KR20000058067A

KR20000058067A - 미조리빈의 제조 방법

Info

Publication number: KR20000058067A
Application number: KR1020000007296A
Authority: KR
Inventors: 베네데띠알베르토; 콜롬보엘리사베따; 니첼레마리나; 파가니헤르메스
Original assignee: 베르나 렌조; 그노시스 에스.알.엘.
Priority date: 1999-02-17
Filing date: 2000-02-16
Publication date: 2000-09-25
Also published as: EP1029927B1; JP2000279192A; JP4443708B2; KR100574189B1; EP1029927A1

Abstract

본 발명은 에우페니실륨(Eupenicillium) 속에 속하는 미생물을 배양함을 포함하여, 미조리빈을 제조하는 발효 방법에 관한 것이다.

Description

미조리빈의 제조 방법{Process for producing mizoribine}

본 발명은 미조리빈의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에우페니실륨 속에 속하는 미생물을 배양함을 포함하여, 미조리빈을 제조하는 발효 방법에 관한 것이다.

브레디닌 (5-하이드록시-1-β-D-리보푸라노실-1H-이미다졸-4-카복스아미드)로도 알려져 있는 미조리빈은 현재 에우페니실륨 브레펠디아눔(Eupenicillium brefeldianum)에 의해 제조되는, 세포독성 및 면역억제 활성을 제공하는 공지된 뉴클레오사이드 항생물질이고(US 3,888,843), 이는 350mcg/ml의 효능을 나타내는 배양액을 제공하는 것으로 보고되어 있다[참조: Mizuno et al., Journal of Antibiotics, vol. XXVII, No. 10, pp. 775-782, 1974].

본 발명에 이르러, 미조리빈은 GN-83으로서 본 발명자들의 균주 컬렉션내에 동정되고, "도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘"(DSMZ)에 수탁번호: DSM 12615로 1998년 9월 24일자로 기록된 에우페니실륨 자바니쿰(Eupenicillium javanicum)의 발효를 고려하는 미생물학적 방법에 의해 제조할 수 있다는 것을 밝혀내었다.

생성된 유기물은 오랑가바드(인디아)에서 수집된 토양 샘플로부터 분리하고 제이.아이. 피트(J.I. Pit)에 의해 문헌[참조: "The Genus Penicillium", Academic Press, London 1979]에서 제안된 기준에 따라 분류한다.

미생물, 콜로니 및 형태의 특징은 하기 설명한다. 맥아 추출물 한천(MEA) 상에서의 증식 경과는 25℃에서 7일간 배양한 후 평가한다.

4 내지 5mm의 크라운을 나타내며 중앙이 균일하게 황색인, 균일하고, 솜털로 덮히고, 벨벳같은, 하얀 테두리가 있는 표면을 갖는 콜로니의 평균 직경은 43mm이다. 빈번하게, 백색 균사체를 갖는 영역의 출현, 및 백색 영역에 존재하는 삼출물의 부재가 관찰된다.

보다 어두운 착색을 나타내는 영역을 갖는 콜로니의 후면은 담황색을 띤다. 확산성 색소가 존재하지 않는다.

배양 배지 MEA 상에서만 분화되는 폐쇄 자낭과는 배양 15일 후에 성숙한다. 이들의 형태는 구형이고 치수는 100 내지 200㎛ 범위이고; 이들은 담황색을 띠고 균일한 균사체하 층을 형성시킨다.

자낭과에 포함된 자낭포자는 만곡한 형태를 가지고, 이의 치수는 3.0 내지 3.5㎛ 범위이다. 이들은 또한 어떠한 명백한 표면 장식이나 어떠한 홈도 보이지 않는다.

에우페니실륨 자바니쿰에서, 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 부정형 생식 구조의 분화는 MEA 배지 상에서만, 배양 15일 후에 개시된다.

수적으로 부족한 분생포자병은 다양한 길이를 가지나, 30㎛ 보다 긴 균병을 분화시키는 기생 균사 상에서 자기 형성시킨다.

페니실륨은 일렬로 배열되고 분생포자병의 헤드(head)당 적은 수(3 내지 6개)의 병모양 분생자를 갖는다. 분생자 상부에 있는 분생포자기의 쇄는 다양한 길이를 갖는다.

콜로니 연령에 따라, 분생포자병의 수 및 분생포자기 쇄의 길이 둘다 콜로니의 특정 영역에서 증가하는 경향이 있다. 콜로니가 1월령일 경우, MEA 상에서의 분생포자병의 존재는 콜로니의 특정 영역이 푸르스름한 색조를 띠도록 한다. 분생포자기는 구형이며, 평활한 벽으로 둘러싸여 있고, 1.5 내지 2.5㎛범위의 치수를 갖는다.

본 발명은 에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에 발효를 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함을 포함하여, 미조리빈을 제조하는 발효 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 유리하게는 23℃ 내지 33℃의 온도에서 3 내지 7일에 걸친 기간 동안 수행할 수 있다. 또한, 부가된 무기물 분말 조성물의 존재하에서 발효를 수행하는 것은 몇몇 이점을 가질 수 있다.

더우기, 본 발명은 미조리빈의 정제, 및/또는 발효 배양액으로부터 생성되는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조를 포함한다.

발효는 23℃ 내지 33℃, 바람직하게는 25℃ 내지 29℃ 범위의 온도에서 3 내지 7일, 바람직하게는 4 내지 6일 동안 교반하에 액체 상에서 수행한다.

균주를 바람직하게는 예비 배양한 다음, 통기되는 발효기에 접종하여 현저한 양의 미조리빈을 수득한다.

에우페니실륨 자바니쿰의 증식에 사용되는 배양 배지는 탄소, 질소 및, 바람직하게는, 무기 염의 공급원으로 구성된다. 탄소원은, 예를 들어, 전분, 덱스트로스, 덱스트린, 글루코스, 프럭토스, 글리세린, 사카로스, 만니톨, 만노스 등일 수 있고; 질소원은, 예를 들어, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카제인의 효소 가수분해물, 대두분, 건조 효모, 펩톤, 대두 펩톤, 고기 추출물, 질산염, 아미노산, 카제인 등일 수 있다. 우수한 결과는 또한 암모늄 염, 예를 들어, 질산암모늄 및 황산암모늄을 사용하여 수득한다. 상기 제조에 사용되는 무기 염은, 배양 배지에 따라 달라질 수 있고; 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 황산염, 염화물, 질산염 이온을 제공하는 가용성 무기 염을 사용할 수 있다. 이러한 염은, 예를 들어, 1염기성 인산칼륨, 황산마그네슘, 1염기성 황산칼륨, 질산나트륨일 수 있다. 탄산칼슘의 첨가도 또한 유용할 수 있다.

발효는 플라스크 및 상이한 용량의 발효기내에서 수행할 수 있다.

분석법

크로마토그래피(HPLC)

벡크만(Beckman) 크로마토그래피 장치 시스템:

- 126 펌프; - 168 검출기; - 507e 자동 샘플러

주입 루프의 용량은 50㎕이다. 5㎛ LICHROSORB로 팩킹된 스테인레스-스틸 칼럼(15cm x 6.0mm 내경)은 실온에서 사용한다. 이동 상은 1.0ml/분의 유속으로 전달되는 70mM 1염기성 인산칼륨(pH 2.5)-아세토니트릴(30:70)이다. 칼럼 유출물을 흡수 감도 0.050을 사용하여 280nm에서 모니터링한다.

샘플 제제

원심분리(3,000rpm에서 10분) 후에, 적합하게 희석시킨 청정한 상등액의 50㎕ 분액을 HPLC 시스템으로 주입한다.

정량화

미조리빈의 원액을 100㎍/ml의 농도로 물 중에서 제조한다. 미조리빈 표준 용액을 사용하여, 배양액의 샘플을 25 내지 100㎍/ml의 범위의 농도로 시험한다.

임의로 건조시킨 다음 동일한 용매 또는 용매의 혼합물(예를 들어, 부탄올/아세트산/물)에 재현탁시킨 유기 상의 농축 후, 미조리빈을 함유하는 조 침전물을 수득한다.

발효에 잇따른 조 생성물의 정제는, 예를 들어, 용출액으로서 물과 유기 용매, 예를 들어, 아세톤, 아세트산, 메탄올, 부탄올, 클로로포름의 혼합물을 사용하는 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 1

균주 증식

에우페니실륨 자바니쿰 균주를 하기 조성의 사면 한천(MEA: 맥아 추출물 한천) 상에 공급한다:

맥아 추출물(Difco) 20.0g/ℓ

펩톤(Difco) 1.0g/ℓ

덱스트로스(Roquette) 20.0g/ℓ

한천(Difco) 20.0g/ℓ

증류수 1000ml

상기 사면 배지를 26℃에서 15 내지 18일 동안 항온처리한다.

증류수 5ml를 사용하여 표면을 스크랩핑시켜 약 1/3의 증식물을 떼어내 포자 현탁액을 수득한다.

예비 배양

상기한 바와 같은 균주 증식물로부터 생성시킨 현탁액을 예비 배양물로서 진탕-플라스크내에 접종한다.

진탕-플라스크내의 배양물은 하기 조성을 갖는다:

카제인의 효소 가수분해물(Difco) 3g/ℓ

옥수수 침지액(Roquette) 1g/ℓ

덱스트로스(Roquette) 20g/ℓ

증류수 1000ml

살균을 121℃에서 20분 동안 수행한다.

2개의 배플을 가지고 상기 배지 100ml를 함유하는 500ml 플라스크에 배지를 분배한다. 플라스크를 회전 진탕기 상에서 250rpm으로 26℃에서 24시간 동안 항온처리한다.

3개의 배플을 가지고 상기 배지 750ml를 함유하는 2ℓ 플라스크에 제1 예비 배양물의 2%에 상당하는 양을 접종함으로써 제2 예비 배양을 수행한다.

상기 플라스크를 회전 진탕기 상에서 200rpm으로 26℃에서 약 48시간 동안 항온처리한다.

발효

제2 예비 배양물의 약 2%를 사용하여 하기 조성의 영양 배지 15ℓ를 함유하는 병 발효기에 접종한다:

황산암모늄(Merck) 10g/ℓ

질산암모늄(Merck) 10g/ℓ

1염기성 인산칼륨(Merck) 2g/ℓ

황산마그네슘 7수화물(Merck) 0.2g/ℓ

옥수수 침지액(Roquette) 20g/ℓ

덱스트로스(Roquette) 50g/ℓ

수돗물 1000ml

발효액을 26℃ 내지 28℃에서 96시간 동안 1v/v/분의 통기를 사용하는 호기성 조건하에 600rpm에서의 교반하에 배양한다.

미조리빈의 생산을 HPLC에 의해 배양액 여액 상에서 간격을 두고 시험한다.

600 내지 700mcg/ml에 상당하는 가장 높은 효능이 4 내지 5일 후에 기록된다.

실시예 2

균주 증식

에우페니실륨 자바니쿰 균주를 하기 조성의 사면 한천 상에 공급한다:

맥아 추출물(Difco) 20.0g/ℓ

1염기성 인산칼륨(Merck) 1.0g/ℓ

덱스트로스(Roquette) 20.0g/ℓ

황산마그네슘 7수화물(Merck) 0.2g/ℓ

옥수수 침지액(Roquette) 20.0g/ℓ

한천(Difco) 20.0g/ℓ

증류수 1000ml

상기 사면 배지를 26℃에서 15 내지 20일 동안 항온처리한다.

예비 배양

균주 증식물로부터 생성시킨 현탁액을 하기 조성의 영양 배지를 함유하는 진탕-플라스크내에 접종한다:

카제인의 효소 가수분해물 2g/ℓ

대두 펩톤 5g/ℓ

덱스트로스 10g/ℓ

증류수 1000ml

살균을 121℃에서 20분 동안 수행한다.

2개의 배플을 가지고 상기 배지 100ml를 함유하는 500ml 플라스크에 배지를 분배한다.

플라스크를 회전 진탕기 상에서 250rpm으로 26℃에서 약 40시간 동안 항온처리한다.

제2 예비 배양물을 제조하여 실시예 1과 같이 배양한다.

발효

증식 후, 예비 배양물을 하기 조성의 영양 배지를 함유하는 15ℓ 발효기에 접종한다:

황산암모늄 5g/ℓ

질산암모늄 10g/ℓ

1염기성 인산칼륨 2g/ℓ

황산마그네슘 7수화물 0.2g/ℓ

대두 펩톤 20g/ℓ

사카로스 60g/ℓ

수돗물 1000ml

상기 발효액을 실시예 1에서와 동일한 조건으로 배양하며, HPLC에 의해 시험된 미조리빈의 생산은 4일 후에 750 내지 800mcg/ml의 효능을 나타낸다.

실시예 3

추출

pH가 5.6이고 미조리빈을 700mcg/ml 함유하는 배양액(실시예 1로부터 생성됨) 50ℓ를 Wathman^R페이퍼 상에서 여과하여 투명한 여액 40ℓ를 수득한다.

상기 여액을 330ml/분의 유속으로 XAD 1180(ROHM & HAAS) 수지 8ℓ를 사용하여 칼럼(ø 12cm)에 통과시켜 배양액을 탈색시킨 다음, 420nm에서의 흡광도를 판독한다. 다음, 수지를 상기한 바와 동일한 유속으로 물 20ℓ로 세척한다.

탈색된 생성 액체(pH=5.8) 60ℓ를 20% NaOH의 첨가에 의해 pH=9.0으로 조정한다.

상기 액체를 500ml/분의 유속으로 30ℓ Relite 2AS(RESINDION S.R.L.)(OH^-형태) 칼럼(ø 20cm)에 통과시켜 미조리빈을 흡수시킨다.

상기 수지를 탈염수 120ℓ로 세척한 다음, 2% 아세트산으로 용출시켜 10ℓ 분획을 수집한다.

HPLC로 시험한 활성 분획을 수집하고 진공하에 농축시켜 유성 잔사 220g을 수득한다.

상기 잔사를 메탄올 400ml 및 아세톤 1ℓ와 혼합한 다음, 4℃에서 5시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상기 침전물을 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켜 조 미조리빈(순도: 15%) 150g을 수득한다. 수득된 분말을 부탄올:아세트산:물(10:1:2)의 용매 혼합물에 현탁시키고 동일한 용매 혼합물로 팩킹된 Silicagel 60 칼럼(ø 7cm)내에서 정제한다.

500ml 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 유성 잔사(순도: 44%) 33g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨 다음, 메탄올 30ml에 재현탁시키고 아세톤 90ml로 침전시킨다.

상기 침전물을 아세톤으로 진공하에 세척하여 회색 분말 28g을 수득하고, 이를 메탄올에 현탁시키고 클로로포름:메탄올:아세트산(30:1:1)의 용매 혼합물로 팩킹된 1ℓ Silicagel 60 칼럼(ø 4cm)에 충전시켜 1:7:7의 혼합물이 수득될 때까지 구배 용출시킨다. 500ml 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 진공하에 농축시켜 유성 잔사(순도: 85%) 14.5g을 수득한 다음, 이에 동일 용적의 아세톤을 가하여 5℃에서 밤새 정치시킨다.

무색 미조리빈 결정(11g)을 수득한다.

실시예 4

추출

미조리빈을 700mcg/ml 함유하는 배양액(실시예 1에서 생성됨)(pH=5.6) 50ℓ를 Dicalite(DICALITE EUROPE SUD) 상에서 진공하에 여과한다.

투명한 여액 40ℓ의 pH를 20% H₂SO₄의 첨가에 의해 4.5로 조정한 다음, pH 4.5의 0.05M 아세트산염 완충액 20ℓ로 팩킹된 5ℓ CM SEPHAROSE FAST FLOW 칼럼(ø 12cm)에 통과시킨다.

상기 여액을 83ml/분의 유속으로 흡수시킨 다음, 0.05M 아세트산염 완충액(pH 4.5) 5ℓ로 세척하고 0.05M 아세트산염 완충액(pH 4.5) 25ℓ를 추가의 0.05M 아세트산염 완충액(pH 4.5) 25ℓ 및 0.5M NaCl과 혼합하면서 구배 용출시킨다.

1ℓ 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 진공하에 농축시켜 회색 분말(순도: 55%) 45g을 수득한다.

메탄올에 현탁된 분말을 클로로포름/메탄올/아세트산(1:7:7)의 용매 혼합물로 팩킹된 1ℓ Silicagel 60 칼럼(ø 4cm) 상에서 정제한다.

500ml 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 미조리빈의 무색 결정(순도: 97%) 18g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨다.

실시예 5

추출

투명한 여액 40ℓ를 또한 설폰산 폴리에테르 막을 통한 한외여과로 정제한다. 상기 액체를 20% NaOH의 첨가에 의해 pH=9.0으로 조정한다.

상기 액체를 500ml/분의 유속으로 30ℓ Relite(RESINDION S.R.L.)에 통과시켜 미조리빈을 흡수시킨다.

HPLC로 시험한 활성 분획을 수집하고 진공하에 농축시켜 오일 150g을 수득한다.

상기 잔사를 메탄올 150ml 및 아세톤 300ml와 혼합한 다음, 4℃에서 5시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상기 침전물을 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켜 조 미조리빈(순도: 20%) 110g을 수득한다. 수득된 분말을 부탄올:아세트산:물(10:1:2)의 용매 혼합물에 현탁시켜 동일한 용매 혼합물로 팩킹된 Silicagel 60 칼럼(ø 7cm)내에서 정제한다.

500ml 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 유성 잔사(순도: 55%) 30g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨 다음, 메탄올 10ml에 재현탁시키고 최종적으로 아세톤 30ml로 침전시킨다.

상기 침전물을 아세톤으로 진공하에 세척한 다음, 진공하에 밤새 정치시킨다.

무색 미조리빈 결정(13g)을 수득한다.

본 발명에 따라, 에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에서 발효를 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함으로써, 미조리빈을 발효에 의해 제조할 수 있다.

Claims

에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에서 발효를 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함을 포함하여, 미조리빈을 제조하는 발효 방법.
제1항에 있어서, 균주를 예비 배양하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 23℃ 내지 33℃의 온도에서 3 내지 7일 범위의 기간 동안 수행하는 방법.
제3항에 있어서, 25℃ 내지 29℃의 온도에서 4 내지 6일 범위의 기간 동안 수행하는 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 발효를 부가된 무기 염의 존재하에 수행하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조를 포함하는 방법.