JPH01500829A - 医薬組成物のためのスクシニル化されたインターロイキン―２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の化学的及び／又は生理学的特性 を変え、る、生物学的活性のＩ！、−２の化学的変性に関する。さらに詳しくは 、本発明は１、生理学的ｐＨでＩＬ、−２を溶解するためにＩＬ−２の選択的ス クシニル化に関する。

微生物宿主細胞中で産生される多くの異種タンパク質、たとえばＩＬ−２は、２ 体中に不溶性物質として見出される。

さらに、ＩＩ、−２は天然において疎水性であり、そして溶液中に残存するより もむしろ材料に及びそれ自体に付着（すなわち集合）する傾向がある。また、Ｅ 、コリ　（Ｅ、ｃｏＩｉ）からの組挟えＩＬ−２はグリコジル化されず、ところ がその天然のＩＬ−２（相当物）は、グリコジル化された水溶性の分子である。

その溶解特性を変えることができる、ＩＬ−・２の変性は、治療への使用のため にＩ　Ｌ　−２の配合を促進せしめるそれによってその免疫原性を減じることが できる。

特定の生理学的応答を生成する目的のために循環系へのポリペプチド、たとえば ＩＬ−２の使用は、医学界において良く知られている。ポリペプチドの臨床的使 用に由来する可能性ある治療利益に対する限界は、循環系において免疫応答を誘 発するそれらの能力である。この免疫応答は、注入の前、材料中における集合体 により引き起こされ得る。Ｒ，ｌ１１１ｇを参照のこと。

ポリペプチドの所望の生理学的活性をなお維持しながら、免疫応答を排除し又は 少なくとも減じるために、これらの可能性ある有用な治療用ポリペプチドの変性 は、前記欠点を伴わないで哺乳類の循環系へのこれらのポリペプチドの使用を可 能にするであろう。

アメリカ特許第４．１７９．３３７号は、ＰＥＧ又はＰＰＧへの水溶性ポリペプ チド、たとえば酵素及びインシュリンの接合を開示する。アメリカ特許第４．０ ０２．５３１号は、アルデヒド誘導体を通してＰＥＧに酵素を接合する異なった 方法を開示する。

１９８７年１月１５日に出版されたＷＯ３７１０００５６は、タンパク質の高め られた溶解性及び減じられた免疫原性を得る一′−めに、ＰＥＧ又はポリオキシ エチル化されたポリオールとインターフェロン−β、インターロイキン−２又は 免疫毒素との接合を開示する。また、Ｔａｋｅｃ！ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎ ｄＵｓｔｒｉｅｓ、Ｌｔｄ、により１９８５年９日１１日に出版されたＥＰ１５ ４．３１６は、リンホカインの少なくとも１つの第一アミノ基に直接的に結合さ れたＰＥＧを含む、化学的に変性されたリンホカイン、たとえば１Ｌ−２を開示 し、そして請求する。

種々のスクシニル化されたタンパク質の特性が、Ｈａ　ｌｃｅｎｂｅｒｇ。

されている。これらの文献は、スクシニル化の結果としてタンパク質の溶解性の 変化を論議しない。

アメリカ特許第４．４１４．１４７号は、ジカルボン酸の兼水物、たとえば無水 琥珀酸にインターフェロンを接合することによって低い疎水性にインターフェロ ンをすることを記載する。

本明細書に特に例示されたインターフェロン−βは、疎水性を低くされているが 、スクシニル化に基づいて実質的な比活性をも失っているように思える。

選択されたタンパク質が、種ｌのタンパク質の薬物動力学及び物性のばく大な相 違のためにこの化学成分による誘導体化に都合良く応答するであろうことを予測 することは、これまで不可能である。

従って、本発明は、医薬的に許容できるｐＨ範囲で周囲条件下において水に通常 溶解しないインターロイキン−２をスクシニル化し、そのような条件下で水性暖 衝液中においてそれを可溶性にすることを提供する。このスクシニル化はまた、 溶液中にそのタンパク質を保持するために外部からの可溶化添加剤、たとえば界 面活性剤又は変性剤の添加を回避する。

スクシニル化されたＩＬ−，２は、初期及び時間の経過後の両者で、変性されな かったＩＬ−２の生物学的活性を保持する。

化の程度を選択することによって調節され得る。

より詳しくは、本発明は、生物学的に活性的な接合されたインターロイキン−２ （ＩＬ−２）に向けられ、ここでＩＬ−２は１又はそれよりも多くのスクシニル 成分に共有的及び選択的に接合され、そしてその非接合形でのＩＬ７２は通常疎 水性であり、そして可溶化剤の不在下でｐＨ６〜８で水性キャリヤー媒体中に溶 解しない。

本発明はまた、スクシニル化されたＩＬ＝２が溶解される医薬的に許容できる非 毒性不活性水性キャリヤー媒体を含んで成る医薬組成物も提供する。

好ましくは、ＩＬ−２は、組換えインターロイキン−２である。

本発明のもう１つの態様は、生物学的に活性的なスクシニル化されたＩＬ−２を 調製するための方法に関し、（ａ）生物学的に活性的な、通常疎水性の水不溶性 インターロイキン−２と無水琥珀酸とを反応せしめ、そして（ｂ）スクシニル化 されたインターロイキン−２を単離することを含んで成る。

もう１つの観点は、上記２つの段階及び次の段階＝（ｃ）医薬的に許容できる非 毒性不活性水性キャリヤー媒体中に前記スクシニル化されたインターロイキン− ２を配合することを含んで成る、医薬組成物を調製するための方法に関する。

最終観点において、本発明は、たとえば船積熱に対し−Ｃの動物の医薬処理のた めに有用である、上記スクシニル化されたタンパク質の持効性製剤、すなわちミ クロ封入形を提供する。

本明細書で使用される場合、インターロイキン−２を記載する場合の用語“通常 疎水性の水不溶性”とは、約６〜８０間のｐＨで、すなわち天然又は生理学的ｐ Ｈで室温及び大気圧の周囲条件下で、水又は水性媒体に不溶性であり又は容易に 溶解しないこれらのインターロイキン−２分子に関する。本発明の変性は、その ようなインターロイキン−２タンパク質の溶解性を高めるために作用し、ここで それらは、そのような生理学的条件にゆだねられる。本発明の目的のために、溶 解性が、（１）分光光度装置により測定される場合の濁り度、（２）超遠心分離 により測定される場のＳ値（ここでより早い集合体の沈降速度よりもむしろモノ マータンパク質の沈降速度が溶解性を示す）、及び（３）サイズ排除クロマトグ ラフィーにより測定される場合の見掛の天然分子量（ここで可溶性インターロイ キン−２は、不溶性インターロイキン−２よりもこの値に近い）により試験され 得る。これらの試験のそれぞれについての溶解性を示す正確な数は、インターロ イキン−２が配合される緩衝液のタイプ、緩衝液のｐＨ１及び緩衝液のイオン強 度に依存するであろう。

本発明のインターロイキン−２は、組織培養物から、又は組換え技法により、及 びいずれかの哺乳類源、たとえばマウス、ネズミ、ウサギ、霊長類、ブタ及びヒ トから得られる。

好ましくは、インターロイキン−２は、ヒトに由来し、そしてより好ましくは組 換えヒトタンパク質である。

ＩＬ−２、好ましくはヒトＩＬ−２として命名された用語な組換えＤＮＡ技法に よって調製された生来のＩＬ−２に匹敵する生物学的活性を有するインターロイ キン−２に関する。

一般的に、ＩＬ−２をコードする遺伝子がその生来のプラスミドから切断され、 そしてクローン化されるべきクローニングベクター中に挿入され、そして次に宿 主生物体、好ましくは微生物及び最っとも好ましくはＥ、コリを形質転換するた めに使用される発現ベクター中に挿入される。その宿主生物体は、発現条件下で ＩＬ−２を生産するために外来性遺伝子を発現する。

より好ましくは、ＩＬ−２は、アメリカ特許第４．５１８．５８４号に記載のよ うなムティンであり、ここで野生型又は生来の分子の１２５位で通常存在するシ スティンが、中性アミノ酸、たとえばセリン又はアラニンによって置換されてい る。他方、ＩＬ−２ムテインは、野生型又は生来の分子の１０４位で通常存在す るメチオニンが中性アミノ酸、たとえばアラニンによって置換されているムティ ンである。最後に、使用されるＩＬ−２は、欠失された生来のＩＬ−２の初めの ５個のＮ−末端のアミノ酸の１又はそれ以上を有することができる。

好ましくは、ＩＬ−２は、５８及び１０５位でシスティンのジスルフィド結合を 含む、生来のヒ）ＩＬ−２のアミノ酸に少なくとも実質的に同一のアミノ酸を有 するタンパク質をコードするＩＬ−２のヒ）　ｃＩ］ＮＡ配列により形質転換さ れた微生物又は酵母により産生されたタンパク質であり、そして生来のヒ）ＩＬ −２に共通する生物学的活性を有する。アミノ酸配列の実質的な同一性とは、そ の配列が合成タンパク質と生来のヒ）ＩＬ−２との間に反対の機能的な相違性を 引き起こさない１又はそれよりも多くのアミノ酸の変更（付加、置換）により同 一であるか又は異なるかを意味する。そのような性質を有するＩＬ−２タンパク 質の仮りは、Ｔａｎ　ｉｇｕｃｈ　ｉなど、。

載されているものを含む。最っとも好ましくは、ＩＬ−２は、Ｓｅｒ　ｌ　２　 Ｓ　ＩＬ−２、ｄｅＳ−ａｌａ＋ｓｅｒ＋ｚｓｌＬ−２、ｄｅｓ−ａ　Ｉａ　＋ 　ＩＬ−２、ｄｅＳ−ａｌａ＋ａｌａｉｏｎｌＬ−２、又はｄｅｓ−ａｌａ、ａ ｌａ、ｏ４ｓｅｒ＋２ｓｌＬ−２であり、ここでｄｅｓ−ａｌａ、”は、ＩＬ− ２のＮ−末端のアラニル残基で欠失されたことを示す。

本発明のＴＬ−２の正確な化学構造は、多くの因子に依存するであろう。イオン 化できるアミノ基及びカルボキシル基が分子中に存在する場合、特定のＩＬ−２ が、酸性塩又は塩基性塩として、又は中性形で得られる。適切な環境条件下に置 かれる場合、それらの生物活性を保持するすべてのそのような調製物は、本発明 のＩＬ−２の定義に含まれる。さらに、ＩＬ−２の一次アミノ酸配列は、糖成分 を用いての誘導体化（グリコジル化）により又は他の補足的分子、たとえば脂質 、ホスフェート、アセチル基及び同様のものにより、より好ましくはサツカリド による接合により増大され得る。そのような増大化の１つの観点は、産生性宿主 の翻訳後プロセシングシステムを通して達成され：他のそのような変性は４７　 ｅトロで導入され得る。とにかく、そのような変性は、ＩＬ−２の生物活性が破 壊されないかぎり、本発明のＩＬ−２の定義内に含まれる。もちろん、そのよう な変性が、種々のアッセイにおいてＩＬ−２の活性を増強し又は低下することに よってその生物活性に量的又は質的に影響を及ぼすことができることが予測され る。

組換えＤ　Ｎ　Ａを含む形質転換された宿主細胞から産生された疎水性組換えＩ Ｌ−２は、細胞培養培地に溶解できるものに対立するものとして、細胞の内部に 沈澱する。細胞内に産生されたＩＬ−２は、細胞残骸から分離され、そしてそれ が精製された生物学的に活性的な物質中に配合される前、細胞から回収されるべ きである。１９８６年１２月３０日に出版されたヨーロッパ特許出ｗ：４第０２ ０６８２８号は、そのような２体を単離するための方法を開示する。この方法に おいては、形質転換された宿主微生物の細胞膜が破壊され、９９重量％以上の塩 がその破壊物から除去され、その脱塩された破壊物が再破壊され、物質、好まし くは糖、たとえばスクロースがその破壊物に添加され、その破壊物内の液体中に 密度又は粘度グラジェントを作り、そして２体が高速遠心分離、すなわち約１０ ．０００〜４０．０００ｘ　ｇで細胞残骸から分離される。好ましくは、その塩 はダイアフィルトレージョン又は遠心分離により破壊物から除去され、そしてス クロースは、約１．１〜１．３ｇ／−にその液体の密度を高めるために添加され る。

遠心分離段階の後、２体を含むペレットが、変性剤、たとえばドデシル硫酸ナト リウムにより溶解され、その得られたｇ濁液が遠心分離され、そしてタンパク質 を含Ｃ′ｌ−漬物が、そのタンパク質を単離するために処理される。そのタンパ ク質は、適切な手段、たとえば遠祖高圧液体クロマトグラフィー　（ＲＰ−ＨＰ ＬＣ）及び／又はゲル濾過クロマトグラフィーによりその上漬物から分離される 。そのような分離の後、タンパク質は、好ましくは酸化され、その生来の対応物 のように、遠心分離において組換えタンパク質の高収率を確保されろ。そ、のよ うな酸化は、アメリカ特許Ｚ　４．５３０，７８７号＜１−５ｈａｋｅｄなど） に記載されている。その酸化はまた、アメリカ特許第４、５７２．７９８号（Ｋ 、　Ｋｏｔｈｓなど）に記載のように、空気の存在下で約５．５〜９の間のｐＨ で可溶化形のタンパク質を含む水溶液とＣｕ２＋カチオンを含む少なくとも有効 量の酸化促進剤とを反応せしめることによっても行なわれ得る。好ましい酸化促 進剤又はオキシダントは、ＣｕＣｊ？２又は（０−フェナントロリンＬＣｕ２＋ である。酸化の後、タンパク質は、場合によっては下記に記載のようなスクシニ ル化の前、脱塩され、そしてサラにＲＰ−ＨＰＬＣ、希釈／ダイアフィルトレー ジョン、５２００ゲル濾過クロマトグラフイー及び限外濾過技法により精製され 得る。しかしながら、スクシニル化は、異種ＩＬ−２が治療目的のために生物学 的に活性である十分に純粋な形で単離された後、どの段階ででも行なわれ得る。

変生が存在するであろう点は、最終的な医薬製剤及びその使用のために必要とさ れるＩＬ−２の根本的な純粋性に依存するであろう。

ＩＬ−２に適用するために本発明に使用される場合、用語“選択的に接合された ”とは、主に反応条件及び最終使用に依存し、て、タンパク質の１又は２個のア ミノ酸残基により共有結合されるこれらのＩＩ、−２タンパク質を言及する。そ れらの残基がＩＬ−２上でのいずれかの反応性アミノ酸、たとえば１又は２個の システィン又はＮ−末端のアミノ酸基である場合、好ましくはその反応性アミノ 酸は、その遊離ε−°ｆミノ基を通して無水琥珀酸に結合されるリシンである。

本発明の方法に従えば、通常疎水性であり、そして水不溶性であるＩ　Ｌ　−、 、、、、、、２は、スクシニル成分への接合を通し”ｒｌＬ−２を変性すること によって、可溶化剤を使用しないで、好ましくは約５〜・８、より好ましくは約 ６〜８及び最っとも好ましくは６，５〜７．８のｐｌ！で、水性キャリヤー媒体 中に溶解せしめられ得る。ＩＮ、−２がそのリシン残基を通して反応される場合 、その反応のｐ！（は好ましくは約７〜９、より好ましくは８〜９である。その ような変性、たとえば実質的な生物学的活性の保持の好結果は、インターフェロ ン−５βの初期スクシニル化から予測され得ない。

ＩＬ−２が結合されるスクシニル成分は、無水琥珀酸に由来する。無水琥珀酸は 、ＩＬ、−２上の遊離アミノ基又は他の反応基、！：選択的に反応する。しかし ながら、最適な結果を得るため：、＝使用される無水琥珀酸の合計量及び反応の ための時間は、琥珀酸とＩＬ−２上の多過ぎる又は少な過ぎる活性基との反応を 避けるために、所望される特定の性質に依存するであろうことが理解されるであ ろう。使用される無水琥珀酸の正確な量は、使用される溶媒（有機溶媒はより少 量の無水琥珀酸を必要とする）、タンパク質濃度、反応媒体のＰＨ１反応媒体中 に存在する塩及び所望される特定の性質に依存する。

しかしながら、ＩＬ−２のモル当り少なくとも２モル、より好ましくは約２〜６ ０モルの無水琥珀酸を使用することが好ましい。使用されるべき最終量は、同時 に、可能なら、ＩＬ−２の半減期（該半減期は無水琥珀酸の量が多くなるほど減 少する）を最適にしながら、最適な活性及び溶解性（多量の無水琥珀酸を用いて 達成される）を維持するための残余である。好ましくは、ＩＬ−２の生物学的活 性の少なくとも約５０％が保持され、そして最っとも好ましくは１００％が保持 される。−置換性スクシニル−ＩＬ−２がｐＨ７で可溶化剤を添加１７ないで改 良された溶解性を有する場合、３日間の４℃での貯藏又：ま室温での物理的な攪 拌がＩＬ−１２タンパク質の明らかな沈殿を引き起こすこ：とが注目される。

共有スクシニル化反応は、ロー一−２と無水琥珀酸さを、該ＩＩ、−２上の反応 基かりシン基である場合、好ましくは約５〜９、より好ましくは７〜・９のｐ　 ｌで接触せし７めることによって起こる。その反応は、タンパク質に恕ＩＷ　４ ：与えないびあろう溶媒中で起こる。た、ケえば、タンパク質が悪影響を受けな い場合、ジメヂルホルｌ、アミドが使用され得る。好ましくは、その反応は、可 溶化剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウトを含む緩衝液の水溶液中において室温 で起こる。

琥珀酸はＩＩ、−２の溶液に一度にすべで添加され得るが、しかし好ましくは、 そζ３は下記の例に示されるように、たとえば５分の間隔で添加される。スクシ ニル化されたＩ　Ｎ、、　−２の生物活性は、反応の間、種々の時間でモニター され得る。

反応の後、スクシニル化されたＩＬ−２は、その反応混合物から単離される。こ れは、他の種類、たとえば、可溶化剤からＩＬ−２及びスクシニル化されたＩＬ −２を分離し、そして次に、千ノー又はジ−スクシニル化されたＩＬ−２が調製 される場合、たとえばＴＳＫ−ＤＥＡＥイオン交換ＨＰＬＣの使用によりＩＬ− ２種を分離し、そしてその分離されたＩＬ−２種を脱塩することによって達成さ れ得る。より高く変性された種が産生される場合２、可溶化剤が除去された後１ 、ｐＨが中性ＰＨに低められ、より早めに行なわれなければ、そし７てサンプル が脱塩され、そして濃縮される。

次に、このようにしてスクシニル化されたＸ１７−２−２は、好ましくは、約３ 〜８；より好ましくは６−８のｐａｌで、医薬的に許容される非毒性で不活性な 水性キャリヤー媒体中に配合される。イン　とＩ−口適用のためには、投与及び 配合の態梯は臨界ではない。培養物又は潅流培地２：適合できる水性配置合物が 一般的に使用されるであろう、、治療のためにイン　じボで使用される場合、無 菌生成、物は、混合物がｖ１猫成される場合、医薬的に許容されるｐＨ４を提供 １′るであろ・）量で水性緩衝液中：ご溶解されたＩ　Ｌ、。−２の混合物から 成るであろう。水溶性キャリヤ゛−１たきえばマンニトールが、その媒体ｉ：何 意に添加され得る。現在、配合されたＪ］；変性Ｉ　１．、−２は、４　ｔ′で 少なくとも６力月間、安定する。

配合物中、ＩＬ−２の投与レベルは、予備臨床試験の後、得られたイン　ビボで の効能データに依存し、そして主に最終使用に依存するであろう。

配合物が凍結乾燥される場合、その凍結乾燥された混合物は、従来の非経口水性 注射液、たとえば蒸留水のパイ”ｒル中に注入することによって再構成され得る 。

上記のようにして調製された再構成配合物は、ヒト又は他の動物を治療するため に、治療的に有効な量（すなわち、患者の病理学的状態を除去し又は減じる量） での非経口投与のために適切である。ＩＬ−２治療は、種々の免疫調節性徴候、 た２：えばＴ細胞突然変７形戊、細胞τ性′ｒ細胞の誘導、天然のキラー細胞活 性の増強、ＩＦＮ−ｒの誘導、細胞免疫性の回復又は増強（たとえば免疫欠失状 態の治療）、及び細胞性抗腫瘍活性の増強のために適切である。

ＸＬ−２の直接的な投与の他に、ｌｌ−−２は、医薬的に許容されるキャリヤー 中、単離された、リンホカイン活性化白血球と共に、養子免疫療法により投与さ れ得、ここで該白血球が、腫瘍を有するヒトに対してＩＬ−２を投与される場合 、りさらに詳しく記載される。

動物への１つの特定の適用においては、本発明のスクシニル化されたＩ　Ｌ−２ が、家畜の重量増加を高めるために適用され得る。好ましくは長期の間及び約１ ０３〜１０５単位／ｋｇ／日の投与量でのそのような動物へのし）ＩＬ、２の有 効量の投与・は、ヨーロッパ特許出願第０２１９９７９号（１９８７年４月２９ 日に出版された）にさらに詳しく記載されている。

動物へのもう１つの特定の適用においては、本発明のスクシニル化されたｉ　Ｌ −２は、飼育場での家畜に関連するストレス及び特に不快さ、すなわち“船積熱 ”として通常知られている動物の徴候群を防ぎ、そして改良するために使用され 得る。そのようなストレス誘導性徴候群を保護するために、家畜１、好ましくは 牛へ、の有効量のヒ）−インターロイキン、−２の投与が、１９８７年４月２９ 日出版されたヨ・−ロッパ特許出願第０２１９９７９号により詳しく説明される 。

簡単に言えば、船積熱に対イる投与の型は、船積及び飼育場の状態に依存するで あろう。投与は飼育場に到着Ｊるよりも少なくとも早く開始され、そし２て必要 な場合、たとえば１〜８又はそれ以上の即問にわたって、複数回の注入又は下記 に記載のように持効性手段のいずれかにより続けられることが好ましい。１０３ 〜１０ｓ単位／ｋｇ／日の範囲の合計量が一般的に使用される。

他の家畜のストレス関連又は呼吸困難徴候群に関しては、投与される型及び量は 、動物（たとえば豚、ヤギ、羊、等）の性質及び大きさ、並びに症状の重度に依 存するであろう。

好ましくは、その組成物は、持効性配合物としてこれらの家畜のために投与され る。そのような配合物は、当業者により理解されるように、相当の種類存在する 。非経口投与のための典型的な持効性組成物は、ストレス誘導性症候群のために は１５〜３０日の期間、調節された速度（０゜０７〜７．０■／合計投与量）で 、及び重量の増加を増強するためには約１０３〜１０ｓ単位／ｋｇ／口の範囲で の調節された速度で、１回の注入によりスクシニル化された組換えヒ）ＩＬ−２ を供給するであろう注入可能なマイクロカプセルである。（純粋なヒトＩＬ−２ は、約３〜６Ｘ１０’Ｕ／■の比活性を有し、その詰果、」１記ストレス誘導性 症候群のための合計投与量は約２Ｘ１０’〜約４Ｘ１０’単位に変化する。） マイクロカプセル配合物は、従来の皮下注射針により筋肉注射又は皮下注射され 得る、直径２０〜１００、−の球状粒子から成るさらさらした粉末であり、そし てそのマイクロカプセルは、ポリ　（ＤＬ−ラクチドーゴーグリコリド）　＜Ｄ Ｌ−ＰＬＧ）賦形剤、すなわち生物分解性、生物連合性ポリエステル中に封入さ れたスクシニル化された０４５〜５％ヒトＩ　Ｌ−２から成る。

持効性に関する他の標？ｔ′、配合物もまた使用できる、Ｉ　Ｌ　−、、−２の 投与量及び投５型は、たとえば祭物の祭物動力学、疼痛の性質、スクシニル化の 程度、ＩＩ、−２の特徴、患者及び患者の病歴に依存するＣあろう。たとえば、 種々の変性されたＩ　Ｌ　−、、−２タンパク質は、秤々の投与のルー川・のた め（ご好都合である種々の葵物劫力学特性７’＜　（：、Ｆ治療１を性をイｊす ２、二とが予期される。長く作用゛−１１″る薬物は、３　＝−４ｅごとに、１ 週ごと１こ又は２週ｊ、−１度、投与されるのみである。クリアランス速度は、 たとえばスクシニル化の程度を変える５−と：ごよんで変更され、それによ、っ て患者の特定の８安性を満たづため：、″基本的な柔軟性が付与され得る。たき えば、モノ−及びジ−スクシニル化されたＩＬ−２クンバク質は、変性されなか ったＩＬ−２と同じクリアランス速度を有する。しかしながら、より高度にスク シニル化されたＩＬ−２タンパク質は、変性されていないＨ，−２よりも早いク リアランス速度を有する。

本発明をさらに例示する次の例において、ずべ°Ｃの部及び％は、特にことわら ないかぎり重量によってであり、そしてすべての温度は℃による。

例Ｉ スクシニル化されたＩＬ−２の調製 Ａ、千ソノ−びジ−スクシニルＩＬ−２゜アメリカ特許第４．５１８．５８４号 及び第４．５３０．７８７号、前記に記載のようにして調製された、Ｒｒ’、− ＨＩ’ＬＣにより精製された紹換えｄｅｓ−アラニル、ｓｅｒ　、□５ｌＬ−２ （１２５位でのシスティンがセリンにより置検され、そしてＮ−末端のアラニル 残基が削除されでいる）を、この例のために使用し、た。緩衝液（０，１Ｍ硼酸 プ川用リウム、ｐＨ９；０．Ｊ−％５ｒｌＳ）　］、、　］０−７中０．４ｍｇ のこの精製されたＩ　Ｌ　−２に、Ｉ　Ｌ−２のモル当り無水琥珀酸０．２モル （ジメヂルホルノ、アミド中）を添加した。十分に混合ｊ８．た後、その溶液を 室温（２３℃）で５分間、攪拌した、。

次に、Ｉ　Ｌ−２モル当り０．２モルの無水琥珀酸を添加し７た。

この添加を、５分間隔でさらに９回くり返した。その反応混合物を、１Ｘ４５ｃ 、ｍの脱塩カラｌ、に適用し、低分子量種、！：　Ｉ　Ｌ＝２及びスクシニル化 されたＩＬ−２種とを分離した。その脱塩カラムは、ＳＤＳを含まない１０ｍ！ Ｊ硼酸ナトリウ１−（ｐＨ９）溶液中で行なわれ、そしてまた、タンパク質から ＳＤＳのほとんどを除去するためにも使用した。２種のスクシニル化されたＩＬ −２を、７に調節されたｐＨを有する、ＤＥＡＥイオン交換）ＩＰＬＣカラムに 反応混合物を適用することによって、お互いから及び変性されていないＩＬ−２ から分離した。次に、精製されたプールを脱塩し、そしてマイクロ濃縮器を用い て濃縮した。

Ｂ、高度にスクシニル化されたＩＬ−２゜０．１Ｍ硼酸ナトリウム、ｐ）１９及 びＯ６１％ＳＤＳを含む５■／ｄのＩＬ−２溶液（該ＩＬ−２は、上記の産生過 程からの後−ダイアフィルトレージョンされたｄｅｓ−ａｌａ、ｓｅｒ＋２ｓｌ Ｌ−２）に、室温で攪拌しながら、ＩＬ−２０モル当り無水琥珀酸（ＤＭＦ中） １０モルを合計３又は６回の添加のために５分間隔で添加した。反応の間、種々 の時間での反応混合物のアリコートを、Ｇ１１ｌｉｓ、Ｓ、、など、　、　Ｊ、 　！　ｍｒｎｕｎｏ　１．、１２０．２０２７〜２０３２　（１９７８）に一般 的に記載されている方法によりＩＬ−２の生物活性（細胞増殖）についてアッセ イした。ＳＤＳを上記のようにして除去し、ｐＨを７．３に調整し、そしてその サンプルを、マイクロ濃縮器を用いて０．７■／＠！に濃縮した。

例■ スクシニル化されたＩ　Ｌ　−２Ｘｍの特徴化Ａ、無水琥珀酸：ＩＬ−２のモル 比を変えることによる、反応体からの変性されたＩＬ−２生成物のサイズ特徴化 。

例Ｉに記載の反応からの生成物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１４％）は、高度にスク シニル化されたＩＬ−２が変性されていないＩＬ−２よりもわずかに高い分子量 を示すことに指摘した。千ノー及びジ−スクシニル化されたＩＩ、−２種は、変 性されていないＩＬ−２の分子量にひじょうに近い分子量を有した。

Ｂ、変性の程度の関数としてスクシニル化されたＩＬ−２の生物活性。

例ＩＢの高度にスクシニル化されたＩＬ−２反応の前記溶離からの両分を、例Ｉ に記載のＩＬ−２細胞増殖バイオアツセイによりアッセイした。その結果は、す べてのＩＬ−２画分が生物活性であることを示す。ＩＬ−２の特異的生物活性の 大きな変動は、スクシニル化されたＩＬ−２の生物活性が変性されていないＩＬ −２の生物活性の約±３０％になることを引き起こす。

Ｃ０変性されていないＩＬ−２に比べてのスクシニル化されたＩＬ−２の溶解性 。

ＳＤＳの除去をもたらす反応及び続＜　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５クロマトグ ラフイー処理の後、すべてのＩＬ−２調製物のｐＨを、６．５〜７．０に低めた 。低いＳＤＳの変性されていないＩＩ、−２はｐＨ５〜７で沈殿した。モノ−ス クシニル化されたＩＬ−２は、可溶化剤を添加しないで改良された溶解性を示す が、しかし４℃での３日間の貯蔵又は室温での物理的な攪拌は、モノ−スクシニ ル化されたＩＬ−２の目に見える沈殿を引き起こした。しかしながら、高度にス クシニル化されたＩＬ−２は、Ｑ、７ｖｃＺ／＠ｌで完全に溶解し、そしてその 溶液は４℃で数週間にわたって安定していた。ジ−スクシニルＩＬ−２の溶解性 は測定されなかった。

Ｄ、変性されていないＩＬ−２に比べてのスクシニル化されたＩＬ−２の薬物動 力学。

１、千ノー＝及びジ−スクシニル化されたＩＬ−２変性されていないＴ　１．、 −２及びモノ−及びジ−スクシニル化されたＩＬ−２の薬物動力学データが、グ ループ当り合計８匹のマウスのそれぞれに、Ｄ５Ｗ　＜水中、５％デキストロー ス）中、タンパク質１２，５■を静脈注射した後、得られた。

４匹の雌のｂａｌｂ／Ｃマウスの２つのグループからのそれぞれのマウスの尾の 静脈中に３種のサンプルの１つを注射し：そして１５分後、後眼窩から採血した 。注射の後、種々の時間で、血液サンプル１００Ｉを、ヘパリンを添加された血 管中に後眼窩から採血した。すぐに血漿を、遠心分離（１分）にかけることによ って調製し、そしてアリコートを、例工に記載のようなバイオアッセイのために アッセイ媒体中に希釈した。

その結果は、モノ−及びジ−スクシニルＩＬ−２の血漿エントランスが実験的誤 差内で、変性されていないＩＬ−２の血漿エントランスと同じであることを指摘 した。

２、高度にスクシニル化されたＩＬ−２カニユーレ挿入された３匹の１！ｉｓｐ ｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙネズミに、スクシニル化されたＩＬ−２を静脈注射し た（２匹は変性されていないＩＬ−２を注射された）。ネズミを、それぞれの時 点でカニユーレから採血し、そして血漿を調製し、そして上記のようなバイオア ッセイのために媒体中に希釈した。高度にスクシニル化されたＩＬ−２は、変性 されていないＩＬ−２よりもより早く透明になることが見出された。

要約すれば、本発明は、スクシニル化されたＩＬ−２及びそのようなＩＩ、−２ を含む医薬組成物を供給することに関し、ここで１又はそれよりも多くのスクシ ニル成分に選択的に接合され、そしてそれによって生理学的ｐｔｌで水性媒体中 に可溶性又はより可溶性にされた生物学的に活性的な特異的ＩＬ−２がそのよう な媒体中に溶解されている。その接合は、ｐ１１６〜８で水中に通常疎水性の水 不溶性タンパク質を溶解せしめるのみならず、また多くの場合、その生理学半減 期をも変える。接合が存在しない場合、ＴＬ−２は、可溶化剤、たとえば界面活 性剤又は変性剤の添加により、可溶化剤の添加と共にｐＨを高めることにより、 又はｐＨを下げることにより溶解さ゛れるべきである。

以１余白 国際調査報告 ＡＲ’！ミニＸＴｏ’Ｘ：ミｉＥＸヱｆｆＥ：ｌシＭＡ’：ＸＣＮＡＬＳｉミ： −コ−ＲＣＨＭミニＥ？ＣＲＴＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．１又はそれよりも多くのスクシニル成分に共有的に及び選択的に接合されて いる、生物学的に活性的な接合されたインターロイキン−２であって、ここでそ の接合されていない形での前記インターロイキン−２は通常疎水性であり、そし て可溶化剤の不在下でｐＨ６〜８での水性キャリヤー媒体中に溶解しないことを 特徴とするインターロイキン−２。
2. ２．請求の範囲第１項記載のインターロイキン−２を溶解する、医薬的に許容さ れる非毒性の不活性水性キャリヤー媒体を含んで成る医薬組成物。
3. ３．前記媒体が約５〜８のｐＨであり、そして緩衝液を含む請求の範囲第２項記 載の組成物。
4. ４．前記インターロイキン−２がヒト源からの組換えインターロイキン−２であ る請求の範囲第２項又は３項記載の組成物。
5. ５．前記インターロイキン−２が、中性アミノ酸により置換された、生来のタン パク質の１０４及び／又は１２５位で存在するアミノ酸を有するインターロイキ ン−２ムテインである請求の範囲第２〜４項のいずれか１項記載の組成物。
6. ６．生物学的に活性的なスクシニル化されたインターロイキン−２を調製するた めの方法であって：（ａ）生物学的に活性的な、通常疎水性の水不溶性インター ロイキン−２と無水琥珀酸とを反応せしめ、そして（ｂ）スクシニル化されたイ ンターロイキン−２を単離することを含んで成る方法。
7. ７．医薬組成物を調製するための方法であって：（ａ）生物学的に活性的な、通 常疎水性の水不溶性インターロイキン−２と無水琥珀酸とを反応せしめ；（ｂ） スクシニル化されたインターロイキン−２を単離し；そして （ｃ）医薬的に許容できる非毒性不活性水性キャリヤー媒体中に前記スクシニル 化されたインターロイキン−２を配合することを含んで成る方法。
8. ８．段階（ａ）において、少なくとも合計２モルの無水琥珀酸を、１モルのイン ターロイキン−２当りに使用する請求の範囲第６項又は７項記載の方法。
9. ９．前記スクシニル化されたインターロイキン−２を、６〜８のｐＨで配合し、 そして前記インターロイキン−２がヒト源からである請求の範囲第７項又は８項 記載の方法。
10. １０．１又はそれよりも多くのスクシニル成分に共有的に及び選択的に接合され ている、生物学的に活性的な接合されたインターロイキン−２を含んで成る持効 性製剤であって、ここでそのスクシニル化されていない形での前記インターロイ キン−２は、通常疎水性であり、そして可溶化剤の不在下でｐＨ６〜８での水性 キャリヤー媒体中に溶解しないことを特徴とする配合物。