína adaptadora que garantiza la captación en
células que pueden infectarse por virus.
También son objeto de la invención usos para la
preparación de fármacos para el tratamiento de pacientes que
necesitan VIRIP mediante administración de cantidades terapéuticas
de los polipéptidos según la invención.
Alternativamente, la acción terapéutica del
polipéptido según la invención puede alcanzarse mediante
administración de polinucleótidos que codifican VIRIP y posterior
expresión in vivo en el paciente.
Dado el caso, el hemofiltrado humano se diluye
con agua y se acidifica. El valor de pH asciende preferiblemente a
de 1,5 a 3,5, especialmente 2,5 a 3,0. El hemofiltrado se pasa
después a través de un intercambiador de cationes, por ejemplo un
material de soporte modificado con grupos ácido sulfónico (Fraktogel
SP - 650 (M), Merck, Darmstadt). Los péptidos unidos al
intercambiador de cationes se eluyen con una solución salina
relativamente muy concentrada. En este sentido, la fuerza iónica de
la disolución de elución se corresponde aproximadamente con una
disolución de acetato de amonio 0,5 a 1 molar.
El eluato recogido se somete a otra
cromatografía en intercambiador de cationes. Esta cromatografía es
preferiblemente una elución escalonada con tampones de valores de
pH crecientes.
Las fracciones que contienen el péptido según la
invención se purifican adicionalmente mediante cromatografía
preparativa en fase inversa y posterior cromatografía
semipreparativa en fase inversa, por ejemplo en materiales de
soporte modificados con C18. El grado de purificación se comprueba
preferiblemente mediante cromatografía analítica en fase inversa,
por ejemplo en materiales de soporte modificados con C18.
La sustancia obtenida mediante la purificación
cromatográfica se sometió a elucidación estructural. La
determinación de las masas moleculares del péptido purificado se
realizó mediante un espectrómetro de masas por electropulverización
(ESI-MS). El análisis de secuencias del péptido
nativo se realizó mediante una degradación de Edman con un
secuenciador ABI 473 A. La secuencia de péptidos según la invención
se sintetizó químicamente y también se elucidó la estructura del
péptido sintéticamente preparado. Este VIRIP sintéticamente
preparado también produce una supresión dependiente de la dosis de
la infección y/o replicación de VIH-1 de o en
células sanguíneas
humanas.
humanas.
El péptido según la invención, así como su ADNc,
su gen y análogos; fragmentos y derivados del péptido, el ADNc y el
gen pueden usarse como fármacos. Su actividad biológica se
corresponde con la de sustancias inhibidoras de virus. En este
sentido puede suponerse que el VIRIP es captado en las células
sanguíneas debido a su corta secuencia hidrófoba y allí actúa de
inhibidor de enzimas víricas o de inhibidor de enzimas de las
células sanguíneas o que el VIRIP se une a receptores que son
importantes para la entrada de virus. Por tanto, el VIRIP impide la
infección de células con el virus.
En este sentido, el péptido según la invención
puede administrarse del modo habitual para péptidos por vía
parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal,
local-tópica, subcutánea o bucal. La cantidad de
péptido que va a administrarse asciende a de 1 mg a 1 g por unidad
farmacéutica por día. La acción del péptido según la invención
puede inhibirse mediante la administración de
inhibidores/antagonistas adecuados.
Los anticuerpos contra un péptido según la
invención pueden obtenerse mediante inmunización de mamíferos. El
agente diagnóstico según la invención contiene ADN, ARN y/o ANP,
dado el caso en forma modificada y/o marcada para utilizarse en
sistemas de prueba conocidos para el experto como PCR o huella
genética.
Figura 1: Purificación de VIRIP. Las etapas de
purificación se describen en el texto. (b) Inhibición de la
replicación de NL43 de VIH-1 en linfocitos de sangre
humana por la fracción 1-20. Las células se
estimularon 2 días con PHA, se infectaron con cargas virales que
contenían 10 ng de p24 y la actividad de la transcriptasa inversa
se determinó en el sobrenadante de cultivo 9 días después de la
infección. Se representa el resultado de los experimentos de
infección.
infección.
Figura 2: Influencia del VIRIP sintético en la
infección de células indicadoras CEMx174-SEAP
(izquierda) y la replicación en PBMC humanas (derecha). Las células
se infectaron y se cultivaron en presencia de las cantidades de
VIRIP citadas. Para determinar la entrada viral, la actividad de la
fosfatasa alcalina secretada se determinó en el sobrenadante de
cultivo de las células CEMx174-SEAP tres días
después de la infección.
Figura 3: El bucle V3 del clon de NL43
X4-trópico se sustituyó por las secuencias
correspondientes de las cepas aisladas de VIH-1
representadas. Por tanto, los virus recombinantes se diferencian
exclusivamente en el bucle V3. En el cuadro derecho se representa
el efecto inhibitorio observado (%), la carga total de la región V3
y el tropismo del correceptor.
Figura 4: Inhibición dependiente de la dosis de
los recombinantes de NL4-3 de VIH-1
P59S X4-trópico y 92TH R5-trópico
por VIRIP. Las células indicadoras P4R5 se infectaron en presencia
de las concentraciones de VIRIP representadas y la actividad de
\beta-galactosidasa se midió en el extracto
celular 2 días después de la infección.
Figura 5: VIRIP inhibe la multiplicación de
distintas cepas aisladas de VIH con diferente tropismo celular y
del correceptor en PBMC humanas. Las PBMC previamente estimuladas se
en presencia de las concentraciones de VIRIP representadas con las
diversas cepas aisladas de VIH-1 (10 ng de antígeno
p27) o un onco-lentivirus mixto
(Mu-VIH). La multiplicación vírica se determinó
mediante la medición de la actividad de la transcriptasa inversa en
el sobrenadante de cultivo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describe más detalladamente
mediante los siguientes ejemplos.
1ª
etapa
Se ajustan 800-1000 l de
hemofiltrado con HCl hasta un valor de pH de 2,7 y se diluyen con
agua hasta una conductividad de 5,5 mS/cm y se cargan con una
velocidad de flujo de 3 l/min a un intercambiador de cationes
fuertes.
\newpage
Condiciones cromatográficas:
- Columna:
- Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
- Material de la columna:
- Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
- Flujo:
- 3 l/min
- Detección:
- 280 nm, pH, conductividad
- Tampón A:
- Hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm
- Tampón B:
- Acetato de amonio 0,5 M
- Equipo:
- Sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de cargar el total de 1.000 l de líquido
durante la noche se aclara con varios volúmenes de columna de HCl 5
mM. La elución de los péptidos unidos se realiza como elución
discontinua con acetato de amonio 0,5 M. En este caso se logra una
elución completa de los péptidos mediante valor de pH creciente (6,8
- 7,2) y conductividad creciente (56 mS/cm) en aproximadamente 5 l
de eluato.
2ª
etapa
Los eluatos de acetato de amonio de la
extracción discontinua se combinan en una cantidad de 10.000 l de
péptido de hemofiltrado. Después del ajuste de pH hasta 2,7, el
extracto de péptidos se carga al intercambiador de cationes
preparativo mezclando agua desmineralizada con una conductividad de
5,5 mS/cm.
Condiciones cromatográficas:
- Columna:
- Vantage 250 VA
- Material de la columna:
- Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
- Flujo:
- hasta 3 l/min durante la carga, de 0,5 a 1 l durante la elución
- Detección:
- 280 nm, pH, conductividad
- Muestra:
- Hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm
- Equipo:
- Sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden).
Después de cargar el extracto bruto durante 240
min, la columna se aclara con HCl 0,01 M hasta que la conductividad
sea inferior a 1 mS/cm. En este sentido, la elución se realiza en
varias etapas con los tampones especificados a continuación
Los eluatos 1-7 se denominan
combinación de pH I-VII (véase la fig. 1a). Se
recogen por separado y finalmente se aclaran con agua
desmineralizada. La elución se realiza hasta alcanzar una nueva
referencia alcanzándose para las distintas combinaciones de pH I a
VII volúmenes de elución de 10 a 25 l.
3ª
etapa
Las distintas combinaciones de pH se separan
para fraccionamiento y desalación simultánea mediante una
cromatografía en fase inversa.
Condiciones cromatográficas:
- Columna:
- FineLine 100 (Pharmacia, Friburgo)
- Material de la columna:
- Source RPC, 15 \mum 10 x 12,5 cm (FineLine 100)
- Flujo:
- 150 ml/min (FineLine 100)
- Detección:
- 280 nm, conductividad, pH
- Tampón A:
- HCl 10 mM
- Tampón B:
- 80% de acetonitrilo en HCl 10 mM
- Gradiente:
- 0-60% de tampón B en 5 volúmenes de columna.
Después de cargar las distintas combinaciones de
pH, la columna se aclara con tampón A. Durante la elución se
recogen fracciones de 200 ml. Las fracciones se liofilizan y se
almacenan a -20ºC. Las alícuotas de las fracciones formadas se
prueban en un bioensayo. La fracción 20 de la combinación de pH I
contuvo el péptido según la invención (véase la fig. 1b, c).
4ª
etapa
Un total de 500 mg de la fracción 20 de la
combinación de pH I bioactiva en el ensayo se separó mediante una
columna semipreparativa de fase inversa. La fracción 27 contenía la
sustancia según la invención (véase la fig. 1d).
Condiciones cromatográficas:
- Columna:
- Columna de acero de 4,7 cm x 30 cm
- Material de relleno:
- Vydac RP-C18 15-20 \mum, 300 \ring{A}
- Tampón A:
- 30% de metanol, 70% de agua, 0,1% de TFA
- Tampón B:
- 100% de metanol, 0,1% de TFA
- Gradiente:
- 0 - 60% de B en 2100 ml
- Flujo:
- 40 ml/min
- Detección:
- 214 nm y 280 nm
- Equipo de cromatografía:
- BioCad 250, PerSeptive Biosystems
- Fracciones:
- 50 ml a partir del inicio del gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
5ª
etapa
La fracción bioactiva 27 de la cromatografía
previa se separó mediante una columna analítica de fase inversa.
Las alícuotas se probaron en el bioensayo. Las fracciones 33+34
contuvieron la sustancia según la invención en forma
purificada.
Condiciones cromatográficas: 5 \mum,
100 \ring{A}, 20 x 250 mm;
- Columna:
- Columna de acero de 2 cm x 25 cm
- Material de relleno:
- RP-C4, 5 \mum, 100 \ring{A}, Biotek Silica, Östringen, Alemania
- Tampón A:
- agua, 0,1% de TFA
- Tampón B:
- 80% de acetonitrilo, 20% de agua, 0,1% de TFA,
- Gradiente:
- 20 - 60% de B en 80 min, 60 - 100% de B en 2 min
- Flujo:
- 8 ml/min
- Detección:
- 214 nm y 280 nm
- Equipo de cromatografía:
- Kontron
- Fracciones:
- 1,5 min a partir del inicio del gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación de esto, la sustancia pura según
la invención se examinó en un bioensayo de una forma dependiente de
la dosis y se caracterizó mediante química de péptidos.
Las determinaciones de la masa del péptido
aislado a partir del hemofiltrado (a partir de las fracciones 33+34
de la 5ª etapa en el ejemplo 1) y del péptido químicamente
sintetizado (ejemplo 3) se realizaron en un espectrómetro de masas
de ESI (véase la fig. 1f). Las masas moleculares de los péptidos se
determinaron correspondientemente a los siguientes números másicos
(PM) mostrados:
- VIRIP, aislado a partir de hemofiltrado humano:
- 2303 Da
- VIRIP, péptido químicamente sintetizado:
- 2303 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos nativos purificados y químicamente
sintetizados se analizan mediante degradación de Edman en un
secuenciador ABI 473 A usando el programa habitual. Las muestras se
cargan en una membrana de polibreno en cantidades entre 100 y 400
pmol. Tanto para el péptido aislado a partir de hemofiltrado (a
partir de las fracciones 33+34 de la 5ª etapa en el ejemplo 1) como
para el péptido químicamente sintetizado (ejemplo 3) resultó la
siguiente secuencia de aminoácidos completa idéntica:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
Se realizó una comparación de datos con ayuda
del paquete informático HUSAR en las bases de datos SwissProt y de
ácidos nucleicos EMBL. La secuencia de péptidos posee una identidad
del cien por cien con los aminoácidos 353-372 de la
proteína humana alfa-1-antitripsina
derivados del ADNc (nº de registro P01009).
La síntesis química de VIRIP se realizó mediante
síntesis en fase sólida convencional en un sintetizador de péptidos
9050 usando la conocida química Fmoc. El péptido obtenido se
purificó mediante cromatografía en fase inversa, su identidad y
pureza se estableció mediante RP-HPLC analítica, así
como la determinación de masas y secuencias descritas en el ejemplo
2.
El aislamiento de VIRIP se realizó debido a su
acción inhibitoria en la multiplicación de VIH-1 en
un ensayo que mide la replicación de VIH-1 en
linfocitos de sangre humana periférica (PBMC). Para esto se
liofilizaron respectivamente alícuotas de las distintas etapas de
cromatografía descritas en el ejemplo 1 y a continuación se
sometieron al ensayo biológico en cantidades de 10 ml hasta 1 l de
equivalente de hemofiltrado. Las fracciones que dieron
respectivamente una señal positiva se sometieron a purificación
adicional.
Los linfocitos de sangre periférica humana
(PBMC) se obtuvieron a partir de sangre completa mediante
centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll. Las células se
estimularon previamente durante dos días (medio RPMI, 20% de FKS,
100 U/ml de IL-2, 5 \mug/ml de fitohemaglutinina
[PHA]). A continuación, las PBMC se sedimentaron mediante
centrifugación durante 5 min a 1200 rpm, se recogieron en medio RPMI
sin PHA (20% de FKS, 100 U/ml de IL-2) y se
sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos en un volumen de
80 \mul en una concentración de aproximadamente 150.000 células
por pocillo.
Al siguiente día se introdujeron alícuotas de
las distintas etapas de cromatografía descritas en el ejemplo 1 en
cantidades de 10 ml hasta 1 l de equivalente de hemofiltrado. Para
esto, las etapas de cromatografía liofilizadas se recogieron en
agua y se pipetearon a las PBMC en distintas concentraciones en un
volumen total de 10 \mul. Después de 2 horas de incubación a
37ºC, las células se infectaron mediante la adición de 10 \mul de
carga viral de VIH-1 que contenía de 0,1 a 10 ng del
antígeno p24. A continuación se sustituyeron cada 2 días 50 \mul
del medio de cultivo por medio recién preparado que adicionalmente
contenía las fracciones de péptidos correspondientes. La producción
de partículas de VIH en los distintos momentos de tiempo (9, 12 y
18 días) después de la infección de las células se cuantificó en la
prueba de la transcriptasa inversa (RT). La prueba de RT mide la
actividad de la transcriptasa inversa en el sobrenadante de cultivo
sin células y por tanto es una medida de la producción de
partículas virales y la multiplicación viral en los cultivos de
PBMC. Alternativamente, la producción de virus se determinó en el
ELISA del antígeno p24. Se purificaron adicionalmente fracciones
que, en comparación con mezclas sin péptidos potencialmente
estimulantes o inhibitorios, llevaron a una reducción de al menos
el 90% de la producción de RT (véase, por ejemplo, la fig. 1b) y por
tanto inhibieron eficazmente la multiplicación de
VIH-1 en PBMC humanas.
Tanto el VIRIP purificado a partir de
hemofiltrado (ejemplo 1) como el VIRIP químicamente sintetizado
(ejemplo 3) mostraron una inhibición dependiente de la dosis de la
infección por VIH-1 de células indicadoras
CEMx174-SEAP y la replicación en PBMC (fig. 2). Por
el contrario, el VIRIP según la invención no posee acción citotóxica
en las células sanguíneas.
Los resultados probaron que tanto el VIRIP a
partir de hemofiltrado como el péptido sintéticamente preparado
bloquean eficazmente la replicación de NL43 de
VIH-1. Para descubrir si el VIRIP es específico para
variantes X4-trópicas o también inhibe otras formas
que utilizan el correceptor CCR5 o son dual-trópicas
(X4/R5) se examinó una serie de variantes de V3 del clon de
NL4-3 molecular (fig. 3). El bucle V3 del clon de
NL4-3 X4-trópico se sustituyó por
la región correspondiente de una serie de cepas aisladas de
VIH-1 primario. Las pruebas funcionales con
distintas líneas de células indicadoras mostraron que estos
recombinantes de V3 presentaban un tropismo celular y del
correceptor diferente. Para examinar la influencia inhibitoria de
VIRIP en estas variantes se usaron células indicadoras P4R5. Las
células P4R5 expresan tanto CCR5 como CXCR4 y contienen el gen
luciferasa bajo el control de las LTR de VIH-1.
Esta línea celular se infectó en presencia y ausencia de VIRIP con
los diversos virus recombinantes (50 ng de p24) y la infección se
cuantificó con ayuda de la prueba de la luciferasa. Como se
representa en la figura 3, el VIRIP inhibió tanto variantes
X4-trópicas como R5-trópicas y
X4/R5-trópicas. Sin embargo, en general, las
variantes X4-trópicas con bucle V3 muy positivamente
cargado se inhibieron más eficazmente que las cepas aisladas
R5-trópicas o dual-trópicas.
Para cuantificar más exactamente el efecto
inhibitorio de la sustancia según la invención, células indicadoras
P4R5 se infectaron en presencia de distintas dosis de VIRIP con la
cepa aislada P59S de VIH-1
X4-trópica y 92TH R5-trópica. Como
se representa en la fig. 4, el VIRIP inhibió la cepa aislada P59S de
VIH-1 en un 50% a una concentración de 40 \mug/ml
y en un 90% a una concentración de 180 \mug/ml. Para inhibir la
cepa aislada 92TH X-trópica se requirieron
concentraciones de VIRIP aproximadamente 2 veces mayores (fig.
4).
En otros experimentos se mostró que el VIRIP
suprimió completamente la replicación de variantes de VIH
X4-trópicas y dual-trópicas en PBMC
humanas a concentraciones de 1000 \mug/ml y al menos parcialmente
a concentraciones de 100 \mug/ml (fig. 5, arriba). Los efectos
inhibitorios en formas R5-trópicas eran menores. No
se inhibió un onco-lentivirus mixto
(Mu-VIH) que llevaba la proteína de la cápside del
VLM (fig. 5, abajo).
<110> Forssmann,
Wolf-Georg
\hskip1cmKirchhoff, Frank
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptido inhibidor del virus
circulante humano (VIRIP) y su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VIRIP
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
Claims (14)
1. Péptido (VIRIP) con la siguiente secuencia de
aminoácidos:
LEAIPMSIPPEVKFNKPFVF
así como fragmentos del péptido y/o
derivados amidados, acetilados, sulfatados, modificados con
polietilenglicol (PEG), fosforilados y/o glicosilados del péptido
que suprimen la infección y/o replicación de o en células
sanguíneas humanas por
VIH-1.
2. Uso de un péptido con la siguiente secuencia
de aminoácidos:
Z_{1}-LEAlPMSIPPEVKFNKPFVF-Z_{2}
\;(VIRIP)
y/o derivados amidados, acetilados,
sulfatados, modificados con polietilenglicol (PEG), fosforilados y/o
glicosilados del péptido que suprimen la infección y/o replicación
de o en células sanguíneas humanas por
VIH-1
en la que Z_{1}, Z_{2} representan,
independientemente entre sí, un número de 0 a 10 residuos de
aminoácidos y si Z_{1} o Z_{2} = 0 significan residuos de
aminoácidos, entonces Z_{1} = H y/o Z_{2} = COOH,
para la preparación de un fármaco para el
tratamiento de infecciones por VIH-1 y
VIH-2.
3. Polinucleótidos que codifican el péptido o
sus fragmentos según la reivindicación 1.
4. Polinucleótidos según la reivindicación 3,
caracterizados porque los polinucleótidos se sintetizan a
partir de ADN, ARN, ADN genómico o ANP.
5. Vector que contiene los polinucleótidos de la
reivindicación 3.
6. Células huésped genéticamente manipuladas que
contienen el vector según la reivindicación 5.
7. Péptidos de la reivindicación 1 en
combinación con una proteína adaptadora que garantiza la captación
en células que pueden infectarse por virus.
8. Formulación galénica constituida por péptidos
según la reivindicación 1 ó 7 y un vehículo compatible.
9. Procedimiento para la preparación del péptido
según la reivindicación 1 mediante extracción de hemofiltrado
mediante extracción en intercambiador de cationes con posterior
elución de las sustancias adsorbidas, una nueva cromatografía en
intercambiador de cationes del extracto que contiene los péptidos,
así como cromatografía en fase inversa de varias etapas.
10. Procedimiento para la preparación del
péptido según la reivindicación 1 mediante síntesis en fase sólida
en términos de la síntesis de Merrifield, así como síntesis en fase
líquida según procedimientos conocidos para el experto con
aminoácidos protegidos, y su purificación.
11. Procedimiento para la preparación del
péptido según la reivindicación 1 mediante procedimientos de
expresión heteróloga conocidos para el experto mediante vectores
biotecnológicos comunes.
12. Agente diagnóstico que contiene
polinucleótidos según la reivindicación 3 ó 4.
13. Fármaco que contiene los péptidos según la
reivindicación 1 o los polinucleótidos según la reivindicación 3 ó
4 como constituyente eficaz de formas galénicas para administración
por vía oral, intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea,
intratecal, así como un aerosol para administración
transpulmonar.
14. Uso de los polinucleótidos según la
reivindicación 3 ó 4 para la preparación de un fármaco para el
tratamiento de infecciones por VIH-1 o
VIH-2.
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