CN1100566C - 含有钙调神经磷酸酶b亚基的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过调节免疫系统治疗哺乳动物疾病的药物组合物，它含有治疗这种疾病有效量的CaNB亚基和/或其功能衍生物。

Description

含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物

本发明涉及含有钙调神经磷酸酶B亚基(CaNB)的药物组合物。

钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)是目前所知唯一依赖钙，钙调素(calmodulin，CaM)的蛋白磷酸酶。70年代末，80年代初首先在哺乳动物脑内发现并得到纯化。后来在人，兔的非神经组织乃至某些肿瘤细胞中均有发现。CaN的分子量是80KD，由催化亚基A(61KD)和调节亚基B(19KD)按1∶1组成。(Klee，C B et al.，The calmodulin regulated proteinphosphatase molecular aspects of cellular regulation，1988，Vol 5，p225)。

CaN A亚基是全酶催化和调节的核心。生物化学研究表明，它至少包含了4个结构域：与金属离子的结合区(或催化区)，与调节亚基B(CaNB)的结合区，与调节剂CaM的结合区及自抑制区。催化部位在A亚基上的最有力证据是：将A，B二亚基分离后，A亚基仍表现出蛋白磷酸酶的活性。CaN在蛋白磷酸酶分类中属丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。命名为蛋白磷酸酶2B，其催化亚基A和此家族的其他成员特别是蛋白磷酸酶1，2A等有很高的同源性。这主要发生在它们的催化区域，因此它们的催化机制极其相似。但每种磷酸酶有着不同的调节区域和亚基，因而产生出结构和功能的差异。CaNA亚基与其他磷酸酶不同的是它的C末端多出170个氨基酸序列，此序列为B亚基结合区，CaM结合区和自抑制区，它们都与调节CaN磷酸酶的活性有关。

人的CaN B亚基由169个氨基酸组成，它是钙结合蛋白家族中的一员，其一级结构与CaM，肌钙蛋白C等非常相似，与CaM的序列有31％-35％的同源性。并也有4个EF手的钙结合区域。钙离子结合区的氨基酸序列有更为高度的保守性。CaN B亚基与CaM的空间结构也极其相似，都包括了两个球型的，分别含有2个结合钙的结构域和连接两个结构域的中心α螺旋。与CaM不同的是CaM的两个球型钙结构域位于中心α螺旋的两侧，而CaNB亚基的两个球型钙结构域通过中心螺旋在85位甘氨酸处发生急剧转变，连同C末端的β链形成了一个疏水凹槽。使这两个球型钙结构域覆盖在其上侧，而CaNA亚基的B亚基结合中心螺旋(BBH)中的疏水氨基酸就结合在这个疏水凹槽中，成为CaN A，B二亚基结合的结构基础。(Kissinger，CR et al.，Nature，1995，378；641；Griffith，JPet al.，Cell，1995，82：507)。另一个与CaM不同的是CaNB亚基N末端的甘氨酸上连接有一个十四碳的脂肪酰基团。B亚基不具有蛋白磷酸酶的活力，但对于维持CaN酶活性是高度专一的。虽然CaNB亚基和CaM对CaNA亚基的活性具有协同调节作用，但二者对酶活力的调节是不可互相代替的。目前所知最主要的一点是：B亚基通过降低催化亚基A对底物的Km来调节CaN的活性。(Perrino，BA et al.，J.Biol.Chem.，1996，270：340)。

CaN是保守蛋白，广泛分布在真核生物中。从人，大鼠，小鼠，猪，蛙，鱼，鸡等的脑匀浆中以及人，兔等的非神经组织中均检出了CaN。从果蝇胚囊粗提物中检出了B亚基，但没有检出A亚基。在海胆卵中发现了一种受CaM调节的蛋白磷酸酶，它与CaN有着相同的亚基组成，它的小亚基与CaN的B亚基有着相似的肽图谱，但它的大亚基肽图谱与CaNA亚基的肽图谱不同(Klee，CB et al.，Adv.Enzymol.，1987，61：149)。表明B亚基比A亚基更具保守性。

我们曾用小鼠CaN抗体检测人脑及其他肿瘤中的CaN，结果发现，在我们检测的一些肿瘤如人脑胶质瘤，脑膜瘤等中均有B亚基的存在，含量还相当可观。但A亚基很不明显。小鼠H22肝癌腹水中CaNA，B二亚基均能检测到，但B亚基量大于A亚基。(魏群等，生物化学杂志，1993，9：240)。CaN在肿瘤组织中的存在和作用还值得进一步研究和探讨。

从分子生物学研究来看，已经从人，大鼠，小鼠，兔脑等组织的基因文库中分离到几个CaN cDNA克隆，真核组织中CaNA有3种基因编码，分别命名为CaNAα，β，γ。其中Aα，Aβ分别定位在人类4号和10号(10q21-q22)染色体上，CaNB亚基高度保守，目前只发现一种CaNB基因，定位于人的2号染色体(2p16-p15)上。(Wang，MG et al.，Cytogenet.CellGenet.，1996，72：236)。

CaNA，B两亚基哺乳动物的cDNA虽早在80年代末，90年代初就已经问世，但在大肠杆菌中如何表达出高含量，有活性的酶却迟迟不能解决，有在昆虫细胞或其他细胞中表达的，有表达出来以包涵体形式存在的，纯化步骤繁杂，得率很少。或A，B两亚基共同表达。而我们进行了CaNA，B两亚基在大肠杆菌中的分别表达，尤其是CaNB亚基的表达量极大，纯化步骤极其简单。人CaNB亚基和大鼠，牛等哺乳动物均同源，这些均为CaNB亚基的药用奠定了坚实的基础。

CaN有许多重要的生物学功能。由于它是唯一依赖钙，钙调素的蛋白磷酸酶，所以在钙离子信号传递涉及其底物可逆磷酸化的生理，病理过程中都起着重要的作用。又因CaN在脑内的极高含量，许多脑内功能都与之有关。目前最引人注目的是它和学习记忆，老年性痴呆等的关系。最近发现CaN又是T细胞活化中的关键酶。

CaN是T细胞活化中关键酶的证据是证明了它是不同免疫抑制药物如FK506，环胞霉素A等的体内共同靶酶，而且已研究了它在T细胞活化中的作用。研究表明转录因子NF-AT是CaN的底物，而且证明了CaN和NF-AT是结合成复合物从胞浆转移到核内的(Shibasaki，F et al.，Nature，1996，382：370)。NF-AT在核内的作用已很清楚，它结合于白介素2(IL-2)基因启动子区，促使IL-2的转录表达，IL-2再从细胞中分泌出来，结合于T细胞表面的IL-2受体，从而刺激T细胞的增殖。

目前进行的CaN生物功能研究都是基于CaN具有蛋白磷酸酶活性这一特性，进行的实验大部分是在CaNA，B二亚基共同参与下完成的，少数实验是在CaNA亚基或CaNA亚基的突变体单独存在时完成的。有论文对CaNB亚基在完成生物功能中的作用有所论述，特别是免疫抑制剂FK506和FKBP-12及环胞霉素A和其结合蛋白与CaN结合时有人认为B亚基起了重要作用(Li，W et al.，J.Biol.Chem.，1993，268：14040；Milan D，et al.，Cell，1994，79：437；Kawamura A et al.，J.Biol.Chem.，1995，270：15463；Griffith，JP et al.，Cell，1995，82：507)，但认为在此作用中仍需要CaNA的参与。目前为止没有看到用CaNB亚基单独注入体内产生生理效应的报导，更没有看到CaNB亚基能作为抗癌药及生物反应调节剂的报导。

机体免疫状态与肿瘤发生发展有着密切的关系，Burnet于1970年提出免疫监视的概念。其主要论点是：“免疫功能部分是作为阻止体细胞突变产生癌细胞的机制而进化的。”即哺乳动物主要是通过T淋巴细胞来识别和消灭体内癌变的。近年来关于人及动物肿瘤的抗原性，抗肿瘤效应细胞以及肿瘤细胞逃避机体免疫监视等研究有了进一步的进展，表明机体对发挥免疫监视作用的效应细胞除T细胞外，还有其他细胞的参与，抗肿瘤的免疫功能除针对肿瘤相关抗原外，也可对癌细胞的其他异常表现产生反应，并认为，机体免疫功能受损则易患肿瘤。而且目前研究表明，免疫功能的受损主要是由于免疫调节失常引起的。

近代免疫学进展告诉我们，包括人类在内的一切动物，它们的免疫功能是由一个极其复杂而又十分精确的调节系统来调节的，称为免疫调节网络。在这个免疫调节网络中，除神经系统和内分泌系统的调节因素外，就免疫系统本身，按其功能可分为两类：一类调节细胞及其产物能增强免疫反应，称向上调节，另一类调节细胞及其产物是降低免疫反应的称为向下调节。正常机体的免疫系统就依赖于向上和向下调节的机制对来自体内外的各种刺激作出精确的反应，并维持机体的免疫功能处于动态平衡之中。如果由于某种原因如肿瘤生长，或衰老，病毒，慢性感染，化疗等因素的影响，干扰或破坏调节的平衡，使免疫功能低下。如我们能使他们的免疫功能向上调节，就必然有利于这些疾病的控制和改善。免疫调节药物就是从不同的侧面通过调节机体的免疫功能而发挥治疗作用的。其中我们把来自生物体本身的一类免疫调节物质叫生物反应调节剂。

基础研究表明，CaN是T细胞活化中的关键酶，也是现知免疫抑制药物FK506，环胞霉素A的体内靶酶，CaNB亚基在免疫抑制剂和其结合蛋白与CaN结合时起了重要作用。CaNB亚基的保守性很强，人，牛，大鼠等哺乳动物CaNB亚基的氨基酸序列均相同。

本发明的目的是提供一种通过调节免疫系统治疗哺乳动物疾病的药物组合物，它含有有效量的CaNB亚基。

所述药物组合物可含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。

所述的哺乳动物疾病是指可通过调节哺乳动物的免疫反应得到治疗的疾病，例如，肿瘤，病毒慢性感染，衰老，放疗等使免疫功能低下，及其它一些由于免疫功能紊乱造成的疾病。

所说的哺乳动物可以是人，小鼠等。治疗小鼠体内肿瘤的有效量为每只小鼠10-200μg/天(或人的临床剂量为100-2000μg/kg体重/天)，施用一次或多次。对施用途径没有特别限制，可以是静脉内，腹膜内等，并且最好是连续多天施用。

本文所述的CaNB亚基具有如下的氨基酸序列：1    GNEASYPLEM CSHFDADEIK RLGKRFKKLD LDNSGSLSVE EFMSLPELQQ51   NPLVQRVIDI FDTDGNGEVD FKEFIEGVSQ FSVKGDKEQK LRFAFRIYDM101  DKDGYISNGE LFQVLKMMVG NNLKDTQLQQ IVDKTIINAD KDGDGRISFE151  EFCAVVGGLD IHKKMVVDV

上述序列中一个或多个氨基酸残基的加入，缺失或替换，或者一个或多个氨基酸侧链的化学修饰后的功能衍生物，只要它基本上保留了CaNB亚基生物学活性也可以用于本发明的药物组合物中。

我们的体外实验结果表明，CaNB亚基直接作用于大鼠脾淋巴细胞，能使之增殖4-7倍，并与有丝分裂原Con.A对淋巴细胞的刺激有明显的协同作用，62.5mg CaNB亚基能使可的松的免疫抑制效应逆转88％。小鼠体内实验也表明CaNB亚基能刺激重要免疫器官脾的增生，显示了CaNB亚基是一种较好的向上调节免疫功能的免疫调节药物或生物反应调节剂。

CaNB亚基的体内抗肿瘤作用表现尤为明显，能明显减少H22腹水肝癌小鼠的腹水生长，并使荷瘤小鼠生命延长50-83％，同样剂量的CaNB亚基能使S180实体瘤抑制57％以上，与对照组相比，结果均具有显著差异。

CaNB亚基的小鼠急性毒性实验表明，其毒性较小。用有效剂量的4-50倍进行小鼠急性毒性实验，被试小鼠24小时内均无一只死亡。

本发明是建立在我们已完成了有活性的人CaNB亚基在大肠杆菌中大量表达和纯化的基础上将其单独直接药用的结果，并进行了CaNB亚基及功能衍生物的应用工作。

实施例实施例1  CaNB亚基质粒的构建和表达：

CaNB亚基的cDNA来自大鼠脑cDNA文库(Perrino B et al.，J.Biol.Chem.，1996，270：340)，通过5’引物：5’-CCGCCATATGGGAAATGAGGCGAGTT-3’和3’引物：5’-CGCGGGATCCTCACACATCTACCACCA-3’经PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳上分离PCR产物，于NdeI和BamHI酶切后，经T₄DNA连接酶装入pet21a表达载体，转化到感受态E.coli菌株BL21(DE3)plysS中，保存于含氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养板，挑取单菌落预培养，将预培养液加入含50μg/ml含氨苄青霉素的TM培养基中，37℃摇床以250rpm保温培养5-6小时，4500rpm，20分钟离心，弃上清，收获菌体。实施例2：CaNB亚基剪切体及突变体的构建和表达。

CaNB亚基剪切体及近N，C末端突变体的构建采用对所需改变基因特定引物设计后的PCR扩增及在琼脂糖凝胶电泳中产物的分离。CaNB亚基远离N，C末端的基因的定点突变，采用promega公司的pAlter突变质粒系统进行构建。表达系统同野生型。实施例3：CaNB亚基的制备：

1.超声破碎菌体：按1升菌体培养液的1/10-1/20体积加入缓冲液(20mmol/L tris，pH7.4，1mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，1mmol/Lβ巯基乙醇)，然后以输出功率40％破碎细胞，时间为2-3分钟。

2.分离纯化：破碎后菌体经100℃沸水浴30-40分钟，然后经12000rpm离心20分钟，取上清，此为CaNB亚基的粗提液。按体积加3mmol/L CaCl₂.1mmol/L β巯基乙醇和0.5Mol/LNacl后上预先经缓冲液(20mmol/L tris，pH7.4，0.5mmol/L CaCl₂ 1mmol/Lβ巯基乙醇，)平衡的Phenel-SepharoseCL-4B层析柱，再用同样的缓冲液洗尽杂蛋白，最后用缓冲液20mmol/Ltris，pH7.4，lmmol/L EGTA，0.5mmol/L DTT洗脱，每升菌液可得电泳纯CaNB亚基～120mg，所得产物可冷冻干燥保存。实施例4：CaNB亚基的检测鉴定，质量控制及使用方法：

1.DNA序列测定：由507个核苷酸组成，与文献标准人CaNB亚基cDNA相同。

2.氨基酸测序：测序N末端10个氨基酸为GNEASYPLRM。证明是人CaNB亚基蛋白，与文献一致。查证大鼠CaNB亚基和人CaNB亚基序列完全相同。

3.纯度分析：SDS-PAGE鉴定，纯度为98％以上。

4.物理化学性质鉴定：等电点4.8，光吸收值ε_277nm ^1％＝3.1

5.浓度测定：用紫外分光光度法。

6.鉴别实验：CanB亚基抗体免疫印迹阳性，紫外吸收光谱。

7.生物活性：激活CaNA亚基。

8.性状及使用方法：CaNB亚基为水溶性，水中溶解度大，水溶液无色，澄清。可在生理盐水或中性pH的缓冲液中(可加甘露醇)冷冻干燥保存2年以上，临用前用少量生理盐水或缓冲液溶解即可。实施例5 CaNB亚基的体内抗肿瘤实验：

1.H22腹水肝癌防治实验。延长小鼠存活期及剂量试验：BALB/C小鼠，雄性，20±1g，用药组小鼠腹腔分别注射CaNB亚基10，100，200μg/0.2ml/天/只小鼠，对照组小鼠注射PBS 0.2ml/天/只小鼠，2天后注射1×10⁶H22腹水癌细胞，同时继续注射CaNB亚基和PBS共7天，观察小鼠存活期。生命延长率按以下公式计算，结果如下：组别                  平均存活天数±标准误           生命延长率          t测验对照组                      19.5±0.7610μgCaNB                   24.6±3.35                  26％             ＜0.2100μgCaNB                  29.2±1.36                  50％             ＜0.001组别                 平均存活天数±标准误            生命延长率          t测验对照组                      18.75   0.5200μgCaNB                  34.25   4.6                 82.7％           ＜0.001

2.抗H22腹水肝癌，延长小鼠存活期治疗实验：BALB/C小鼠，雄性，20±1g腹腔注射1×10⁷ H22腹水癌细胞，2天后分二组，分别注射CaNB亚基200μg/0.2ml/天/只小鼠(给药组)和PBS 0.2ml/天/只小鼠。(对照组)，观察小鼠存活期。结果如下：组别                     平均存活天数±标准误       生命延长率         t测验对照组                         19.0±1.6给药组                         29.0±8.9               52.6％          ＜0.025

3.抗S180实体瘤治疗试验：取S180腹水癌小鼠腹水按1∶3 PBS稀释后。对每只实验动物昆明种小鼠，雄性，20±1g，于腋窝皮下接种0.2ml(约1×10⁷细胞)。接种后随机分组，第4天(大部分瘤已能看到)分别在腹腔注射PBS 0.2ml/天/只小鼠。(对照组)和CaNB亚基100μg/0.2ml/天/只小鼠(给药组)，共7天，停药24小时后处死动物，解剖剥离瘤块及脾，并称重，计算药物对瘤的抑制率。按以下公式计算，结果如下：组别           平均脾重±标准误     增重率       t测验     平均瘤重±标准误      抑制率    t测验对照组             0.25±0.09                                 1.38±0.66给药组             0.32±0.08       25.5％       ＜0.1        0.59±0.39          57.1％   ＜0.01实施例6：CaNB亚基的体外细胞免疫实验：

1.CaNB亚基对大鼠脾淋巴细胞增殖的直接影响：常规无菌分离大鼠脾淋巴细胞，用1640培养液制成5×10⁶/ml细胞悬液，将细胞0.2ml植入96孔培养板中(5×10⁵细胞/孔)，加入CaNB亚基(0，2.5，12.5，62.5μg/ml)，37℃，5％二氧化碳条件下培养48小时，加入³HdR(0.5μCi/孔)继续培养8-16小时，用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤膜上，烘干后加液闪液，用液闪计数仪测定cpm值，比较给药前后的差异。以增殖倍数表示，按以下公式计算，结果如下：

 剂量               cpm±标准误       增殖倍数         t测验0(对照组)                 467±812.5μg CaNB基             375±2512.5μg CaNB基            1704±194         3.7            ＜0.001625μg CaNB亚基           3041±390         6.5            ＜0.001

2.CaNB亚基与有丝分裂原Con.A对大鼠脾淋巴细胞增殖的协同作用：实验方法基本同实施例6-1，在96孔培养板中加入细胞悬液后，在加入CaNB亚基的同时，还加入免疫刺激剂，有丝分裂原Con.A 5ug/ml，同上培养后，观察CaNB亚基与有丝分裂原Con.A的协同增殖作用。结果如下：

剂量              cpm±标准误           增殖率          t测验0(对照组)             158000±32002.5μg CaNB亚基       155000±700012.5μg CaNB亚基      174000±5200          10.2％          ＜0.00162.5μg CaNB亚基      192000±3600          21.8％          ＜0.001

3.CaNB亚基对可的松免疫抑制作用的逆转效应：实验方法基本同实施例6-1，在96孔培养板中，加入细胞悬液后，先加入免疫刺激剂Con.A5ug/ml和可的松10^-7mmol/L，然后再加CaNB亚基，反应后观察CaNB亚基对可的松免疫抑制作用的逆转效应。结果如下：

剂量              cpm±标准误         增殖逆转率         t测验0(对照组)             66400±45002.5μg CaNB亚基       63500±280012.5μg CaNB亚基      79300±4000           19.4％           ＜0.00162.5μg CaNB亚基      125000±5100          87.9％           ＜0.001实施例7：CaNB亚基的小鼠急性毒性实验：实验动物：BALB/C小鼠，雄性，20±lg。结果如下：组别(剂量)                           数量                        死亡数量

                                               0-24小时    24-48小时   48小时-1个月正常剂量4倍(0.4mg/0.2ml/只小鼠)       4               0            0             0正常剂量20倍(2mg/0.2ml/只小鼠)        4               0            0             0正常剂量50倍(5mg/0.2ml/只小鼠)        8               0            3             0

Claims (6)

1、一种治疗可通过调节哺乳动物的免疫反应得到治疗的哺乳动物疾病的药物组合物，它含有CaNB亚基和/或其功能衍生物。

2、按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。

3、按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的哺乳动物疾病是肿瘤疾病。

4、按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的哺乳动物是人。

5、按照权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的哺乳动物是小鼠，治疗其体内肿瘤的有效量为每只小鼠10-200μg/天。

6、钙调神经磷酸酶B亚基在制备治疗哺乳动物疾病的药物中的应用。