JP3005086B2 - シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 - Google Patents
シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法Info
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- JP3005086B2 JP3005086B2 JP3275124A JP27512491A JP3005086B2 JP 3005086 B2 JP3005086 B2 JP 3005086B2 JP 3275124 A JP3275124 A JP 3275124A JP 27512491 A JP27512491 A JP 27512491A JP 3005086 B2 JP3005086 B2 JP 3005086B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、（２Ｓ、４Ｓ）−
（−）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸
［（（2 S 、4 S ）−（−）−4 −Hydroxypyrrolidine
−2 −carboxylicacid）、以下「シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリン（cis −4 −Hydroxy −L−proline ）
と略称する」］の製造法に関する。
（−）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸
［（（2 S 、4 S ）−（−）−4 −Hydroxypyrrolidine
−2 −carboxylicacid）、以下「シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリン（cis −4 −Hydroxy −L−proline ）
と略称する」］の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンはビャクダンの葉（バイオケミカル ジャーナル
（Biochemical Journal)、117 巻、1013頁（1970
年））やアクチノマイシン等の抗生物質の構成成分（ア
ーチーブス オブ バイオケミストリー アンド バイ
オフィジクス（Archieves of Biochemistryand Biophys
ics）、131 巻、276 頁（1969 年））としてのみ、そ
の存在が知られている。そして、シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは自然界には少量しか存在しないので、
合成化学の手法により供給されている。
リンはビャクダンの葉（バイオケミカル ジャーナル
（Biochemical Journal)、117 巻、1013頁（1970
年））やアクチノマイシン等の抗生物質の構成成分（ア
ーチーブス オブ バイオケミストリー アンド バイ
オフィジクス（Archieves of Biochemistryand Biophys
ics）、131 巻、276 頁（1969 年））としてのみ、そ
の存在が知られている。そして、シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンは自然界には少量しか存在しないので、
合成化学の手法により供給されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ヘリコ
セラス属またはアクロシリンドリウム属に属する微生物
がシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産すること
を見出して本発明を完成した。
セラス属またはアクロシリンドリウム属に属する微生物
がシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産すること
を見出して本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘリコセラス
属またはアクロシリンドリウム属に属するシス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン生産菌を培養し、その培養物よ
りシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取すること
からなるシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法
に関する。
属またはアクロシリンドリウム属に属するシス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン生産菌を培養し、その培養物よ
りシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取すること
からなるシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法
に関する。
【０００５】ここに、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンは以下の構造式
リンは以下の構造式
【０００６】
【化１】
【０００７】で示される。
【０００８】なお、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンは以下の構造式
ロリンは以下の構造式
【０００９】
【化２】
【００１０】で示される。
【００１１】本発明に使用されるヘリコセラス属に属す
る微生物としては、例えばヘリコセラス オリザエ SA
NK 11458 株をあげることができる。
る微生物としては、例えばヘリコセラス オリザエ SA
NK 11458 株をあげることができる。
【００１２】本菌株は抗生物質セルレニン（Cerulenin
）の生産菌として公知である（Ann.Sankyo Res.La
b.、19巻、86−90頁、1967年）。
）の生産菌として公知である（Ann.Sankyo Res.La
b.、19巻、86−90頁、1967年）。
【００１３】本菌株の菌学的性状は以下の通りである。
本菌株はイネの籾から分離された菌株で次のごとき形態
的特徴を有する。WSH 寒天培地上での生育は 25 ℃、１
週間で 40 〜 50 mm、綿毛状、薄く広がりコロニーの表
面は淡褐色（3 −4B）、裏面もほぼ同様である。 25 −
30 日培養を続けると分生子の形成が見られる。PDA 培
地上での生育は 25 ℃、１週間で 50 〜 60 mm、綿毛状
でコロニーの中央部は灰緑褐色（25−3C）、周辺部は橙
褐色（11−2B）、裏面もほぼ同様である。分生子の形成
は見られない。WSH 培地でも PDA 培地でも可溶性色素
の産生は見られない。 37 ℃ではほとんど生育しない。
光学顕微鏡での観察によると、菌糸は淡褐色、平滑で隔
壁を有しその径は 1.5〜4.0 μm である。分生子柄は短
く先端がやや膨らみ、ときに分枝する。分生子はコイル
状、褐色、表面は粗で 5−15 細胞よりなり、隔壁部分
がややくびれ、80〜150 × 7〜11 μm であるが不規則
な形のものも多く見られる。
本菌株はイネの籾から分離された菌株で次のごとき形態
的特徴を有する。WSH 寒天培地上での生育は 25 ℃、１
週間で 40 〜 50 mm、綿毛状、薄く広がりコロニーの表
面は淡褐色（3 −4B）、裏面もほぼ同様である。 25 −
30 日培養を続けると分生子の形成が見られる。PDA 培
地上での生育は 25 ℃、１週間で 50 〜 60 mm、綿毛状
でコロニーの中央部は灰緑褐色（25−3C）、周辺部は橙
褐色（11−2B）、裏面もほぼ同様である。分生子の形成
は見られない。WSH 培地でも PDA 培地でも可溶性色素
の産生は見られない。 37 ℃ではほとんど生育しない。
光学顕微鏡での観察によると、菌糸は淡褐色、平滑で隔
壁を有しその径は 1.5〜4.0 μm である。分生子柄は短
く先端がやや膨らみ、ときに分枝する。分生子はコイル
状、褐色、表面は粗で 5−15 細胞よりなり、隔壁部分
がややくびれ、80〜150 × 7〜11 μm であるが不規則
な形のものも多く見られる。
【００１４】以上の形態をもとに R.T.Moore 著、「My
cologia 」第 47 巻、90−103 頁（1955 年）に掲載の
論文、「Index to the Helicosporae 」を検索の結果、
本菌株を Helicoceras oryzaeLinder et Tullis と同
定した。
cologia 」第 47 巻、90−103 頁（1955 年）に掲載の
論文、「Index to the Helicosporae 」を検索の結果、
本菌株を Helicoceras oryzaeLinder et Tullis と同
定した。
【００１５】なお、コロニーの色調のカッコ内の数値は
A.Kornerup and J.H.Wansher 著「Methuen Handbook o
f Colour」 3rd ed.,Eyre Methuen、London（1978
年）に準拠した表示である。
A.Kornerup and J.H.Wansher 著「Methuen Handbook o
f Colour」 3rd ed.,Eyre Methuen、London（1978
年）に準拠した表示である。
【００１６】また、WSH 寒天培地の組成は次の通りであ
る。 オートミール 10 g NaNO3 1 g KH2PO4 1 g MgSO4・7H2O 1 g 寒天 20 g 水道水 1000 ml ────────────────────── pH 無修正。
る。 オートミール 10 g NaNO3 1 g KH2PO4 1 g MgSO4・7H2O 1 g 寒天 20 g 水道水 1000 ml ────────────────────── pH 無修正。
【００１７】上記ヘリコセラス オリザエ SANK 11458
株は 寄託番号、微工研条寄第3603 号（FERM BP −
3603）（寄託機関、工業技術院微生物工業技術研究所：
寄託日、1991 年 10 月 14 日）として寄託されてい
る。
株は 寄託番号、微工研条寄第3603 号（FERM BP −
3603）（寄託機関、工業技術院微生物工業技術研究所：
寄託日、1991 年 10 月 14 日）として寄託されてい
る。
【００１８】本発明に使用されるアクロシリンドリウム
属に属する微生物としては、例えばアクロシリンドリウ
ム オリザエ SANK 10360 株をあげることができる。
属に属する微生物としては、例えばアクロシリンドリウ
ム オリザエ SANK 10360 株をあげることができる。
【００１９】本菌株の菌学的性状は以下の通りである。
本菌株は罹病したイネの葉鞘から分離された菌株で次の
ごとき形態的特徴を有する。PDA 培地上での生育は比較
的遅く 25 ℃、１週間でコロニーの直径は 30 〜40 mm
、 37 ℃では 2〜3 mmである。コロニーは羊毛状、白
色（1 −A ）で 25℃でも 37 ℃でも分生子をよく形成
する。裏面は淡灰色（21−4C）ないしは淡灰黄色（5 −
5B）である。光学顕微鏡での観察によると、菌糸は無色
で隔壁を有し、その径は 1.5〜4.0μm である。分生子
柄も無色で隔壁を有する場合と有しない場合とがあり、
8 〜16× 3〜4 μm であ。メトレは同じく無色で隔壁は
無く、 6〜8 × 2〜3 μm である。フィアライドは分生
子柄上に直接またはメトレ上にそれぞれ 3−5 づつ形成
され 8〜20× 2〜3 μm である。分生子は無色、平滑、
1 細胞からなり円筒形から長楕円形ないしは楕円形
で、3.0 〜8.0× 1.5〜2.5 μm である。
本菌株は罹病したイネの葉鞘から分離された菌株で次の
ごとき形態的特徴を有する。PDA 培地上での生育は比較
的遅く 25 ℃、１週間でコロニーの直径は 30 〜40 mm
、 37 ℃では 2〜3 mmである。コロニーは羊毛状、白
色（1 −A ）で 25℃でも 37 ℃でも分生子をよく形成
する。裏面は淡灰色（21−4C）ないしは淡灰黄色（5 −
5B）である。光学顕微鏡での観察によると、菌糸は無色
で隔壁を有し、その径は 1.5〜4.0μm である。分生子
柄も無色で隔壁を有する場合と有しない場合とがあり、
8 〜16× 3〜4 μm であ。メトレは同じく無色で隔壁は
無く、 6〜8 × 2〜3 μm である。フィアライドは分生
子柄上に直接またはメトレ上にそれぞれ 3−5 づつ形成
され 8〜20× 2〜3 μm である。分生子は無色、平滑、
1 細胞からなり円筒形から長楕円形ないしは楕円形
で、3.0 〜8.0× 1.5〜2.5 μm である。
【００２０】以上の形態から本菌株を沢田兼吉著、台湾
産菌類調査報告第 2編、台湾総督府中央研究所農業部報
告第 2 号、135 −136 頁（1922 年）に記載されてい
る稲葉鞘腐敗病菌 Acrocylindrium oryzae Sawada と
同定した。本菌株の詳細な菌学的記載は河村栄吉著、日
本植物病理学会報、10 巻、55−59頁（1940 年）にも
記載されている。
産菌類調査報告第 2編、台湾総督府中央研究所農業部報
告第 2 号、135 −136 頁（1922 年）に記載されてい
る稲葉鞘腐敗病菌 Acrocylindrium oryzae Sawada と
同定した。本菌株の詳細な菌学的記載は河村栄吉著、日
本植物病理学会報、10 巻、55−59頁（1940 年）にも
記載されている。
【００２１】なお、コロニーの色調のカッコ内の数値は
A.Kornerup and J.H.Wansher 著「Methuen Handbook o
f Colour」 3rd ed.,Eyre Methuen、London（1978
年）に準拠した表示である。
A.Kornerup and J.H.Wansher 著「Methuen Handbook o
f Colour」 3rd ed.,Eyre Methuen、London（1978
年）に準拠した表示である。
【００２２】上記アクロシリンドリウム オリザエ SA
NK 10360 株は 寄託番号、微工研条寄第 3602 号（F
ERM BP −3602）（寄託機関、工業技術院微生物工業技
術研究所：寄託日、1991 年 10 月 14 日）として寄託
されている。
NK 10360 株は 寄託番号、微工研条寄第 3602 号（F
ERM BP −3602）（寄託機関、工業技術院微生物工業技
術研究所：寄託日、1991 年 10 月 14 日）として寄託
されている。
【００２３】周知のとおり、糸状菌は自然界において、
または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照
射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発
明のSANK 11458 株および SANK 10360 株もこの点は同
じである。本発明にいうSANK 11458 株および SANK 10
360 株はそのすべての変異株を包含する。また、これら
の変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、
形質導入、形質転換等により得られたものも包含され
る。即ち、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産
する、SANK11458 株および SANK 10360 株、その変異株
およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべて SAN
K11458 株および SANK 10360 株に包含されるものであ
る。
または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照
射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発
明のSANK 11458 株および SANK 10360 株もこの点は同
じである。本発明にいうSANK 11458 株および SANK 10
360 株はそのすべての変異株を包含する。また、これら
の変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、
形質導入、形質転換等により得られたものも包含され
る。即ち、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産
する、SANK11458 株および SANK 10360 株、その変異株
およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべて SAN
K11458 株および SANK 10360 株に包含されるものであ
る。
【００２４】本発明の方法を実施するにさいして、微生
物の培養は、通常微生物が利用できる栄養物を含有する
培地中で培養することにより行なわれる。栄養源として
は、一般の微生物の培養に使用される公知のものを使用
することができる。
物の培養は、通常微生物が利用できる栄養物を含有する
培地中で培養することにより行なわれる。栄養源として
は、一般の微生物の培養に使用される公知のものを使用
することができる。
【００２５】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆
粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、ある
いは併用して用いる事ができる。一般には、培地量の1
−10 重量％で変量する。
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆
粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、ある
いは併用して用いる事ができる。一般には、培地量の1
−10 重量％で変量する。
【００２６】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、
ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マル
トエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培
地量の 0.2−6 重量％の範囲で用いる。
物質を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、
ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マル
トエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培
地量の 0.2−6 重量％の範囲で用いる。
【００２７】培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。
【００２８】液体培養に際しては、シリコン油、植物
油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。
油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。
【００２９】SANK 11458 株または SANK 10360株を培
養し、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産する
培地の pHは、 5.0−7.0 に変化できる。
養し、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生産する
培地の pHは、 5.0−7.0 に変化できる。
【００３０】菌の生育は 20 ℃から 37 ℃の範囲が良好
であり、更にシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生
産には 25 ℃から 30 ℃が好適である。シス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンは、好気的に培養して得られる
が、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、
振盪培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。
であり、更にシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生
産には 25 ℃から 30 ℃が好適である。シス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンは、好気的に培養して得られる
が、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、
振盪培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。
【００３１】小規模な培養においては、 26 ℃で数日間
振盪培養を行うのが良好である。
振盪培養を行うのが良好である。
【００３２】培養は、バッフル( 水流調節壁) のついた
三角フラスコ中で、 1−2 段階の種の発育工程により開
始する。種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併
用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で 26
℃、2 〜 3 日間振盪するか、または充分に成長するま
で振盪する。成長した種は第二の種培地または生産培地
に接種するのに用いる。中間の発育工程を用いる場合に
は、本質的に同様の方法で成長させ生産培地に接種する
ために、それを部分的に用いる。接種したフラスコを一
定温度で数日間振盪し、インキュベーションが終わった
らフラスコの含有物を遠心分離またはろ過する。
三角フラスコ中で、 1−2 段階の種の発育工程により開
始する。種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併
用できる。種フラスコは定温インキュベーター中で 26
℃、2 〜 3 日間振盪するか、または充分に成長するま
で振盪する。成長した種は第二の種培地または生産培地
に接種するのに用いる。中間の発育工程を用いる場合に
は、本質的に同様の方法で成長させ生産培地に接種する
ために、それを部分的に用いる。接種したフラスコを一
定温度で数日間振盪し、インキュベーションが終わった
らフラスコの含有物を遠心分離またはろ過する。
【００３３】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養培
地を125 ℃ まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地に
あらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は 26
℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得
るのに適している。
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養培
地を125 ℃ まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地に
あらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は 26
℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得
るのに適している。
【００３４】通常は 48 時間から 72 時間の培養でシス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産量は最高値に達
する。
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産量は最高値に達
する。
【００３５】培養終了後、目的化合物は既知の方法で採
取、定量分析、分離、精製することができる。
取、定量分析、分離、精製することができる。
【００３６】すなわち、培養終了後、培養液中の液体部
分 (および菌体内) に存在するシス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンは、培養液にアセトンなどの有機溶剤を添
加した後、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤
とするろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ
液または上清中に存在するシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを、その物理化学的性状を利用し抽出精製する
ことにより得られる。
分 (および菌体内) に存在するシス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンは、培養液にアセトンなどの有機溶剤を添
加した後、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤
とするろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ
液または上清中に存在するシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを、その物理化学的性状を利用し抽出精製する
ことにより得られる。
【００３７】例えば、ろ液または上清中に存在するシス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンをイオン交換樹脂、例
えばアンバーライト IRC−50、CG−50（ローム・アンド
・ハース社製）、ダウエックス 50W×4 、ダウエックス
SBR−P （ダウ・ケミカル社製）の層を通過させて不純
物を吸着させて取り除くか、またはシス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを吸着させた後、アンモニア水を用い
て溶出させることにより得られる。あるいは吸着剤とし
て、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライ
ト XAD−2 、XAD −4 （ローム・アンド・ハース社製）
等や、ダイヤイオンHP−10、HP−20、 CHP−20、HP−50
（三菱化成（株）社製）等が使用される。シス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを含む液を上記のごとき吸着剤
の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、また
はシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを吸着させた
後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混
合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンをイオン交換樹脂、例
えばアンバーライト IRC−50、CG−50（ローム・アンド
・ハース社製）、ダウエックス 50W×4 、ダウエックス
SBR−P （ダウ・ケミカル社製）の層を通過させて不純
物を吸着させて取り除くか、またはシス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを吸着させた後、アンモニア水を用い
て溶出させることにより得られる。あるいは吸着剤とし
て、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライ
ト XAD−2 、XAD −4 （ローム・アンド・ハース社製）
等や、ダイヤイオンHP−10、HP−20、 CHP−20、HP−50
（三菱化成（株）社製）等が使用される。シス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを含む液を上記のごとき吸着剤
の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、また
はシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを吸着させた
後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混
合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。
【００３８】このようにして得られたシス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンは、更にシリカゲル、フロリジルの
ような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、ア
ビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックス G−
10 （ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマ
トグラフィーおよび順相、逆相カラム、イオン交換カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製するこ
とができる。
キシ−Ｌ−プロリンは、更にシリカゲル、フロリジルの
ような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、ア
ビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックス G−
10 （ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマ
トグラフィーおよび順相、逆相カラム、イオン交換カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製するこ
とができる。
【００３９】なお、目的化合物の定量分析法としては以
下の二つの既知の方法を採用できる。
下の二つの既知の方法を採用できる。
【００４０】まず、イオン交換カラムにより各アミノ酸
を分離した後にニンヒドリンで発色させて検出する方法
（アナリティカル ケミストリー（Analytical Chemist
ry）、30 巻、1185 頁（1958 年））により目的化合
物を定量する（定量機器：高速アミノ酸分析機 L−85
00 型、日立（株）社製）。
を分離した後にニンヒドリンで発色させて検出する方法
（アナリティカル ケミストリー（Analytical Chemist
ry）、30 巻、1185 頁（1958 年））により目的化合
物を定量する（定量機器：高速アミノ酸分析機 L−85
00 型、日立（株）社製）。
【００４１】今ひとつの方法は、まず各アミノ酸をフェ
ニルイソチオシアナートにより対応するチオカルバモイ
ル酸エステルとしてから逆相カラムクロマトグラフィー
による高速液体クロマトグラフィ−分析（ジャーナル
オブ クロマトグラフィー（Journal of chromatograph
y)、336 巻、93 頁（1984 年））により目的化合物を
定量する（定量機器：655 −020 型高速液体クロマトグ
ラフィ−、日立（株）社製）。
ニルイソチオシアナートにより対応するチオカルバモイ
ル酸エステルとしてから逆相カラムクロマトグラフィー
による高速液体クロマトグラフィ−分析（ジャーナル
オブ クロマトグラフィー（Journal of chromatograph
y)、336 巻、93 頁（1984 年））により目的化合物を
定量する（定量機器：655 −020 型高速液体クロマトグ
ラフィ−、日立（株）社製）。
【００４２】または、以上のニ方法を併用して目的化合
物の定量を行なうこともできる。
物の定量を行なうこともできる。
【００４３】
【実施例】次に実施例をあげて、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００４４】実施例 １．下記組成の培地 100 ml を
含有するへそ付き 500 ml 容三角フラスコにヘリコセラ
ス オリザエ SANK 11458 株を植菌し、26℃、 200 r
pmで振とう培養した。
含有するへそ付き 500 ml 容三角フラスコにヘリコセラ
ス オリザエ SANK 11458 株を植菌し、26℃、 200 r
pmで振とう培養した。
【００４５】培地組成 シュクロース 5.0 ％ ペプトン 2.0 コーンスチープリカー 0.3 水道水 残（pH 5.0−5.5 ）。
【００４６】培養 2 日後、菌体を含む培養液に存在す
るシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量した。
るシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量した。
【００４７】なお、定量はアミノ酸をフェニルイソチオ
シアネートとトリエチルアミンの存在下、反応させてそ
れぞれ対応するチオカルバモイル酸エステルに誘導体化
した後、逆相 HPLC により同定する方法によって実施し
た。すなわち、培養液 1 mlに対しアセトン 1 ml 添加
し遠心分離後、上清 25 μl を減圧乾固した。これに
エタノール：水：トリエチルアミン＝2 ：2 ：1 の溶液
を 25 μl添加して減圧乾固した。更にこれにエタノー
ル：水：トリエチルアミン：フェニルイソチオシアネー
ト＝7 ：1 ：1 ：1 の溶液を25 μl 添加して 20分
間、室温にて放置した後、減圧乾固した。次いでこれに
PICO-Tag 希釈液（アセトニトリル：リン酸緩衝液(pH
7.4)＝5 ：95）を 400 μl 添加して遠心上清をノバパ
ック C18（3.9 ×300 mm、ウォーターズ、ミリポア社
製）で HPLC で分析した。移動相としてアセトニトリ
ル：0.1 ％リン酸トリエチルアミン緩衝液（pH 3.2）＝
11：89を使用した。流速 1.2 ml／分で254 nm におけ
る吸収強度によりヒドロキシプロリンのチオカルバモイ
ル酸エステルの検出を実施した。HPLC における保持時
間はシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが 9.10 分
であった。
シアネートとトリエチルアミンの存在下、反応させてそ
れぞれ対応するチオカルバモイル酸エステルに誘導体化
した後、逆相 HPLC により同定する方法によって実施し
た。すなわち、培養液 1 mlに対しアセトン 1 ml 添加
し遠心分離後、上清 25 μl を減圧乾固した。これに
エタノール：水：トリエチルアミン＝2 ：2 ：1 の溶液
を 25 μl添加して減圧乾固した。更にこれにエタノー
ル：水：トリエチルアミン：フェニルイソチオシアネー
ト＝7 ：1 ：1 ：1 の溶液を25 μl 添加して 20分
間、室温にて放置した後、減圧乾固した。次いでこれに
PICO-Tag 希釈液（アセトニトリル：リン酸緩衝液(pH
7.4)＝5 ：95）を 400 μl 添加して遠心上清をノバパ
ック C18（3.9 ×300 mm、ウォーターズ、ミリポア社
製）で HPLC で分析した。移動相としてアセトニトリ
ル：0.1 ％リン酸トリエチルアミン緩衝液（pH 3.2）＝
11：89を使用した。流速 1.2 ml／分で254 nm におけ
る吸収強度によりヒドロキシプロリンのチオカルバモイ
ル酸エステルの検出を実施した。HPLC における保持時
間はシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが 9.10 分
であった。
【００４８】なお、この定量には日立 655-020 型高速
液体クロマトグラフィーが使用された。
液体クロマトグラフィーが使用された。
【００４９】この結果、培養液中に 10 μg ／ml のシ
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの存在が認められ
た。
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの存在が認められ
た。
【００５０】実施例 ２．実施例 １．と全く同様な方
法でヘリコセラス オリザエ SANK 11458 菌株を 26
℃、 200 rpmで 2 日間振とう培養した。得られた菌体
培養液 2.7 リットルに対してアセトン 3 リットルを
添加し 4 ℃ にて一夜放置した。次いでこれをセライ
トでろ過しろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗抽出液
200 ml をダウエックス 50 W のカラムに吸着せし
め、 0.5 N アンモニア水にて溶出した。得られた溶出
液を減圧下で濃縮し、残渣をさらにアンバーライトCG−
50 のカラムに付し非吸着画分を集めて減圧下で濃縮し
た。得られた残渣を移動相にｎ−ブタノール：酢酸：水
＝4 ：1 ： 2 を用いてセファデックス G−10によるゲ
ルろ過を行なった。シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを含む画分をウォーターズ（ミリポア社製）のアミノ
酸分析用カラムにより精製した。シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを含む画分 20 mg を、再びセファデッ
クス G−10を移動相としてｎ−ブタノール：酢酸：水＝
5 ：1 ： 2 を用いてゲルろ過を行なうと精製標品 2.1
mg が得られた。得られた精製標品の重水中における核
磁気共鳴スペクトルは次の通りであった。
法でヘリコセラス オリザエ SANK 11458 菌株を 26
℃、 200 rpmで 2 日間振とう培養した。得られた菌体
培養液 2.7 リットルに対してアセトン 3 リットルを
添加し 4 ℃ にて一夜放置した。次いでこれをセライ
トでろ過しろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗抽出液
200 ml をダウエックス 50 W のカラムに吸着せし
め、 0.5 N アンモニア水にて溶出した。得られた溶出
液を減圧下で濃縮し、残渣をさらにアンバーライトCG−
50 のカラムに付し非吸着画分を集めて減圧下で濃縮し
た。得られた残渣を移動相にｎ−ブタノール：酢酸：水
＝4 ：1 ： 2 を用いてセファデックス G−10によるゲ
ルろ過を行なった。シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを含む画分をウォーターズ（ミリポア社製）のアミノ
酸分析用カラムにより精製した。シス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを含む画分 20 mg を、再びセファデッ
クス G−10を移動相としてｎ−ブタノール：酢酸：水＝
5 ：1 ： 2 を用いてゲルろ過を行なうと精製標品 2.1
mg が得られた。得られた精製標品の重水中における核
磁気共鳴スペクトルは次の通りであった。
【００５１】核磁気共鳴スペクトル：δ ppm 2.07（1 H 、dm、 J ＝14.2 Hz）、2.31（1 H 、ddd
、J ＝14.2、3.9 および 2.0 Hz ）、3.18（1 H 、d
d、 J ＝12.7 および 3.9 Hz ）、3.27（1 H 、ddd
、J ＝12.7、 1.9 および 1.5 Hz ）、4.02（1 H 、d
d、 J ＝10.3 および 3.9 Hz ）、4.40（1 H 、m ） 得られた核磁気共鳴スペクトルは、既知のシス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンのそれと一致した。
、J ＝14.2、3.9 および 2.0 Hz ）、3.18（1 H 、d
d、 J ＝12.7 および 3.9 Hz ）、3.27（1 H 、ddd
、J ＝12.7、 1.9 および 1.5 Hz ）、4.02（1 H 、d
d、 J ＝10.3 および 3.9 Hz ）、4.40（1 H 、m ） 得られた核磁気共鳴スペクトルは、既知のシス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンのそれと一致した。
【００５２】実施例 ３．実施例 １．と全く同様な方
法でアクロシリンドリウム オリザエ SANK 10360 株
を用いて実施し、定量した結果、培養液中に 11.7 μg
／ml のシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの存在が
認められた。
法でアクロシリンドリウム オリザエ SANK 10360 株
を用いて実施し、定量した結果、培養液中に 11.7 μg
／ml のシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの存在が
認められた。
【００５３】
【発明の効果】シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は、これをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに
変換することによって、カルバペネム系抗生物質などの
医薬品原料として使用される重要な化合物である。
は、これをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに
変換することによって、カルバペネム系抗生物質などの
医薬品原料として使用される重要な化合物である。
【００５４】すなわち、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンのアミノ基を保護し（例えば、ｐ−ニトロベンジ
ルオキシカルボニル）、カルボキシル基を保護し（例え
ば、ｐ−ニトロベンジル）、次いで常法に従って反転反
応（例えば、光延ら、ビューレチン オブ ケミカル
ソサィエティー オブ ジャパン（Bulletinof chemica
l society of Japan）、44 巻、3427 頁（1971
年））に付し、最後に保護基を除去することによってト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが得られる。次
いでこれを中間体として例えば、Ｎ−ｐ−ニトロベンジ
ルオキシカルボニル−３−メルカプトピロリジンを合成
し（HETEROCYCLES、24巻、5 号、（1986 年））、さら
に（５Ｒ・６Ｓ・８Ｒ）−６−（１−ヒドロキシエチ
ル）−２−（ピロリジン−３−イルチオ）−２−カルバ
ペネム−３−カルボン酸（特公昭 61−29357 号）を合
成することによって有用なカルバペネム系抗生物質が得
られる。
ロリンのアミノ基を保護し（例えば、ｐ−ニトロベンジ
ルオキシカルボニル）、カルボキシル基を保護し（例え
ば、ｐ−ニトロベンジル）、次いで常法に従って反転反
応（例えば、光延ら、ビューレチン オブ ケミカル
ソサィエティー オブ ジャパン（Bulletinof chemica
l society of Japan）、44 巻、3427 頁（1971
年））に付し、最後に保護基を除去することによってト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが得られる。次
いでこれを中間体として例えば、Ｎ−ｐ−ニトロベンジ
ルオキシカルボニル−３−メルカプトピロリジンを合成
し（HETEROCYCLES、24巻、5 号、（1986 年））、さら
に（５Ｒ・６Ｓ・８Ｒ）−６−（１−ヒドロキシエチ
ル）−２−（ピロリジン−３−イルチオ）−２−カルバ
ペネム−３−カルボン酸（特公昭 61−29357 号）を合
成することによって有用なカルバペネム系抗生物質が得
られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ヘリコセラス属またはアクロシリンドリ
ウム属に属するシス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン生
産菌を培養し、その培養物よりシス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを採取することからなるシス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項２】 ヘリコセラス属に属するシス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン生産菌がヘリコセラス オリザエ
SANK 11458 株である［請求項１］記載の製造法。 - 【請求項３】 アクロシリンドリウム属に属するシス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン生産菌がアクロシリンド
リウム オリザエ SANK 10360 株である［請求項１］
記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3275124A JP3005086B2 (ja) | 1991-10-23 | 1991-10-23 | シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3275124A JP3005086B2 (ja) | 1991-10-23 | 1991-10-23 | シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05111388A JPH05111388A (ja) | 1993-05-07 |
| JP3005086B2 true JP3005086B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=17551044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3275124A Expired - Fee Related JP3005086B2 (ja) | 1991-10-23 | 1991-10-23 | シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3005086B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102114596B (zh) * | 2009-12-30 | 2012-06-27 | 江苏金源锻造股份有限公司 | 一种大型锻件的组焊剪切刀具的制造方法 |
| US8541209B2 (en) | 2008-05-12 | 2013-09-24 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | L-proline cis-4-hydroxylase and use thereof to produce cis-4-hydroxy-L-proline |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2234412C (en) | 1997-06-09 | 2008-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing optically active compound |
| JP6869972B2 (ja) * | 2016-05-12 | 2021-05-12 | サントリーホールディングス株式会社 | Ｌ−ヒドロキシプロリンを含有する酵母ヤロウィア・リポリティカの菌体もしくは菌体培養物又はこれらの抽出物及びその用途並びにｌ−ヒドロキシプロリンの製造方法 |
-
1991
- 1991-10-23 JP JP3275124A patent/JP3005086B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8541209B2 (en) | 2008-05-12 | 2013-09-24 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | L-proline cis-4-hydroxylase and use thereof to produce cis-4-hydroxy-L-proline |
| US8883459B2 (en) | 2008-05-12 | 2014-11-11 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for production of cis-4-hydroxy-L-proline |
| EP2840138A2 (en) | 2008-05-12 | 2015-02-25 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for production of cis-4-hydroxy-L-proline |
| CN102114596B (zh) * | 2009-12-30 | 2012-06-27 | 江苏金源锻造股份有限公司 | 一种大型锻件的组焊剪切刀具的制造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05111388A (ja) | 1993-05-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |