CN105420209A - 一种制备rhCNB二聚体的方法 - Google Patents

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CN105420209A CN201511024337.7A CN201511024337A CN105420209A CN 105420209 A CN105420209 A CN 105420209A CN 201511024337 A CN201511024337 A CN 201511024337A CN 105420209 A CN105420209 A CN 105420209A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(以下简称rhCNB)二聚体的方法。该方法包括如下步骤：步骤1：制备获得rhCNB粗纯液；步骤2：在pH值为6.0～7.0，2～15℃的反应条件下，取所述rhCNB粗纯液与氧化剂混合，氧化12～24h，终止氧化后，纯化分离。本发明工艺终产品为rhCNB二聚体，不含β疏基乙醇、DTT、EGTA等物质，工艺具有创新性且重复性好，收集到的蛋白溶液经纯度检测，二聚体含量在98％以上，多聚体含量小于0.5％。

Description

一种制备rhCNB二聚体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备rhCNB二聚体的方法。
背景技术
CNB是钙调蛋白磷酸酶Calcineurin,CN)的调节亚基。CN是目前所知唯一一种依赖Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，它具有比较窄的底物专一性。于上世纪70年代末、80年代初由加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并从牛脑中提纯。该酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，相对分子质量61×103；B亚基(CNB)是调节亚基，相对分子质量19×103。
魏群教授在对CNB长达约20年的研究中发现，CNB在动物及细胞水平上具有良好的抑制肿瘤生长的效果，与其他抗癌药相比处于较高水平，而毒副作用极低，适用范围广。并于1998年申请了专利“含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物”，专利号为98117642.9，该专利中公开了含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物的分离纯化方法，具体描述为“破碎后菌体经100℃沸水浴30～40分钟，然后经12000rpm离心20分钟，取上清，此为CaNB亚基的粗提液。按体积加3mmol/LCaCl2,1mmol/Lβ疏基乙醇和0.5mol/LNaCl后上预先经缓冲液(20mmol/LTris,pH7.4,0.5mmol/LCaCl21mmol/Lβ疏基乙醇)平衡的phenel-sepharoseCL-4B层析柱，再用同样的缓冲液洗尽杂蛋白，最后用缓冲液20mmol/Ltris，pH7.4，1mmol/LEGTA,0.5mmol/LDTT洗脱，每升菌液可得电泳纯CaNB亚基～120mg，所得产物可冷冻干燥保存。
专利号98117642.9所述纯化工艺所得产品为CaNB的药物组合物，并且工艺中带有β疏基乙醇、DTT、EGTA等物质未经下一步清除。
因此，提供一种高纯度的rhCNB二聚体的方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种制备rhCNB二聚体的方法。本发明工艺终产品为rhCNB二聚体，工艺具有创新性且重复性好，适用于中试及生产规模。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种制备rhCNB二聚体的方法，包括如下步骤：
步骤1：制备获得rhCNB溶液；
步骤2：在pH值为6.0～7.0，2～15℃的反应条件下，取所述rhCNB溶液与氧化剂混合，氧化12～24h，终止氧化后，纯化分离。
在本发明中，粗纯液是菌体经过细胞破壁、分离，进行初步纯化得到的蛋白溶液，尚待进一步纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂的加入方式为每1～5h分段加入。
在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为20：1～30：1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂为过氧化氢、碘、氧化型谷肽甘肽、谷胱甘肽氧化还原对或氧气中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂的浓度为0.05％～1％(w/w)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述终止氧化的试剂为氧化终止液，所述氧化终止液为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、0.1％DTT或还原型谷胱甘肽中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化终止液的浓度为0.05％～1％(w/w)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为50：1～100：1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述分离纯化采用分子排阻色谱层析，所述分子排阻色谱层析采用10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液在pH值为5.8～7.0的条件下洗脱，收集rhCNB二聚体蛋白峰。
在本发明的一些具体实施方案中，所述分子排阻色谱层析采用分离范围为3000～70000Da的介质。
具体的，获得rhCNB蛋白溶液的制备方法包括：通过适宜的培养基培养含有目标蛋白的发酵液，经管式离心机离心后收集含目标蛋白的湿菌体，加入5～20倍的重悬缓冲液，其中重悬缓冲液包括还原性物质、酶抑制剂；搅拌均匀在适当的温度下使杂蛋白聚集沉淀，离心后收集上清液。加入还原性物质是为了维持过程中较高含量的rhCNB单链结构，相比不添加还原性物质而言，回收率提高。其中，适宜的培养基每1kg培养基含：Tryptone20～50g、YeastExtract9～35g、氯化钠4～12g、甘油12～50g、磷酸二氢钾2～10g、磷酸氢二钾三水合物2～10g、氢氧化钠2g。
收集上清液，上样于经平衡液A平衡的疏水介质层析柱中，PhenylSepharose6FastFlow(lowsub)填料，经平衡液A再平衡洗去未结合的蛋白，杂蛋白洗脱液B洗去疏水性弱的蛋白，最后用目的蛋白洗脱液C洗脱目的蛋白，获得含CNB组合物的目的蛋白。其中，每1kg平衡液A含：TRIS1.5～3.5g，氯化钠30～70g，氯化钙0.2～1.0g，盐酸1.0～1.5g。每1kg杂蛋白洗脱液B含：TRIS1.5～3.5g，氯化钙0.2～1.0g，盐酸1.0～1.5g。每1kg目的蛋白洗脱液C含：TRIS1.5～3.5g，EGTA0.1～0.5g，盐酸1.0～1.5g。
本发明提供了一种制备rhCNB二聚体的方法，包括如下步骤：步骤1：制备获得rhCNB溶液；步骤2：在pH值为6.0～7.0，2～15℃的反应条件下，取所述rhCNB溶液与氧化剂混合，氧化12～24h，终止氧化后，分离纯化。
本发明是在还原剂DTT的还原作用下，形成90％以上的单体，再采用特有的氧化还原对使单体99％以上转化为二聚体，同时通过浓度、温度、时间有效控制多聚体的形成，得到高含量二聚体的rhCNB。工艺路线为还原-氧化-还原终止氧化。
1、初步纯化的rhCNB溶液，含有90％以上的单体,本步骤选择pH6.0～7.0，温度2～15℃反应条件，分段加入低浓度氧化剂(0.05％～1％过氧化氢溶液)，使rhCNB单体缓慢的向二聚体转化，二聚体达到75％及以上、多聚体1％时，加入低浓度氧化终止液(0.1％亚硫酸氢钠)中和氧化剂，避免继续氧化使三聚体及以上聚体的形成。转化的原理是rhCNB单体含有游离的巯基，在氧化环境下，两个游离的巯基形成一个二硫键，达到转化为二聚体的目的，同时考虑了缓冲液pH值、温度对反应速度的影响。
2、步骤2中含较高含量二聚体的CNB组合物，尚含有单体和少量三聚体，本步骤中该CNB组合物上样于经平衡液平衡的分子排阻层析柱(含分子排阻填料)，根据分子量大小被缓冲液先后洗脱，获得二聚体纯度达98％以上，三聚体及以上聚体＜0.5％。
综合上述实验结果，本发明工艺终产品为rhCNB二聚体，工艺具有创新性且重复性好，收集到的蛋白溶液经纯度检测，二聚体含量在98％以上，多聚体含量小于0.5％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2氧化后蛋白组分比例结果；
图2示实施例2氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
图3示实施例3氧化后蛋白组分比例结果；
图4示实施例3氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
图5示实施例4氧化后蛋白组分比例结果；
图6示实施例4氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
图7示实施例5氧化后蛋白组分比例结果；
图8示实施例5氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
图9示实施例6氧化后蛋白组分比例结果；
图10示实施例6氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
图11示实施例7筛选试验1蛋白组分比例结果；
图12示实施例7筛选试验2氧化0h蛋白组分比例结果；
图13示实施例7筛选试验2氧化5h蛋白组分比例结果；
图14示实施例7筛选试验2氧化9h蛋白组分比例结果；
图15示实施例7筛选试验2氧化13h蛋白组分比例结果；
图16示实施例7筛选试验2氧化24h蛋白组分比例结果；
图17示实施例7筛选试验3氧化0h蛋白组分比例结果；
图18示实施例7筛选试验3氧化5h蛋白组分比例结果；
图19示实施例7筛选试验3氧化9h蛋白组分比例结果；
图20示实施例7筛选试验3氧化13h蛋白组分比例结果；
图21示实施例7筛选试验3氧化24h蛋白组分比例结果；
图22示实施例7筛选试验4氧化0h蛋白组分比例结果；
图23示实施例7筛选试验4氧化13h蛋白组分比例结果；
图24示实施例7筛选试验4氧化15h蛋白组分比例结果；
图25示实施例7筛选试验4氧化24h蛋白组分比例结果；
图26示实施例8重复试验第一批二聚体及多聚体含量图谱；
图27示实施例8重复试验第二批二聚体及多聚体含量图谱；
图28示实施例8重复试验第三批二聚体及多聚体含量图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种制备rhCNB二聚体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
抗肿瘤药rhCNB有效成分是单体和二聚体，多聚体为杂质，二聚体疗效优于单体，且稳定性优于单体，本发明是在还原剂DTT的还原作用下，形成90％以上的单体，再采用特有的氧化还原对使单体转化为二聚体，同时通过浓度、温度、时间有效控制多聚体的形成，再通过分子排阻色谱分离技术得到高含量二聚体的rhCNB。工艺路线为还原-氧化-还原终止氧化-分离二聚体。
1、初步纯化的rhCNB溶液，含有90％以上的单体,本步骤选择pH6.0～7.0，温度2～15℃反应条件，分段加入0.05％～1％氧化剂(例如过氧化氢溶液)，使rhCNB单体缓慢的向二聚体转化，二聚体达到75％及以上、多聚体1％时，加入低浓度氧化终止液(0.1％亚硫酸氢钠)中和氧化剂，避免继续氧化使三聚体及以上聚体的形成。转化的原理是rhCNB单体含有游离的巯基，在氧化环境下，两个游离的巯基形成一个二硫键，达到转化为二聚体的目的，同时考虑了缓冲液pH值、温度对反应速度的影响。
2、步骤2中含较高含量二聚体的rhCNB组合物，尚含有单体和少量三聚体，本步骤中该CNB组合物上样于经平衡液平衡的分子排阻层析柱(含分子排阻填料)，根据分子量大小被缓冲液先后洗脱，获得二聚体纯度达98％以上，三聚体及以上聚体＜0.5％。
为了更好的阐述本发明，对上述实现目标的工艺步骤进行进一步说明：
1、氧化的pH条件优选为6.0～7.0，在pH较高的情况下，巯基易被氧化，不易控制多聚体，特别是在碱性条件下，多聚体容易形成，形成本发明工艺技术的实验数据与此理论想符。再者根据rhCNB的理化性质，其在pH4.3～5.5的溶液中，可发生不同程度的沉淀。所以氧化pH条件为6.0～7.0。
2、氧化剂包含过氧化氢溶液、氧化型谷胱甘肽、谷胱甘肽氧化还原对、臭氧、纯氧气等。本发明对此5种氧化剂或氧化还原对进行试验，对比后选择了过氧化氢溶液。
3、本发明的另一创新技术是分段氧化，根据每当量单体形成二聚体需消耗的氧离子计算出使用过氧化氢的量，再分时按比例加入，严格控制氧化速度，形成反应曲线。
4、在分子排阻色谱层析步骤中，根据rhCNB的特性，选择分离范围3000～70000的介质。
本发明提供的制备rhCNB二聚体的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1制备获得rhCNB蛋白粗纯液
通过适宜的培养基培养含有目标蛋白的发酵液，经管式离心机离心后收集含目标蛋白的湿菌体，加入5～20倍的重悬缓冲液，其中重悬缓冲液包括还原性物质、酶抑制剂；搅拌均匀在适当的温度下使杂蛋白聚集沉淀，离心后收集上清液。每1kg培养基含：Tryptone20～50g、YeastExtract9～35g、氯化钠4～12g、甘油12～50g、磷酸二氢钾2～10g、磷酸氢二钾三水合物2～10g、氢氧化钠2g。
收集上清液，上样于经平衡液A平衡的疏水介质层析柱中，PhenylSepharose6FastFlow(lowsub)填料，经平衡液A再平衡洗去未结合的蛋白，杂蛋白洗脱液B洗去疏水性弱的蛋白，最后用目的蛋白洗脱液C洗脱目的蛋白，获得含CNB组合物的目的蛋白。
每1kg平衡液A含：TRIS1.5～3.5g，氯化钠30～70g，氯化钙0.2～1.0g，盐酸1.0～1.5g。
每1kg杂蛋白洗脱液B含：TRIS1.5～3.5g，氯化钙0.2～1.0g，盐酸1.0～1.5g。
每1kg目的蛋白洗脱液C含：TRIS1.5～3.5g，EGTA0.1～0.5g，盐酸1.0～1.5g。
实施例2制备rhCNB二聚体
在实施例1制备获得的rhCNB蛋白精纯液中，通过使用氧化剂(过氧化氢，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为20：1)，在pH值为6.6、温度12℃的环境条件下，每1h分段加入浓度为0.75％的氧化剂，氧化12h，加入氧化终止液(0.1％的亚硫酸氢钠溶液，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为90：1)终止氧化，得到rhCNB二聚体组分至75％以上，多聚体控制在1.5％以内的组份溶液(见图1)。再通过将氧化液上样于分子排阻层析柱(选择分离范围3000～70000Da的介质)，10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液pH5.8～7.0洗脱、收集rhCNB二聚体蛋白峰。SEC-HPLC液相法检测多聚体含量＜0.5％，二聚体含量＞98％(图2)。
表1图1的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.093 23731 1014 1.164
2 10.684 1675350 76840 82.19
3 12.058 339296 10594 16.645
总计 2038378 88448 100
表2图2的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.096 2080 130 0.098
2 10.583 2113411 98751 99.156
3 11.896 15908 504 0.746
总计 2131399 99385 100
实施例3
在实施例1制备获得的rhCNB蛋白溶液中，通过使用氧化剂(氧化型谷肽甘肽，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为25：1)，在pH值为6.2、温度10℃的环境条件下，每45h分段加入浓度为0.5％的氧化剂，氧化18h，加入氧化终止液(0.1％的亚硫酸氢钠溶液，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为70：1)终止氧化，得到rhCNB二聚体组分至75％以上，多聚体控制在1.5％以内的组份溶液(图3)。再通过将氧化液上样于分子排阻层析柱(选择分离范围3000～70000Da的介质)，10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液pH5.8～7.0洗脱、收集rhCNB二聚体蛋白峰。SEC-HPLC液相法检测多聚体含量＜0.5％，二聚体含量＞98％(图4)。
表3图3的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.966 32348 1438 1.472
2 10.584 1647986 73281 74.991
3 11.877 517244 23001 23.537
总计 2197579 97720 100
表4图4的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.096 1655 115 0.08
2 10.578 2052532 95328 99.176
3 11.813 15390 505 0.744
总计 2069577 95947 100
实施例4
在实施例1制备获得的rhCNB蛋白溶液中，通过使用氧化剂(谷胱甘肽氧化还原对，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为28：1)，在pH值为7.0、温度5℃的环境条件下，每3h分段加入浓度为0.1％的氧化剂，氧化15h，加入氧化终止液(0.1％的亚硫酸氢钠溶液，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为60：1)终止氧化，得到rhCNB二聚体组分至75％以上，多聚体控制在1.5％以内的组份溶液(图5)。再通过将氧化液上样于分子排阻层析柱(选择分离范围3000～70000Da的介质)，10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液pH5.8～7.0洗脱、收集rhCNB二聚体蛋白峰。SEC-HPLC液相法检测多聚体含量＜0.5％，二聚体含量＞98％(图6)。
表5图5的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.031 28897 1289 1.509
2 10.65 1443559 64406 75.383
3 11.948 442510 19743 23.108
总计 1914966 85438 100
表6图6的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.121 1969 132 0.091
2 10.578 2131922 99699 98.806
3 11.846 23797 565 1.103
总计 2157688 100396 100
实施例5
在实施例1制备获得的rhCNB蛋白溶液中，通过使用氧化剂(臭氧，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为22：1)，在在pH值为6.8、温度15℃的环境条件下，每2h分段加入浓度为1％的氧化剂，氧化20h，加入氧化终止液(0.1％的亚硫酸氢钠溶液，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为100：1)终止氧化，得到rhCNB二聚体组分至75％以上，多聚体控制在1.5％以内的组份溶液(图7)。再通过将氧化液上样于分子排阻层析柱(选择分离范围3000～70000Da的介质)，10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液pH5.8～7.0洗脱、收集rhCNB二聚体蛋白峰。SEC-HPLC液相法检测多聚体含量＜0.5％，二聚体含量＞98％(图8)。
表7图7的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.961 27842 1243 1.445
2 10.581 1446695 64587 75.084
3 11.881 452231 20190 23.471
总计 1926768 86020 100
表8图8的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.121 1193 83 0.057
2 10.585 2062082 97126 99.166
3 11.813 16141 539 0.776
总计 2079415 97748 100
实施例6
在实施例1制备获得的rhCNB蛋白溶液中，通过使用氧化剂，在pH值为6.0、温度2℃的环境条件下，每5h分段缓慢通入高纯度氧气，每次通入氧气时长30min，氧化22h，加入氧化终止液(0.1％的亚硫酸氢钠溶液，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为50：1)终止氧化，得到rhCNB二聚体组分至75％以上，多聚体控制在1.5％以内的组份溶液(图9)。再通过将氧化液上样于分子排阻层析柱(选择分离范围3000～70000Da的介质)，10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液pH5.8～7.0洗脱、收集rhCNB二聚体蛋白峰。SEC-HPLC液相法检测多聚体含量＜0.5％，二聚体含量＞98％(图10)。
表9图9的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.102 19003 834 0.926
2 10.684 1580136 72634 77.026
3 12.058 452301 15502 22.048
总计 2051440 88970 100
表10图10的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.146 5842 308 0.261
2 10.581 2206694 103067 98.75
3 11.911 22096 677 0.989
总计 2234632 104052 100
实施例7筛选试验
1：过氧化氢一次加入法
在实施例1中收集到的rhCNB蛋白溶液0.96kg(溶液pH值为6.98)，加入0.1％过氧化氢溶液4g,搅拌均匀后，反应24h，取样SEC-HPLC法检测rhCNB各组分比例，结果为多聚体3.3％，二聚体83.497％(图11)。
表11图11的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.867 272806 10835 3.3
2 10.521 6902462 311800 83.497
3 11.872 1091408 33628 13.203
总计 8266676 356263 100
2：过氧化氢分段加入法
在实施例1中收集到的rhCNB蛋白溶液0.97kg(溶液pH值为7.01)，在搅拌下，第0、1、3、5、7、9、11、13h分别加入0.1％过氧化氢溶液0.5g,并在第0、5、9、13、24h取样，SEC-HPLC法检测rhCNB各组分比例，结果见表12～17。图谱见图12至图16。
表12图12的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.388 659 39 0.032
2 10.786 173286 6315 8.325
3 12.067 1907652 87053 91.644
总计 2081596 93407 100
表13图13的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.217 6241 324 0.298
2 10.721 1018764 43661 48.571
3 12.081 1072488 44697 51.132
总计 2097494 88682 100
表14图14的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.152 15062 718 0.745
2 10.706 1408448 60895 69.65
3 12.096 598674 21105 29.605
总计 2022184 82718 100
表15图15的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.135 20694 844 1.001
2 10.703 1540674 62860 74.523
3 12.099 506012 20646 24.476
总计 2067380 84350 100
表16图16的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.118 25767 1092 1.264
2 10.702 1548751 67476 75.986
3 12.11 463675 14868 22.749
总计 2038194 83435 100
表17过氧化氢分段加入法结果
3：过氧化氢分段加入法(溶液pH由7.0更改为6.5)
在实施例1中收集到的rhCNB蛋白溶液0.97kg(溶液pH值为6.48)，在搅拌下，第0、1、3、5、7、9、11、13h分别加入0.1％过氧化氢溶液0.5g,并在第0、5、9、13、24h取样取样，SEC-HPLC法检测rhCNB各组分比例，结果见表18～23。图谱见图17至图21。
表18图17的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.158 533 24 0.019
2 10.793 159250 5660 5.718
3 12.058 2625257 120276 94.263
总计 2785040 125960 100
表19图18的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.354 7937 379 0.288
2 10.724 1038688 43846 37.745
3 12.067 1705198 72055 61.966
总计 2751823 116280 100
表20图19的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.148 17883 814 0.662
2 10.698 1694768 74337 62.743
3 12.09 988466 37331 36.595
总计 2701117 112482 100
表21图20的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.123 28078 1230 1.041
2 10.696 1949314 85142 72.296
3 12.101 718920 24126 26.663
总计 2696312 110498 100
表22图21的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.119 34345 1475 1.249
2 10.692 2070056 89293 75.282
3 12.101 645346 20318 23.469
总计 2749746 111086 100
表23过氧化氢分段加入法(溶液pH由7.0更改为6.5)结果
4：加入氧化终止液
上工序中收集到的rhCNB蛋白溶液0.95kg(溶液pH值为6.49)，在搅拌下，第0、1、3、5、7、9、11、13h分别加入0.1％过氧化氢溶液0.5g,在14h、14.5h、15h分别加入0.1％亚硫酸氢钠0.3g，并在第0、13、15和24h取样，SEC-HPLC法检测rhCNB各组分比例，结果见表24～28。图谱见图22至图25。
表24图22的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.033 1172 49 0.056
2 10.663 239429 9906 11.518
3 11.888 1838084 89722 88.425
总计 2078685 99677 100
表25图23的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.962 27051 1123 1.366
2 10.589 1490504 70069 75.244
3 11.893 463350 18396 23.391
总计 1980905 89588 100
表26图24的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.957 28293 1174 1.465
2 10.588 1479647 69919 76.589
3 11.897 423996 16725 21.947
总计 1931936 87818 100
表27图25的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.987 31769 1334 1.505
2 10.599 1629591 75032 77.217
3 11.891 449045 16568 21.278
总计 2110405 92934 100
表28加入氧化终止液结果
实施例8重复试验
重复性试验：
按工艺重复了3批rhCNB原液制备，结果如下(二聚体及多聚体含量图谱见附图26至图28)：
结果见表29～32：
表29图26的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.071 3358 205 0.15
2 10.563 2219322 105659 99.289
3 11.894 12534 506 0.561
总计 2235213 106370 100
表30图27的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 9.983 4990 291 0.209
2 10.559 2358612 111762 98.952
3 11.754 19990 614 0.839
总计 2383592 112668 100
表31图28的色谱图数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％
1 10.071 4766 274 0.198
2 10.561 2384153 112798 99.159
3 11.884 15454 560 0.643
总计 2404373 113632 100
表32重复试验数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备rhCNB二聚体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备获得rhCNB粗纯液；
步骤2：在pH值为6.0～7.0，2～15℃的反应条件下，取所述rhCNB粗纯液与氧化剂混合，氧化12～24h，终止氧化后，纯化分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化剂的加入方式为每1～5h分段加入。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为20：1～30：1。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为过氧化氢、碘、氧化型谷胱甘肽、谷胱甘肽氧化还原对或氧气中的一种或两者以上的混合物。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化剂的浓度为0.05％～1％(w/w)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述终止氧化的试剂为氧化终止液，所述氧化终止液为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、0.1％DTT或还原型谷胱甘肽中的一种或两者以上的混合物。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述氧化终止液的浓度为0.05％～1％(w/w)。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为50：1～100：1。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述分离纯化采用分子排阻色谱层析，所述分子排阻色谱层析采用10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液在pH值为5.8～7.0的条件下洗脱，收集rhCNB二聚体蛋白峰。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述分子排阻色谱层析采用分离范围为3000～70000Da的介质。
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