DE69131202T2 - Die Verwendung von IL-4 und TNF zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebszellen - Google Patents

Die Verwendung von IL-4 und TNF zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebszellen

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Lymphokine. Insbesondere betrifft sie die synergistischen Wirkungen von TNF und IL-4 bei der Inhibierung des Tumorzellenwachstums und der Cytotoxizität.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Ein Cytokin ist eine Molekülart, die durch eine Zelle produziert wird und diese oder andere Zellen beeinflußt. Es gibt eine Vielzahl von Cytokinen, die als Gruppe eine Vielzahl von Wirkungen sowohl auf normale als auch abnormale Zellen ausüben. Die Wirkung eines spezifischen Cytokins auf eine bestimmte Zelle ist vom spezifischen Cytokin und der Art der Zielzelle abhängig.
  • Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist ein Cytokin, das primär ein Produkt aktivierter Monocyten ist, und eine sehr pleiotrope Natur besitzt (Ayier et al. (1988) Tumor Necrosis Factors, CRC Handbook on Cytolytic Lymphocytes and Complement: Effectors of the Immune System (E. R. Podack, Herausgeber), CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., Seite 105; Goeddel et al. (1987) Tumor Necrosis Factors; Gene Structure and Biological Activities. In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, L1: 597). Es inhibiert das Wachstum einer Vielzahl von Tumorzellen in einer Kultur und stimuliert das Wachstum von Fibroblasten, B-Zellen und Thymocyten. Die cytotoxischen Wirkungen von TNF gegenüber Tumorzellen werden durch Interferone verstärkt (Lee et al. (1984) J. Immunol. 133: 1003; Sugarman et al. (1985) Science 230: 943; Aggarwal et al. (1985) Nature 318: 665; Vilcek et al. (1986) Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferons, in The Biology of the Interferon System. Herausgegeben von H. Schellekenes und W. E. Stewart; Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Seite 249; Fransen et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22: 419-426; Campbell et al. (1988) J. Immunol. 141: 2325-2329; Schiller et al. (1987) Cancer Res. 47: 2809-2813). Die Verstärkung der antiproliferativen Wirkungen von TNF durch Interferone begleitet die vermehrte Bildung von TNF- Rezeptoren (Aggarwal et al. (1985) Nature 318: 665; Fransen et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22: 419-426). Die Aufregulierung von TNF-Rezeptoren durch Interferone ist jedoch kein primärer Mechanismus für ihre synergistische cytotoxische Reaktion (Tsujimoto et al. (1986) J. Immunol. 137: 2272-2276; Aggarwal und Eessalu (1987) J. Biol. Chem. 262: 10000-10007).
  • Die synergistischen Wirkungen von Interferon-g und TNF auf die Tumorwachstumsregulierung wurden im US-Patent 4650674 beschrieben.
  • Interleukin-4 (IL-4) ist ein immunomodulatorisches Cytokin, das durch aktivierte T-Lymphocyten gebildet wird. Als einer einer Vielzahl von Immunsystemmodulatoren wurde es ursprünglich aufgrund seiner Fähigkeit, die B-Lymphocyten- Vermehrung zu costimulieren, als B-Zellen-Wachstumsfaktor beschrieben (Howard et al., J. Exp. Med. 155 (1982) 914). IL- 4 beeinflußt auch eine Vielzahl von Zellen, einschließlich T- Zellen, Mastzellen, Makrophagen, und hämopoetischen Vorläuferzellen (Paul et al. (1987) Ann. Rev. Immunol. 5: 429; Yokota et al. (1988) Immunol. Rev. 102: 137; Crabstein et al. (1986), J. Exp. Med. 163: 1405). IL-4 verstärkt das Wachstum verschiedener Zellarten einschließlich von T-Zellen und Mastzellen (Fernandez-Botran et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9689; Spits et al. (1987) J. Immunol. 139: 1142; Zlotnik et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3856; Mosmann et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Bei. USA 83: 5654), induziert die Expression von MHC-Klasse II-Antigen an B- Zellen und Monocyten (TeVelde et al. (1988) J. Immunol. 140: 1548), vermehrt Antigen-spezifische cytotoxische T-Zellen und verstärkt die Makrophagen-vermittelte Cytotoxizität (Spits et al. (1988) J. Immunol. 141: 29; Widmer et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 1447; Crawford et al. (1987) J. Immunol. 139: 135). Obwohl IL-4 die Bildung verschiedener Cytokine, einschließlich IL-1a, IL-b, IFN-g und TMF-a abschwächt, verstärkt es auch die Bildung von IL-6 aus B- Zellen (Essner et al. (1989) J. Immunol. 142: 3857; Lee et al. (1990) J. of Leukocyte Biol. 47: 475-479; Pelman et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 1751). Die IL-2 induzierte LAK- und NK- Zellaktivität wird durch IL-4 abgeschwächt (Brooks et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 74: 162; Nagler et al. (1988) J. Immunol. 141: 2349). Außer proliferativen Wirkungen von IL-4 wurde kürzlich auch gezeigt, daß es das Wachstum von menschlichem Lymphoid- und Plasmazellen-Neoplasma inhibiert (Taylor et al. (1990) Blood 75: 5)
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft synergistische Wirkungen von IL-4 auf die antiproliferative Wirkung von TNF. IL-4 verstärkt die cytotoxischen Wirkungen von TNF gegenüber einer Vielzahl von Tumorzellen, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, von Brusttumorzellen, Karzinomzellen, und Lymphomazellen. Diese synergistischen Wirkungen waren von der Dosis an TNF und IL-4 abhängig. Die Verstärkung der TNF- Cytotoxizität durch IL-4 ist mit der vergleichbar, die bereits für gamma-Interferon berichtet wurde.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die synergistischen Wirkungen eines von T-Zellen abgeleiteten Cytokins, Interleukin-4, auf die cytotoxischen Wirkungen von TNF bei Tumorzellen. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer zellfreien Zusammensetzung, die IL-4 und TNF in einem Einheitenaktivität-Verhältnis von 0,1 : 1 bis 200 : 1 umfaßt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen bereit. In einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung einer zellfreien Zusammensetzung, die IL-4 und Lymphotoxin in einem Einheitenaktivität-Verhältnis von 0,1 : 1 bis 200 : 1 umfaßt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen bereitgestellt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die zellfreie Zusammensetzung, die IL- 4 und Lymphotoxin umfaßt, auch gamma-Interferon.
  • Die antiproliferativen Wirkungen von TNF gegenüber einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien werden durch IL-4 verstärkt. IL-4 allein besitzt keine Wachstum-inhibierenden Wirkungen gegen diese Zelllinien, oder war in einigen Fällen schwach wachstumsstimulierend. Der Grad der Verstärkung der cytotoxischen Wirkungen von TNF durch IL-4 war quantitativ mit dem von IFN-g vergleichbar; der Mechanismus, durch den IL-4 und IFN-g die antiproliferativen oder cytotoxischen Wirkungen von TNF und Lymphotoxin (Lt) potenzieren, sind jedoch verschieden.
  • Die Verabreichung einer zur Behandlung von Tumorzellen geeigneten zellfreien Zusammensetzung, die Tumor-Nekrose- Faktor und Interleukin-4 umfaßt, an ein Tumor-tragendes Tier resultiert in einer Verringerung des Tumorwachstums. Vorzugsweise ist der Tumor-Nekrose-Faktor ein menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor. Der Tumor-Nekrose-Faktor kann aus irgendeiner Quelle erhalten werden. Solche Quellen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Vorzugsweise wird der Tumor-Nekrose-Faktor durch rekombinante Techniken hergestellt.
  • Vorzugsweise ist das IL-4 menschliches IL-4. Das IL-4 kann aus irgendeiner Quelle erhalten werden. Solche Quellen sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Besonders bevorzugt wird IL-4 durch rekombinante Techniken hergestellt.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt die Wirkung verschiedener Konzentrationen an TNF und IL-4 (100 ng/ml) auf die Zellen-Wachstumsfähigkeit einer menschlichen Brusttumor-Zelllinie (MDA-MB-330).
  • Fig. 2A und 2B zeigen die Wirkung verschiedener Konzentrationen an TNF und IL-4 (100 ng/ml) auf die Zellen- Wachstumsfähigkeit einer menschliches Epithelkarzinom- Zelllinie (A-431; Fig. 2A) und menschlichen histiozytischen Lymphoma-Zelllinie (U-937; Fig. 2B).
  • Fig. 3A und 3B zeigen die Wirkung verschiedener Konzentrationen an IL-4 auf die TNF-abhängige Cytotoxizität gegen A-431 (Fig. 3A)- und MDA-MB-330 (Fig. 3B)-Zelllinien.
  • Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Wirkung von IL-4 und IFN-g auf die TNF-abhängige Cytotoxizität gegen MDA-MB-330-Zellen.
  • Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Wirkung von IL-4 auf die TNF- und Lt-abhängige Cytotoxizität gegen MDA-MB-330-Zellen.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung der Erfinder, daß die antiproliferative Wirkung von TNF auf Tumorzellen durch die gleichzeitige Verabreichung von IL-4 und TNF an Tumorzellen verstärkt wird. IL-4 potenziert die cytotoxischen Wirkungen von TNF gegenüber einer Vielzahl von Tumorzellen, einschließlich, aber ohne darauf beschränkt zu sein, von Brusttumorzellen (MDA-MD-330), Vulva-Karzinomzellen (A431) und histiozytischer Lymphoma (U-937)-Zellen. Diese synergistische Wirkung war von der Dosis von TNF und von IL-4 abhängig. IL-4 allein zeigte minimale Wirkungen auf diese Zelllinien, wenn es allein verabreicht wurde. Bei einigen Zelllinien zeigte IL-4 aber eine signifikante proliferative Wirkung, wenn es allein verabreicht wurde. Die Verstärkung der TNF-Cytotoxizität durch IL-4 ist mit der vergleichbar, die bereits für gamma-Interferon (IFN-g) berichtet wurde.
  • Eine Zusammensetzung, die ein von T-Zellen abgeleitetes Cytokin, Interleukin-4, und TNF umfaßt, hat eine größere cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen als bei einer alleinigen Verabreichung von TNF. In einer Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung, die zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen verwendet wird, im wesentlichen gereinigtes TNF und IL-4. Diese Cytokine können aus irgendeiner Quelle abgeleitet sein, einschließlich von nativen oder rekombinant hergestellten Proteinen. Diese Zusammensetzung kann im wesentlichen gereinigtes TNF, IL-4 und gamma-Interferon (IFN-g) umfassen.
  • Der Ausdruck "Individuum" soll irgendein Tier, vorzugsweise einen Säuger, und insbesondere eine(n) Nager, Katze, Hund, Kuh oder einen Mensch umfassen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Tumor-Nekrose-Faktor bezieht sich auf ein von einem Lymphotoxin verschiedenes Polypeptid, das zu einer bevorzugten cytotoxischen Wirkung fähig ist, und einen Bereich aufweist, der eine funktionelle Aminosäurehomologie mit der reifer Tumor-Nekrose-Faktor- Aminosäuresequenz, einem Fragment davon, oder einem Derivat eines solchen Polypeptids oder Fragments, zeigt. Eine detaillierte Beschreibung des Tumor-Nekrose-Faktors, der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, wird im US-Patent 4650674 beschrieben.
  • Die bevorzugte cytotoxische Wirkung ist definiert als die bevorzugte Zerstörung oder Wachstumsinhibierung von Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen unter den gleichen Bedingungen. Die bevorzugte cytotoxische Aktivität wird durch die Wirkung des Polypeptids auf Tumorzellen in vivo oder vitro im Vergleich zu normalen Zellen oder Gewebe bestimmt. In vitro ist im allgemeinen die Zelllyse ein diagnostisches Indiz, während in in vivo-Experimenten die Tumor-Nekrose bestimmt wird. Die cytotoxische Wirkung kann jedoch als cytostatische oder antiproliferative Wirkung manifestiert werden. Geeignete Assay-Systeme sind allgemein bekannt. Z. B. ist der zur Bestimmung der spezifischen Aktivität von Tumor-Nekrose-Faktor verwendete nachstehend beschriebene Zell-lytische Assay brauchbar, sowie der in B beschriebene Assay.
  • Aggarwal et al. in "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, Herausgeber A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center (die A549-Zelllinie, auf die in dieser Arbeit bezuggenommen wird, ist von ATCC als CCL185 erhältlich).
  • Die spezifische Aktivität von TNF wird in Bezug auf die Zielzelllyse, und nicht als Cytostase angegeben. Eine Einheit Tumor-Nekrose-Faktor wird definiert als die Menge, die für 50% Lyse von Zielzellen erforderlich ist. Dies bedeutet jedoch nicht den Ausschluß anderer Assays zur Messung der spezifischen Wirkung, wie z. B. von Methoden auf der Basis der Zielzellen-Wachstumsrate.
  • Nativer Tumor-Nekrose-Faktor aus normalen biologischen Quellen weist ein durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmtes Molekulargewicht von ca. 17000 auf, einen isoelektrischen Punkt von ca. 5,3, eine Anfälligkeit gegenüber Trypsinhydrolyse an mehreren Stellen. Nativer Tumor-Nekrose- Faktor wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
  • Ein als Tumor-Nekrose-Faktor definiertes Polypeptid enthält Bereiche, die im wesentlichen homolog sind mit dem im US- Patent 4650674 beschriebenen Tumor-Nekrose-Faktor-Protein, oder Fragmenten davon über einen kontinierlichen Block von ca. 20 bis 100 Aminosäureresten, und insbesondere die Blöcke, die von den Resten 35 bis 66 und 110 bis 133 umfaßt werden.
  • Ein besonders signifikanter Faktor zur Feststellung der Identität eines Polypeptids als Tumor-Nekrose-Faktor ist die Fähigkeit eines Antiserums, das dazu fähig ist, im wesentlichen die cytolytische Aktivität des reifen Tumor- Nekrose-Faktors zu neutralisieren, auch die cytolytische Wirkung des in Frage stehenden Polypeptids im wesentlichen zu neutralisieren. Es ist jedoch festzustellen, daß die immunologische Identität und cytotoxische Identität nicht notwendigerweise gleich ausgebildet sind. Ein neutralisierender Antikörper für Tumor-Nekrose-Faktor könnte ein Kandidatenprotein nicht binden, weil der neutralisierende Antikörper nicht eine Stelle am Tumor-Nekrose-Faktor spezifisch binden könnte, die für seine cytotoxische Wirkung kritisch ist. Stattdessen könnte der Antikörper einen harmlosen Bereich binden und seine neutralisierende Wirkung durch sterische Hinderung ausüben. Ein in diesem harmlosen Bereich mutiertes Kandidatenprotein kann deshalb den neutralisierenden-Antikörper nicht mehr binden, aber es würde trotzdem im Hinblick auf eine wesentliche Homologie und biologische Wirkung ein Tumor-Nekrose-Faktor sein.
  • Von Bedeutung ist es, festzustellen, daß Charakteristika, wie z. B. das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt und dergleichen, für aus peripheren Lymphocyten oder Zelllinienkulturen erhaltenen reifen menschlichen nativen oder Wildtyp-Tumor-Nekrose-Faktor nur für die nativen Spezien des Tumor-Nektrose-Faktors beschreibend sind. Tumor-Nekrose- Faktor, wie er von der vorstehend angegebenen Definition umfaßt wird, kann auch andere Spezien umfassen, die nicht alle Charakteristika des nativen Tumor-Nekrose-Faktors zeigen. Obwohl Tumor-Nekrose-Faktor, wie er hier definiert wird, nativen Tumor-Nekrose-Faktor umfaßt, fallen unter die Definition auch andere verwandte cytotoxische Polypeptide. Z. B. bringen TNF-Derivate, wie die Insertionsmutanten, Deletionsmutanten oder Fusionsproteine, den Tumor-Nekrose- Faktor außerhalb des für nativen menschlichen Tumor-Nekrose- Faktor festgesetzten Molekulargewichts (Fusionsproteine mit reifem Tumor-Nekrose-Faktor oder pre-TNF-selbst, sowie Insertionsmutanten, werden ein größeres Molekulargewicht zeigen als nativer, reifer Tumor-Nekrose-Faktor, während Deletionsmutanten des nativen reifen Tumor-Nekrose-Faktors ein niedrigeres Molekulargewicht haben werden). Tumor- Nekrose-Faktor kann abgewandelt sein, um die Empfänglichkeit gegenüber einer Hydrolyse durch Trypsin oder andere Proteasen zu verringern oder zu eliminieren. Schließlich kann eine post-translationale Verarbeitung von menschlichem pre-TNF in von Nicht-Primaten-Säugern abgeleiteten Zelllinien eine Mikroheterogenität im Bereich des Aminoendes ausbilden, wodurch Valin nicht mehr das Aminosäureaminoende ist.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß der sprachliche Ausdruck "fähig" zur cytotoxischen Wirkung oder zur in vivo-Tumor- Nekrose bedeutet, daß der Ausdruck Tumor-Nekrose-Faktor Polypeptide einschließt, die, z. B. durch enzymatische Hydrolyse, aus einem einem Zymogen analogen inaktiven Zustand in ein Polypeptidfragment überführt sein können, das die gewünschte biologische Wirkung zeigt. Typischerweise sind inaktive Vorläufer Fusionsproteine, in denen reifer Tumor- Nekrose-Faktor über eine Peptidbindung an sein Carboxyl-Ende an ein menschlisches Protein oder ein Fragment davon gebunden ist. Die Sequenz an dieser Peptidbindung oder in der Nähe wird so gewählt, daß sie für eine proteolytische Hydrolyse empfänglich ist, um Tumor-Nekrose-Faktor entweder in vivo, oder als Teil eines Herstellungsprotokolls, in vitro freizusetzen. Der so gebildete Tumor-Nekrose-Faktor zeigt dann die gemäß der Definition erforderlich cytotoxische Wirkung.
  • Obwohl Tumor-Nekrose-Faktor normalerweise menschlichen Tumor- Nekrose-Faktor bedeutet, sind Tumor-Nekrose-Faktoren aus Quellen, wie z. B. Mäusen, Schweinen, Pferden oder Rindern, von der Definition des Tumor-Nekrose-Faktors umfaßt, solange er die vorstehend beschriebenen Standards für homologe Bereiche und die cytotoxische Aktivität erfüllt. TNF ist nicht Spezies-spezifisch, z. B. ist der menschliche TNF bei Mäusetumoren wirksam. Deshalb kann TNF aus einer Spezies zur Therapie einer anderen verwendet werden.
  • Tumor-Nekrose-Faktor umfaßt auch multimere Formen. Vom Umfang des Ausdrucks Tumor-Nekrose-Faktor werden auch Derivate von Tumor-Nekrose-Faktor umfaßt. Die Bereiche des Tumor-Nekrose- Moleküls innerhalb der Reste 35 bis 56 und 110 bis 133 einschließlich zeigen eine starke Homologie (50%) mit Lymphotoxin. Die hydrophoben Carboxy-Enden (Tumor-Nekrose- Faktor-Reste 150 bis 157) der zwei Moleküle sind ebenfalls signifikant erhalten. Da beide Proteine cytotoxische Wirkung oder in vivo Tumor-Nekrose zeigen, wird angenommen, daß diese Bereiche für die anteilige Aktivität von Lymphotoxin und Tumor-Nekrose-Faktor von Bedeutung sind. Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung kann deshalb in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung Lymphotoxin TNF ersetzen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Interleukin-4" oder "IL-4" bezieht sich auf ein Polypeptid, das ursprünglich als ein Faktor beschrieben wurde, der durch EL-4-Thymoma-Zellen und nachfolgende Aktivierung durch TPA, das die Vermehrung von durch submitogene Dosen an anti-Ig aktivierten Maus-B-Zellen induzierte, gebildet wurde. IL-4 wurde auch als B-Zellen- Wachstumsfaktor (BOGF), B-Zellen-stimulatorischer Faktor (BSF-1), T-Zellen-Wachstumsfaktor II (TCGF-II) und Mastzellen-Wachstumsfaktor-II (MCFG-II) bezeichnet (Howard et al. (1982) J. Exp. Med. 155: 914-923; Yokota et al. (1988) Immunol. Rev. 102: 137). Durch eine Vielzahl von T- Zellen/Lymphocyten-Populationen erzeugtes IL-4 kann durch Immunoassays (ELISAs) und Northern Blot-Analyse (Paliard et al. 1988) bestimmt werden. Typischerweise kann die IL-4- Aktivität in einem Bioassay der T-Zellen-Wachstum-fördernden Wirkung bestimmt werden, wie z. B. dem vom Spits et al. (1987) J. Immunol. 139: 1142-1147, beschriebenen. Zur Untersuchung der Aktivität von IL-4 und Identifikation von IL-4 sind für den Fachmann auf diesem Gebiet jedoch auch andere Methoden bekannt. Ein typischer Bioassay wird z. B. durchgeführt, indem man mononukleare periphere Blutzellen mit PHA 72 Stunden bei 37ºC aktiviert, die PHA-Blasten wäscht und auf einer 96- Vertiefungen enthaltenden Platte 5000 Zellen/0,1 ml/Vertiefung aufbringt. Die IL-4-Testproben werden seriell verdünnt und mit den Zellen 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zu den Zellen wurde tritiiertes Thymidin zugegeben und die IL-4-Aktivität durch Messen des Einbaus an tritiiertem Thymidin in die Zellen bestimmt. Eine Einheit IL-4 wird definiert als die Menge Cytokin, die die halbe maximale Vermehrung ergibt.
  • Die Reinigung des natürlich auftretenden IL-4 aus Kulturüberstände enthaltendem Serum wurde von Le et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10817-10823, beschrieben. Nach Kationenaustauschchromatographie an S-Sepharose wurden die mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M in 50 mM HEPES, pH = 7,0, eluierten IL-4-enthaltenden Fraktionen einer Gelfiltration an Sephadex G-100 unterworfen. Die IL-4- Fraktionen wurden weiter durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradienten von 20 bis 70% (V/V) Acetonitril in 0,1% (V/V) Trifluoressigsäure gereinigt.
  • Diese Verfahren ergeben Ausbeuten von ca. 60% und eine 3000- fache Reinigung (spezifische Aktivität: 2,6 · 10&sup7; E/mg). Die Reinigung von IL-4 aus den serumfreien Kulturüberständen erfordert nur eine Chromatographiestufe an cm-Sepharose und ergibt Ausbeuten von 40% und eine 100-fache Reinigung (spezifische Aktivität: 3 · 10&sup7; E/mg).
  • Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung ist irgendein Polypeptid mit IL-4-Aktivität und einem Bereich, der eine funktionelle Aminosäurehomologie mit der reifes IL-4- Aminosäuresequenz, einem Fragment davon oder einem Derivat eines solchen Polypeptids oder Fragments aufweist, brauchbar.
  • Die spezifische Aktivität von IL-4 wird trotz der Tatsache, daß in der vorliegenden Erfindung der Zweck die Potenzierung der TNF-Cytotoxizität ist, im Hinblick auf die Zellvermehrung angegeben. Das bedeutet jedoch nicht den Ausschluß anderer Assays zur Messung der spezifischen Aktivität, z. B. Methoden, die auf anderen biologischen Wirkungen auf die Zielzellen beruhen.
  • Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von IL-4 wurden von Yokota et al. (1988) Immunol. Rev. 102: 137, und Le et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10817-10823, beschrieben. Natives IL-4 aus normalen biologischen Quellen besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von ca. 20000 bis 22000 Da, bestimmt durch Gelfiltration, einen isoelektrischen Punkt von ca. 6,7, wenn die Zuckergruppen entfernt wurden, und 10,53 mit den Zuckergruppen, und eine Anfälligkeit gegenüber einer Hydrolyse durch Trypsin und Chymotrypsin. Die IL-4- Proteinsequenz weist 129 Aminosäuren auf, was ein theoretisches Molekulargewicht von 15000 Dalton ergibt. Dieses theoretische Molekulargewicht liegt nahe an den durch SDS-PAGE bestimmten Molekulargewichten von 15000, 18000 und 19000. Die Abweichung zwischen dem durch Gelfiltration und SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht wird den Kohlenhydrateinheiten zugeschrieben.
  • Rekombinantes IL-4 besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von ca. 22000 Da, bestimmt durch Gelfiltration, und 15000 durch SDS-PAGE, einen isoelektrischen Punkt von ca. 10,53, und eine Anfälligkeit gegenüber Hydrolyse durch Trypsin und Chymotrypsin.
  • Es ist bei 4ºC länger als 3 Monate stabil, länger als einen Monat bei Raumtemperatur, und ca. 10 Minuten bei 60ºC. IL-4 ist über einen weiten pH-Bereich (2-10) stabil. IL-4 ist insofern nicht Spezies-spezifisch, weil menschliches IL-4 auf Mäusezellen wirkt, aber Mäuse-IL-4 ist Spezies-spezifisch.
  • Der Grad der Aminosäuresequenzhomologie, die ein Polypeptid in den Rahmen der hier angegebenen Definition für IL-4 bringt, variiert abhängig davon, ob die Homologie zwischen dem Kandidatenprotein und IL-4 in oder außerhalb der IL-4- Bereiche liegt, die für die cytotoxische Wirkung verantwortlich sind. Domänen, die kritisch für die cytotoxische Aktivität sind, sollten einen hohen Grad an Homologie zeigen, um unter die Definition zu fallen, während Sequenzen, die zur Aufrechterhaltung der IL-4-Konformation oder für eine Rezeptorbindung keine Rolle spielen, eine vergleichsweise niedrige Homologie zeigen können. Zusätzlich können kritische Domänen eine cytolytische Wirkung besitzen und trotzdem homolog im Sinne der hier angegebenen Definition bleiben, wenn Reste, die funktionell ähnliche Aminosäureseitenketten enthalten, substituiert sind. Funktionell ähnlich bezieht sich auf die dominanten Eigenschaften der Seitenketten, wie z. B. basisch, neutral oder sauer, oder die Gegenwart oder Abwesenheit einer sterischen Gruppierung.
  • Ein äußerst signifikanter Faktor zur Feststellung der Identität eines Polypeptids als IL-4 ist die Fähigkeit eines Antiserums, das die biologische Aktivität von IL-4 im wesentlichen neutralisieren kann, auch die biologische Aktivität des in Frage stehenden Polypeptids zu neutralisieren. Es ist jedoch festzustellen, daß die immunologische Identität und die cytotoxische Identität nicht notwendigerweise im gleichen Bereich liegen. Ein neutralisierender Antikörper für IL-4 könnte ein Kandidatenprotein nicht binden, weil der neutralisierende Antikörper eine Stelle am IL-4, die für seine biologische Aktivität kritisch ist, nicht bindet. Stattdessen könnte der Antikörper einen harmlosen Bereich binden und seine neutralisierende Wirkung durch sterische Hinderung ausüben. Ein in diesem harmlosen Bereich mutiertes Kandidatenprotein könnte deshalb den neutralisierenden Antikörper nicht mehr binden, würde aber trotzdem im Hinblick auf eine wesentliche Homologie und biologische Aktivität IL-4 sein.
  • Von Bedeutung ist die Feststellung, daß Charakteristika, wie z. B. das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt und dergleichen, für das aus peripheren Lymphocyten und Zelllinienkulturen erhaltene reife native oder Wildtyp IL-4 nur für die native Spezien von IL-4 beschreibend sind. Das IL-4 im Sinne der vorstehenden Definition umfaßt andere Spezien, die nicht alle Charakteristika des nativen IL-4 zeigen. Obwohl das wie hier definierte IL-4 natives IL-4 einschließt, fallen auch andere verwandte Polypeptide unter die Definition. Z. B. werden IL-4-Derivate, wie Insertionsmutanten, Deletionsmutanten, oder Fusionsproteine, IL-4 aus dem für natives IL-4 festgesetzten Molekulargewichtsbereich bringen (Fusionsproteine mit reifem IL-4 sowie Insertionsmutanten werden ein größeres Molekulargewicht besitzen als natives reifes IL-4, während Deletionsmutanten von nativem IL-4 ein niedrigeres Molekulargewicht haben werden). IL-4 kann auch abgewandelt sein, um die Anfälligkeit gegenüber einer Hydrolyse durch Trypsin oder andere Proteasen zu verringern oder zu eliminieren.
  • Die erfindungsgemäß verwendete Zusammensetzung kann mit einem oder allen Polypeptiden in einer inaktiven Form, die durch enzymatische Hydrolyse aus einem zu einem Zymogen analogen inaktiven Zustand in ein Polypeptidfragment überführt werden kann, das die gewünschte biologische Aktivität besitzt, verabreicht werden. Typischerweise sind die inaktiven Vorläufer Fusionsproteine, in denen eines oder mehrere von IL-4-TNF und IFN-g über eine Peptidbindung am Carboxylende an ein menschliches Protein oder Fragment davon, oder entweder direkt oder indirekt an ein anderes der Polypeptide, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, gebunden sind. Die Sequenz an dieser Peptidbindung oder in der Nähe wird so gewählt, daß sie gegenüber einer proteolytischen Hydrolyse anfällig ist, um das IL-4, den Tumor-Nekrose-Faktor, und IFN-g entweder in vivo oder, als Teil eines Herstellungsprotokolls, in vitro freizusetzen. Die Zusammensetzung, die so ausgebildet wird, zeigt dann die definitionsgemäß erforderliche cytotoxische Wirkung.
  • Obwohl unter IL-4 üblicherweise menschliches IL-4 verstanden wird, ist im Rahmen der Definition von IL-4 IL-4 aus anderen Quellen, wie z. B. aus Maus, Schwein, Pferd oder Rind, eingeschlossen, solange es im übrigen die vorstehend für homologe Bereiche beschriebenen Standards und die cytotoxische Aktivität erfüllt.
  • Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung können auch multimere Formen von IL-4 verwendet werden.
  • Vom Umfang der Bezeichnung IL-4 werden auch Derivate von IL-4 umfaßt. Derivate umfassen Aminosäuresequenz-Mutanten, Glycosylierungs-Varianten und kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Gruppierungen. Kovalente Derivate werden durch Bindung funktioneller Gruppen an Gruppen, die in den IL-4-Aminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Enden vorhanden sind, mittels bekannter Methoden hergestellt.
  • So wie bei TNF umfassen mutante IL-4-Derivate bestimmte, d. h. stellenspezifische, Mutationen von IL-4 oder seinen Fragmenten, die zur erfindungsgemäßen Durchführung brauchbar sind. Mutiertes IL-4 wird als ein Polypeptid definiert, das im übrigen unter die hier angegebene Homologie-Definition für IL-4 fällt, aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der von IL-4 entweder aufgrund einer Deletion, Substitution oder Insertion verschieden ist. Methoden zur Herstellung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind allgemein bekannt, z. B. die M13- Primer-Mutagenese.
  • Im wesentlichen homogenes IL-4 oder Tumor-Nekrose-Faktor bedeutet IL-4 oder Tumor-Nekrose-Faktor, das (der) im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, die im Hinblick auf die Quelle, aus der das native Protein isoliert wurde, nativ sind. Dies bedeutet, daß homogenes IL-4 und/oder Tumor- Nekrose-Faktor im wesentlichen frei ist von Blutplasmaproteinen, wie z. B. Albumin, Fibrinogen, Serinproteasen, a-Globulinen, Nicht-Tumor-Nekrose-Faktorcytotoxischen Polypeptiden, wie z. B. Lymphotoxin oder Interferonen, oder anderen Proteinen der Zelle oder des Organismus, die als synthetischer Ursprung des Polypeptids dienen, einschließlich ganzer Zellen und teilchenförmiger Zelltrümmer. Im wesentlichen reine Polypeptide können jedoch Substanzen, wie die nachstehend beschriebenen Stabilisatoren und Träger, bestimmte Mengen an Proteinen von der Zelle oder dem Organismus, die als synthetischer Ausgangsstoff dienen, Proteine aus anderen als den ursprünglichen Polypeptidquellen-Zellen oder -Organismen, und synthetische Polypeptide, wie z. B. Poly-L-Lysin, umfassen. Rekombinantes IL-4 oder Tumor-Nekrose-Faktor, das/der in einer allo-, d. h. bakteriellen, Wirtzelle exprimiert wird, wird selbstverständlich vollständig frei von Genquellenproteinen exprimiert.
  • Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendetes IL-4 und Tumor-Nekrose-Faktor werden vorzugsweise in Kulturen von rekombinanten Organismen nach Methoden, die für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, synthetisiert.
  • Zur Verabreichung wird die Zusammensetzung durch Mischen von Tumor-Nekrose-Faktor und IL-4 mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch annehmbaren Trägern, d. h. Trägern, die gegenüber Empfängern in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind, hergestellt. Üblicherweise umfaßt dies das Kombinieren der IL-4- und TNF-Zusammensetzung mit Puffern, Antioxidantien, wie z. B. Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ca. 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose oder Dextrinen, Geliermitteln, wie z. B. EDTA, und anderen Stabilisatoren und Trägern. Der Träger sollte so formuliert werden, daß er die Zusammensetzung stabilisiert. Die zur therapeutischen Verabreichung bestimmte Zusammensetzung muß steril sein. Dies wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht. Die Zusammensetzung wird üblicherweise in lyophilisierter Form gelagert.
  • Da Interferone mit IL-4 und Tumor-Nekrose-Faktor synergistisch wirken, wird alpha-, beta- oder gamma- Interferon zweckmäßigerweise mit Tumor-Nekrose-Faktor/IL-4- Zusammensetzungen oder IL-4/Tumor-Nekrose-Faktor und Lymphotoxin-enthaltenden Zusammensetzungen kombiniert. TNF besitzt eine spezifische Aktivität von ca. 100 E/ng. Die spezifische Aktivität von IL-4 und IFN-g beträgt ca. 10 E/ng. Eine typische Formulierung umfaßt IL-4 und/oder IFN, und Tumor-Nekrose-Faktor und/oder Lymphotoxin in einem Einheitenaktivität-Verhältnis von 0,1 : 1 bis 200 : 1, und üblicherweise von 10 zu 1, und kann anstelle eines Teiles oder des gesamten Tumor-Nekrose-Faktors Lymphotoxin enthalten. Diese Anteile können selbstverständlich, wenn dies therapeutisch zweckmäßig ist, modifiziert werden.
  • IL-4/TNF-Zusammensetzungen werden an Tumor-tragende Tiere verabreicht. Der Weg der Verabreichung entspricht bekannten Methoden, z. B. der intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, intraläsionalen Infusion oder Injektion von sterilen IL-4/TNF-Lösungen, oder zeitlich regulierten Abgabesystemen, wie dies nachstehend angegeben wird. IL-4/TNF kann intraläsional, d. h. durch direkte Injektion in feste Tumore, verabreicht werden. Im Falle von disseminierten Tumoren, wie z. B. Leukämie, geschieht die Verabreichung vorzugsweise intravenös oder in das Lymphsystem. Tumore der Abdominalorgane, wie z. B. Ovarialkarzinom, werden vorteilhafterweise durch intraperitoneale Infusion unter Verwendung einer Peritonealdialysevorrichtung und peritonealverträglichen Lösungen behandelt. Üblicherweise wird IL-4/TNF jedoch kontinuierlich durch Infusion verabreicht, obwohl auch eine Bolusinjektion möglich ist.
  • IL-4/TNF wird zweckmäßigerweise aus einer implantierbaren Substanz zur zeitlich gesteuerten Abgabe verabreicht. Beispiele für geeignete Systeme für Proteine mit dem Molekulargewicht von Tumor-Nekrose-Faktor-Dimeren oder - Trimeren umfassen Copolymere von Ethyl-L-glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al. 1983, Biopolymers 22(1): 547-556), Poly(2-hydroxyethyl-methacrylat) (R. Langer et al. 1981, J. Biomed. Matter. Res. 15: 167-277, und R. Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), oder Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.). Diese Substanz wird an chirurgischen Eingriffsstellen, von denen Tumore ausgeschnitten wurden, implantiert. Alternativ wird die IL- 4/TNF-Zusammensetzung in semipermeable Mikrokapseln oder Liposome zur Injektion in den Tumor eingekapselt. Diese Verabreichungsart ist insbesondere für chirurgisch nicht entfernbare Tumore, z. B. Hirntumore, geeignet.
  • Die Methode zur Behandlung von Tumorzellen durch Verabreichung von TNF und IL-4 an Tumor-tragende Individuen umfaßt sowohl eine gleichzeitige als auch eine hintereinanderfolgende Verabreichung dieser Polypeptide. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es bekannt, daß die Wirkung einer gleichzeitigen Verabreichung auch durch Verabreichung eines der Polypeptide an das Individuum und nachfolgende Verabreichung des zweiten Polypeptids erzielt werden kann. Die zeitliche Koordinierung einer solchen hintereinanderfolgenden Verabreichung ist für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und hängt nur von der in vivo- Abbaurate des ersten verabreichten Polypeptids ab.
  • Die Menge der IL-4/TNF-Zusammensetzung, die verabreicht wird, hängt z. B. vom Verabreichungsweg, dem in Frage stehenden Tumor und dem Zustand des Patienten ab. Intraläsionale Injektionen werden, bezogen auf das Körpergewicht, weniger IL-4/TNF erfordern als eine intravenöse Infusion, obwohl einige Tumortypen, z. B. feste Tumoren, gegenüber Tumor- Nekrose-Faktor resistenter erscheinen als andere, z. B. leukämische. Für den Therapeuten ist es deshalb notwendig, zum Erhalt einer optimalen cytotoxischen Wirkung gegenüber dem Zieltumor die Dosierung wie erforderlich genau festzusetzen und den Verabreichungsweg zu modifizieren, wie dies z. B. durch Biopsie des Tumors oder diagnostische Assays auf vermeintliche Krebsmarker, wie z. B. karzinoembryonisches Antigen, im Hinblick auf eine rekombinante Toxizität, die mit einer höheren Dosierung verbunden ist, bestimmt werden kann. Es wurde festgestellt, daß Tumor-Nekrose-Faktor-Dosierungen bei Mäusen (bis zu ca. 120 mg/kg Körpergewicht/Tag durch intravenöse Verabreichung) normalerweise im wesentlichen nicht toxisch und in vivo wirksam sind. IL-4-Dosierungen sind bei Mäusen (bis zu ca. 120 mg/kg Körpergewicht/Tag durch intravenöse Verabreichung) normalerweise im wesentlichen nicht toxisch und in vivo wirksam.
  • Es wird nicht angenommen, daß Tumor-Nekrose-Faktor in seiner cytotoxischen Wirkung Spezies-spezifisch ist, weshalb Tumor- Nekrose-Faktoren, die vom menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor verschieden sind, z. B. vom Rind oder Schwein, erfindungsgemäß bei der Therapie menschlicher Tumore verwendet werden können. Zweckmäßig ist es jedoch, einen Tumor-Nekrose-Faktor von der zu behandelnden Spezies zu verwenden, um eine potentielle Ausbildung von Autoantikörpern zu vermeiden.
    • Beispiel 1 Zellukulturverfahren
  • Alle Zelllinien wurden in subkonfluenten Kulturen gehalten. Die Zellen wurden mit 0,3 bis 1,3 · 10&sup6; Zellen/25 mm Petrischale in DMEM-Medium, ergänzt mit Glutamin (2 mM), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 ug/ml) und fötalem Rinderserum (10%) in einem Befeuchtungs-Inkubator unter 5% CO&sub2; in Luft aufgetragen.
    • Beispiel 2 Cytotoxizität-Assays
  • Für Cytotoxizität-Assays wurden 5 · 10³-Zellen in 0,1 ml des Mediums auf Costar-Platten mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Nach Inkubieren über Nacht bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; in Luft wurde das Medium entfernt und eine serielle Verdünnung der Testprobe in 0,1 ml Medium durchgeführt. Nach 72 stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Medium entfernt und, wie von Sugarman et al. (1985) Science 230: 943, beschrieben, durch Anfärben mit Kristallviolett auf wachstumsfähige Zellen geprüft. Der Prozentsatz der relativen Zellen-Wachstumsfähigkeit wurde als optische Dichte in Gegenwart der Testprobe dividiert durch die optische Dichte in Abwesenheit der Testprobe (Medium), und mit 100 multipliziert, berechnet.
    • Beispiel 3 Radiorezeptor-Assay
  • Rezeptorbindungs-Assays wurden wie bei Aggarwal et al. (1985) Nature 318: 665 beschrieben, durchgeführt. 0,25 · 10&sup6; Zellen wurden in 12 · 75 mm Polypropylen-Röhrchen in 0,2 ml frischem eiskaltem Medium (DMEM+10% FBS), enthaltend 0,2 · 10&sup6; cpm ¹²&sup5;I-TNF, entweder in Gegenwart (nicht spezifische Bindung) oder Abwesenheit (vollständige Bindung) eines 100-fachen Überschußes an unmarkiertem TNF inkubiert. Nach Inkubation während 60 Minuten bei 4ºC wurde das Medium entfernt, die Zellen dreimal durch Zentrifugieren gewaschen, und die zellgebundene Radioaktivität bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
    • Beispiel 4 Erhöhung der antiproliferativen Wirkung von TNF durch IL-4
  • Es wurden die durch Interleukin-4 erhöhten antiproliferativen Wirkungen von TNF gegen verschiedene Tumorzellarten getestet. Verschiedene Konzentrationen von TNF allein oder in Kombination mit einer bestimmten Konzentration an IL-4 (100 ng/ml) wurden an einer Brusttumorzelllinie, MDA-MB 330, untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Nach der Inkubation von 5 · 10³ Zellen in 0,1 ml Medium, das die angegebene Menge an Cytokinen enthielt, während 72 Stunden wurde die Zellen-Wachstumsfähigkeit wie im Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
  • TNF allein hatte selbst bei so hohen Konzentrationen wie 10000 E/ml nur eine minimale Wirkung auf diese Zellen. Wenn IL-4 zu den Kulturen mit dem TNF zugegeben wurde, wurde das Wachstum dieser Zellen jedoch in einer Dosisabhängigen Weise inhibiert. Wie dies aus der Fig. 1 ersichtlich ist, wurde bei einer Konzentration von 10000 E/ml nur eine 10%-ige Zellwachstumsinhibierung beobachtet. Wenn jedoch 100 ng/ml IL-4 zugegeben wurden, wurde die Tumorzellenwachstumsinhibierung auf fast 60% erhöht. Die Potenzierung der cytotoxischen Wirkungen von TNF durch IL-4 wurde auch mit anderen Zelltypen, wie z. B. Vulva- Karzinomzellen (A431) und histiozytische Lymphomazellen (U- 937), beobachtet. Die Fig. 2A und 2B zeigen die Wirkung verschiedener Konzentrationen an TNF und IL-4 (100 ng/ml) auf die relative Zellen-Wachstumsfähigkeit (in %) einer menschlichen Karzinomzelllinie (A-431; Fig. 2A) und einer menschlichen histiozytischen Lymphomazelllinie (U-937; Fig. 2B). 0,5 · 10³ Zellen wurden in 0,1 ml des Mediums, das die angegebene Menge der Cytokine enthielt, während 72 Stunden inkubiert, und danach die Zellen-Wachstumsfähigkeit wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
  • Die Fig. 2A und 2B zeigen, daß bei so niedrigen Konzentrationen wie 0,01 E/ml des Cytokins eine signifikante Wirkung von IL-4 auf die TNF-abhängige Wachstumsmodulierung von A431-Zellen (Fig. 2A) beobachtet werden kann.
  • Die Erhöhung der cytotoxischen Wirkungen von TNF durch IL-4 war bei einer höheren Konzentration (1000 E/ml) an U-937- Zellen sogar noch ausgeprägter.
  • Die Wirkung variabler Konzentrationen an IL-4 auf eine bestimmte Konzentration an TNF (1000 E/ml) wurde ebenfalls untersucht. 5 · 10³ Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an Cytokinen in 0,1 ml des Mediums 72 Stunden inkubiert, und danach die Zellen-Wachstumsfähigkeit wie im Beispiel 1 angegeben bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt. Die Fig. 3A und 3B zeigen die Wirkung variierender Konzentrationen an IL-4 auf die Cytotoxizität von 1000 Einheiten/ml TNF gegen A-431 (Fig. 3A) und MDA-MB-330 (Fig. 3B)-Zelllinien. Die Wirkung einer einzigen Dosis an IL-4 (1 ug/ml) allein ist ebenfalls dargestellt. A-431-Zellen (Fig. 3A) wurden in einer Dosisabhängigen Weise in Gegenwart von IL-4 und TNF inhibiert. IL- 4 allein war sogar bei einer Konzentration von 1 ug/ml unwirksam. Eine ähnliche Dosis-abhängige Reaktion von IL-4 wurde mit Brusttumorzellen (Fig. 3B) beobachtet.
    • Beispiel 5 Vergleich der IL-4- und IFN-g-Potenzierung der TNF- Cytotoxizität
  • Es wurde bereits gezeigt, daß Interferon-g die cytotoxischen Wirkungen von TNF gegenüber einer Vielzahl von Tumorzelllinien ebenfalls verstärkt (US-Patent 4650674; Lee et al. (1984) J. Immunol. 133: 1003; Sugarman et al. (1985) Science 230: 943; Aggarwal et al. (1985) Nature 318: 665; Vilcek et al. (1986) Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferons. The Biology of the Interferon System, Herausgegeben von H. Schellekenes und W. E. Stewart. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Seite 249; Fransen et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22: 419-426; Campbell et al. (1988) J. Immunol. 141: 2325-2329; Schiller et al. (1987) Cancer Res. 47: 2809-2813; Tsujimoto et al. (1986) J. Immunol. 137: 2272-2276). Fig. 4 zeigt den Vergleich der Wirkung von IL-4 und IFN-g auf die TNF-abhängige Cytotoxizität gegenüber MDA-MB-330-Zellen. 5 · 10³ Zellen wurden in 0,1 ml des Mediums, das verschiedene Konzentrationen an TNF und entweder IL-4 (100 ng/ml) oder IFN-g (100 ng/ml) enthielt, während 72 Stunden inkubiert, und dann die Zellen-Wachstumsfähigkeit wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
  • Um zu bestimmen, ob IL-4 und IFN-g nach einem ähnlichen Mechanismus wirken, um die cytotoxischen Wirkungen von TNF zu potenzieren, wurde die Potenzierung der antiproliferativen Reaktion von TNF durch IL-4 und Interferon-g verglichen. Die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß bei Brusttumorzellen sowohl IL-4 auch als IFN-g bei gleichen Konzentrationen (100 ng/ml) die wachstumshemmenden Wirkungen von TNF in einem ähnlichen Ausmaß erhöhen. Es wurde eine ca. 60 bis 70%-ige Inhibierung des Zellwachstums beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit A-431- und U-937-Zellen erhalten (Tabelle I).
    • Tabelle I
  • Wirkung von Interleukin-4 und gamma-Interferon auf die TNF- abhängigen antiproliferativen Wirkungen gegenüber verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien¹. Relative Zellen-Wachstumsfähigkeit (%)
  • ¹ 5 · 10³ Zellen wurden in einem Volumen von 0,1 ml des Mediums, das entweder TNF (200 ng/ml) oder IL-4 (100 ng/ml) oder IFN-g (100 ng/ml) oder eine Kombination der Cytokine, wie vorstehend angegeben, enthielt, inkubiert. Im Falle der A-431-Zellen war die Konzentration aller Cytokine die gleiche mit Ausnahme von IFN-g (1 ng/ml). Nach einer Inkubation während 72 Stunden mit Cytokinen wurde die Zellen- Wachstumsfähigkeit durch Anfärben mit Kristallviolett, wie im Beispiel 1 angegeben, bestimmt.
  • IL-4 scheint auch die antiproliferativen Wirkungen von IFN-g leicht zu erhöhen, allerdings nicht in gleichem Ausmaß wie TNF (Tabelle I). Die Kombination aller drei Cytokine zusammen war maximal wirksam. Beim Test an A431-Zellen wurden z. B. mit TNF nur 30% Inhibierung des Zellwachstums beobachtet, 55%, wenn IL-4 und TNF zusammen zugegeben wurden, und 80%, wenn alle drei Cytokine in Kombination vorhanden waren, d. h. IFN- g, IL-4 und TNF (Tabelle I).
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß der Mechanismus, mit dem IFN-g die cytotoxische Reaktion von TNF verstärkt, verschieden ist von dem von IL-4. Um den Unterschied im Mechanismus der Potenzierung von TNF durch IL-4 und IFN-g zusätzlich zu zeigen, wurde die Wirkung beider Cytokine auf die Induktion des TNF-Rezeptors bestimmt. Es ist bekannt, daß IFN-g den Rezeptor für TNF induziert. Die in Tabelle II angegebenen Ergebnisse zeigen klar, daß eine Pre-Exposition von U-937- Zellen gegenüber IL-4 über Nacht keinen Anstieg der spezifischen Bindung von TNF verursachte, was auf keine Steigerung der Synthese neuer Rezeptoren hinweist. Der Mechanismus der IL-4-Potenzierung von TNF ist deshalb von dem von IFN-g verschieden. Tabelle II Wirkung von Interleukin-4 auf das Binden von Tumor-Nekrose- Faktor an U-937-Zellen¹
  • ¹ U-937-Zellen wurden mit IL-4 (1 ug/ml) 24 Stunden bei 37ºC behandelt und dann mit dem Medium gewaschen. 250000 Zellen wurden bei 4ºC eine Stunde in 0,2 ml Medium, das 0,2 · 10&sup6; cpm ¹²&sup5;I-TNF, enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 nm unmarkiertem TNF inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und die zellgebundene Radioaktivität wie im Beispiel 2 beschrieben bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
  • Eine Zugabe von IL-4 allein verursachte eine Proliferation bestimmter Zellen. Wie in Tabelle III gezeigt, erhöhte IL-4 das Wachstum der Brusttumorzelllinie ZR-75-1 gegenüber der Kontrolle um fast 40%. Die Zellen-proliferativen Wirkungen wurden auch mit einigen der anderen Zelllinien beobachtet, aber in einem geringeren Ausmaß. Das Wachstum von A-431- Zellen wurde durch IL-4 leicht inhibiert (Tabelle II). Diese Wachstums-stimulierenden Wirkungen von IL-4 waren dosisabhängig.
    • Tabelle III Modulation des Wachstums verschiedener menschlicher Tumorzelllinien durch Interleukin-4¹ Zellarten Relative Zellen-Wachstumsfähigkeit (%)
  • ZR-75-1 (Brusttumor) 140
  • MDA-MB-4GS (Brusttumor) 130
  • HS-OS7ST (Brusttumor) 132
  • BT-20 (Brusttumor) 110
  • MCF-7 (Brusttumor) 125
  • A-375 (Melanom) 120
  • MDA-MB-330 (Brusttumor) 110
  • A-431 (Vulva-Karzinom) 86
  • U-937 (histiozytisches Lymphom) 110
  • ¹ 5 · 10³-Zellen wurden mit Interleukin-4 (1 ug/ml) 72 Stunden lang inkubiert, und dann die relative Zellen- Wachstumsfähigkeit gemäß Beispiel 1 durch Anfärben mit Kristallviolett bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
    • Beispiel 6 Erhöhung der antiproliferativen Wirkung von Lymphotoxin durch IL-4
  • Beim Test gegenüber Tumorzellen erhöhte Interleukin-4 die antiproliferativen Wirkungen von Lymphotoxin (Lt). Die antiproliferative Wirkung von Lt (1000 E/ml) allein oder in Kombination mit IL-4 (1 ug/ml) wurde mit der Wirkung von TNF (1000 E/ml) allein oder in Kombination mit IL-4 (1 ug/ml) an einer Brusttumor-Zelllinie, MDA-MB-330, verglichen. Nach Inkubation von 5 · 10³ Zellen in 0,1 ml des Mediums, das die angegebene Menge an Cytokinen enthielt, während 72 Stunden, wurde die Zellen-Wachstumsfähigkeit wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 angegeben.
  • TNF allein hat eine minimale Wirkung auf diese Zellen, und inhibierte das Zellwachstum nur um 5%. Lt allein hatte ein geringe proliferative Wirkung auf diese Zellen. Die Zellen- Wachstumsfähigkeit in Gegenwart von IL-4 allein betrug 95 bis 98%. Wenn jedoch IL-4 zu den Kulturen mit TNF oder Lt zugegeben wurde, wurde das Wachstum dieser Zellen signifikant inhibiert. Wie dies auf Fig. 5 ersichtlich ist, wurde die Tumorzellwachstums-Inhibierung in Gegenwart von IL-4 und TNF um fast 60% erhöht, und in Gegenwart von IL-4 und Lt um 40%.
  • Der Mechanismus, mit dem IFN-g die TNF-Reaktion potenziert, ist nicht bekannt. Es ist bekannt, daß die Steigerung der cytotoxischen Wirkungen von TNF durch IFN-g die vermehrte Bildung der TNF-Rezeptoren begleitet (Aggarwal et al. (1985) Nature 318: 665; Vilcek et al. (1986) The Biology of the Interferon System, Seite 249). Unsere Untersuchungen zeigen jedoch, daß IL-4 TNF-Rezeptoren an Zellen, die dadurch beeinträchtigt werden, nicht vermehrt. Obwohl diese Beobachtungen anzeigen, daß der Mechanismus der Erhöhung der TNF-Reaktion durch IL-4 von der von IFN-g verschieden ist, wurde berichtet, daß die vermehrte Bildung der TNF-Rezeptoren durch IFN-g auch für ihre synergistische cytotoxische Antwort nicht ausreichend ist (Tsujimoto et al. (1986) J. Immunol. 137: 2272-2276; Aggarwal et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 10000-10007). Unsere Beobachtungen deuten auch darauf hin, daß IFN-g die Reaktion von TNF und IL-4 zusammen potenziert. Es ist deshalb möglich, daß diese zwei Agentien über unabhängige Mechanismen arbeiten. Für Interleukin-1 ist es ebenfalls bekannt, daß es die cytotoxischen Wirkungen von TNF verstärkt (Ruggiero und Baglioni (1987) J. Immunol. 138: 0661-0663; Holtmann and Wallach (1987) J. Immunol. 139: 1161-1167). Der Mechanismus, mit dem IL-4 die Wirkungen von TNF potenziert ist somit auch nicht klar. Im Gegensatz zu IFN-g wurde gezeigt, daß IL-1 die Bildung der Rezeptoren für TNF verringert. Neben Cytokinen können auch andere Mittel, wie z. B. Inhibitoren der Proteinsynthese und erhöhte Temperatur, die TNF-abhängige Cytotoxizität erhöhen (Watanabe et al. (1988) Cancer Res. 48: 650-653; Niitsu et al. (1988) Cancer Res. 48: 654-657). Untersuchungen mit Proteinsynthese- Inhibitoren deuten darauf hin, daß TNF die Synthese bestimmter Proteine induziert, was die Zellen vor der cytotoxischen Wirkung von TNF schützt (Himeno et al. (1990) Cancer Res. 50: 4941-4945; Watanabe et al. (1988) Immunopharmacol. Immunotoxicol. 10: 479-499). Es ist bekannt, daß sowohl der epidermale Wachstumsfaktor als auch der transformierende Wachstumsfaktor die antiproliferativen Wirkungen von TNF gegenüber verschiedenen Zelltypen inhibieren (Sugarman et al. (1987) Cancer Res. 47: 780-786). Es ist bekannt, daß diese Wachstumsfaktoren von verschiedenen Tumorzellen gebildet werden. Es ist deshalb möglich, daß IL-4 wirkt, indem es die Synthese dieser Wachstumsfaktoren inhibiert. Es ist auch möglich, daß IL-4 wirkt, indem es die Expression von C-fos und c-myc-onkogenen, von denen es bekannt ist, daß sie mit der Zellproliferation im Zusammenhang stehen, verringert.
  • Die cDNAs für Rezeptoren für TNF, IFN-g und IL-4 wurden kürzlich geklont (Idzerda et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 861- 873; Schall et al. (1990) Cell 61: 361-370; Loetscher et al. (1990) Cell 61: 351-359; Smith et al. (1990) Science 248: 1019- 1023; Auget et al. (1988) Cell 55: 273-280). Die Struktur dieser Rezeptoren hat jedoch ergeben, daß der Rezeptor selbst nicht für eine Signal-Transduktion ausreicht. Es ist bekannt, daß IL-4 die Bildung von TNF aus Makrophagen verringern kann (Essner et al. (1989) J. Immunol. 142: 3857; Hamilton (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3803), aber es wurde auch berichtet, daß IL-4 die Makrophagen-vermittelte Cytotoxizität erhöhen kann (Somers und Erickson (1989) Cell Immunol. 122: 178-187). Es wurde gezeigt, daß die letztere Eigenschaft primär auf TNF beruht (Feinman et al. (1987) J. Immunol. 138: 635-640). Es ist deshalb nicht klar, wie die Inhibierung der TNF-Bildung mit der Erhöhung der Makrophagen- Cytotoxizität durch IL-4 verbunden ist. Es ist möglich, daß die Erhöhung der Makrophagen-Cytotoxizität gegen Tumorzellen durch IL-4 durch die hier beschriebenen synergistischen Wirkungen von TNF und IL-4 zusammen vermittelt wird. Es wurde gezeigt, daß IL-4-produzierende Tumorzellen eine Antitumor- Wirkung in vivo gegen andere Tumore zeigen (Tepper et al. (1989) Cell 57: 503-512). Da IL-4 allein nicht direkt eine antiproliferative Wirkung in Tumorzellen in Kulturen hervorruft, wird der Mechanismus, durch den IL-4 als Antitumormittel in vivo wirkt, nicht verstanden. Es ist möglich, daß in dieser Situation IL-4 als Antitumormittel wirkt, indem es Makrophagen aktiviert sowie die Antitumorwirkungen von TNF potenziert.

Claims (7)

1. Verwendung einer zellfreien Zusammensetzung umfassend Interleukin-4 und Tumor-Nekrose-Faktor in einem Einheitsaktivität-Verhältnis von 0,1 : 1 bis 200 : 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Tumor-Nekrose-Faktor menschlicher Tumor-Nekrose- Faktor ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Interleukin-4 menschliches Interleukin-4 ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung Interleukin-4 und Tumor-Nekrose-Faktor in einem Einheitsaktivität- Verhältnis von 10 : 1 umfaßt.
5. Verwendung einer zellfreien Zusammensetzung umfassend Interleukin-4 und Lymphotoxin in einem Einheitsaktivität- Verhältnis von 0,1 : 1 bis 200 : 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorzellen.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Interleukin-4 menschliches Interleukin-4 ist.
7. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zusätzlich Interferon umfaßt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1299295A (en) * 1993-12-02 1995-06-19 President And Fellows Of Harvard College Improved efficacy of alpha-helical cytokines
US5679338A (en) * 1994-05-12 1997-10-21 Osteoarthritis Science, Inc. Use of IL-4 for inhibition of the breakdown of articular cartilage and other tissues
US6277368B1 (en) 1996-07-25 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine
CN1100566C (zh) * 1998-08-26 2003-02-05 北京师范大学 含有钙调神经磷酸酶b亚基的药物组合物
UA71952C2 (en) * 1999-11-16 2005-01-17 Urea aromatic derivatives as antiinflammatory agents
CN100482683C (zh) * 2005-06-09 2009-04-29 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 人富含甘氨酸蛋白的活性片段及其应用
CN113368219B (zh) * 2021-06-28 2024-05-10 广东工业大学 Globulol的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4650674A (en) * 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
US4770995A (en) * 1985-08-29 1988-09-13 New York Blood Center, Inc Detection of the sensitivity of cells to the effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin
US4962091A (en) * 1986-05-23 1990-10-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled release of macromolecular polypeptides

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