DE19906921A1 - Neuronal-cell-survival-factor (NCSF) und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Das Peptid mit nachfolgender Aminosäuresequenz: DOLLAR A FVTERRLREAVQLLEDYKHGTLRPG-X (NCSF), DOLLAR A wobei X ein Peptid mit 0-3 Aminosäuren darstellt sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Varianten und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid (Eiweißstoff) mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften: Neuronal-cell-survival-factor (NCSF) und seine Verwendung.

Die Erfindung umfaßt weiterhin von dem NCSF abgeleitete Fragmente und/oder Derivate sowie schließlich ein Arzneimittel enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Indikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Desweiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für NCSF oder eines seiner Fragmente und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen NCSF oder eines seiner Fragmente zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken.

Die als NCSF bezeichneten Peptide konnten mit Hilfe eines biologischen Assays aus Schweinegehirn isoliert werden und besitzen eine Masse von 3.299 bzw. 2.985 Da. Die vollständige Sequenzanalyse erfolgte durch Sequenzanalyse der dazugehörigen cDNA. Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmalig die Isolierung und Analyse eines Neuron-stimulating-factor aus einem Gewebe, wie hier dem Gehirn.

Die biochemische Charakterisierung des erfindungsgemäßen Peptides erfolgte durch Massenspektrometrie und Sequenzierung des N-Terminus. Die Sequenzanalyse des biologisch aktiven Komplexes ergab die N-terminalen Sequenzen für:
NCSF, Aminosäuren 1-25 Seq.-ID No. 1
NCSF, Aminosäuren 1-28 Seq.-ID No. 2.

Im MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Induced Desorption and Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)-Massenspektrum des NCSF waren die Molekularmassen (MW) detektierbar:
NCSF, Aminosäuren 1-25, MW 2985
NCSF, Aminosäuren 1-28, MW 3299

Die C-terminale Aminosäure des Peptids wurde durch den Vergleich der gemessenen MW mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen befindet sich innerhalb der Meßgenauigkeit des MALDI-TOF-Massenspektrometers von 0.1% der Gesamtmasse.

Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von Schweinegehirn erhältlich. Dieses Verfahren wurde in Anlehnung an das patentierte Verfahren (Forssmann, W. G. 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 A1), welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat erfunden wurde, in einer verfeinerten Form durchgeführt, wie im weiteren ausgeführt.

Die Schweinegehirne werden mit einem Eisessigpuffer extrahiert, homogenisiert und anschließend filtriert. Das Filtrat wird einer Ultrafiltration unterzogen, mit beispielsweise einer Membran von 50 kDa Ausschlußgrenze.

Das Permeat wird einer Kationenaustauscher-Chromatographie unterzogen, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP-650 (M), Merck, Darmstadt). Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.

Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des Peptids erfolgte mittels eines MALDI-TOF Massenspektrometers. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman-Abbau der Peptide mit einem ABI 473 A Sequenzer.

Neben der gentechnischen Herstellung der Peptide ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-Synthese oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau des Peptids und von ihm abgeleiteten Derivaten mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Das erfindungsgemäße Peptid, sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie Antikörper, welche die Wirkung NCSF aufheben, können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der zellproliferativen Substanzen, ähnlich der bekannter Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktoren.

Für das NCSF liegt desweiteren eine wachstumsförderndern Wirkung auf Nervenzellen und eine Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstumshormon (Growth Hormone, GH, Somatotropin) vor, wie dies in der Literatur für IBP-2 beschrieben wird (Slootweg, M. C. et al., 1995, Endocrinology Vol. 136, Seiten 4210-4217).

Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch oder bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichendem Peptid beträgt 1 mg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren/Antagonisten gehemmt werden.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv­ markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1 Schweinegehirn-Extraktion

10 kg Gehirn von insgesamt 100 Schweinen wird in eiskalter wässriger Lösung (0,5 M Eisessig, 8 mM Ascorbat, 0,8 mM EDTA) extrahiert. Der Extrakt wird mit Waring-Blendor (höchste Stufe) für 15-30 Sekunden homogenisiert. Das Homogenisat mit einem Endvolumen von 30 Litern wird über Nacht bei 4°C extrahiert. Nach Zentrifugation (Sigma 6K10, Rotor 12.500 mit 15600 g, 35-40 min) wird der Überstand filtriert (4-7 µm, S & S Filter). 18 Liter Filtrat wird durch eine 50 kDa-Membran ultrafiltriert.

Ultrafiltrationsbedingungen

Membran: 50 kDa, PS-Membran
Transmembraner Druck: p_E

= 1 bar, T = 5°C
Flußrate: 5-6 L/h
Puffer: 0,5 M Eisessig, 8 mM Ascorbat, 0,8 mM EDTA
Anlage: Sartocon-Mini (0,1 m²

), Sartorius, Göttingen

Erste präparative Auftrennung

Das Permeat der Ultrafiltration wird auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 3,1 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.

Chromatographiebedingungen

Säule: Vantage 250 VA (Amicon)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 1,9 Liter
Fluß: 0,5 L/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Schweinehirn-Filtrat, pH: 2,44, Leitfähigkeit: 3,1 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)

Nach Auftrag des Extraktes über 150 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern

Die Eluate 1-6 werden als pH-Pool I-VI bezeichnet und der Waschpuffer als pH- Pool 0. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools 0 bis VI Elutionsvolumina von 6 bis 78 L erreicht werden.

Zweite präparative Auftrennung

Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt

Chromatographiebedingungen

Säule: YMC-Kartusche, 15-30 µm, 47 × 300 mm
Fluß: 40 mL/min
Detektion: 214/280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 7-57% Puffer B in 2100 ml

Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 50 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert.

Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie

Die im Assay bioaktive Fraktion 23 aus pH-Pool IV wurde über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 25/26 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.

Chromatographiebedingungen

Säule: 10 × 250 mm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18, 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 10-25% B in 2 min, 25-50% B in 50 min, 50-100% B in 2 min
Fluß: 1,8 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Anlage: Kontron 322
Fraktionen: á 1.8 min ab Start des Gradienten

Kationenaustauschchromatographie

Die bioaktiven Fraktionen 25/26 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Kationenaustauscher-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 50-53 und 57/58 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.

Chromatographiebedingungen

Säule: 4 × 50 mm Stahlsäule
Füllmaterial: Pacomer Pepkat, Biotek 5 µm, 300 Å
Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat, pH 3,0
Puffer B: 50 mM Kaliumphosphat, pH 3,0, 1,5 M KaCl
Gradient: 0-100% B in 50 min
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: 214 nm
Anlage: Kontron 322
Fraktionen: á 0,5 min ab Start des Gradienten

Analytische Reverse-Phase Chromatographie

Die bioaktiven Fraktionen 50-53 und 57/58 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden sukzessive in mehreren identischen Läufen über eine Reverse Phase-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 26 und 38 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.

Chromatographiebedingungen

Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,0851% TFA, 100% Acetonitril
Gradient: 10-70% B in 120 min
Fluß: 5 µl/min
Detektion: 220 nm
Anlage: ABI 140 D Solvant Delivery System (Perkin-Elmer)

In dieser Rechromatographie wird die Reinheit des isolierten Peptides, wie es zur weiteren Analytik verwandt wird, deutlich.

Beispiel 2 Massenbestimmungen

Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten und modifizierten Peptide wurden auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer durchgeführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden entsprechend der oben gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt.

Sequenzbestimmung

Die aufgereinigten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergaben sich folgende N-terminale Sequenzen:
NCSF, MW 2985
25 Aminosäuren
FVTERRLREAVQLLEDYKHGTLRPG
NCSF, MW 3299
28 Aminosäuren
FVTERRLREAVQLLEDYKHGTLRPGVTN

Datenbankvergleich

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzen eine hundertprozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des murinen mammary gland NbMMG Mus musculus cDNA Clons.

Beispiel 3 Bestimmung der biologischen Aktivität des NCSF

Die Isolierung des NCSF erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Überlebensassay der PC-12 (Pheochromocytom-Zellen)-Zellinie. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographie­ stufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.

Der Assay mißt das Überleben der Zellen, nachdem sie serumfrei gehalten wurden, indem 24 Stunden nach Serumentzug die Aktivität mitochondrialer Enzyme bestimmt wird. Als Positiv-Kontrolle wird in diesem Assay Nervenwachstumsfaktor (NGF), Insulin-like growth factor (IGF-1) und fetales Kälberserum (FCS) eingesetzt.

In 96 Loch-Platten werden 7.000 PC-12 Zellen pro Loch in serumfreien Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots in die wells. 48 Stunden später wird die Überlebensrate der Zellen mittels eines Wst-1 Substrats gemessen. Dieses Substrat wird von mitochondrialen Enzymen umgesetzt. Die entstehende Farbstoffintensität wird bei 405 nm im ELISA-Reader gemessen, die Referenzwellenlänge liegt dabei bei über 600 nm.

Der Nerve-cell-stimulating-factor besitzt in dosisabhängigerweise eine überlebensfördernde Wirkung auf PC-12 Zellen. Diese Zellen entsprechen neuronalen Vorläuferzellen, so daß man davon ausgehen kann, das NCSF ein neuroprotektiver Faktor ist.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Das Peptid mit nachfolgender Aminosäuresequenz:
FVTERRLREAVQLLEDYKHGTLRPG-X (NCSF),
wobei X ein Peptid mit 0-3 Aminosäuren darstellt sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Varianten und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X = VTN ist.

3. Polynukleotide kodierend für Peptide NCSF nach Anspruch 1 und/oder dessen Fragmente, Varianten, Derivate und Analoga.

4. Polynukleotide nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotide aus DNA, RNA, genomischer DNA oder PNA aufgebaut sind.

5. Ein Vektor enthaltend die Polynukleotide aus Anspruch 3.

6. Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 5.

7. Polynukleotide hybridisierend mit einem Polynukleotid aus Anspruch 3.

8. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und/oder 2.

9. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide aus Anspruch 1 und/oder 2.

10. Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1 und 2 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen-Chromatographie.

11. Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1 und 2 durch Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese sowie Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten Aminosäuren und dessen Aufreinigung.

12. Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1 und 2 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechnologischer Vektoren.

13. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper nach Anspruch 8 oder enthaltend Polynukleotide nach Anspruch 3 oder Anspruch 7.

14. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 oder Polynukleotide nach Anspruch 3 für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Substanz.

15. Diagnostikmittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 und 2 als Marker für neuronale Erkrankungen, inflammatorische und neoplastische neuronale Prozesse sowie als Marker bei Krebs.

16. Arzneimittel enthaltend die Peptide nach Anspruch 1 oder 2, Polynukleotide nach Anspruch 3, 4 oder 7, Antikörper nach Anspruch 8 und/oder Antagonisten/Inhibitoren nach Anspruch 9.

17. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 16 zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Neuropathien, Multiple Sklerose sowie zur Nervenregeneration nach Nervenläsionen.