CN1053838C - 肿瘤坏死因子和白细胞介素-4的协同 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种包括肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介质-4(IL-4)的组合物。该组合物以依赖剂量的方式抑制人体乳腺肿瘤细胞、人体外阴癌细胞及人体组织淋巴瘤细胞的生长。当人体乳腺癌细胞只露于TNF或IL-4时，很少能影响其生长特性。但是，将这两种细胞介素合并在一起，它们就可按剂量依赖方式抑制这些细胞的生长，另外，干扰素-gamma(IFN-g)进一步可加强TNF和IL-4组合物的抗增殖作用。

Description

肿瘤坏死因子和白细胞介素-4的协同
本发明涉及淋巴介素。更具体地说，它涉及TNF和IL-4对肿瘤细胞生长的抑制和对细胞毒性的协同作用。
细胞介素(激肽)是由一个细胞产生的多种类的分子，它可侵袭细胞本身或其它细胞。它有许多种类细胞介素作为一组对正常细胞与异常细胞都发挥出广泛效应。特定的细胞介素对特定细胞的效应取决于特殊的细胞介素及靶细胞的种类。
肿瘤坏死因子(TNF)是细胞介素，它是活性单核细胞的初产物并且在自然界是多效性的(Ayier，et al.(1988)肿瘤坏死因子，溶细胞淋巴细胞和补体的CRC手册：免疫系统的效应子(E.R.Po-dack，ed.)，CRC，出版公司.，Boca Raton，Fla.，105页；Goed-del，et al.(1987)肿瘤坏死因子：基因结构和生物活性。在ColdSpring Harbor Symposia中的定量生物学，L1：597)。它抑制了大量肿瘤细胞在孵育时的生长并刺激成纤维细胞、B-细胞和胸腺细胞的产生。TNF对肿瘤细胞的细胞毒性作用被干扰素所加强(Lee，等(1984)J.Immunol 133：1003；Sugarman，等(1985(Science 230：943；Aggarwal，et al.(1985)Nature 318.665；Vilcek，等(1986)肿瘤坏死因子和干扰素的相互作用，在干扰素系统的生物学中。H.Schellekenes和W.E.Stewart编辑，Elsevier Science Publishers，Amsterdam.，P.249；Fransen等(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22：419-426；Campbell等(1988)J.Immunol.141：2325-2329；Schiller，等(1987)Cancer Res.47：2809-2813)。干扰素增长了TNF抗增殖效应并同时使TNF受体向上调节(Aggarwal，等(1985)Nature 318：665；Fransen，等(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22：419-426)。但是，干扰素使TNF受体上向调节不是它们协同细胞毒性应答的原始机制(Tsujimoto等(1986)J.Immunol.137：2272-2276；Aggarwal和Eessalu(1987)J.Biol.Chem.262：10000-10007)。
在美国专利第4,650,674中揭示了干扰素-g和TNF对肿瘤生长调节的协同作用，这里列出供参考。
白细胞介素-4(IL-4)是一种由活性T-淋巴细胞产生的免疫调节的细胞介素。许多免疫系统调控代谢物中的一种最初被描述为B-细胞长生因子，因为它能共同刺激B-淋巴细胞的增殖(Howard等J.Exp.Med.155：914(1982)。IL-4也侵袭许多种类细胞，包括T-细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造血祖细胞(Paul等(1987)Ann.Rev.Immunol.5：429；Yokota等(1988)、Immunol.Rev.102：137；Crabstein等(1986)J.Exp.Med.163：1405)。IL-4增加了包括T-细胞和肥大细胞的等一类的细胞生长(Fernandez-Botran等(1986)Proc.Natal.Acad.Sci.USA 83：9689；Spits等(1987)J.Im-munol.139：1142；Zlotnik等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3856；Mosmann，等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA 83：5654)，诱导MMC类II抗原在B-细胞和单核细胞上表达(TeVelde等(1988)J.Immunol.140：1548)，增加了抗原特定细胞毒性的T-细胞并增长了传递细胞毒性的巨噬细胞(Spits等(1988)J.Immunol.141：29；Widmer，等(1987)J.Exp.Med.166：1447；Crawford，等(1987)J.Immunol.139：135)。同时IL-4向下调节包括IL-1a、IL-b、IFN-g和TNF-a的一些细胞介素的产生，它也向上调节从B-细胞中产生IL-6(Essner等(1989)I.Immunol142：3857，Lee等(1990)J.of Leukocyte Biol.47：475-479；Pelman等(1989)J.Exp.Med.170：1751)。IL-2诱导的LAK及NK细胞活性被IL-4向下调节(Brooks等(1988)Clin.Exp.Immunol.74：162；Nagler等.(1988)J.Immunol.141：2349)。此外，最近IL-4的增殖效应也显示出抑制人体淋巴和血浆细胞瘤的生长(Taylor等(1990)Blood 75：5)。
本发明涉及IL-4对TNF抗增殖活性的协同作用。IL-4-加强了TNF对种种肿瘤细胞，包括(但不局限于)乳腺肿瘤细胞、瘤细胞和淋巴瘤细胞细胞毒性作用。这些协同效应视TNF和IL-4的剂量而定。将IL-4使TNF细胞毒性的增长与以前报道的干扰素γ相比较。
本发明涉及T-细胞产生的细胞介素，IL-4对TNF在肿瘤细胞内细胞毒性作用的协同作用。在一个实例中，本发明提供了一种基本包括纯化的TNF和IL-4的组合物。在另一个实例中，提供了一种基本包括纯化的TNF、IL-4和干扰素-γ(IFN-γ)。在再一个实例中提供了该种组合物用来抑制肿瘤细胞生长的用途。在另一个实例中提供了用该组合物杀死肿瘤细胞的用途。
TNF对许多不同细胞系的抗增殖作用被IL-4所加强。单独的IL-4对这些细胞系无生长抑制作用，或者有时稍微剌激其生长。将被IL-4所增加的细胞毒性作用程度与被IFN-γ增加的相比较；但是，IL-4和IFN-γ加强TNF和淋巴因子(Lt)的抗增殖作用或细胞毒性作用的机制是不同的。
给患肿瘤的动物使用无细胞的、适合治疗肿瘤细胞的、包括TNF和IL-4的组合物将导致肿瘤生长降低。较好的是，肿瘤坏死因子是人体肿瘤坏死因子。肿瘤坏死因子可从任何来源中得到。这类来源是该技术领域中公知的。较好的是，肿瘤坏死因子是重组体产生的。
较好的是，IL-4是人体IL-4，IL-4可从任何来源处得到，这类来源是该技术领域中公知的。最好IL-4是重组体产生的。
本发明也提供了一种治疗肿瘤的方法，它包括给患肿瘤的动物使用包括治疗肿瘤有效量的TNF和IL-4的组合物。
另外，本发明提供了一种包括TNF、IL-4和IFN-γ的组合物。当给患肿瘤的动物使用本发明组合物时则减少了肿瘤的生长并对肿瘤细胞有选择性的细胞毒性。
读了下面的实施例详细阐述并结合附图、综述，将使本发明的目的、特征及改进成为显而易见的了。
图1显示不同浓度的TNF和IL-4(100ng/ml)对人体乳腺肿瘤细胞系(MDA-MB-330)的细胞存活性的作用。
图2表明不同浓度的TNF和IL-4(100ng/ml)对人体上皮癌细胞系(A-431；上部方格)及组织细胞淋巴瘤细胞系(U-937，下部方格)的细胞存活性的作用。
图3表明不同浓度的IL-4对依赖TNF的对A-431(上部方格)和MDA-MB-330(下部方格)细胞系细胞毒性的作用。
图4表明将IL-4和IFN-γ对TNF依赖的对MDA-MB-330细胞的细胞毒性作用进行比较。
图5表明将IL-4对TNF和Lt依赖的对MDA-MB-330细胞得细胞毒性作用进行比较。
本发明详细提供了一种通过给肿瘤细胞使用共存TNF的IL-4而增加TNF的增殖活性的方法。IL-4加强了TNF对种种肿瘤细胞，包括乳腺肿瘤细胞(MDA-MD-330)、外阴癌细胞(A431)和组织细胞淋巴瘤细胞(11-937)的细胞毒性作用。协同作用视TNF和IL-4的剂量而定。当单独使用IL-4时，它对这些细胞系的作用最小。事实上，对一些细胞系而言，单独使用IL-4展示出有效的增殖活性。将被IL-4所增加的TNF毒性与以前报告的干扰素γ(IFN-γ)进行比较。
本发明提供了一种包括T-细胞产生的细胞介素、IL-4和TNF的协同组合物。该组合物对肿瘤细胞的细胞毒性大于只使用TNF所产生的细胞毒性。在一个实例中，由本发明提供了包括基本纯化的TNF和IL-4的组合物。这些细胞介素可从任何来源得到，包括从天然蛋白质和重组体产生的蛋白质中得到，在另一实例中提供了一种包括基本纯化的TNF、IL-4和干扰素-γ(IFN-γ)的组合物。在再一个实例中提供了该组合物用来抑制肿瘤细胞生长的用途。在另一个实例中提供了用本发明组合物杀死肿瘤细胞的用途。
此“个体”意指包括任何动物，较好的是哺乳动物，最好是啮齿动物、猫、狗、母牛或人。
这里所用的术语“肿瘤坏死因子”指除了淋巴因子外而能产生适宜的细胞毒性活性，并有一区带显示出与成熟肿瘤坏死因子的氨基酸顺序、其片段或这类多肽或片段的衍生物同源的官能性的氨基酸的多肽。美国专利第4,650,674中揭示了用于本发明的肿瘤坏死因子，在此列出供参考。
适宜的细胞毒性活性与相同条件下正常的细胞相比，其对肿瘤细胞的适宜的杀灭作用或生长抑制作用，通过多肽对在体内或体外肿瘤细胞的影响并与正常细胞或组织相比较来检测适宜的细胞毒性活性。细胞溶解一般是体外的诊断指征，而肿瘤坏死则在体内实验中检查，但是，细胞毒性活性作用白细胞郁积或抗增殖活性是显而易见的。合适的分析系统是公知的，例如，用来检测如下所述的肿瘤坏死因子的特异活性的溶细胞分析是可接受的，如B.Aggarwal等在“胸腺激素和淋巴因子”中所述的分析(A.Goldslein编辑，关于健康卫生的春天座谈会，乔治·华盛顿大学医学中心)(在此文献中A 549细胞系是可从ATCC中得到的CCL185)。
TNF的特异活性是靶细胞溶解而不是白细胞郁滞。1单位的肿瘤坏死因子被定义为使50％靶细胞溶解所需的量。但是，这并不排除其它测量特异活性的分析，例如，根据靶细胞生长率为基础的方法。
来自正常生物来源的天然肿瘤坏死因子在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上的计算分子量约17,000，异电点约5.3，在多个位点易于进行胰蛋白水解，用反相HPLC来纯化天然肿瘤坏死因子。
一般定义为肿瘤坏死因子的多肽将含有与美国专利第4,650,674号所述的肿瘤坏死因子蛋白基本同源的区带或与其有20-100氨基酸残基的持续区带的片段，特别包含残基35-66和110-133的区带的片段基本同源的区带。
在建立作为肿瘤坏死因子的多肽的同一性中最充分的因素是成熟肿瘤坏死因子的溶细胞活性，以便基本中和正在讨论的多肽的溶细胞活性。应当认识到免疫同一性和细胞毒性同一性不需要共存。由于中和抗体正好不定向特异地连接到其细胞毒性活性为临界的肿瘤坏死因子上，故对于肿瘤坏死因子的中和抗体可能不与候补蛋白结合。可替代的是抗体可结合在无害区域并通过空间障碍发挥其抑制中和作用。因此，在此无害区域突变的候补蛋白可能不再与中和抗体结合，但就其基本同源和生物活性而言它是INF。
观察从外周淋巴细胞所得的或对于天然类肿瘤坏死因子建立细胞系培养所得的天然或野生型成熟人体肿瘤坏死因子的诸如分子量、异电点之类的特征是很重要的。前面所指TNF也包括也显示的天然肿瘤坏死因子的所有特征的其它种类。既然这里所定义的肿瘤坏死因子包括天然肿瘤坏死因子，那么其它相关的细胞毒性的多肽也属于此范围中。例如，像插入突变体、删除突变体或熔合蛋白的TNF衍生物使肿瘤坏死因子超越了为天然肿瘤坏死因子所建立的分子量(带有成熟肿瘤坏死因子的熔合蛋白或前TNF本身及插入突变体的分子量大于天然成熟的肿瘤坏死因子，而天然成熟肿瘤坏死因子删除突变体的分子量较低)。相似地，可以操纵肿瘤坏死因子以减少或消除被胰蛋白或其它蛋白酶水解的易变性。最终，从非灵长目哺乳动物中派生出来的细胞系中，人体前TNF的后衍化过程可在氨基末端区域产生出微异质性，结果缬氨酸不再是氨基末端的氨基酸。
注意“能产生细胞毒性活性”或体内肿瘤坏死的语言意味着肿瘤坏死因子一词包括如通过酶水解使多肽从非活性状态源转化至酶原再至有所需生物活性的多肽片段。典型的，非活性前体是熔合蛋白，其中成熟肿瘤坏死因子在多肽的骨架羧基末端处与人体蛋白或其片段相连。选择该肽骨架或肽骨架附近的顺序以使其在体内或在人工制造部分的体外易于进行蛋白水解以释放出肿瘤坏死因子。这样产生的肿瘤坏死因子就显示出特定所需的细胞毒性活性。
既然肿瘤坏死因子通常意指人体肿瘤坏死因子，那么来源于鼠、猪、马或牛的肿瘤坏死因子也称为肿瘤坏死因子，只要它能同样满足上述同源区带及细胞毒性活性的标准。TNF不是种族特异的，例如人的TNF对鼠肿瘤是活性的。因此，来自一个种族的TNF可用于另一个种族治疗中。
肿瘤坏死因子也包含多种形式。肿瘤坏死因子的衍生物包括在肿瘤坏死因子的范畴内。肿瘤坏死因子分子在35-66和110-133残基的区域显示出与淋巴因子基本同源(50％)。两分子的疏水羧基末端(肿瘤坏死因子残基150至157)也可被有效保存。由于两种蛋白显示出细胞活性或体内肿瘤坏死，据信这些区域在表现出淋巴因子活性及肿瘤坏死因子活性方面是重要的，因此，在实践本发明中，本发明组合物中的淋巴介素可用TNF取代。
这里所用的术语“白细胞介质-4”或“IL-4”指一种多肽，它是最初由EL-4胸腺细胞产生的因子，然后通过TPA活化，它诱导被亚有丝分裂素量抗-Ig活化的鼠B-细胞的增殖。IL-4也称为B-细胞生长因子(BOGF)，B-细胞刺激因子(BSF-17)，T-细胞生长因子II(TCGF-II)及肥大细胞生长因子-II(MCFG-II)(Houard等(1982)J.Exp.Med.155：914-923；Yokota等(1988)J.Immunol.Rev 102：137。由种种T-细胞/淋巴细胞群产生的IL-4可通过免疫分析(ELISAS)和Northern污渍分析(Paliard等1988)。典型地，在诸如Spits等(1987)J.Immunol.139：1142-1147中所揭示的亚细胞生长促进活性的生物分析中来检测IL-4活性。但是，用来分析IL-4活性并部别IL-4的其它方法是该技术领域人员公知的。例如，通过使外周单核血细胞用PHA在37℃下活化72小时，用PHA一细胞洗涤并在96-井的金属平板上铺5000细胞/0.1ml/井的平板而进行典型的生物分析，将IL-4试验样品作一系列稀释并在37℃下与细胞培养72小时。将研磨的胸腺密啶核甙并通过测量掺入细胞中的研磨的胸腺嘧啶核甙来测定IL-4活性，一单位IL-4被定义为得到最大增殖一半的细胞分裂量的量。
在Le等(1988)J.Biol Chem.263：10817-10823中阐述了来自含有培养液上清液的血清中天然产生IL-4的纯化，简言之，在S-琼脂糖上经阳离子层析后，含组份的IL-4用0-0.5M的NaCl梯度在50mM HEPES，pH7.0中洗脱，然后部分在Sepkadex G-100上过滤。IL-4部分进一步用反相HPLC纯化，用20-70％(v/v)乙腈的梯度在0.1％(v/v)三氟乙酸中洗脱。
这些过程导致约60％和3000一倍纯化的发现(特异活性：2.6×107u/mg)。从无培养上清液的血清中纯化IL-4只要求在CM-琼脂糖上的一个色谱层析步骤，结果得到40％和100一倍纯化(特异活性：3×107u/mg)。
在本发明中任何有IL-4活性并具有显示出与成熟IL-4氨基酸顺序同源的氨基酸官能团的区域的多肽，或这类多肽或其片段的衍生物是有用的。
尽管IL-4用于本发明是加强TNF细胞毒性，但IL-4的特定活性被认为是使细胞增殖。但是，这并不意味着排除其它测量特定活性的分析，例如基于对靶细胞的其它生物作用的方法。
Yokota等(1988)Immunol.Rev102：137和Le等(1988)J.Bi-ol.Chem.263：10817-10823阐述了IL-4的物化性质，来源于正常生物源的天然IL-4的由凝胶过滤测得的，计算分子量为约20,000-22,000Da，除去糖基时异电点约为6.7，带有糖基的异电点为10.53，它易于被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。IL-4蛋白顺序有129个氨基酸，其理论分子量为15,000道尔顿，该理论分子量接近于由SDS-PAGE测定的分子量15,000、18,000和19,000。凝胶过滤测得的分子量与SDS-PAGE所测得分子量不同之处是通过碳水化合物部分计算。
重组体IL-4的计算分子量：由凝胶过滤测得的约22,000道尔顿，由SDS-Page测得的约15,000，其异电点为约10.53，它易于被胰蛋白酶和糜蛋白酶水解。
它在4℃下可在多于3个月内稳定，在室温下于1个多月内稳定，在56℃下约稳定10分钟。IL-4在宽的pH范围(2-10)稳定。由于人IL-4可作用于鼠细胞上，故IL-4无种族特异性，但鼠IL-4是种族特异性的。
使多肽属于IL-4定义范围里的同源氨基酸程度视候补蛋白和IL-4属于或不属于IL-4对细胞毒性活性应答的区域是否是同源而定。细胞毒性活性的临界区域应当有高度的同源性以符合定义，然而顺序与保持IL-4构象无关或不影响相对低同源性的受体。另外，若含功能相似的氨基酸付链被取代，临界区域可存在溶细胞活性且仍保持这里所定义的同源性。功能相似是指副链的显性特征，如碱性、中性或酸性，或是否有空间体积存在。
在建立多肽作为IL-4的最充分的因素是抗血清的能力，它能基本中和IL-4的生物活性，也就是基本中和所讨论的多肽的生物活性。但是，据认为免疫同一性和细胞毒性同一性不一定要共存。由于中和抗体正好不与在其临界生物活性的IL-4特定点上定向结合，故对于IL-4的中和抗体不与候补蛋白结合。可代替的是，抗体可结合至无害区域并通过空间障碍发挥作用。因此，在此无害区域突变的候补蛋白可能不再与中和抗体结合，但就其基本同源性和生物活性而言它是IL-4。
观察从外周淋巴细胞所得的或对于天然类IL-4建立细胞系培养所得的天然或野生型成熟IL-4的诸如分子量、异电点之类的特征是很重要的，前面所定义的IL-4也包括未显示的天然IL-4的所有特征的其它种类。既然这里所定义的IL-4包括天然IL-4，那么其它相关的细胞毒性的多肽也属于定义范围中。例如，像插入突变体，删除突变体或熔合蛋白的TNF衍生物使IL-4超越了为天然IL-4所建立的分子量(带有成熟IL-4的熔合蛋白及插入突变体的分子量大于天然成熟的IL-4，而天然成熟IL-4删除突变体的分子量较低)。相似地，可以操纵IL-4以减少或消除被胰蛋白或其它蛋白酶水解的易变性。
本发明的组合物可用一种或多种多肽以非活性的形式而被使用，通过酶水解可从非活性状态源转化成酶原再成为有所需生物活性的多肽片段。典型的，非活性前体是熔合蛋白，其中一种或多种IL-4、TNF和/或IFN-γ通过肽骨架在其羧基末端连接人体蛋白或其片段，或者直接或间接地连接至本发明中的另一种多肽上。选骨架羧基末端处与人体蛋白或其片段相连。选择该肽骨架或肽骨架附近的顺序以使其在体内或有人工制造部分的体外易于进行蛋白水解以释放出IL-4、肿瘤坏死因子及IFN-γ。这样形成的组合物表现出特定所需的细胞毒性活性。
既然IL-4通常意指人体IL-4，那么来源于鼠、猪、马或牛的IL-4也包括于IL-4的定义中，只要它能同样满足上述同源区带及细胞毒性活性的标准即可。
IL-4的多种形式也可用于本发明中。
IL-4的衍生物包括于术语IL-4的范围中。衍生物包括氨基酸顺序突变体、糖基化变体及与其它化学部分共价或聚合配对物。用已知方法将官能团连接至在IL-4氨基酸的侧链上的基团上或在N-或C-末端的基团上从而制得共价衍生物。
与TNF相比，突变体IL-4衍生物包括可用于本发明的预定的(即位点特定)的IL-4突变或其片段。突变体IL-4被定义为对IL-4同样定义同源的多肽，但其氨基酸顺序与是否经过删除、取代或插入的IL-4顺序不同。在已知顺序的DNA预定位点上进行取代突变的技术也是已知的，例如M13初级诱变。
基本同型的IL-4或肿瘤坏死因子表示来源的天然蛋白已被分离掉的基本无其它天然蛋白的IL-4或肿瘤坏死因子。这表示同型IL-4和/或肿瘤坏死因子基本上无血浆蛋白，诸如白蛋白、纤维蛋白原、血清蛋白酶、α-球蛋白、诸如淋巴毒素或干扰素的非肿瘤坏死因子细胞毒性多肽，或其它作为合成多肽原料的其它细胞或器官的蛋白质，包括全细胞及部分细胞碎片。但是，基本纯的多肽可以包括下述作为稳定剂和赋形剂的物质，预定量的作为合成原料的来自细胞或器官的蛋白质，来自除原始多肽源外的细胞或器官的蛋白质以及诸如聚-L-赖氨酸的合成多肽。
在异基团，例如细菌、宿主细胞中表达的重组体或肿瘤坏死因子完全不表达基因源蛋白质。
用于本发明的IL-4和TNF较好地通过该领域已知的方法在重组体生物的培养中合成。
通过使肿瘤坏死因子及有所需纯度的IL-4与生理学上可接受的载体，即在使用的剂量与浓度时无毒的载体相混合而制得本发明的组合物。一般来说，这必须将IL-4和TNF的本发明组合物与缓冲液、诸如抗血坏酸的抗氧剂、低分子量多肽(少于10个残基)、蛋白质、氨基酸、包括葡萄糖或右旋糖的碳水化合物，诸如EDTA的螯合剂以及其它稳定剂和赋型剂相混合。配制载体以稳定组合物。用作治疗的组合物必须进行消毒。这通过消毒过滤膜过滤而容易地进行。组合物一般以冻干形式贮存。
另外，由于干扰素与IL-4和肿瘤坏死因子起协同作用，故α-、β-或γ-干扰素可与TNF/IL-4组合物或IL-4TNF和含淋巴毒素的组合物相合并。TNF的特定活性为约100U/ng。IL-4和IFN-g的特定活性为约10U/ng。典型的配方包括IL-4和或IFN以及肿瘤坏死因子和/或淋巴毒素，其单位活性比例为0.1∶1-200∶1，一般为10-1，它可含有淋巴毒素来代替部分或全部的肿瘤坏死因子，当然，这些比例在治疗时要进行改变。
给患肿瘤的动物使用IL-4/TNF。根据已知方法进行使用，例如，静注、腹腔内注射、肌注、患处浸或注入消毒的IL-4/TNF溶液，或通过下面所注出的定时释放系统。IL-4/TNF可在患处给药，即直接注入固体肿瘤中。对于诸如白血病的扩散肿瘤，较好地通过静脉或淋巴系统给药。诸如胰腺癌的腹部器官的肿瘤有利地用腹膜渗析设备及腹膜相容的溶液通过腹腔内浸注进行治疗。但是一般来说，虽然大量注射是允许的，但IL-4/TNF通过浸注而被连续给药。
IL-4/TNF从可植入的定时释放物品中给药。适用于分子量为肿瘤坏死因子二聚体或三聚体蛋白质的系统的例子包括L-谷氨酸和α-乙基-L-谷氨酸酯(U.Sidman，等1983，“Biopolymers”22(1)：547-556)，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer，等，1981，“J.Biomed.Matter.Res.”15：167-277和R.Langer，1982，“Chem.Tech.”12：98-105)或乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等，同上)。该物品插入肿瘤处的开刀处。可替换的是，将IL-4/TNF装入半渗透性的微胶囊内或脂质体内以注射到肿瘤内。这种给药模式对于不可手术切除的肿瘤，如脑肿瘤尤为有用。
通过给患肿瘤的个体使用TNF和IL-4的本发明治疗肿瘤细胞的方法是将这些多肽协同使用并按顺序给药。该技术领域人员已知通过给个体使用任何一种多肽然后再使用第二种多肽来模拟协同给药的效果。这类按顺序给药的时间选择对该技术领域人员来说是显而易见的，它只视第一次服用的多肽在体内的降介率而定。
使用IL-4/TNF组合物的量要根据，例如使用途径、肿瘤情况及病人情况而定。患处内注射IL-4/TNF的用量少于静脉输液所需的量，而一些肿瘤类型，如固体肿瘤对TNF的耐药性比其它肿瘤，如白血病的耐药性大。因此，必须对治疗者微调剂量并按需要改进给药途径以得到对靶肿瘤的最佳细胞毒性活性，如通过肿瘤的活组织检查或用诸如癌胚胎抗原的推定的肿瘤标记的诊断分析来检测，根据重组体的毒性来评算其剂量。一般来说，业已发现在鼠体内的肿瘤坏死因子剂量(静脉注射直至约120mg/kg体重/天)基本是无毒并有效的。已发现IL-4的剂量(静脉注射直至约120ng/kg体重/天)在鼠体内基本无毒并有效的。
据信肿瘤坏死因子在其细胞毒性活性上无种族特异性，结果非人体肿瘤坏死因子的肿瘤坏死因子，如来自牛或猪的肿瘤坏死因子可用于本发明组合物中以治疗人体肿瘤。但是，需要用来自同种的肿瘤坏死因子以避免产生潜在的自身抗体。
这里列出所有的引用文献供作参考。
对本发明作出总的阐述后，下面通过特定的实施例以作出更彻底的理解。这些实施例仅供阐述之用，除非作同样说明外它们不用于限定本发明。
                        实施例1
                     细胞的培养过程
将所有的细胞系严格保持在汇合的培养基下，将细胞放在0.3-1.3×106细胞/25mm佩特里细菌培养器的DMEM培养基中，它用谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)及胎牛血清(10％)作营养物，在5％CO2的空气下于潮湿孵化器中培养。
                     实施例2
                   细胞毒性分析
作为细胞毒性分析，将在0.1ml培养基中的5×103细胞放在96井的平板上。在5％CO2的空气中的潮湿大气压下于37℃下孵化过夜，除去培养基，在0.1ml培养基中作出一系列的试验样品稀释。在37℃下孵化72小时后，除去培养基，用如Sigarman等(1985)Science230：943中所述的结晶紫色染色来监测存活细胞。将试验样品存在下的光密度除去无试验样品存在时(培养基)的光密度乘100可计算出相关细胞的存活百分率。
                      实施例3
                    放射受体分析
如Aggarwal等(1985)Nature 318：665所述进行受体结合分析。简言之，将0.25×105细胞放在含0.2×106Cpm125I-TNF的0.2ml新鲜冰冷培养基(DMEM+10％FBS)的12×75mm聚丙烯试管中于100-倍过量的不能标记TNF存在下(非特定结合)。或它们不存在时(总结合)进行孵化。在4℃下孵化60分钟后，除去培养基，细胞通过离心洗涤三次，测定细胞结合的放射活性。所有测定重复三次。
                      实施例4
               IL-4增加TNF的抗增殖作用
当对不同肿瘤细胞类型进行试验时，IL-4增加了TNF的抗增殖作用。对乳腺肿瘤细胞系、MDA-MB330检查只用种种浓度的TNF或与固定浓度IL-4(100ng/ml)合并的种种浓度TNF的作用。结果如图1所示。如实施例1所述来检测5×103细胞在含指定量细胞分裂素的0.1ml培养基中接着孵化72小时后细胞的存活性。所有测定重复三次。
只用TNF，即使其浓度高达10,000U/ml对这些细胞仅有极少影响。但当IL-4加至含有TNF的培养基中时，这些细胞的生长以剂量依赖的方法而被抑制了。如图1所示。在10,000U/ml浓度下仅观察到10％细胞生长抑制。但是，当再加入100ng/ml IL-4时，肿瘤细胞生长抑制增加至近60％。在诸如外阴癌细胞(A431)和组织淋巴细胞(N-937)的其它细胞类型中也可观察到TNF的细胞毒性作用被IL-4所加强。图2表示不同浓度的TNF和IL-4(100ng/ml)对人体上皮癌细胞系(A-431；上部方格)及人体组织淋巴细胞系(U-937，下部方格)的相关细胞存活性的影响。将0.5×103细胞放在含有脂定量的细胞分裂素的0.1ml培养基中孵化72小时，然后根据实施例1所述来检测细胞存活性。
图2表明在低达0.01U/ml细胞分袭素浓度下可观察到IL-4对A431细胞(上部方格)的TNF-依赖的生长修饰的充分影响。
在高浓度(1000U/ml)下甚至对U-937细胞(下部方格)IL-4可增加TNF的细胞毒性影响。
种种浓度的IL-4对固定浓度TNF(1000U/ml)的作用也被研究了。将5×103细胞与指定浓度的细胞分裂素在0.1ml培养基中孵育72小时，然后如实施例1所指出的那样测定细胞存活性。所有测定重复三次。图3表明种种浓度IL-4对1000单位/ml TNF时A-431(上部方格)和MDA-MB-330(下部方格)细胞系的作用。也显示了只用单剂量IL-4(1μg/ml)的作用。A-431细胞(下部方格)在IL-4和TNF两者的存在下以剂量依赖方法受到抑制，只用IL-4即使在1μg/ml浓度下也是无效的。用乳腺肿瘤细胞(下部方格)到IL-4相似的剂量依赖应答。
                        实施例5
            IL-4和IFN-γ加强TNF细胞毒性的比较
前面已表明干扰素-γ也增加TNF的细胞毒性作用。(美国专利第4,650,674，Lcc(1984)J.Immunol.133：1003；Sugarman(1985)Science 230：943；Aggarwal等(1985)Nature 318：665；Vilcek等(1986)肿瘤坏死因子和干扰素之间的相互作用。干扰素系统的生物学，Schellekenes和W.E.Steware编辑.Elsevier科学出版社，Ams-terdam.，第249页；Fransen等.(1986)Eur.J.Cancer Clin.Oncol.22；419-426；Campbell等(1988)J.Immunol.141：2325-2329；Scgukker(1987)Cancer Res.47：2809-2813；Tsujimoto.(1986)J.Im-munol.137：2272-2276).图4表明IL-4和IFN-g对TNF依赖的对MDA-MB-330细胞的作用比较。使5×103细胞在含不同浓度TNF和IL-4(100ng/ml)或IFN-γ(100ng/ml)的0.1ml培养基中孵化72小时，然后如实施例1所述检测细胞的存活性。所有的测定重复三次。
为了决定IL-4和IFN-γ是否是通过相似的机理来加强TNF的细胞毒性作用，比较IL-4和干扰素-γ对TNF抗增殖应答的加强，结果如图4所示，它表明对乳腺肿瘤细胞同样浓度(100ng/ml)的IL-4和IFN-γ以相似的程度增加TNF的生长抑制作用。观察到约60-70％细胞的生长抑制。用A-431和N-937细胞可观察到相似的结果(表I)。
                         表    I
            白细胞介质-4和干扰素γ对依赖TNF的对
             种种人体肿瘤细胞系抗增殖作用的影响
                           相关的细胞存活率(％)细胞介素                  MDA-MB-        A-431       U-937
                      330无                        100            100         100TNF                       80             71          89IL-4                      103            86          104IFN-g                     82             69          104TNF+IFN-g                42             33                50TNF+IL-4                 51             45                64TNF-g+IL-4               60             48                89TNF+IFN-g+IL-4           38             20                41
将5×103细胞放在含有TNF(200ng/ml)或IL-4(100ng/ml)或IFN-γ(100ng/ml)或如上所指出的与细胞分裂素合并的0.1ml体积培养基中进行培养。对于A-431细胞而言，除了IFN-γ为(1hg/ml)外所有细胞分裂素的浓度相同。与细胞分裂素一起孵育72小时后，如实施例1所指出的通过结晶紫染色来检测细胞的存活性。
虽然IL-4的增长程序与TNF的不同，但IL-4也明显地增加IFN-γ的抗增殖作用。此外，所有三种细胞分裂素合并在一起可达到最大效能。例如，当对A431细胞试验时，用TNF只观察到30％细胞生长抑制，当IL-4和TNF加在一起时55％细胞生长抑制，当三种细胞分裂素一起存在时IFN-γ、IL-4和TNF存在时，80％细胞生长抑制(表I)。
这些结果表明IFN-g增加TNF的细胞毒素应答的机制与IL-4是不同的。为了进一步表明IL-4和IFN-γ对TNF的加强机理是不同的，测定两种细胞介素对TNF受体诱导作用。已知IFN-γ可诱导TNF受体，表II所示的结果明确指出将U-937细胞对IL-4预暴露过夜不增加TNF的特定结合，它提示对新受体不增加协同作用。因此，IL-4加强TNF与IFN-γ的机理是不同的。
                     表    I
           白细胞介质-4对肿瘤坏死因子结合
                至U.937细胞上的影响处理          总结合        非特异性结合         特异结合
                                            (每分钟计数)无            1271+20          264+43              1007IL-4          1203+50          277+25              926
将U937细胞用IL-4(1μg/ml)在37℃下处理24小时。然后用培养基洗涤。在4℃下将250,000细胞在含0.2×106Cpm的125I-TNF的0.2ml培养基中在100nm未标记TNF存在或无其存在下的孵化。此后，洗涤细胞并如实施例2所述来测定细胞结合放射活性。所有测定重复三次。
当只加入IL-4时会引起某些细胞增殖。如表III所示，IL-4对乳腺肿瘤细胞系ZR-75-1比对照增加了40％的生长。用其它细胞系也可观察到细胞增殖作用，但其程度较小。通过IL-4可稍微抑制A-431细胞的生长(表II)。这些IL-4生长刺激作用被发现是剂量依赖性的。
                    表    III
             通过白细胞介质-4来调节种种
                 人体肿瘤细胞的生长细胞类型                                  相关的细胞存活(％)ZR-75-1(乳腺肿瘤)                               140MDA-MB-4GS(乳腺肿瘤)                            130HS-OS7ST(乳腺肿瘤)                              132BT-20(乳腺肿瘤)                                 110MCF-7(乳腺肿瘤)                                 125A-375(黑色瘤)                                   120MDA-MB-330(乳腺肿瘤)                         110A-431(外阴癌)                                 86U-937(组织细胞淋巴癌)                        110
将5×103细胞与白细胞介素-4(1μg/ml)一起孵化72小时，然后根据实施例1通过结晶紫染色测定相关的细胞存活性，所有的测定重复三次。
                       实施例6
                  通过IL-4增加淋巴因子
                     的抗增殖作用
当用细胞介素-4对肿瘤细胞进行试验时它可增加淋巴因子(Lt)的抗增殖作用。将单独使用比(1000U/ml)或与IL-4(1μg/ml)结合使用的对乳腺肿瘤细胞素，MDA-MB330抗增殖作用与单独用TNF(1000U/ml)或与IL-4(1μg/ml)结合使用的抗增殖作用相比较。接着将5×103细胞于含指定量细胞毒素的0.1ml培养基中孵化72小时，如实施例1所述来检测细胞的存活性，所有测定重复三次。结果如图5所示。
单独使用TNF对这些细胞仅有最小的影响，只抑制5％的细胞生长，单独使用Lt对这些细胞稍有增殖作用，只有IL-4存在时细胞的存活率达95-98％。但是，将IL-4加至带有TNF或Lt的培养物中，明显抑制了这些细胞的生长。如图5所示，在IL-4和TNF存在下，对肿瘤细胞的抑制增长为约60％，在IL-4和Lt存在下，其上升为40％。
尚不了解IFN-γ加强TNF应答的机理。已知IFN-γ对TNF细胞毒性作用上调伴随着TNF受体上调(Aggarwal等(1985)Zature 318：665；Vilcck等(1986)The Biology of the Interferon System，等249页)
但是，我们的研究显示IL-4不能上调被作用细胞上的TNF受体。即使这些观察指通过已知IL-4增加TNF应答的机制与IFN-γ的不同，业已报道即使IFN-γ上调TNF受体也不是协同细胞毒性应答的充分理由(Tsujimoto，等(1986)J.Immunol.137：22722276；Aggarw-al等(1987)J.Biol.Chem.262：10000-10007)。我们的观察也表明IFN-γ加强IFN-γ加强TNF和IL-4的应答。因此，可能这两种试剂通过各自的机理发挥作用。已知IL-1也可增强TNF的细胞毒性作用(Ruggiero and Baglioni(1987)J.Immunol.138：0661-0663；Holt-mann和Wallach(1987)J.Immunol.139：1161-1167)。因此，IL-4加强TNF作用的机理也是不清楚的。与IFN-γ相反，IL-1已表明对TNF受体有向下调节作用。除细胞介素外，诸如蛋白合成抑制剂的其它试剂及温度升高都能增加TNF依赖的细胞毒性(Watanabe，等(1988)Cancer Res.48：650-653；Niitsu，等(1988)Cancer Res.48：654-657)。用蛋白质合成抑制剂试验意指TNF诱导某些可以保护细胞不受TNF细胞毒性作用影响的蛋白质产生。(Himeno等(1990)Cancer Res.50：4941-4945；Watanabe，等(1988)Im-munopharmacol.Immunotoxicol.10：479-499).已知上皮生长因子和转移生长因子都可抑制TNF对一些细胞类型的抗增殖作用。(Sugarman等(1987)Cancer Res.47：780-786)已知这些生长因子由种种肿瘤细胞所产生。因此，可能IL-4通过抑制这些生长因子和合成而发挥作用。也可能IL-4通过向下调节已知与细胞增殖的C-fos和C-myc致癌基因的表达而发挥作用。
对于TNF、IFN-γ和IL-4的受体的cDNA最近已被克隆(Idzerda等(1990)J.Exp.Mde.171；861-873；Schall等，(1990)Cell 61：361-370；Loetscher等(1990)Cell61：351-359；Smith等，(1990)Science 248：1019-1023；Auget等，(1988)Cell 55：273-280)但是，这些受体的结构表明受体本身不足以进行信号转导。已知IL-4可向下调节巨噬细胞形成TNF(Essner等(1989)J.Immunol.142：3857；Hamilton，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3803)。但也报道IL-4可增加巨噬细胞调节细胞活性Somers和Erickson(1989)CellImmunol.122：178-187)。后者已显示出TNF的初步应得物(Fein-man等(1987)J.Immunol.138：635-640)。因此，尚不清楚TNF的产生抑制如何伴随着IL-4增加巨噬细胞的细胞毒性。可能IL-4增加巨噬细胞对肿瘤细胞的毒性是通过这里所述的TNF和IL-4的共同协同作用，现已显示IL-4形成肿瘤细胞在体内对其它肿瘤有抗肿瘤活性(Tepper等(1989)Cell 57：503-512)。由于只用IL-4对在培养基中的肿瘤细胞不直接产生抗增殖作用，现尚不了解IL-4作为体内抗肿瘤剂的机理。可能是通过活化巨噬细胞及加强TNF的抗肿瘤作用而使IL-4作为抗肿瘤剂。
该技术领域人员应懂得，本发明极适合完成上述目的并得到上述的优良结果。这里所述的组份、方法、过程及技术仅代表较好的实例，仅供例举用而不能用来限定本发明的范围。该技术领域人员对其作出的改进及其它用途也包括于本发明的精神及附上的权利要求书所定义的范围。

Claims (7)

1.一种适合治疗肿瘤细胞的无细胞组合物的制备方法，包括使用协同抗肿瘤有效量的肿瘤坏死因子和白细胞介素-4，其中在所述的组合物中，肿瘤坏死因子的浓度为2微微克(Pg)至2微克，所述的白细胞介素-4的浓度为2微微克至10微克。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的肿瘤坏死因子是人体肿瘤坏死因子。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的IL-4是人体白细胞介素-4。
4.一种适合治疗肿瘤细胞的无细胞组合物的制备方法，包括使用协同抗肿瘤有效量的肿瘤坏死因子、白细胞介素-4及干扰素，其中在组合物中，所述的肿瘤坏死因子的浓度为2微微克至2微克，所述的白细胞介素-4的浓度为2微微克至10微克，所述的干扰素浓度为2微微克至2微克。
5.一种适合治疗肿瘤细胞的无细胞组合物的制备方法，包括使用协同抗肿瘤有效量的淋巴因子和白细胞介质-4，其中在所述组合物中，所述淋巴因子的存在浓度为2微微克至2微克，所述白细胞介素-4的浓度为2微微克至10微克。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其中所述的白细胞介素-4是人体白细胞介素-4。
7.一种适合治疗肿瘤细胞的无细胞组合物的制备方法，它包括使用协同抗肿瘤有效量的淋巴因子、白细胞介素-4及干扰素，其中在所述的组合物中，所述的淋巴因子的存在浓度为2微微克至2微克，所述的白细胞介素-4的浓度为2微微克至10微克，所述的干扰素的浓度为2微微克至2微克。
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