JPH0488992A - ４―オキソ―ｌ―リジンの製造法及びその生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗真菌剤として有用な４−オキソ−し−リジ
ンの新規な製造法及びこれを生産する微生物に関する。

〔従来の技術〕

４−オキソ−し−リジンは公知化合物であり、従来、Ｒ
ｏＣｏＨｉｎｄｅｒらの方法（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
　ＰｅｒｋｉｎＩ　１９７２１８２５）などにより合成
されていた。

また、特開昭６３−１８３５２６号公報には、４−オキ
ソ−し−リジンが優れた抗真菌作用を有すること、及び
ＤＬ一体から効率的にＬ一体を得る方法が記載されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、この方法は、得られたラセミ化合物中の
Ｄ一体を光学分割により除去するものであるため、最終
工程でのＬ一体の収率を５０％以上にすることは理論上
不可能であり、工業的に有利な方法ではなかった。

従って、優れた抗真菌作用を有する４−オキソ−Ｌ−’
Ｊリジン工業的に有利に製造する方法の開発が望まれて
いた。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者らは鋭意検討を重ねた結
果、ストレプトミセス属に属する特定の菌が、特異的に
４−オキソ−し−リジンを生産することを見出し、本発
明を完成した。

すなわち、本発明は、ストレプトミセス属に属する４−
オキソ−し−リジン生産菌を培養し、培養液より４−オ
キソ−Ｌ−ＩＪリジン採取することを特徴とする４−オ
キソ−し−リジンの製造法及びこれを生産する微生物を
提供するものである。

本発明の４−オキソ−Ｌ−リジン生産菌としては、例え
ばストレプトミセス　Ｓｐ、にＣ−７１６１株が挙げら
れる。

このＫＣ−７１６１株は、下記の菌学的性質を有する。

なお、各培地上の性質は特に記載のない限り、２７℃で
１４日間培養し、常法によって観察したものであり、色
調の表現はカラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コ
ンテナー・コーポレーション・アメリカ）の分類に従っ
た。

■、形態学的性質 本菌は通常の分類培地上で気菌糸が形成され、それらは
単純分枝を示し、また胞子形成菌糸はらせん状を呈する
。

胞子は１０個以上連鎖しており、その表面は刺様であり
、大きさは０．６μｍｘ０．８ｍｍ程度である。

通常の分類培地上で胞子のう、鞭毛胞子、菌核などの形
成は認約られない。

■、各種培地上の性状 １、シュークロース・硝酸塩寒天培地 生育　　　　　　中程度 気菌糸の着生　　貧弱 気菌糸の色　　　白色（ａ） 基中菌糸の色　　淡褐色（４ｇｃ） 可溶性色素　　　認められない ２、グルコース−アスパラギン寒天培地生育　　　　　
　中程度 気菌糸の着生　　中程度 気菌糸の色　　　白色（ａ）〜灰（ｃ）基中菌糸の色　
　淡灰桃色（３ｃ　ａ）〜淡黄褐色（３ｉｅ） 可溶性色素　　　認められない ３、グリセリン−アスパラギン寒天培地生育　　　　　
　中程度 気菌糸の着生　　中程度 気菌糸の色　　　白（ａ） 基中菌糸の色　　淡灰褐色（２ｉ　ｅ）可溶性色素　　
　微黄色（２ｅａ） ４、スターチ・無機塩寒天培地 生育　　　　　　良好 気菌糸の着生　　豊富 気菌糸の色　　　白（ａ） 基中菌糸の色　　黒褐色（２ｎｆ） 可溶性色素　　　認められない ５、チロシン寒天培地 生育 気菌糸の着生 気菌糸の色 基中菌糸の色 可溶性色素 ６、栄養寒天培地 生育 気菌糸の着生 気菌糸の色 基中菌糸の色 可溶性色素 中程度 中程度 白（ａ） 黒褐色（３ｎｆ） 認ｔられない 貧弱 貧弱 白（ａ） 微黄色（２ｅａ） 認められない ７、イースト−麦芽寒天培地 生育　　　　　　良好 気菌糸の着生　　貧弱 気菌糸の色　　　白（ａ） 基中菌糸の色　　淡黄褐色（２ｉ　ｃ）可溶性色素　　
　認められなし） ８、オートミール寒天培地 生育　　　　　　良好 気菌糸の着生　　貧弱 気菌糸の色　　　淡灰色（３ｃ　ｂ） 基中菌糸の色　　灰黄色（１’Ａｇ　ｃ）可溶性色素　
　　微黄色（２ｅａ） ■、生理的性質 １、生育温度範囲　　　　　１０℃〜４３℃至適生育温
度　　　　　３４℃〜４０℃２、ゼラチンの液化　　　
　陽　性 ３、スターチの加水分解　　陽　性 ４、脱脂牛乳の凝固　　　　疑わしい 脱脂牛乳のペプトン化　疑わしい ５、メラニン様色素の生成　陰性 ６、耐塩性　　　　　　　　≧４％、〈７％■、炭素源
の利用性 ブリドハム・ゴツトリーブ寒天培地上での炭素源の利用
性を検討した結果、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース、Ｌ−ラムノース、
ラフィノースを利用した。

Ｄ−マンニトールの利用は認められなかった。Ｌ−アラ
ビノース、イノシトールの利用は疑わしかった。

■、細胞壁成分 細胞壁加水分解物中にＬＬ−ジアミノピメリン酸を含む
。

以上の形態的特徴及び生理学的性質をもとに、本菌株と
類似する菌株を「バーシーズ・マニュアル・オブ・ディ
ターミナティブ・バクテリオロジー」第８版、シャーリ
ング及びゴツトリーブによるＩＳＰ記載の諸菌株、ワッ
クスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻及びその他
の放線菌の新種発表文献で検索したところ、類似株とし
て、ストレプトミセス・スバルソジェネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｓｐａｒｓｏｇｅｎｅｓ）　ｌ５Ｐ−５
３５６株が選択された。しかし、ストレプトミセス・ス
バルソジェネス　ｌ５Ｐ−５３５６株はＤ−マンニトー
ル、Ｌ−アラビノース、イノシトールを利用するが、Ｋ
Ｃ−７１６１株はＤ−マンニトールを利用せず、Ｌ−ア
ラビノース、イノシトールの利用は疑わしい点で両菌株
は異っていた。

以上より、ＫＣ−７１６１株はストレプトミセス・スバ
ルソジェネスｌ５Ｐ−５３５６株に近縁な新菌株である
と判定し、ストレプトミセスｓｐ、　ＫＣ−７１６１株
と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第２９９２号（ＦＢＲＭ　ＢＰ−２９９２）として寄
託した。

本発明においては、ストレプトミセス属に属し４−オキ
ソ−Ｌ−リジン生産能を有する菌であれば、上記にＣ−
７１６１株だけでなく、その自然変異株、人工変異株も
使用することができることはいうまでもない。

上記本発明微生物を用いて４−オキソ−Ｌ　−ＩＪリジ
ン製造するには、適当な培地に当該微生物を接種し、通
常の放線菌の培養方法に従って培養すればよい。

培地の炭素源としては種々のものが用いられるが、澱粉
、ブドウ糖、グリセリン、マルトース、デキストリン、
蔗糖、果糖、糖蜜などを単独で又は組み合わせて用いる
ことが好ましい。さらに菌の資化性によっては炭化水素
、有機酸、植物油なども用いられる。窒素源としては大
豆粉、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、肉エキス、コ
ーンステイー・ブリカー、カザミノ酸、ディスティラー
ズソリニプル、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
尿素、硝酸ナトリウムなどを単独で又は組み合わせて用
いられる。

その他必要に応じ、食塩、燐酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシ
ウム、塩化コバルト、硫酸亜鉛、塩化鉄、硫酸鉄、リン
酸カリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩、ならびに
微量の重金属を添加することができる。さらに菌の発育
を助け、４−オキソ−Ｌ−リジンの生産を促進する有機
及び無機物質を適宜に添加することができる。通気培養
法を用いる場合には、さらに脂肪油、シリコーン油、パ
ラフィンなどの消泡剤が用いられる。

培養方法としては、固体培地上での培養も可能であるが
、一般の抗生物質生産の方法と同様に液体培養法、特に
深部培養法を用いることが好ましい。培養は好気的条件
下で行なわれ、培養温度は２０〜３５℃、特に２５〜３
０℃が好ましい。

４−オキソ−し−リジンは、振盪培養又はタンク培養の
いずれの場合も２〜６日間培養を行なうと、活性物質が
培養液中に生産蓄積される。培養液中の生産量が最大に
達した時点で培養を停止し、培養液中より目的の抗生物
質を単離精製する。４−オキソ−し−リジンは水に可溶
で一般の有機溶媒に難溶の水溶性塩基性物質であるため
、培養濾液から単離精製するには、通常の水溶性塩基性
抗生物質の単離、精製法を利用することができる。

すなわち、イオン交換樹脂、活性炭、セルロース、シリ
カゲル、アルミナ等による吸脱着法、補助剤として高級
儲肪酸を加えブタノール、アミルアルコール等で抽出す
る方法などを適当に組み合わせて用いることができる。

培養濾液を弱酸性陽イオン交換樹脂の層に通すと、４−
オキソ−し−リジンが吸着される。これを０．１〜３．
０規定のアルカリ又は酸で溶出し、活性成分を凍結乾燥
すると、４−オキソ−し−リジンの粗粉末が得られる。

このとき用いられる弱酸性陽イオン交換樹脂としては、
アンバーライトＩＲＣ−５０、Ｉ　ＲＣ−８４又はＣＧ
−５０（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオン
ＷＫ−１０又はＷＫ−２０（三菱化成社製）などがあげ
られる。またアルカリとしてはアンモニア水、水酸化ナ
トリウム水溶液などが、酸としては蟻酸、塩酸、硫酸な
どがあげられる。

また、培養濾液をｐＨ７〜９に調整し、目的物質を活性
炭に吸着させ、酸性の水又は塩酸メタノールで溶出させ
る方法も利用できる。

こうして得られる粗粉末は、弱酸性陽イオン交換樹脂、
ＣＭ−セファデックス、ＣＭ−セルロースなどに吸着さ
せ、アンモニア水、蟻酸アンモニウム水溶液などを用い
、濃度勾配法又は濃度段階法で溶出することにより、遊
離塩基として目的物を得ることができる。単離された目
的物は、更にセルロース、シリカゲル、アルミナなどを
用いる吸着クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１
０、などを用いるゲル濾過法、ダウエックス１×２など
を用いるイオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィーなどを適用することによって精製するこ
とができる。これらの方法は単独で又は組み合わせて適
用することができる。

このようにして得られる遊離塩基は、さらに、塩酸、硫
酸、臭化水素酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、メ
タンスルホン酸などの有機酸を加え、常法により酸付加
塩とすることができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、４−オキソ−Ｌ−ＩＪリジン特異的に
生産する微生物を用い、これを培養することにより優れ
た抗真菌作用を有する４−オキソ−し−リジンを効率良
く生産することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて、本発明の詳細な説明するが、本発
明は何らこれに限定されるものではない。

実施例１ 山ロ県山ロ市（湯圧温泉）で採取した土壌試料を、滅菌
水に懸濁させ、これをポテト浸出液（ポテト１０％、ト
マトペースト０．５％、オートミル１％）に肉エキス０
．１％、マイコスタチン５０μｇ／ｍｊ２、ペニシリン
Ｇ　　Ｏ，４μｇ／ｒｎ１．、ポリミキシンＢ　２μｇ
／ｍｆｌ、ナリジキシン酸８μｇ／ｍｌ、及び寒天１．
５％を加えた培地（ｐ）１７．０　）に塗抹し、２７℃
で７日間培養を行い、生じた集落を採取することによっ
てストレプトミセスｓｐ、　ＫＣ−７１６１株を得た。

実施例２ ポテト・デキストロース寒天斜面に生育したストレプト
ミセスｓｐ、　ＫＣ−７１６１株を可溶性澱粉１％、グ
ルコース１％、大豆粉１％、コーンステイープリカー０
．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｌ０　０．０５％、ＣａＣＯ３
０，３％、ＣＯＣｌ２”６Ｈ２００，０００５％からな
る培地に接種し、２８℃で４８時間振盪培養して、種培
養液とした。

次いで、可溶性澱粉２％、グルコース１％、大豆粉２％
、ＮａＣ１０，３％、ＫＨ２ＰＯ，０，５４％、ＮａＪ
Ｐ０４・１２Ｈ２００，３６％、Ｍｇ５Ｏ，・７１（，
００，０５％、ＣｏＣｌ２”６Ｈ２００，０００５％、
綿実油（０゜５％）からなる培地（ｐＨ７，０）　１０
１を２０１容量のステンレスタンク中に仕込み、この培
地中に前記種培養液１００ｍ１を接種し、通気量５Ｉ２
／分、撹拌数３２Ｏｒ、ｐ０ｍ、、２８℃で７２時間培
養した。培養終了後、培養液を濾過し、得られた濾液（
３０１）をアンバーライトＩ　ＲＣ−５０［Ｈ”：　Ｎ
Ｈ，＋型（１：　４）　］のカラム（２１）に吸着し、
水洗後０．５Ｎアンモニア水で溶出した。活性区分を集
め、減圧下濃縮後、ＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｎ
Ｈ，＋型）のカラム（１００ｍｅ）に吸着させ、水〜０
．２Ｎアンモニア水で濃度勾配溶出を行った。

活性画分を集め、減圧下濃縮後、濃縮液をセルロースカ
ラム（２００ｍｊりの上部に載せ、ｎ−プロパツール：
ピリジン：酢酸：水（１５：１０：３：１２）の溶媒系
で、溶出分画した。活性画分を濃縮し、ｐＨを５に調整
後、水を展關溶媒とするセファデックスＧ−１００カラ
ムクロマトグラフイ（３００−）で精製し、凍結乾燥し
て無色の粉末（７５０ｍｇ）を得た。

得られた物質の理化学的性質は下記のとおりである。

１、比旋光度（塩酸塩）　： ［α］：’　−２３，５°　（ｃ　０．３４　、８２０
）２、紫外線吸収スペクトル： 末端吸収を示すのみである。

３、赤外線吸収スペクトル： 臭化水素ペレット中で測定したスペクトルは図１に示す
とおりである。

’Ｈ−ＮＭＲ： 重水中で測定した’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図２に示す
とおりである。

５、　１３Ｃ−ＮＭＲ： 重水中で測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは図３に示
すとおりである。

６、　薄層クロマトグラフィｍ： Ｒｆ値；０．３４ 展開溶媒；ｎ−プロパノ−ルーピリジン４、 −酢酸−水（１５：１０：３ ＝　１２） プレート；セルロースプレートＡｒｔ　５７１８（メル
ク社製） ７、呈色反応： ニンヒドリン反応及びライドンスミス反応に陽性である
。

以上の理化学的性質により、本物質は４−オキソ−Ｌ−
リジンであることが確認された。

試験例 実施例２で得られた４−オキソ−し−リジンの真菌に対
する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定したところ、以
下のとおりであった。なお、測定は、イーストモルフォ
ロジー寒天プレート（デイフコ社製）に被験菌の懸濁液
を塗抹し、２７℃で２〜４日間培養することにより行な
った。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明で得られた４−オキソ−Ｌ−リジンの赤外
線吸収スペクトル、図２は’Ｈ−ＮＭＲスペクトル、図
３は１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。 以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトミセス属に属する４−オキソ−Ｌ−リ
   ジン生産菌を培養し、培養液より４−オキソ−Ｌ−リジ
   ンを採取することを特徴とする４−オキソ−Ｌ−リジン
   の製造法。
2. （２）ストレプトミセス属に属する４−オキソ−Ｌ−リ
   ジン生産菌。
3. （３）ストレプトミセスｓｐ、ＫＣ−７１６１である請
   求項２記載の４−オキソ−Ｌ−リジン生産菌。