JP6869972B2 - Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカの菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその用途並びにｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその用途、並びに、Ｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法に関する。本発明はまた、Ｌ−ヒドロキシプロリンを製造するための酵母の使用に関する。本発明はまた、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含有する飲食品、化粧料、化粧料原料及びＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物等に関する。

Ｌ−ヒドロキシプロリン（ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）は、Ｌ−プロリンの４位の炭素原子に水酸基が結合した構造を有するアミノ酸である。Ｌ−ヒドロキシプロリンの効能として、線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進、表皮細胞の増殖促進、コラーゲンと同等以上の保湿効果、皮膚の老化防止、トリペプチドよりも高い経皮吸収性、しわの改善効果、アトピー性皮膚炎の改善効果等が挙げられる。Ｌ−ヒドロキシプロリンは人体に対して安全であることから、飲食品、化粧料、医薬品等に含有させて使用することができ、その有益性は非常に高い。

Ｌ−ヒドロキシプロリンは、有機合成法によって製造することができるが、微生物を利用する製造方法も検討されている。例えば特許文献１には、ミヤコグサ根粒菌由来のＬ−プロリン シス−４−ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成、蓄積させ、該培養物中からシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取するシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法が記載されている。

特許第５５０６６６８号公報

ところで、酵母は、飲食品分野等で古くから様々な工業的利用が試みられている微生物であり、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの効能が期待される化粧料、飲食品等の原料として有用である。しかしながら、菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積する酵母は、未だ報告されていない。

本発明は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその用途、並びに、Ｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法を提供することを主な目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、酵母のヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を好気培養すると、その菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積することを見出した。また、得られるＬ−ヒドロキシプロリンを含有するヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計重量含量に対するＬ−ヒドロキシプロリンの重量含量の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が特定範囲になり得ることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を行い、本発明を完成するに至った。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有し、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００であることを特徴とする。
本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。

本発明の別の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含み、上記窒素源がＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源であることを特徴とする。

本発明の製造方法においては、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドであることが好ましい。上記コラーゲンペプチドの平均分子量は１０００〜１００００であることが好ましい。
本発明の製造方法においては、上記好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。

本発明は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の、Ｌ−ヒドロキシプロリンを製造するための使用も包含する。
本発明の使用は、上記酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させることを含み、上記窒素源がＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源であることが好ましい。

本発明の使用においては、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドであることが好ましい。上記コラーゲンペプチドの平均分子量は１０００〜１００００であることが好ましい。
本発明の使用においては、上記好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。

本発明の組成物は、本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする。
本発明の飲食品は、本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする。

本発明の化粧料又は化粧料原料は、本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする。
本発明の化粧料又は化粧料原料は、コラーゲン産生促進、表皮細胞の増殖促進、皮膚の保湿、皮膚の老化防止、皮膚のたるみの予防又は改善、皮膚のハリの改善、しわの予防又は改善及びアトピー性皮膚炎の改善から選ばれる用途に用いられることが好ましい。
一態様において、本発明の化粧料又は化粧料原料は、化粧料原料であり、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が５〜３００ｐｐｍであることが好ましい。
本発明の化粧料又は化粧料原料は、化粧料であり、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が０．０１〜２０ｐｐｍであることも好ましい。本明細書中、ｐｐｍは、重量ｐｐｍを意味する。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする。
本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物においては、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００であることが好ましい。また、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。

本発明によれば、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその用途、並びに、Ｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法等を提供することができる。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、飲食品、化粧料等の原料等として好適に使用される。

図１は、酵母のＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）蓄積量を示すグラフである。 図２は、各培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（（ａ）：条件１、（ｂ）：条件２）。 図３は、ＰＤ培地又は０．１２５％ゼラチンを添加したＰＤ培地で５日間培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（白：０．１２５％ゼラチンを含むＰＤ培地、黒：ＰＤ培地）。 図４は、組成が異なるＹＰＤ培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（（ａ）：Ｈｙｐ蓄積量（μｇ／ｍＬ）、（ｂ）：細胞あたりのＨｙｐ量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００））。 図５は、ペプトン又はコラーゲンペプチドを含む培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量、細胞あたりのＨｙｐ量及びＯＤ６００を示すグラフである（（ａ）：Ｈｙｐ蓄積量（μｇ／ｍＬ）、（ｂ）：細胞あたりのＨｙｐ量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）、（ｃ）：ＯＤ６００））。 図６は、振盪培養又は静置培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示す図である（（ａ）：培養物サンプル（細胞内）の培地あたり換算Ｈｙｐ量、（ｂ）：培養上清中のＨｙｐ量））。 振盪培養又は静置培養したYarrowia lipolyticaの培養上清のエタノール濃度及びグルコース濃度を示すグラフである（（ａ）：エタノール濃度（ｖ／ｖ％）、（ｂ）：グルコース濃度（重量％））。 図８は、アミノ酸混合標準液Ｈ型及びＬ−ヒドロキシプロリンを含む０．１Ｎ塩酸溶液（各アミノ酸濃度２０μｍｏｌ／Ｌ）を分析したＨＰＬＣチャートである（（ａ）：Ｃｈ１の励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで検出、（ｂ）：Ｃｈ２の励起波長２６６ｎｍ、蛍光波長３０５ｎｍで検出）。

以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において適宜変更して適用することができる。
本明細書中、酵母の属種は、The Yeasts, a Taxonomic Study Fifth Edition（Elsevier発行、2011年）に記載の属種名で記載した。

本発明の第一の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有し、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００である。

本発明の第二の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である。
以下、本発明の第一の態様及び第二の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を、まとめて本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物ともいう。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物である。
本発明における酵母は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)に属する酵母であればよく、１種のみ使用してもよく、２種以上を使用してもよい。
酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)は、さまざまな寄託機関等より入手可能である。寄託機関としては、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）等が挙げられる。また、自然界から分離することもできる。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含有する。本発明におけるＬ−ヒドロキシプロリンは、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンである。本明細書中、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に含まれるＬ−ヒドロキシプロリンは、遊離のＬ−ヒドロキシプロリンを指す。酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物におけるＬ−ヒドロキシプロリン含量又は蓄積量は、遊離のＬ−ヒドロキシプロリン量を指す。その菌体又は菌体培養物中に遊離のＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積する酵母は報告されていなかった。

本発明の第一の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００である。このような酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの効能が期待される飲食品や化粧料の原料等に好適に使用される。「Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合」（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））を、以下では「（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合」ともいう。本明細書中、上記（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合におけるＬ−プロリン含量は、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に含まれる遊離のＬ−プロリン含量を指す。
好ましい態様において、本発明の第二の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が、３５〜１００である。
上記（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合は、好ましくは４０〜１００であり、より好ましくは５０〜１００であり、より好ましくは６０〜１００であり、さらに好ましくは７０〜１００であり、さらにより好ましくは８０〜１００であり、特に好ましくは９０〜１００である。上記（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合がこのような酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｈｙｐの含量割合が高く、Ｌ−ヒドロキシプロリンの効能が期待される飲食品や化粧料の原料等として特に好適である。

本発明の第二の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である。
本発明の第一の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が上記範囲である酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの効能が期待される飲食品や化粧料の原料等として好適である。
本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のＬ−ヒドロキシプロリンの含量は、１５μｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、１７μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、２０μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、３０μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４０μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、５０μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、７０μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１００μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１５０μｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、２００μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、２５０μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、４００μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、４５０μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、４７５μｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、５００μｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。
酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のＬ−ヒドロキシプロリンの含量の上限は特に限定されず、多い方が好ましいが、通常、６０００μｇ／ｍＬ以下であり、３０００μｇ／ｍＬ以下又は２０００μｇ／ｍＬ以下であってもよい。
本発明によれば、酵母の菌体又は菌体培養物に由来するＬ−ヒドロキシプロリンの含量が、上記範囲である酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を提供することができる。

酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物中のＬ−プロリンの含量（μｇ／ｍＬ）及びＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することができる。酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物が菌体を含む場合には、加熱等による自己消化や酵素分解処理等により菌体を破砕し、菌体内容物を溶出したものを用いて、Ｌ−プロリン及びＬ−ヒドロキシプロリンの含量を測定する。Ｌ−プロリン及びＬ−ヒドロキシプロリン含量の測定方法及びＨＰＬＣの測定条件等は、実施例に記載の方法及び条件等を採用すればよい。好ましくは、（１）ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）及び４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｃｌ）により順次アミノ酸を誘導体化して、ＨＰＬＣにより分析する方法（励起波長５０３ｎｍ／蛍光波長５４１ｎｍで検出）、又は、（２）メルカプトプロピオン酸、ＯＰＡで１級アミノ基を誘導体化後クロロ蟻酸−９−フルオレニルメチル（ＦＭＯＣ）により２級アミノ酸を誘導体化して、ＨＰＬＣにより分析する方法（励起波長２６６ｎｍ、蛍光波長３０５ｎｍで検出）により、より好ましくは上記（２）の方法により、Ｌ−プロリン及びＬ−ヒドロキシプロリンを定量する。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を液体培地中で好気培養し、必要に応じて菌体破砕等を行って得られるものである。
酵母の菌体培養物は、酵母の菌体及び／又は培養上清を含むことが好ましく、酵母の菌体内容物を含んでいてもよい。酵母の菌体は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。酵母の菌体及び／又は培養上清を含む菌体培養物として、上記酵母を好気培養して得られる酵母の菌体（培養菌体）及び培養上清を含む菌体培養液、該菌体培養液から酵母の菌体を集菌したもの（菌体）、又は該菌体培養液から菌体を除去した培養上清が挙げられる。菌体培養液の培養上清を、単に培養上清という。菌体培養物は、好ましくは、酵母の菌体及び培養上清を含む菌体培養液又は培養上清である。
また、菌体又は菌体培養物の抽出物は、通常、菌体内容物を含み、菌体内容物及び培養上清を含むことが好ましい。菌体又は菌体培養物の抽出物として、菌体又は菌体を含む菌体培養物（好ましくは菌体培養液）に、自己消化処理や酵素分解処理等の菌体破砕処理を行って、酵母菌体内容物を培養液中等に溶出したもの（菌体破砕物）、菌体破砕処理を行った菌体又は菌体培養物（菌体破砕物）から菌体残渣を除去したものが挙げられ、好ましくは、菌体破砕処理を行った菌体培養液（菌体破砕物）又は該菌体破砕物から菌体残渣を除去して得られる、菌体内容物及び培養上清を含む抽出物である。

上記のように、本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、通常、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を液体培地中で好気培養して得られる酵母の菌体及び培養上清を含む菌体培養液に、必要に応じて集菌、菌体破砕等の処理を行って調製される。
本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に含まれるＬ−ヒドロキシプロリンは、上記の好気培養により得られる酵母の菌体又は菌体培養物に由来することが好ましい。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に含まれるＬ−ヒドロキシプロリンは、上記の好気培養前には実質的に存在しないことが好ましい。
本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、例えば、化粧料、酒類を含む飲食品等の原料として好適に使用することができるものである。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）を、ＯＤ６００で除した値（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）が、０．５以上であることが好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）を、ＯＤ６００で除した値（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）を、以下、Ｈｙｐ／ＯＤ６００値ともいう。Ｈｙｐ／ＯＤ６００値が高いほど、細胞あたりのＬ−ヒドロキシプロリンの含量が多いため好ましい。酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のＨｙｐ／ＯＤ６００値の上限は特に限定されず、多いほど好ましいが、通常、３００以下である。Ｈｙｐ／ＯＤ６００値は、１以上であることがより好ましく、例えば、１〜１５０が好ましい。Ｈｙｐ／ＯＤ６００値は、２５以上がさらに好ましく、５０以上がさらにより好ましい。

ＯＤとはｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙの略で、光学密度を指す。ＯＤは、細胞の濃度などを表す。一般的には６００ｎｍ又は６６０ｎｍの波長の可視光に対する吸光度ＯＤ６００又はＯＤ６６０を測定する（バイオ実験イラストレイテッド▲７▼使おう酵母 できるＴｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ、秀潤社、２００３年発行）。
Ｈｙｐ／ＯＤ６００値の計算に使用されるＯＤ６００は、菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の調製に用いた、菌体及び培養上清を含む菌体培養液（菌体及び培養上清を含む菌体培養物）の６００ｎｍの吸光度である。
より具体的には、上記の酵母を液体培地中で好気培養して得られる酵母の菌体培養液をそのまま菌体培養物とする場合には、ＯＤ６００は、該菌体培養液（菌体培養物）の吸光度ＯＤ６００である。酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物が、酵母の菌体を破砕して菌体内容物を溶出させた菌体又は菌体培養物の抽出物の場合には、ＯＤ６００は、その調製に使用した菌体培養液（菌体破砕前の酵母の菌体及び培養上清を含む菌体培養液）の吸光度ＯＤ６００である。ＯＤ６００は、例えば、分光光度計により測定することができる。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、エタノール含量が１ｖ／ｖ％以下であることが好ましい。エタノール含量が１ｖ／ｖ％以下であると、各種飲食品や化粧料等の原料として特に好適に使用することができる。エタノールが１ｖ／ｖ％を超えると、酵母の増殖などに悪い影響がある場合がある。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のエタノール含量は、より好ましくは０．８ｖ／ｖ％以下であり、さらに好ましくは０．５ｖ／ｖ％以下である。エタノール含量は、公知の方法により測定することができる。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の形態は特に限定されないが、例えば、ペースト状、懸濁状、エキス状、液状等が挙げられる。
本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、後述するように化粧料、飲食品等の原料として好適に使用することができるものである。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を乾燥等により粉末化して使用することもできる。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含有する液体培地中で好気培養し、必要に応じて菌体破砕等することにより、得ることができる。より具体的には、窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む。
酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源、及び、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、該酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンが蓄積し、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体又は菌体培養物が得られる。酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源、及び、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、該酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含む方法は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法、又は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法として好ましい。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程（以下、Ｈｙｐ蓄積工程ともいう）を含む。上記窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源である。
本発明の製造方法は、所望によりＨｙｐ蓄積工程以外の工程を有してもよい。例えば、後述する前培養工程、集菌工程、菌体破砕工程等の１又は２以上の工程を有していてもよい。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法においては、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を得ることができる。
上記Ｈｙｐ蓄積工程を行うことにより、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体又は菌体培養物が得られる。得られる酵母の菌体又は菌体培養物は、通常、上記（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が３５〜１００である。また、Ｈｙｐ蓄積工程により得られる酵母の菌体又は菌体培養物は、通常、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である。このような酵母の菌体又は菌体培養物は、上述した本発明の酵母の菌体又は菌体培養物として使用できる。また、得られた菌体又は菌体培養物に、所望によりさらに菌体破砕処理等の処理を行って、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体又は菌体培養物の抽出物を調製することもできる。
Ｈｙｐ蓄積工程を含むＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の製造方法としても好ましい。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を得る場合、Ｈｙｐ蓄積工程及びその好ましい態様は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法におけるＨｙｐ蓄積工程及びその好ましい態様と同じである。

Ｈｙｐ蓄積工程において、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の液体培地ヘの添加方法は、炭素源及び窒素源を含有する液体培地中に直接少量の菌体を接種することで増殖させることができるが、短期間で菌体濃度を上昇させるためには、前培養した菌液を接種することが好ましい。前培養に用いる培地は特に限定されず、Ｈｙｐ蓄積工程（通常、本培養）で使用される液体培地と同じ培地でもよく、酵母に使用することができる公知の培地を使用してもよい。前培養の時間は、通常１０〜７２時間であり、好ましくは１２〜４８時間である。前培養温度は、１５〜４０℃とすることが好ましい。前培養した菌液を接種する量としては、通常、Ｈｙｐ蓄積工程で使用する培地量の１／１０００００〜１／２であり、１／１０００〜１／１０が好ましく、１／２００〜１／１０がより好ましく、１／２００〜１／２０がさらに好ましい。接種量が上記範囲であれば、Ｈｙｐ蓄積工程において酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の増殖が速く、Ｌ−ヒドロキシプロリンを効率よく蓄積させることができる。

Ｈｙｐ蓄積工程で使用される液体培地の窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源である。このような窒素源を用いて酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を好気培養すると、菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンが蓄積する。このような窒素源は１種のみ使用してもよく、２種以上を使用してもよい。Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドは１種であってもよく、２種以上であってもよい。
Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドとは、Ｌ−ヒドロキシプロリンを構成アミノ酸に含むペプチドであればよいが、好ましくは、構成アミノ酸の１０重量％以上がＬ−ヒドロキシプロリンであるペプチドである。一態様において、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドであることも好ましい。

Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源は、例えば、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質を加水分解することにより得ることができる。Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質とは、構成アミノ酸にＬ−ヒドロキシプロリンを含むタンパク質であればよいが、好ましくは、構成アミノ酸の１０重量％以上がＬ−ヒドロキシプロリンであるタンパク質である。上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質として、コラーゲン性タンパク質等が好ましい。コラーゲン性タンパク質として、例えば、内臓、皮、魚鱗、骨等のコラーゲンを含む組織から調製されるタンパク質；コラーゲン、ゼラチンが挙げられる。コラーゲン性タンパク質の原料由来は特に限定されない。例えば牛由来、豚由来、魚由来等の動物由来のコラーゲン性タンパク質を好適に使用することができる。コラーゲン性タンパク質は、市販品を使用することができる。Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質の加水分解は、酵素等により公知の方法で行うことができる。

Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源として、例えば、動物由来のペプトンを好適に使用することができる。好ましくは、牛、豚又は魚由来のペプトンであり、より好ましくは牛又は魚由来のペプトンである。本発明の一態様において、ペプトンとして、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトンも好ましい。
本発明において使用できるＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源の市販品の一例として、例えば、製品名Pepton（#211677）（Bacto社）等が挙げられる。

一態様において、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドは、好ましくはコラーゲンペプチドである。コラーゲンペプチドとは、加水分解コラーゲンを意味し、天然コラーゲンを熱処理して変性させたゼラチン又は天然コラーゲンを加水分解したコラーゲンペプチド、又は、これらを化学的、酵素的に修飾したものの何れであってもよい。加水分解は、酵素、酸、アルカリ等により行うことができ、好ましくは酵素により行われる。好ましくは、天然コラーゲンを熱処理して変性させたゼラチン又は天然コラーゲンを加水分解したコラーゲンペプチドを用いる。コラーゲンペプチドの原料由来は特に限定されない。例えば牛由来、豚由来、魚由来等の動物由来のコラーゲンペプチドを好適に使用することができる。好ましくは、魚由来のコラーゲンペプチドである。コラーゲンペプチドは、市販品を使用することができる。

本発明において使用できるコラーゲンペプチドの市販品の一例として、例えば、新田ゼラチン（株）製の「コラーゲンペプチド イクオスＨＤＬ−５０ＳＰ」（製品名）（平均分子量５０００）、「コラーゲンペプチドＴｙｐｅ Ｓ」（製品名）（平均分子量１２００）、「スーパーコラーゲンペプチド ＳＣＰ−２０００」（製品名）（平均分子量２０００）、野洲化学工業（株）製の「コラーゲンペプチドＰ−５０００」（製品名）（平均分子量５０００）、「コラーゲンペプチドＦ−５０００」（製品名）（平均分子量５０００）、日祥（株）製の「マリンコラーゲンオリゴＣＦ」（製品名）（平均分子量９００〜１１００）、「マリンコラーゲンオリゴＭＦ」（製品名）（平均分子量９００〜１５００）等が挙げられる。中でも、「コラーゲンペプチドＴｙｐｅ Ｓ」（平均分子量１２００）、「コラーゲンペプチド イクオスＨＤＬ−５０ＳＰ」（平均分子量５０００）等が好ましい。
これらの中で、例えば「コラーゲンペプチド イクオスＨＤＬ−５０ＳＰ」、「コラーゲンペプチドＴｙｐｅ Ｓ」、「コラーゲンペプチドＦ−５０００」、「マリンコラーゲンＣＦ」、「マリンコラーゲンオリゴＭＦ」は魚に由来するものであり、「コラーゲンペプチドＰ−５０００」、「スーパーコラーゲンペプチド ＳＣＰ−２０００」は豚に由来するものである。

本発明の好ましい実施態様においては、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源は、好ましくはコラーゲンペプチド（より好ましくは魚由来のコラーゲンペプチド）及び／又はペプトン（より好ましくは牛、豚又は魚由来、さらに好ましくは牛又は魚由来のペプトン）であり、特に好ましくはコラーゲンペプチドである。このようなＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源を使用すると、酵母の菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が多くなる。ペプトンは、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトンであってよい。本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法の好ましい実施態様の一例は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源、並びに、コラーゲンペプチド及び／又はペプトンを含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含む。

一態様において、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源は、平均分子量が１００００以下であることが好ましく、例えば、平均分子量が１００〜１００００が好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドは、平均分子量が１００００以下であることが好ましく、例えば、平均分子量が１００〜１００００が好ましい。また、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドは、分子量が１００００以下であることも好ましい。
コラーゲンペプチドは、平均分子量が１０００〜１００００であることが好ましい。平均分子量が上記範囲のコラーゲンペプチドを窒素源に使用すると、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が多くなる。
Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドの平均分子量は、ゲル濾過などにより算出される。コラーゲンペプチドの平均分子量は、通常、写真用ゼラチン試験法（ＰＡＧＩ法）第１０版「２０−２ 平均分子量」に記載されている方法により算出される値である。ペプチドの平均分子量は、重量平均分子量を指す。

コラーゲンペプチドの平均分子量は、より好ましくは１０００〜６０００であり、さらに好ましくは１０００〜５５００であり、特に好ましくは１０００〜５０００である。このようなコラーゲンペプチドを窒素源に使用すると、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量がより多くなる。また、一態様において、コラーゲンペプチドの平均分子量として、１０００〜３０００がより好ましく、１０００〜１５００がさらに好ましい。本発明の別の好ましい態様においては、コラーゲンペプチドの平均分子量は、２０００〜５５００がより好ましく、３０００〜５０００がさらに好ましい。

上記液体培地中のＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源の濃度は、０．１〜１０重量％が好ましく、０．２５〜５重量％がより好ましく、１〜５重量％であることがさらに好ましい。上記窒素源の濃度が上記範囲であると、菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンが蓄積する。このため、例えば、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が１０μｇ／ｍＬ以上である酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を得ることができる。また、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が３５〜１００である菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を得ることができる。液体培地中の上記窒素源の濃度は、１．５〜４．５重量％がさらにより好ましく、２〜４重量％が特に好ましい。上記窒素源の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。
一態様において、上記液体培地中のコラーゲンペプチド又はペプトンの濃度が、上記範囲であることが好ましい。

上記炭素源は特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラフィノース、マンノース、マルトース、ガラクトース、マンニトール、トレハロース、メレビトース、セロビオース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、Ｌ−ソルボース、グリセロール、エタノール、グルシトール等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酸、又はグルコン酸等の有機酸等が挙げられる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。中でも、炭素源はグルコース、フルクトース、スクロース等の糖が好ましく、グルコースが特に好ましい。

液体培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１〜２０重量％であり、好ましくは０．５〜１５重量％であり、より好ましくは１〜１０重量％であり、より好ましくは１〜５重量％であり、さらに好ましくは２〜５重量％である。液体培地中の炭素源の濃度が１重量％以上であると、菌体の増殖速度が速いため好ましい。なお、炭素源の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。

本発明の製造方法においては、炭素源（Ｃ）とＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源（Ｎ）との重量比（Ｃ／Ｎ）が０．２５〜２０であることが好ましい。Ｃ／Ｎの重量比が上記範囲であると、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が多くなるため好ましい。一態様において、上記Ｃ／Ｎの重量比は、０．２５〜５がより好ましく、０．３〜３がより好ましく、０．４〜１．５がさらに好ましい。Ｃ／Ｎの重量比が上記範囲であると、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量がより多くなる。一態様において、例えばＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源（Ｎ）にコラーゲンペプチド（好ましくは平均分子量が１０００〜５０００）又はペプトンを使用する場合には、上記Ｃ／Ｎの重量比は０．２５〜５がより好ましく、０．３〜３がより好ましく、０．４〜１．５がさらに好ましく、０．５〜１．３が特に好ましい。
別の好ましい態様において、上記Ｃ／Ｎの重量比は、０．５〜２０も好ましい。
上記Ｃ／Ｎの重量比は、培養開始時に上記範囲であればよい。

液体培地は、上述した炭素源及びＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源以外の成分を含んでもよく、例えば、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）を含むことが好ましい。酵母抽出物は、通常Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含まず、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源には含まれない。酵母抽出物は、酵母の培養に使用できるものであればよく、特に限定されず、市販品を使用することができる。例えば、製品名Bacto yeast Extract(#212750)（Bacto社）等を好適に使用することができる。
酵母抽出物を使用する場合、酵母抽出物の濃度は、液体培地に対して０．１〜３重量％が好ましく、０．５〜３重量％がより好ましい。酵母抽出物の濃度は、培養開始時に上記濃度であればよい。

一態様において、液体培地のｐＨは、３〜９が好ましく、４〜９がより好ましく、４を超えて９以下がさらに好ましく、４．５〜８．８がさらにより好ましく、５〜８．７が特に好ましい。液体培地のｐＨは、適宜調整すればよい。ｐＨ調整には、公知の酸又はアルカリ剤を使用でき、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、グルタミン酸、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水、グルタミン酸ナトリウム等が挙げられる。

培養温度は、１５〜４５℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃がさらに好ましい。培養温度がこの温度範囲であると、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の増殖が速く、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が多くなる。

好気培養を行う方法は特に限定されず、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を接種した液体培地を、例えば、振盪培養又は攪拌培養すればよい。振盪又は攪拌の速度は特に限定されないが、好ましくは３０〜６００ｒｐｍであり、一態様において、より好ましくは５０〜６００ｒｐｍであり、さらに好ましくは、１００〜６００ｒｐｍである。また別の好ましい態様において、振盪又は攪拌の速度は、より好ましくは３０〜５００ｒｐｍであり、さらに好ましくは５０〜３００ｒｐｍである。このような速度で振盪培養又は攪拌培養すると、Ｌ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が多くなるため好ましい。より好ましくは、上記速度で振盪培養する。また、所望により滅菌された空気又は酸素でバブリングを行ってもよい。また、培養形式は、回分培養、流加培養、連続培養のいずれでもよいが、回分培養が好ましい。本発明の製造方法においては、静置培養を行ってもよい。

培養時間は特に限定されず、適宜設定すればよいが、例えば、好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。培養時間が上記範囲であると、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンが蓄積する。また、通常、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が３５〜１００である、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が１０μｇ／ｍＬ以上である酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を得ることができる。また、エタノール含量が少ない（例えば、１ｖ／ｖ％以下）酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物が得られる。培養時間が１０時間未満であると、Ｌ−ヒドロキシプロリンの蓄積量が少ない場合や、得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が３５未満となる場合がある。培養時間が１００時間を超えると、得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のエタノール濃度が１ｖ／ｖ％を超える場合がある。また、コンタミネーションが起こりやすくなったり、酵母の死滅後に自己消化による着色等が生じたりする場合がある。培養時間は、より好ましくは１０〜８０時間であり、さらに好ましくは１２〜７２時間であり、さらにより好ましくは２０〜６０時間であり、さらにより好ましくは２４〜５５時間であり、特に好ましくは２４〜５０時間である。また、本発明の製造方法においては、菌体又は菌体培養物中のＬ−ヒドロキシプロリン含量が１０μｇ／ｍＬ以上となるまで、好気培養を行うことが好ましい。
本発明の製造方法において、好気培養は、通常、本培養として行われるが、前培養であってもよく、前培養及び本培養において好気培養を行ってもよい。

上記の好気培養を行うことにより、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンが蓄積する。菌体培養物は、酵母の菌体及び培養上清を含む菌体培養液であってもよく、酵母の菌体であってもよく、又は、菌体培養液の培養上清であってもよい。Ｈｙｐ蓄積工程を行うことにより、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有し、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が、３５〜１００である酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体又は菌体培養物を得ることができる。また、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体又は菌体培養物を得ることができる。酵母の菌体又は菌体培養物に、例えば菌体破砕処理を行うことにより、酵母の菌体又は菌体培養物の抽出物を得ることができる。

本発明においてＬ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はその抽出物を調製する場合は、例えば、Ｈｙｐ蓄積工程で得られる酵母の菌体及び培養上清を含む菌体培養液をそのままＬ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体培養物とすることができる。また、菌体培養液から酵母の菌体を集菌し、得られた菌体を酵母の菌体又は菌体培養物としてもよく、菌体培養液から菌体を除去した培養上清を菌体培養物とすることもできる。さらに、上記菌体又は菌体培養液に、必要に応じて菌体を破砕する処理を行って、菌体内容物を培養液中等に溶出させて菌体又は菌体培養物の抽出物を調製することもできる。菌体又は菌体培養物の抽出物の調製においては、菌体を破砕した後、菌体残渣を除去する工程を行ってもよい。また、菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物には、必要に応じて殺菌、加熱等の処理を行ってもよい。本発明の製造方法は、このような集菌工程、菌体破砕工程、菌体残渣除去工程、殺菌工程等の１又は２以上の工程を含んでもよい。

菌体培養液から菌体を集菌する方法は特に限定されず、通常行われている方法を採用することができ、例えば、遠心分離等が挙げられる。
上記菌体を破砕する方法は特に限定されず、通常行われている方法を採用することができ、例えば、自己消化法、酵素分解法、アルカリ抽出法等が挙げられる。中でも、自己消化法が好ましい。自己消化法においては、例えば菌体又は菌体培養物を４０〜６０℃で６０〜１８０分間、又は、９５〜１００℃で５〜１５分間加熱すればよい。
菌体残渣を除去する方法は特に限定されない。例えば、濾過、遠心分離等の公知の方法により菌体残渣を除去すればよい。
殺菌を行う場合には、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を７５〜９０℃（より好ましくは８０℃）、４５〜９０分（より好ましくは６０分）加熱することが好ましい。菌体残渣除去及び殺菌を行う場合、いずれを先に行ってもよい。

本発明において得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物、及び、その好ましい態様は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物、及び、その好ましい態様と同じである。本発明の製造方法によれば、例えば、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が、３５〜１００であり、かつ、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が１０μｇ／ｍＬである酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を製造することができる。酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物中のＬ−ヒドロキシプロリンは、通常、上記酵母の菌体又は菌体培養物に由来するものである。
上記方法により得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に、さらに天然物由来又は合成されたＬ−ヒドロキシプロリンを添加してもよいが、好ましい態様においては、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に含まれるＬ−ヒドロキシプロリンは、上記のＨｙｐ蓄積工程により得られる酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体又は菌体培養物に由来するＬ−ヒドロキシプロリンからなる。

本発明で得られるＬ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、後述する飲食品、化粧料等の原料等として使用することができる。また、本発明のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法においては、得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物から、Ｌ−ヒドロキシプロリンを精製する工程を行ってもよい。Ｌ−ヒドロキシプロリンの精製は、例えば、カラムクロマトグラフィー等の公知の方法により行えばよい。

本発明は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の、Ｌ−ヒドロキシプロリンを製造するための使用も包含する。
上記ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を製造するためにも好適に使用される。Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が、３５〜１００であることが好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であることも好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の好ましい態様は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の好ましい態様と同じである。

本発明の使用は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させることを含むことが好ましい。
上記窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源であることが好ましい。

本発明の使用においては、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドであることが好ましい。また、上記コラーゲンペプチドの平均分子量は１０００〜１００００であることが好ましい。

本発明の使用においては、上記液体培地中のＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源の濃度が０．２５〜５重量％であることが好ましい。また、炭素源（Ｃ）とＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源（Ｎ）との重量比（Ｃ／Ｎ）が０．２５〜２０であることが好ましい。一態様において、上記Ｃ／Ｎ比は０．５〜２０であることも好ましい。本発明の使用においては、上記好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。

本発明の使用における液体培地、炭素源及びＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源並びにこれらの好ましい態様は、上述したＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法におけるものと同じである。また、好気培養の条件及びその好ましい態様も、上述したＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法におけるものと同じである。本発明の使用は、上述した集菌工程、菌体破砕工程、菌体除去工程、殺菌工程等の１又は２以上の工程を含んでもよい。

上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、化粧料、飲食品、医薬品等の各種組成物に配合することができる。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含む組成物も、本発明に包含される。本発明の組成物は、上述した本発明の第一の態様及び第二の態様の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物のいずれかを含めばよく、両方を含んでよい。本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含む組成物は、該酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に由来するＬ−ヒドロキシプロリンを含む。
本発明の組成物として、例えば、化粧料（化粧料組成物）、飲食品（飲食品組成物）、医薬品（医薬品組成物）、医薬部外品（医薬部外品組成物）等が挙げられる。組成物は、これらの原料であってもよい。一態様において、組成物は、化粧料又は飲食品、これらの原料であることが好ましい。

本発明の組成物中の上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量は特に限定されず、該組成物の種類、用途に応じて適宜設定することができる。例えば、組成物に対して、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の固形分換算の含量を０．００００１〜５０重量％とすることが好ましく、０．００００５〜２０重量％がより好ましく、０．０００１〜１０重量％がさらに好ましい。

本発明の組成物が化粧料又は医薬品である場合、その剤型は特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。
化粧料は特に限定されず、例えば、クレンジング剤、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、美容液、育毛剤、オイル、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、香水、パウダー、オーデコロン、ボディソープ、石鹸、入浴剤、日焼け止めクリーム等とすることができる。

上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含む化粧料又は化粧料原料は、本発明における好ましい態様の１つである。化粧料及び化粧料原料は、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物以外の成分を含んでいてもよい。化粧料及び化粧料原料には、化粧料に通常配合される種々の成分を配合することができる。例えば、油分、香料、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、顔料、色素等を適宜配合することができる。これらの配合比率は適宜選択すればよい。本発明の化粧料原料は、本発明の化粧料を製造するために好適に使用される。
化粧料の用法及び用量は、化粧料の種類等に応じて、適宜決定することができる。
本発明の化粧料又は化粧料原料は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有することから、例えば、コラーゲン産生促進、表皮細胞の増殖促進、皮膚の保湿、皮膚の老化防止、皮膚のたるみの予防又は改善、皮膚のハリの改善、しわの予防又は改善及びアトピー性皮膚炎の改善から選ばれる用途に好適に用いられ、皮膚のハリの改善、及び、しわの予防又は改善から選ばれる用途により好適に用いられる。

化粧料中の上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量は、化粧料に対して、固形分換算で０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１０重量％とすることが好ましく、０．０００１〜５重量％がより好ましく、０．００１〜５重量％がより好ましく、０．０１〜３重量％がさらに好ましく、０．０５〜２重量％が特に好ましい。また、別の好ましい態様において、化粧料中の上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量は、化粧料に対して、固形分換算で０．００００５〜１重量％がより好ましく、０．０００１〜０．５重量％がさらに好ましい。
化粧料原料中の上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量は、化粧料原料に対して、例えば、固形分換算で０．００１〜２０重量％が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましく、０．０５〜５重量％がさらに好ましく、０．１〜２重量％が特に好ましい。化粧料原料中のＬ−ヒドロキシプロリン含量は、例えば、５〜３００ｐｐｍが好ましく、１０〜２００ｐｐｍがより好ましく、５０〜１００ｐｐｍがさらに好ましい。一態様において、化粧料中のＬ−ヒドロキシプロリン含量は、例えば、０．０１〜２０ｐｐｍとすることができ、０．０３〜１５ｐｐｍが好ましく、０．０５〜１０ｐｐｍがより好ましい。Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が上記の範囲となるように、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を配合することが好ましい。

本発明の組成物が飲食品（飲食品組成物）である場合、飲食品は特に限定されない。飲食品の形態は、液状、半液体状又は固体状、ペースト状のいずれであってもよく、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性食品等のいずれでもよい。
一般的な飲食品は特に限定されず、酒類も含まれる。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品等を含む。栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品、栄養機能食品を含む。

栄養補助食品として、美容ドリンク、サプリメント等が挙げられる。本発明の飲食品は、カプセル等の医薬製剤の形態、ドリンク剤等であってもよい。
飲食品には、飲食品に配合することが認められている種々の成分を配合することができる。このような成分としては例えば、結合剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、崩壊剤、懸濁化剤、界面活性剤、防腐剤、甘味料、酸味料等が挙げられる。
上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含む飲食品は、本発明における好ましい態様の１つである。

飲食品中の上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量は、例えば、飲食品に対して、固形分換算で０．０００１〜１０重量％とすることが好ましく、０．００１〜５重量％がより好ましく、０．０１〜１重量％がさらに好ましい。また、飲食品中のＬ−ヒドロキシプロリン含量は、０．０００１〜０．０１重量％が好ましく、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が上記の範囲となるように、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を配合することが好ましい。上記化粧料、化粧料原料、飲食品等の組成物中のＬ−ヒドロキシプロリン含量は、遊離のＬ−ヒドロキシプロリン含量である。Ｌ−ヒドロキシプロリンは、好ましくは、上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に由来する。

本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含有する化粧料、飲食品、これらの原料等の組成物は、これらに通常使用されている原料、添加剤等をその種類に応じて選択して配合し、これに本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を配合し、公知の手法によって製造することができる。

本発明は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程（Ｈｙｐ蓄積工程）を含む、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料の製造方法も包含する。上記窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源である。本発明のＬ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料の製造方法の好ましい態様は、上述したＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法の好ましい態様と同じである。上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料の製造方法は、本発明の化粧料原料の製造方法として好ましい。
Ｈｙｐ蓄積工程を行うことにより、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体又は菌体培養物が得られる。また、酵母の菌体又は菌体培養物に上述した菌体破砕処理を行うことにより、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体又は菌体培養物の抽出物が得られる。このようにして得られる酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物、及び、その好ましい態様は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物、及び、その好ましい態様と同じである。得られるＬ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、所望により化粧料に通常使用される添加剤等を配合して、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料として使用することができる。また、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物から精製したＬ−ヒドロキシプロリンに、所望により化粧料に通常使用される添加剤等を配合して、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料を製造することもできる。本発明により得られるＬ−ヒドロキシプロリン含有化粧料原料は、コラーゲン産生促進、表皮細胞の増殖促進、皮膚の保湿、皮膚の老化防止、皮膚のたるみの予防又は改善、皮膚のハリの改善、しわの予防又は改善及びアトピー性皮膚炎の改善から選ばれる用途の化粧料に好適に使用される。

本発明は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含む、Ｌ−ヒドロキシプロリン補強用組成物も包含する。
上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有するが、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００であることが好ましい。上記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上が好ましい。このような酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、化粧品、飲食品等のＬ−ヒドロキシプロリンを補強、補充又は強化するための添加剤として特に好適に使用することができる。酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の好ましい態様は、上述した本発明の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその好ましい態様と同じである。Ｌ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、Ｌ−ヒドロキシプロリン補強用の添加剤組成物として、飲食品、化粧料等に好適に使用することができる。Ｌ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、Ｌ−ヒドロキシプロリン補充用組成物又はＬ−ヒドロキシプロリン強化用組成物と言い換えることもできる。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含んでいればよく、該菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量が１００重量％であってもよいが、所望により、他の成分を含んでいてもよい。例えばＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物を食品添加剤として使用する場合には、食品に使用される公知の添加剤１種又は２種以上を含んでいてもよい。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物は、例えば、化粧料添加剤としても好適に使用される。Ｌ−ヒドロキシプロリン補強用組成物を化粧料添加剤として使用する場合は、該組成物中、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含んでいればよく、該菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物の含量が１００重量％であってもよいが、所望により、化粧料に使用される公知の添加剤１種又は２種以上を含んでいてもよい。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物の製造方法は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含むことが好ましい。このような工程を含むＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物の製造方法も本発明に包含される。上記窒素源は、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源である。本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物の製造方法及びその好ましい態様は、上述したＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法及びその好ましい態様と同じである。本発明のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物の製造方法は、所望により、酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物に公知の食品添加剤、化粧料添加剤等を添加する工程を含んでいてもよい。

本発明の別の態様のＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含む。
本発明の別の態様の製造方法においては、上記窒素源が、Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質又はＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含むことが好ましい。
本発明の別の態様の製造方法においては、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質がコラーゲン性タンパク質であり、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドであることが好ましい。本発明の別の態様の製造方法においては、上記コラーゲン性タンパク質及びコラーゲンペプチドの平均分子量が１０００〜１０００００であることが好ましい。
本発明の別の態様の製造方法においては、上記液体培地中の窒素源の濃度が０．２５〜５重量％であり、炭素源（Ｃ）と窒素源（Ｎ）との重量比（Ｃ／Ｎ）が０．５〜２０であることが好ましい。また、上記好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。

本発明の別の態様の使用は、酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の、Ｌ−ヒドロキシプロリンを製造するための使用であって、上記酵母を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、上記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させることを含み、上記窒素源がＬ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質又はＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含むことが好ましい。
本発明の別の態様の使用においては、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質がコラーゲン性タンパク質であり、上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドであることが好ましい。本発明の別の態様の使用においては、上記コラーゲン性タンパク質及びコラーゲンペプチドの平均分子量が１０００〜１０００００であることが好ましい。
本発明の別の態様の使用においては、上記液体培地中の窒素源の濃度が０．２５〜５重量％であり、炭素源（Ｃ）と窒素源（Ｎ）との重量比（Ｃ／Ｎ）が０．５〜２０であることが好ましい。また、上記好気培養を１０〜１００時間行うことが好ましい。

上記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質としては、例えば、上述したコラーゲン性タンパク質が挙げられる。コラーゲン性タンパク質等のＬ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質の平均分子量は、好ましくは１００００を超えて１０００００以下である。タンパク質の平均分子量は、重量平均分子量を指す。コラーゲン性タンパク質等のＬ−ヒドロキシプロリン含有タンパク質の平均分子量は、ゲル濾過などにより算出される。

以下、本発明をより具体的に説明する試験例等を示す。なお、本発明はこれらの試験例等のみに限定されるものではない。試験例中、特に断らない場合には、「％」は「重量％」を意味する。

試験例中、検量線の作成に使用するＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）標準溶液等の調製には、ナカライテスク（株）製のＬ−４−ヒドロキシプロリンを使用した。Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）標準溶液等の調製等には、ナカライテスク（株）製のＬ−プロリンを使用した。試験例で測定したＬ−ヒドロキシプロリン及びＬ−プロリンは、いずれも遊離のＬ−ヒドロキシプロリン及びＬ−プロリンである。

試験例中で使用した培地は、全て液体培地である。試験例中で使用したＹＰＤ培地は、特に断らない場合は、Ｙ：Ｐ：Ｄが１：２：２（重量比）（Ｙ：酵母抽出物１．０％、Ｐ：ペプトン２．０％、Ｄ：グルコース２．０％）とした。
培地調製に使用した酵母抽出物は、Bacto社製の製品名Yeast Extract(#212750)である。ペプトンは、Bacto社製の製品名Pepton(#211677)、ウシの細胞をブタの膵臓由来の酵素で分解したものを使用した。
試験例において、培養開始前の培地のｐＨは、約６．５〜８．５であった。

＜試験例１＞
Ｌ−ヒドロキシプロリン（以下、Ｈｙｐ）を蓄積する酵母のスクリーニング
表１に示す６０株の酵母を使用し、Ｈｙｐを培養物中に蓄積する酵母のスクリーニングを行った。表１に各菌株の属種名を示す。

以下の条件で、ＹＰＤ培地で酵母を培養した後、ＨＰＬＣでＨｙｐを定量した。

（培養）
０．５％Ｌ−プロリン（以下、Ｐｒｏ）を添加したＹＰＤ培地１ｍＬに、各菌株を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）した後、室温で４〜７日間静置培養して酵母の菌体培養液（菌体培養物）を得た。

（サンプル調製）
酵母の菌体培養液に以下の処理を行って、培養物サンプルを調製し、Ｈｙｐ含量を測定した。
上記の培養後、集菌し、菌体を１ｍＬの生理食塩水で洗浄した。菌体を０．２ｍＬの５０ｍＭ カリウムリン酸緩衝液（以下、ＫＰＢ）（ｐＨ６．０）に懸濁し、１０分間煮沸して、自己消化により菌体内容物を溶出させた（煮沸法）。得られた菌体抽出物から遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体残渣を除いた。これにより、Ｈｙｐ蓄積量を測定するための培養物サンプルを調製した。

培養物サンプルをウォーターズ社の（AccQ-Fluor Reagent Kit）を使用して、ＡｃｃＱＴａｇ法により誘導体化し、以下の条件でＨＰＬＣでＨｙｐを定量した。

ＨＰＬＣ分析に使用した装置及び条件を以下に示す。
（装置）
高速液体クロマトグラフ： Prominence（（株）島津製作所）
カラム： XBridge C18 5μm（2.1 x 150 mm、ウォーターズ社製）
（測定条件）
溶離液Ａ：酢酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ５）
溶離液Ｂ：メタノール（０〜０．５ｍｉｎ．（０％→１％），０．５〜１８ｍｉｎ．（１％→５％），１８〜１９ｍｉｎ．（５％→９％），１９〜２９．５ｍｉｎ．（９％→１７％），２９．５〜４０ｍｉｎ．（１７％→６０％），４０〜４３ｍｉｎ．（６０％））
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：蛍光検出器（励起波長：２５０ｎｍ、検出波長：３９５ｎｍ）
溶離液Ｂの濃度（％）は、ｖ／ｖ％である。
結果を図１に示す。

図１は、酵母のＨｙｐ蓄積量を示すグラフである。図１の縦軸（Ｈｙｐ（μｇ／ｍＬ））は、培養物サンプル１ｍＬあたりのＨｙｐ（μｇ）を示す。
上記の試験から、Ｈｙｐを蓄積する酵母が見出された。特にYarrowia lipolyticaが、Ｈｙｐ蓄積量が多かった。

＜試験例２＞
酵母Yarrowia lipolyticaについて、培地によってＨｙｐ蓄積量が変化するかを調べた。Yarrowia lipolytica NBRC0717を使用し、以下の液体培地を使用した。Yarrowia lipolytica NBRC0717は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から入手した。

ＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）
ＹＴＤ（１％酵母抽出物、２％トリプトン、２％グルコース）
ＹＭ（０．３％酵母抽出物、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、２％グルコース）
ＰＤ（０．４％ポテト抽出物、２％グルコース）
ＳＤ（合成培地、１％グルコース）

（前培養及び本培養）
（１）条件１
０．５％Ｐｒｏを添加したＹＰＤ培地１ｍＬに、Yarrowia lipolytica NBRC0717を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。
０．５％Ｐｒｏを添加した各培地（上記ＹＰＤ、ＹＴＤ、ＹＭ、ＰＤ又はＳＤ）２ｍＬに、前培養液０．２ｍＬを接種して、２８℃で３６時間振盪培養（３００ｒｐｍ）してYarrowia lipolyticaの菌体培養液を得た。
（２）条件２
０．５％Ｐｒｏを添加したＹＰＤ培地の代わりに、０．５％Ｐｒｏを添加したＳＤ培地を使用した以外は、条件１と同じ条件で前培養を行った。０．５％Ｐｒｏを添加した各培地（上記ＹＰＤ、ＹＴＤ、ＰＤ又はＳＤ）２ｍＬに、前培養液０．２ｍＬを接種して、２８℃で４５時間振盪培養（３００ｒｐｍ）してYarrowia lipolyticaの菌体培養液を得た。

（サンプル調製）
条件１又は２の培養後、酵母の菌体培養液に以下の処理を行って培養物サンプルを調製し、Ｈｙｐ含量を測定した。
上記の培養後、集菌し、菌体を１ｍＬの生理食塩水で洗浄した。菌体を０．２ｍＬの５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に懸濁し、１０分間煮沸して、自己消化により菌体内容物を溶出させた（煮沸法）。得られた菌体抽出物から遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体残渣を除いた。これにより、Ｈｙｐ蓄積量を測定するための培養物サンプルを調製した。

（Ｈｙｐ定量）
培養物サンプルをｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）及び４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｃｌ）により誘導体化し、ＨＰＬＣでＨｙｐを定量した。
（誘導体化方法）
4-Chloro-7-nitrobenzofurazan（ＮＢＤ−Ｃｌ）による誘導体化
０．４Ｍ ホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を５０μＬ分注し、培養物サンプルを２μＬ加えた。３００ｍＭ ＯＰＡ（Ｗａｋｏ １６７−０９２６３）（メタノールに溶解）を２μＬ加えて混合し、３７℃で２０分間反応後、２ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｓｉｇｍａ２５４５５）（メタノールに溶解）を５０μＬ加えて混合し、３７℃で２０分間反応した液に、１Ｎ ＨＣｌを２５μＬ、５０％メタノールを７５μＬ加え、１４０００ｒｐｍで５分間遠心した上清をＨＰＬＣ測定用のサンプルとし、ＨＰＬＣ用のバイアルへ移した。

ＨＰＬＣ分析に使用した装置及び条件を以下に示す。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（５μｍ；２．１ｍｍ×１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）
Ａ液：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）
Ｂ液：メタノール
グラジエント：
０〜０．５分：Ｂ．Ｃｏｎｃ ０ｖ／ｖ％→１ｖ／ｖ％
０．５〜１８分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １ｖ／ｖ％→５ｖ／ｖ％
１８〜１９分：Ｂ．Ｃｏｎｃ ５ｖ／ｖ％→９ｖ／ｖ％
１９〜２９．５分：Ｂ．Ｃｏｎｃ ９ｖ／ｖ％→１７ｖ／ｖ％
２９．５〜４０分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １７ｖ／ｖ％→６０ｖ／ｖ％
４０〜４３分：Ｂ．Ｃｏｎｃ ６０ｖ／ｖ％
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出器：蛍光検出器、励起波長５０３ｎｍ／蛍光波長５４１ｎｍ
注入量：１０μＬ

検量線は、Ｈｙｐの、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、２５０μｍｏｌ／Ｌの５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）溶液を調製して作成した。

結果を図２に示す。図２は、各培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（（ａ）：条件１、（ｂ）：条件２）。図２の縦軸のＨｙｐ（μｇ／ｍＬ）は、培養物サンプル１ｍＬあたりのＨｙｐ（μｇ）である。条件１の培養では、ＹＰＤ及びＹＭ培地で培養した菌体にヒドロキシプロリンが多く蓄積した（ペプトンを含む培地）。条件２の培養では、ＹＰＤ培地で培養した菌体にＨｙｐが蓄積した。

＜試験例３＞
培養日数による蓄積量の変動を調べた。
Yarrowia lipolyticaのNBRC1551株、NBRC0717株、NBRC0746株及びNBRC1195株をそれぞれＹＰＤ培地で１日、２日又は３日間培養し、酵母の菌体（細胞）から溶出させたＨｙｐをＨＰＬＣを用いて定量した。ＮＢＲＣ番号で特定されるこれらの酵母は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から入手した。

（前培養）
ＹＰＤ培地１ｍＬに、各菌株を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。

（本培養）
ＹＰＤ培地２ｍＬに、前培養液０．２ｍＬを接種して、２８℃で１〜３日間振盪培養（３００ｒｐｍ）して菌体培養液を得た。

（サンプル調製及びアミノ酸定量）
試験例２と同じ方法で培養物サンプルを調製し、ＯＰＡ及びＮＢＤ−Ｃｌにより誘導体化した。
試験例２と同じ条件でＨＰＬＣによる分析を行い、Ｈｙｐ及びＰｒｏを定量した。Ｐｒｏの検量線は、Ｐｒｏの５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、２５０μｍｏｌ／Ｌの５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）溶液を調製して作成した。

各培養物サンプルのＰｒｏ及びＨｙｐ量を表２に示す。また、Ｐｒｏ及びＨｙｐの測定値から、Ｐｒｏ及びＨｙｐの合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＨｙｐの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））を計算した。その結果も表２に示す。

Yarrowia lipolyticaは、培養によってＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積した。得られた菌体培養物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有した。また、（Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））割合が３５以上であった。

＜試験例４＞
Yarrowia lipolyticaのゼラチン資化性を検討した。Yarrowia lipolyticaのNBRC1551株、NBRC0717株及びNBRC0746株を使用して、ＰＤ培地又は０．１２５％ゼラチンを添加したＰＤ培地で５日間培養し、菌体から菌体内容物を溶出させてＨｙｐをＨＰＬＣにより定量した。ＰＤ培地は、試験例２で使用したものと同じ培地を使用した。

（前培養）
ＰＤ培地１ｍＬに、各菌株を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。
（本培養）
ＰＤ培地又は０．１２５％ゼラチン（和光純薬工業（株）製、製品名ゼラチン）を添加したＰＤ培地２ｍＬに、前培養液０．２ｍＬを接種して、２８℃で５日間振盪培養（３００ｒｐｍ）して菌体培養液を得た。
（サンプル調製及びＨｙｐ定量）
培養物サンプルの調製及びＨｙｐ定量は、試験例２と同じ方法で行った。結果を図３に示す。

図３は、ＰＤ培地又は０．１２５％ゼラチンを添加したＰＤ培地で５日間培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（白：０．１２５％ゼラチンを含むＰＤ培地（ＰＤ＋ｇｅｌ）、黒：ＰＤ培地）。縦軸のＨｙｐ（μｇ／ｍＬ）は、培養物サンプル１ｍＬあたりのＨｙｐ（μｇ）である。図３から、高分子ゼラチンのまま培地に添加すると、Ｈｙｐの蓄積は試験例３と比較して少なかった。

＜試験例５＞
Yarrowia lipolytica NBRC0717を用いて、ＹＰＤ培地組成によりＨｙｐ蓄積量が変化するか検討した。表３に＃１〜＃１２の各培地のＹＰＤ組成を示す。表３中、Ｙは、酵母抽出物、Ｐはペプトン、Ｄはグルコースである。酵母抽出物（Ｙ）を一定にし、ペプトン（Ｐ）及びグルコース（Ｄ）を変化させた（表中の数値は終濃度（重量％））。

（前培養）
各ＹＰＤ培地１ｍＬに、Yarrowia lipolytica NBRC0717を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。
（本培養）
各ＹＰＤ培地２ｍＬに、前培養液０．２ｍＬを接種して、２８℃で４日間振盪培養（３００ｒｐｍ）して菌体培養液を得た。
（サンプル調製及びＨｙｐ定量）
培養物サンプルの調製及びＨｙｐ定量は、試験例２と同じ方法で行った。

上記のＹＰＤ培地で培養した酵母Yarrowia lipolyticaは、Ｈｙｐを蓄積した。＃１及び＃７〜１１の培地で培養した場合にＨｙｐ蓄積量が多かった。＃１及び＃７〜１１の培地で培養した場合の結果を図４に示す。

図４は、組成が異なるＹＰＤ培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示すグラフである（（ａ）：Ｈｙｐ蓄積量（μｇ／ｍＬ）、（ｂ）：細胞あたりのＨｙｐ量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００））。図４の（ａ）の縦軸は、培養物サンプル１ｍＬあたりのＨｙｐ（μｇ）である。図４の（ｂ）の縦軸の（Ｈｙｐ／ＯＤ）は、細胞あたりのＨｙｐ量であり、培養物サンプル１ｍＬ中のＨｙｐ量（μｇ）をＯＤ６００の測定値で除した値（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）である。
ＯＤ６００は、核酸蛋白質分光光度計（装置名Bio spec mini、（株）島津製作所）を用いて、培養物サンプルの調製に使用した菌体培養液６０μＬを超純水１１５０μＬで希釈し、吸光度（６００ｎｍ）を測定した

＜試験例６＞
試験例５で使用したＹＰＤ培地＃１及び＃１０において、Ｐとして使用したペプトンをコラーゲンペプチド（新田ゼラチン社製の製品名スーパーコラーゲンペプチド ＳＣＰ−２０００、ブタ由来、平均分子量２０００）に置換して、Ｈｙｐの蓄積量を調べた。酵母は、Yarrowia lipolytica NBRC0717を使用した。ＹＰＤ培地において、ペプトンの一部又は全部をコラーゲンペプチドに置換した培地は、ＹＰＤ改変培地ともいえる。
ＹＰＤ培地のＰの組成
ノーマル：ペプトン１００％
ＣＰ５０：ペプトン５０％ コラーゲンペプチド５０％
ＣＰ１００：コラーゲンペプチド１００％

培地組成
（１）ＹＰＤ＃１−ノーマル（ＹＰＤ＃１）
（２）ＹＰＤ＃１−ＣＰ５０（ＹＰＤ＃１において、ペプトンの代わりにＣＰ５０を使用）
（３）ＹＰＤ＃１−ＣＰ１００（ＹＰＤ＃１において、ペプトンの代わりにＣＰ１００を使用）
（４）ＹＰＤ＃１０−ノーマル（ＹＰＤ＃１０）
（５）ＹＰＤ＃１０−ＣＰ５０（ＹＰＤ＃１０において、ペプトンの代わりにＣＰ５０を使用）
（６）ＹＰＤ＃１０−ＣＰ１００（ＹＰＤ＃１０において、ペプトンの代わりにＣＰ１００を使用）

（前培養）
ＹＰＤ培地１ｍＬに、Yarrowia lipolytica NBRC0717を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。
（本培養）
上記（１）〜（６）の各培地２ｍＬに、前培養液０．１ｍＬを接種して、２８℃で４日間振盪培養（３００ｒｐｍ）して菌体培養液を得た。
（サンプル調製及びＨｙｐ定量）
培養物サンプルの調製及びＨｙｐ定量は、試験例２と同じ方法で行った。
結果を図５示す。

図５は、ペプトン又はコラーゲンペプチドを含む培地で培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量、細胞あたりのＨｙｐ量及びＯＤ６００を示すグラフである。（（ａ）：Ｈｙｐ蓄積量（μｇ／ｍＬ）、（ｂ）：細胞あたりのＨｙｐ量（μｇ／ｍＬ／ＯＤ６００）、（ｃ）：ＯＤ６００）。図５の（ａ）〜（ｃ）中、Ｎは、Ｐがノーマルの培地、５０は、ＰがＣＰ５０の培地、１００はＰがＣＰ１００の培地であることを意味する。ペプトンを完全にコラーゲンペプチドに置換した培地でもYarrowia lipolyticaは増殖でき、Ｈｙｐを蓄積した。

＜試験例７＞
Yarrowia lipolytica NBRC0717を用いて、培養時のエアレーションの影響を検討した。培地は、試験例５のＹＰＤ培地＃１及び＃１０を使用した。

（前培養）
ＹＰＤ培地１ｍＬに、Yarrowia lipolytica NBRC0717を１白金耳接種し、２８℃で２４時間振盪培養（３００ｒｐｍ）して前培養液を得た。
（本培養）
各ＹＰＤ培地（＃１又は＃１０）２ｍＬに、前培養液０．１ｍＬを接種して、２８℃で３日間振盪培養（３００ｒｐｍ）又は静置培養して菌体培養液を得た。
（サンプル調製及びＨｙｐ定量）
培養物サンプルの調製及びＨｙｐ定量は、試験例２と同じ方法で行った。また、培養上清についても、培養物サンプルと同じ方法で誘導体化し、ＨＰＬＣでＨｙｐを定量した。
結果を図６に示す。

図６は、振盪培養又は静置培養したYarrowia lipolyticaのＨｙｐ蓄積量を示す図である（（ａ）：培養物サンプル（細胞内）の培地あたり換算Ｈｙｐ量、（ｂ）：培養上清中のＨｙｐ量）。
Yarrowia lipolyticaは、好気培養するとＨｙｐ蓄積量が多かった。

＜試験例８＞
試験例７で得られた培養上清中のエタノール濃度及びグルコース濃度をＨＰＬＣ（発酵カラム（バイオ・ラッド社製、製品名Aminex発酵モニター用カラム）を使用）で定量した。
結果を図７に示す。

図７は、振盪培養又は静置培養したYarrowia lipolyticaの培養上清のエタノール濃度及びグルコース濃度を示すグラフである（（ａ）：エタノール濃度（ｖ／ｖ％）、（ｂ）：グルコース濃度（重量％））。

＜試験例９＞
Yarrowia lipolytica NBRC0717について、ＹＰＤ培地の組成（Ｙ：Ｐ：Ｄの比率及びＰの種類）及び培養時間を変化させて本培養を行い、菌体培養物中のＨｙｐ含量及びＰｒｏ含量を測定した。

（前培養）
ＹＰＤ培地３ｍＬに、Yarrowia lipolytica NBRC0717を１白金耳接種し、３０℃で１日静置培養して前培養液を得た。

（本培養）
上記で得られた前培養液１００μＬを、下記のＹＰＤ培地５ｍＬに接種して３０℃で振盪培養（６０ｒｐｍ）した。培養時間は、１日又は２日として菌体培養液（菌体培養物）を得た。
本培養では、ＹＰＤ培地のＰとして、ペプトン又はコラーゲンペプチド（ＣＰ）を使用した。コラーゲンペプチドには、コラーゲンペプチド イクオス ＨＤＬ−５０ＳＰ（製品名、新田ゼラチン（株）製、平均分子量５０００）（以下、コラーゲンペプチド（ＣＰ１）と記載する）又はコラーゲンペプチドＴｙｐｅ Ｓ（製品名、新田ゼラチン（株）製、平均分子量１２００）（以下、コラーゲンペプチド（ＣＰ２）と記載する）を使用した。
また、本培養におけるＹＰＤ培地のＹ：Ｐ：Ｄの比率は、（１）Ｙ：Ｐ：Ｄ＝１：２：２（重量比）（Ｙ：酵母抽出物１．０％、Ｐ：ペプトン又はコラーゲンペプチド２．０％、Ｄ：グルコース２．０％）、又は、（２）Ｙ：Ｐ：Ｄ＝１：４：５（重量比）（Ｙ：酵母抽出物１．０％、Ｐ：ペプトン又はコラーゲンペプチド４．０％、Ｄ：グルコース５．０％）とした。表４に、本培養で使用した培養条件１〜１２を示す。

本培養で得られたYarrowia lipolyticaの菌体培養液に、以下の自己消化工程及び殺菌工程を行って培養物サンプルを調製し、Ｈｙｐ含量を測定した。
（自己消化工程）
Yarrowia lipolyticaの菌体培養液を５０℃で２時間インキュベートして、自己消化により菌体内容物を培養液中に溶出した。
（殺菌工程）
上記で自己消化した培養液を８０℃で１時間インキュベートした。
得られた抽出物から遠心分離（３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、１℃）により菌体残渣を除いた。これにより、Ｈｙｐ蓄積量を測定するための培養物サンプルを調製した。

（サンプル調製）
得られた培養物サンプルを０．１Ｎ塩酸溶液で希釈して、ＨＰＬＣのサンプルを調製した。培養時間１日の菌体培養液から調製した培養物サンプルは、１０倍希釈、培養時間２日の菌体培養液から調製した培養物サンプルは、条件１２以外は４０倍希釈し、条件１２は２０倍希釈した。

（ＨＰＬＣ分析）
ＨＰＬＣでは、オートサンプラーで１級アミノ酸（１級アミノ基）、２級アミノ酸（２級アミノ基）の蛍光標識化を行い、逆相のＨＰＬＣで分析を行うシステムを用いた。１級アミノ基の蛍光標識には、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を、２級アミノ基の蛍光標識には、クロロ蟻酸−９−フルオレニルメチル（ＦＭＯＣ）を、それぞれ使用した。

上記で調製したＨＰＬＣのサンプルを、サンプルバイアルに０．４５μｍのフィルターでろ過してオートサンプラーにセットした。空バイアルにＭＰＡ（メルカプトプロピオン酸）試薬３０μＬ、ＯＰＡ試薬１５μＬ、上記サンプル５μＬを入れて１分静置後、ＦＭＯＣ試薬を５μＬ加え２分間反応した溶液１μＬをＨＰＬＣに注入した。ＯＰＡと１級アミノ酸が反応し、残った２級アミノ基を持つＨｙｐ及びＰｒｏがＦＭＯＣと反応する。それぞれの蛍光波長を２チャンネルで検出することにより、すべてのアミノ酸を同時に検出することが可能である。

ＨＰＬＣ分析に使用した装置及び条件を以下に示す。
（装置）
（株）島津製作所製の高速液体クロマトグラフ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２ システム（製品名）
システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ、送液ユニット：ＬＣ−３０ＡＤ（２台）、脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒ、ミキサ：ＭＲ１８０μＬ ＩＩ、オートサンプラー：ＳＩＬ−３０ＡＣ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ、蛍光検出器：ＲＦ−２０ＡＸＳ、ワークステーション：ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ＬＣ／ＧＣ

（測定条件）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−４ １００ｍｍ×３．０ｍｍφ Ｓ−２μｍ （ジーエルサイエンス（株））
ガードカラム：ＵＨＰＬＣ Ｆｉｔｔｉｎｇ（製品名、ジーエルサイエンス（株））（Ｍａｘ． Ｐｒｅｓｓｕｒｅ：１３０ＭＰａ）
移動相
Ａ液：１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４及び５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）
Ｂ液：１５／４５／４０（ｖ／ｖ／ｖ）＝水／アセトニトリル／メタノール
Ｒ０（リンス液）：水／メタノール＝２０／８０（ｖ／ｖ）
Ｒ３（リンス液）：水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）
初期Ｂ液濃度：１０ｖ／ｖ％
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度：３５℃
注入量：１μＬ
検出：
Ｃｈ１：励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ
Ｃｈ２：励起波長２６６ｎｍ、蛍光波長３０５ｎｍ
セル温度:２５℃、Gain: ×4、Sensitivity: Midium

グラジエントプログラム
０〜１．５分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １０ｖ／ｖ％
１．５〜６分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １０ｖ／ｖ％→３０ｖ／ｖ％のグラジエント
６〜１１分：Ｂ．Ｃｏｎｃ ３０ｖ／ｖ％→４０ｖ／ｖ％のグラジエント
１１〜１５分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １００ｖ／ｖ％
２０〜２１．５分：Ｂ．Ｃｏｎｃ １００ｖ／ｖ％→１０ｖ／ｖ％
２５分：コントローラ停止
検量線：Ｈｙｐ及びＰｒｏそれぞれについて、６．２５μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌの０．１Ｎ ＨＣｌ溶液を調製した。これらの各溶液を、上記の方法でＭＰＡ、ＯＰＡ及びＦＭＯＣの各試薬と反応させ、ＨＰＬＣで分析して検量線を引いた。
アミノ酸混合標準液Ｈ型溶液及びＬ−ヒドロキシプロリンを含む０．１Ｎ塩酸溶液についても、同様に各試薬と反応させてＨＰＬＣで分析した。使用したアミノ酸混合標準液Ｈ型は、和光純薬工業（株）製である。

図８は、アミノ酸混合標準液Ｈ型及びＬ−ヒドロキシプロリンを含む０．１Ｎ塩酸溶液（各アミノ酸濃度２０μｍｏｌ／Ｌ）を分析したＨＰＬＣチャートである（（ａ）：Ｃｈ１の励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで検出、（ｂ）：Ｃｈ２の励起波長２６６ｎｍ、蛍光波長３０５ｎｍで検出）。

培養物サンプルのＨｙｐ及びＰｒｏの定量結果を表５に示す。表中、ＣＰ１は、上記のコラーゲンペプチド（ＣＰ１）（製品名コラーゲンペプチド イクオス ＨＤＬ−５０ＳＰ）であり、ＣＰ２は、コラーゲンペプチド（ＣＰ２）（製品名コラーゲンペプチド Ｔｙｐｅ Ｓ）である。Ｈｙｐ及びＰｒｏの定量結果から、各培養物サンプル中のＰｒｏ及びＨｙｐの合計含量に対するＨｙｐの含量の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））を計算した。その結果も表５に示す。表の培養条件は、本培養の条件である。なお、培養開始前の各培地には、遊離のＨｙｐはほとんど含まれなかった。

＜試験例１０＞
（前培養）
ＹＰＤ培地３ｍＬに、Yarrowia lipolyticaを１白金耳接種し、２８℃で１日振盪培養（１００ｒｐｍ）して前培養液を得た。

（本培養）
培地にＹＰＤ改変培地（酵母抽出物１．０％、コラーゲンペプチド（ＣＰ１）２．０％、グルコース１．０％）を使用し、２８℃で２日間、振盪培養（２００〜５００ｒｐｍ）した以外は、試験例９と同じ方法で本培養を行った。コラーゲンペプチド（ＣＰ１）は、試験例９と同じものである。
本培養で得られたYarrowia lipolyticaの菌体培養液に、試験例９と同じ方法で自己消化工程及び殺菌工程等を行って培養物サンプルを調製した。試験例９と同じ方法で、Ｈｙｐ含量及びＰｒｏ含量を測定した。試験はｎ＝４で行った。結果を表６に示す

＜試験例１１＞
試験例１〜１０で使用したYarrowia lipolyticaを用いて、試験例９〜１０と同じ方法で培養し、菌体培養液を得た。これを５０℃で２時間インキューベートすることにより、自己消化により菌体内容物を培養液中に溶出した後、８０℃で１時間インキュベートした。その後、１℃で遠心分離（３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、菌体残渣を除いたＬ−ヒドロキシプロリン含有菌体培養物の抽出物（Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物）を得た。Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物は、適宜希釈して使用することもできる。

以下、試験例１１で得た各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を配合した皮膚外用剤組成物の製造例の一例を示す。
＜製造例１＞石鹸
原料の配合量を表７に示す。
石鹸素地を混合攪拌し、その後各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を投入し均一に混合後、成型した。

＜製造例２＞シャンプー
原料の配合量を表８に示す。
精製水に１，３−ブチレングリコールに溶解した防腐剤を投入した。均一に攪拌後、ラウレス硫酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミドを投入し、その後色素、香料及び残りの１，３−ブチレングリコールを投入し、各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を投入後、均一に混合攪拌した。

＜製造例３＞コンディショナー
原料の配合量を表９に示す。
（１）塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム及び食塩を精製水に投入し、８０℃まで加温し溶解した。
（２）セトステアリルアルコール、水素添加ポリイソブテン及びグリセリンモノステアレートを８０℃まで加温し溶解した。
（３）（１）をホモミキサーで攪拌しながら（２）を添加し、添加後５分間予備攪拌を行った。
（４）予備攪拌終了後、５０℃まで攪拌しながら冷却し、各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を添加しさらに３５℃まで攪拌冷却し調製した。

＜製造例４＞ヘアトニック
原料の配合量を表１０に示す。
精製水にサリチル酸、グリセリン、エタノールに溶解したビタミンＥ、Ｌ−メントールを投入し、さらに精製水の一部に溶解したグリチルリチン酸ジカリウムを投入し、その後各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を投入し、均一に混合し調製した。

＜製造例５＞ミスト
原料の配合量を表１１に示す。
精製水にクエン酸及びクエン酸ナトリウムを投入し溶解した。その後エタノールに溶解した防腐剤及びポリソルベート８０を投入した。その後各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を投入し均一に攪拌し調製した。

＜製造例６＞化粧水
原料の配合量を表１２に示す。
精製水にクエン酸及びクエン酸ナトリウムを投入し溶解した。次にグリセリン、１，３−ブチレングリコール及びエチレンジアミン四酢酸三ナトリウムを順次投入し、さらにエタノールに溶解したポリオキシエチレン（１８）オレイルアルコールエーテル、ビタミンＥ及びメチルパラベンを投入し均一になるまで攪拌した。その後各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を投入し均一に攪拌し調製した。

＜製造例７＞乳液
原料の配合量を表１３に示す。
（１）ステアリン酸、セチルアルコール、ミリスチン酸オクチルドデシル及び流動パラフィンを８０℃まで加温し溶解した。
（２）トリエタノールアミン、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル及びエチレンジアミンヒドロキシ三酢酸ナトリウムを精製水に投入し８０℃まで加温した。
（３）（１）をホモミキサーで攪拌しながら（２）を投入し、投入後５分間予備攪拌した。
（４）予備攪拌終了後、５０℃まで冷却し、各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を加え、さらに３５℃まで冷却し調製した。

＜製造例８＞クリーム
原料の配合量を表１４に示す。
（１）ステアリン酸、モノステアリン酸グリセリル、セスキステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、セトステアリルアルコール、スクワラン、ヘキサ（ヒドロキシステアリン酸／ステアリン酸／ロジン酸）ジペンタエリスリット、オリーブ油、ミリスチン酸オクチルドデシル及びメチルポリシロキサンを８０℃まで加温し溶解した。
（２）精製水にグリセリン、１，３−ブチレングリコール、水酸化ナトリウム及びメチルパラベンを投入し、８０℃まで加温し溶解した。
（３）（１）をホモミキサーで攪拌しながら（２）を投入し、投入後５分間予備攪拌した。
（４）予備攪拌終了後、５０℃まで冷却し、各Ｈｙｐ含有菌体培養物の抽出物を加え、さらに３５℃まで冷却し調製した。

本発明のＬ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体、菌体培養物及びこれらの抽出物は、化粧料、飲食品等の原料として有用である。

Claims (21)

1. 酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、
   前記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有し、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００であり、
   前記抽出物は、菌体又は菌体培養物に、菌体破砕処理を行った菌体破砕物、又は、前記菌体破砕物から菌体残渣を除去したものであることを特徴とする酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物。
2. Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である請求項１に記載の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物。
3. 酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物であって、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上であり、
   前記抽出物は、菌体又は菌体培養物に、菌体破砕処理を行った菌体破砕物、又は、前記菌体破砕物から菌体残渣を除去したものであることを特徴とする酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物。
4. 酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、前記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させる工程を含み、前記窒素源がＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源であることを特徴とするＬ−ヒドロキシプロリンの製造方法。
5. 前記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドである請求項４に記載の製造方法。
6. 前記コラーゲンペプチドの平均分子量が１０００〜１００００である請求項５に記載の製造方法。
7. 前記好気培養を１０〜１００時間行う請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
8. 酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の、Ｌ−ヒドロキシプロリンを製造するための使用。
9. 前記酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を、炭素源及び窒素源を含む液体培地中で好気培養することにより、前記酵母の菌体又は菌体培養物中にＬ−ヒドロキシプロリンを蓄積させることを含み、前記窒素源がＬ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドを含む窒素源である請求項８に記載の使用。
10. 前記Ｌ−ヒドロキシプロリン含有ペプチドがコラーゲンペプチドである請求項９に記載の使用。
11. 前記コラーゲンペプチドの平均分子量が１０００〜１００００である請求項１０に記載の使用。
12. 前記好気培養を１０〜１００時間行う請求項９〜１１のいずれかに記載の使用。
13. 請求項１〜３のいずれかに記載の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする組成物。
14. 請求項１〜３のいずれかに記載の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする飲食品。
15. 請求項１〜３のいずれかに記載の酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含むことを特徴とする化粧料又は化粧料原料。
16. コラーゲン産生促進、表皮細胞の増殖促進、皮膚の保湿、皮膚の老化防止、皮膚のたるみの予防又は改善、皮膚のハリの改善、しわの予防又は改善及びアトピー性皮膚炎の改善から選ばれる用途に用いられる請求項１５に記載の化粧料又は化粧料原料。
17. 前記化粧料又は化粧料原料は、化粧料原料であり、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が５〜３００ｐｐｍである請求項１５又は１６に記載の化粧料又は化粧料原料。
18. 前記化粧料又は化粧料原料は、化粧料であり、Ｌ−ヒドロキシプロリン含量が０．０１〜２０ｐｐｍである請求項１５又は１６に記載の化粧料又は化粧料原料。
19. Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物を含み、前記抽出物は、菌体又は菌体培養物に、菌体破砕処理を行った菌体破砕物、又は、前記菌体破砕物から菌体残渣を除去したものである、ことを特徴とするＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物。
20. 前記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）及びＬ−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）の合計含量（μｇ／ｍＬ）に対するＬ−ヒドロキシプロリンの含量（μｇ／ｍＬ）の割合（１００×Ｈｙｐ／（Ｐｒｏ＋Ｈｙｐ））が、３５〜１００である請求項１９に記載のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物。
21. 前記酵母の菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物は、Ｌ−ヒドロキシプロリンの含量が１０μｇ／ｍＬ以上である請求項１９又は２０に記載のＬ−ヒドロキシプロリン補強用組成物。

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