JP4443708B2 - ミゾリビンの生産方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はミゾリビンの生産方法に関する。特に、本発明はミゾリビンを生産するための発酵方法に関し、Eupenicillium属に属する微生物を培養することを特徴とする。
【0002】
【従来技術】
ミゾリビンはブレジニン(5−ヒドロキシ−1−β−D−リボフラノシル−1H−イミダゾール−4−カルボキサミド)としても知られ、細胞毒性及び免疫抑制活性をもつ公知ヌクレオシド抗生物質であり、一般にEupenicillium brefeldianumにより生産され(米国特許第3,888,843号)、350μg/mlの力価を示すブロスを提供すると報告されている(Mizunoら,Journal of Antibiotics,vol.XXVII,No.10,pp.775−782,1974)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らの菌株コレクションでGN−83と命名し、1998年9月24日付けでDeutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSMZ)に寄託(受託番号DSM12615)したEupenicillium javanicumの発酵を想定する微生物学的方法によりミゾリビンを製造できることが今般判明した。
【0004】
【課題を解決するための手段】
生産生物はAurangabad(インド)で採取した土壌サンプルから単離し、J.I.Pitにより“The Genus Penicillium”,Academic Press,London 1979に提案されている基準に従って分類した。
【0005】
微生物、コロニー及び形態の特徴を以下に説明する。麦芽エキス寒天(MEA)上の増殖過程を25℃で7日間インキュベーション後に評価した。
【0006】
コロニーは43mmの平均直径をもち、均質で毛羽だったベルベット様の縁の白い表面をもち、4〜5mmのクラウンを示し、中心は一様に黄色である。多くの場合に、白色菌糸体を含むセクターの出現と、白色セクターに存在する浸出液の不在が観察された。
【0007】
コロニーの裏面はクリームイエローであり、セクターは暗色の着色を示す。拡散性色素は認められない。
【0008】
15日間インキュベーション後に培養基質MEA上のみで分化した閉子器が成熟する。閉子器は球形を示し、100〜200μmの寸法をもち、クリームイエローであり、均質な菌糸下層を形成する。
【0009】
子嚢果に含まれる子嚢胞子は曲線状であり、3.0〜3.5μmの寸法をもつ。子嚢胞子は明白な表面刻紋も溝も示さない。
【0010】
Eupenicillium javanicumにおいて、Penicillium属に属するとみなされる非晶質生殖構造の分化はMEA基質上のみで15日間培養後に開始する。
【0011】
数的に少ない分生子柄は気中菌糸にそれ自体形成され、30μmを越える可変長をもつ柄を分化する。
【0012】
箒状体は単層であり、分生子柄頭当たり少数(3〜6)の瓶様分生子をもつ。分生子の頂部の分生子連鎖は可変長をもつ。
【0013】
コロニーが成熟するにつれて、分生子柄の数と分生子連鎖長はコロニーの所定のセクターで増加する傾向がある。コロニーが1カ月齢の場合にMEA上に分生子柄が存在すると、コロニーの所定領域は薄緑色がかる。分生子は球形であり、平滑な壁をもち、1.5〜2.5μmの寸法をもつ。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明はミゾリビンを生産するための発酵方法を提供し、該方法は炭素と窒素の同化源を含む栄養液体培地でEupenicillium javanicum菌株の存在下に好気条件で発酵を実施することを特徴とする。本発明の方法は23℃〜33℃の温度で3〜7日間実施すると有利である。更に、付加無機粉末組成物の存在下に発酵を実施すると有利な場合がある。
【0015】
更に、本発明は発酵ブロスから生産されるにつれてミゾリビンを精製及び/又は医薬的に許容可能なその組成物を製造する段階を含む。
【0016】
発酵は23℃〜33℃、好ましくは25℃〜29℃の温度で3〜7日間、好ましくは4〜6日間液相で撹拌下に実施する。
【0017】
菌株を予備培養した後、通気ファーメンターに接種して多量のミゾリビンを得ることが好ましい。
【0018】
Eupenicillium javanicumの増殖に使用する培地は炭素、窒素及び好ましくは無機塩源から構成される。炭素源としては例えば澱粉、デキストロース、デキストリン、グルコース、フルクトース、グリセリン、サッカロース、マンニトール、マンノース等が挙げられ、窒素源としては例えば麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼインの酵素水解物、大豆粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉エキス、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン等が挙げられる。硝酸アンモニウムや硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩を使用しても良好な結果が得られる。生産に使用する無機塩は培地によって異なり、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、硫酸、塩化物、硝酸イオン等を提供する可溶性無機塩を使用することができる。このような塩としては、例えば第一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、第一硫酸カリウム、硝酸ナトリウムが挙げられる。炭酸カルシウムを加えても有用である。
【0019】
発酵は種々の容量のファーメンターでフラスコ中で実施することができる。
【0020】
分析方法
クロマトグラフィー(HPLC)
Beckmanクロマトグラフィー装置システム:
−126ポンプ、−168デテクター、−507eオートサンプラー。
【0021】
注入ループの容量は50μlとした。5μm LICHROSORBを充填したステンレス鋼カラム(15cm×6.0mm内径)を室温で使用した。移動相は70mM第一リン酸カリウム(pH2.5)−アセトニトリル(30:70)を流速1.0ml/分で流した。カラム流出液を280nmで0.050の吸光度感度で監視した。
【0022】
試料調製
遠心(3000rpmで10分間)後に、透明上清の適当に希釈した50μlアリコートをHPLCシステムに注入した。
【0023】
定量
水中濃度100μg/mlのミゾリビンストック溶液を調製した。ミゾリビン標準溶液を使用し、25〜100μg/mlの濃度で培養ブロス試料を試験した。
【0024】
有機相を場合により乾燥し、同一溶剤又は混合溶剤(例えば、ブタノール/酢酸/水)に再懸濁し、濃縮後にミゾリビンを含む粗沈殿が得られる。
【0025】
発酵後の粗生成物の精製は、例えば水と有機溶剤(例えばアセトン、酢酸、メタノール、ブタノール、クロロホルム)の混合物を溶離剤として使用するクロマトグラフィーカラムを使用して実施することができる。
【0026】
実施例1
菌株増殖
以下の組成(MEA:麦芽エキス寒天):
麦芽エキス(Difco) 20.0g/l
ペプトン(Difco) 1.0g/l
デキストロース(Roquette) 20.0g/l
寒天(Difco) 20.0g/l
蒸留水 1000ml
をもつ寒天傾斜培地でEupenicillium javanicum菌株を保存した。
【0027】
傾斜培地を26℃で15〜18日間インキュベートした。
【0028】
蒸留水5mlで表面を掻き取ることにより増殖細胞の約3分の1を除去し、胞子懸濁液を得た。
【0029】
予備培養
上記菌株増殖により得られた懸濁液を予備培養液として振盪フラスコに接種した。
【0030】
振盪フラスコ中の培地は以下の組成:
カゼインの酵素水解物(Difco) 3g/l
コーンスティープリカー(Roquette) 1g/l
デキストロース(Roquette) 20g/l
蒸留水 1000ml
とした。121℃で20分間滅菌した。
【0031】
各々2個のバッフルをもつ500ml容フラスコに上記培地100mlを分配した。フラスコを250rpmの回転振盪器で26℃で24時間インキュベートした。
【0032】
3個のバッフルをもつ2リットル容フラスコに上記培地750mlを入れ、第1回予備培養液の2%に等しい量を接種することにより第2回目の予備培養を実施した。
フラスコを200rpmの回転振盪器で26℃で約48時間インキュベートした。
【0033】
発酵
第2回予備培養液の約2%を使用し、以下の組成:
硫酸アンモニウム(Merck) 10g/l
硝酸アンモニウム(Merck) 10g/l
第一リン酸カリウム(Merck) 2g/l
硫酸マグネシウム・7水和物(Merck) 0.2g/l
コーンスティープリカー(Roquette) 20g/l
デキストロース(Roquette) 50g/l
水道水 1000ml
をもつ栄養培地15リットルを入れたジャーファーメンターに接種した。
【0034】
発酵材料を26℃〜28℃で1v/v/分の通気下に600rpmで撹拌しながら96時間好気条件でインキュベートした。
【0035】
培養ブロス濾液でHPLCによりミゾリビンの生産を定期的に試験した。
【0036】
4〜5日後に600〜700μg/mlの最高力価が記録された。
【0037】
実施例2
菌株増殖
以下の組成:
麦芽エキス(Difco) 20.0g/l
第一リン酸カリウム 1.0g/l
デキストロース(Roquette) 20.0g/l
硫酸マグネシウム・7水和物(Merck) 0.2g/l
コーンスティープリカー(Roquette) 20.0g/l
寒天(Difco) 20.0g/l
蒸留水 1000ml
をもつ寒天傾斜培地でEupenicillium javanicum菌株を保存した。
【0038】
傾斜培地を26℃で15〜20日間インキュベートした。
【0039】
蒸留水5mlで表面を掻き取ることにより増殖細胞の約3分の1を除去し、胞子懸濁液を得た。
【0040】
予備培養
以下の組成:
カゼインの酵素水解物 2g/l
大豆ペプトン 5g/l
デキストロース 10g/l
蒸留水 1000ml
をもつ栄養培地を入れた振盪フラスコに、上記菌株増殖により得られた胞子懸濁液を接種した。121℃で20分間滅菌した。
【0041】
各々2個のバッフルをもつ500ml容フラスコに上記培地100mlを分配した。
【0042】
フラスコを250rpmの回転振盪器で26℃で約40時間インキュベートした。
【0043】
実施例1と同様に第2回予備培養液を調製し、インキュベートした。
【0044】
発酵
増殖後、以下の組成:
硫酸アンモニウム 5g/l
硝酸ナトリウム 10g/l
第一リン酸カリウム 2g/l
硫酸マグネシウム・7水和物 0.2g/l
大豆ペプトン 20g/l
サッカロース 60g/l
水道水 1000ml
をもつ栄養培地を入れた15リットル容ジャーファーメンターに予備培養液を接種した。
【0045】
発酵材料を実施例1と同一条件でインキュベートし、HPLCによりミゾリビンの生産を試験した処、4日後に750〜800μg/mlの力価を示した。
【0046】
実施例3
抽出
pH5.6をもち、700μg/mlのミゾリビンを含む(実施例1から得られた)培養ブロス50リットルをWathman(登録商標)濾紙で濾過し、透明濾液40リットルを得た。
【0047】
流速330ml/分でXAD 1180(ROHM & HAAS)8リットルを使用して濾液をカラム(φ12cm)に通し、ブロスを脱色した後、420nmの吸光度を読み取った。次に、樹脂を上記と同一流速で水20リットルで洗浄した。得られた脱色液(pH=5.8)60リットルに20%NaOHを加えてpH=9.0に調整した。液体を流速500ml/分で30リットルRelite 2AS(RESINDION S.R.L.)(OH−形態)カラム(φ20cm)に通し、ミゾリビンを吸着させた。
【0048】
樹脂を脱イオン水120リットルで洗浄した後、2%酢酸で溶離し、10リットルフラクションを集めた。
【0049】
HPLC試験で活性であったフラクションを集め、減圧濃縮し、油状残渣220gを得た。
【0050】
この残渣をメタノール400ml及びアセトン1リットルと混合し、4℃で5時間放置して沈殿させた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥し、粗ミゾリビン150gを得た(純度15%)。得られた粉末をブタノール:酢酸:水(10:1:2)混合溶剤に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル60カラム(φ7cm)で精製した。
【0051】
500mlフラクションを集め、油状残渣(純度44%)33gが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した後、メタノール30mlに再懸濁し、アセトン90mlで沈殿させた。
【0052】
沈殿を減圧下にアセトンで洗浄して得られた灰色粉末28gをメタノールに懸濁し、クロロホルム:メタノール:酢酸(30:1:1)混合溶剤を充填した1リットルシリカゲル60カラム(φ4cm)に通し、1:7:7混合物が得られるまで勾配溶離した。500mlフラクションを集め、最高濃度フラクションを減圧濃縮し、油状残渣(純度85%)14.5gを得、等容量のアセトンを加え、一晩5℃で放置した。無色ミゾリビン結晶が得られた(11g)。
【0053】
実施例4
抽出
ミゾリビン700μg/mlを含む(実施例1から得られたままの)培養ブロス(pH=5.6)50リットルをDicalite(DICALITE EUROPE SUD)で減圧濾過した。
【0054】
透明濾液40リットルに20%H2SO4を加えてpH4.5に調整した後、0.05M酢酸緩衝液(pH4.5)20リットルを充填した5リットルCM SEPHAROSE FAST FLOWカラム(φ12cm)に通した。濾液を流速83ml/分で吸着させた後、0.05M酢酸緩衝液(pH4.5)5リットルで洗浄し、0.05M酢酸緩衝液(pH4.5)25リットルを更に0.05M酢酸緩衝液(pH4.5)25リットル及び0.5M NaClと混合して勾配溶離した。
【0055】
1リットルフラクションを集め、最高濃度フラクションを減圧濃縮し、灰色粉末(純度55%)45gを得た。
【0056】
粉末をメタノールに懸濁し、クロロホルム/メタノール/酢酸(1:7:7)の混合溶剤を充填した1リットルシリカゲル60カラム(φ4cm)で精製した。
【0057】
500mlフラクションを集め、ミゾリビンの無色結晶(純度97%)18gが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した。
【0058】
実施例5
抽出
ミゾリビン700μg/mlを含む(実施例1から得られたままの)培養ブロス(pH=5.6)50リットルをDicalite(DICALITE EUROPE SUD)で減圧濾過した。
【0059】
透明濾液40リットルをスルホンポリエーテル膜で限外濾過精製した。20%NaOHを加えて液体をpH=9.0に調整した。
【0060】
液体を500ml/分で30リットルRelite(RESINDION S.R.L)に通し、ミゾリビンを吸着させた。
【0061】
樹脂を脱イオン水120リットルで洗浄した後、2%酢酸で溶離し、10リットルフラクションを集めた。
【0062】
HPLC試験で活性であったフラクションを集め、減圧濃縮し、油状物150gを得た。
【0063】
この残渣をメタノール150ml及びアセトン300mlと混合し、5時間4℃で放置して沈殿させた。沈殿をアセトンで洗浄し、減圧乾燥すると、粗ミゾリビン110g(純度20%)が得られた。得られた粉末をブタノール:酢酸:水(10:1:2)混合溶剤に懸濁し、同一混合溶剤を充填したシリカゲル60カラム(φ7cm)で精製した。
【0064】
500mlフラクションを集め、油状残渣(純度55%)30gが得られるまで最高濃度フラクションを減圧濃縮した後、メタノール10mlに再懸濁し、最後にアセトン30mlで沈殿させた。
【0065】
沈殿をアセトンで減圧洗浄し、一晩減圧放置した。
【0066】
無色ミゾリビン結晶が得られた(13g)。
Claims (6)
- ミゾリビンを生産するための発酵方法であって、炭素と窒素の同化源を含む栄養液体培地でEupenicillium javanicum菌株の存在下に好気条件で発酵を実施することを特徴とする前記方法。
- 菌株を予備培養する請求項1に記載の方法。
- 23℃〜33℃の温度で3〜7日間実施する請求項1又は2に記載の方法。
- 25℃〜29℃の温度で4〜6日間実施する請求項3に記載の方法。
- 付加無機塩の存在下に発酵を実施する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ミゾリビンの精製及び/又は医薬的に許容可能なその組成物の製造を含む請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
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