KR100574189B1

KR100574189B1 - 미조리빈의 제조방법

Info

Publication number: KR100574189B1
Application number: KR1020000007296A
Authority: KR
Inventors: 베네데띠알베르토; 콜롬보엘리사베따; 니첼레마리나; 파가니헤르메스
Original assignee: 그노시스 에스.알.엘.
Priority date: 1999-02-17
Filing date: 2000-02-16
Publication date: 2006-04-27
Also published as: EP1029927A1; JP4443708B2; JP2000279192A; KR20000058067A; EP1029927B1

Abstract

본 발명은 에우페니실륨(Eupenicillium) 속에 속하는 미생물을 배양함을 포함하는, 미조리빈(mizoribine)의 제조를 위한 발효방법에 관한 것이다.

에우페니실륨, 에우페니실륨 자바니쿰, 미조리빈, 예비 배양, 영양 액체 배지

Description

미조리빈의 제조방법{Process for producing mizoribine}

본 발명은 미조리빈(mizoribine)의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 에우페니실륨(Eupenicillium) 속에 속하는 미생물을 배양함을 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법에 관한 것이다.

브레디닌 (5-하이드록시-1-β-D-리보푸라노실-1H-이미다졸-4-카복스아미드)로도 알려져 있는 미조리빈은 현재 에우페니실륨 브레펠디아눔(Eupenicillium brefeldianum)에 의해 제조되고 세포독성 및 면역억제 활성을 제공하는 공지된 뉴클레오사이드 항생물질이며[참조: 미국 특허공보 제3,888,843호], 이는 350mcg/㎖의 효능을 나타내는 배양액을 제공하는 것으로 보고되었다[참조: Mizuno et al., Journal of Antibiotics, vol. XXVII, No. 10, pp.775-782, 1974].

본 발명에 이르러, 미조리빈을, 본 발명자들의 균주 컬렉션내에 GN-83으로서 동정되고 "도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘(DSMZ)"에 수탁번호 DSM 12615로 1998년 9월 24일자로 기록된 에우페니실륨 자바니쿰(Eupenicillium javanicum)의 발효를 고려한 미생물학적 방법에 의해 제조할 수 있음을 밝혀내었다.

생성된 유기물을 인도에 소재한 오랑가바드에서 수집한 토양 샘플로부터 분리하고 제이.아이. 피트(J.I. Pit)에 의해 문헌[참조: "The Genus Penicillium", Academic Press, London 1979]에서 제안된 기준에 따라 분류하였다.

미생물, 콜로니 및 형태의 특징을 하기 설명한다. 맥아 추출물 한천(MEA: malt extract agar) 상에서의 증식 경과는 25℃에서 7일간 배양한 후에 평가하였다.

균일하고, 솜털로 덮혀 있으며, 벨벳같고, 백색 테두리가 있는 표면을 갖는 콜로니의 평균 직경은 43mm이며, 4 내지 5mm의 크라운을 나타내고, 중앙이 균일하게 황색이다. 빈번하게, 백색 균사체를 갖는 영역의 출현 및 백색 영역에 존재하는 삼출물의 부재가 관찰되었다.

보다 짙게 착색된 영역에서 콜로니의 후면은 크림 옐로우색을 나타낸다. 확산성 색소는 존재하지 않는다.

배양 배지 MEA 상에서만 분화되는 자낭구(cleistothecia)는 배양 후 15일이 지나서 성숙된다. 이의 형태는 구형이고 치수는 100 내지 200㎛ 범위이며, 이들은 크림 옐로우색을 나타내고 균일한 균사체하 층을 형성시킨다.

자낭과에 포함된 자낭포자는 만곡된 형태를 가지며 치수는 3.0 내지 3.5㎛ 범위이다. 당해 자낭포자는 어떠한 명백한 표면 장식이나 어떠한 홈(sulcus)도 보이지 않는다.

에우페니실륨 자바니쿰에서, 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 부정형 생식 구조의 분화는, MEA 배지 상에서만 배양 후 15일이 지나서 개시된다.

수적으로 부족한 분생포자는, 길이가 다양하지만 30㎛ 보다 긴 균병을 분화시키는 기생(氣生) 균사 상에서 자기 형성된다.

페니실륨은 일렬로 배열되며, 분생포자의 헤드(head)당 병모양 분생포자를 소량(3 내지 6개) 갖는다. 분생포자의 상부에 존재하는 분생자의 쇄는 다양한 길이를 갖는다.

콜로니 연령에 따라, 분생포자의 수 및 분생자의 쇄의 길이는 둘 다 콜로니의 몇몇 영역에서 증가하는 경향이 있다. 콜로니가 1개월령인 경우, MEA 상에 분생포자가 존재함으로써 콜로니의 몇몇 영역이 연녹색 색조를 나타낸다. 분생자는 구형이고 평활한 벽으로 둘러싸여 있으며 치수가 1.5 내지 2.5㎛ 범위이다.

본 발명은 에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에서의 발효를 동화 가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함을 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 유리하게는 23 내지 33℃의 온도에서 3 내지 7일에 걸친 기간 동안 수행할 수 있다. 또한, 부가된 광물 분말 조성물의 존재하에서 발효를 수행하는 경우 몇몇 이점이 존재할 수 있다.

또한, 본 발명은 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조를 포함하는데, 이는 발효 배양액으로부터 제조되기 때문이다.

발효는 23 내지 33℃, 바람직하게는 25 내지 29℃ 범위의 온도에서 3 내지 7일, 바람직하게는 4 내지 6일 동안의 교반하에 액체 상에서 수행한다.

균주를 바람직하게는 예비 배양한 후에 에어레이션(aeration)되는 발효기에 접종시켜, 현저한 양의 미조리빈을 수득한다.

에우페니실륨 자바니쿰의 증식에 사용되는 배양 배지는 탄소 및 질소, 바람직하게는 광물염의 공급원으로 구성된다. 탄소원은, 예를 들면, 전분, 덱스트로스, 덱스트린, 글루코스, 프럭토스, 글리세린, 사카로스, 만니톨, 만노스 등일 수 있고, 질소원은, 예를 들면, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카제인의 효소 가수분해물, 대두분, 건조 효모, 펩톤, 콩 펩톤, 수육 추출물, 질산염, 아미노산, 카제인 등일 수 있다. 또한, 암모늄염, 예를 들면, 질산암모늄 및 황산암모늄을 사용하는 경우에 우수한 결과를 수득한다. 당해 제조에 사용되는 광물염은 배양 배지에 따라 가변적일 수 있으며, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 황산염, 염화물, 질산염 이온을 제공하는 가용성 무기염을 사용할 수 있다. 이러한 염은, 예를 들면, 1염기성 인산칼륨, 황산마그네슘, 1염기성 황산칼륨, 질산나트륨일 수 있다. 또한, 탄산칼슘의 첨가가 유용할 수 있다.

발효는 플라스크 및 상이한 용량의 발효기 속에서 수행할 수 있다.

분석법

크로마토그래피(HPLC)

벡크만(Beckman) 크로마토그래피 장치 시스템:

-. 126개 펌프; -. 168개 검출기; -. 507개 자동 샘플러

주입 루프의 용량은 50㎕이었다. 5㎛ 리크로소브(LICHROSORB)로 패킹된 스테인레스 스틸 칼럼(내경 15cm ×6.0mm)을 실온에서 사용하였다. 이동상은 유속 1.0㎖/min으로 전달되는 70mM 1염기성 인산칼륨(pH = 2.5):아세토니트릴(30:70)이었다. 칼럼 유출물을 흡수 감도 0.050으로 280nm에서 모니터링하였다.

샘플 제조

원심분리(3,000rpm에서 10분) 후에, 적합하게 희석시킨 투명한 상등액의 50㎕ 분취액을 HPLC 시스템 속에 주입하였다.

정량화

미조리빈의 원액을 물 속에서 농도 100㎍/㎖으로 제조하였다. 미조리빈 표준 용액을 사용하여, 배양액의 샘플을 25 내지 100㎍/㎖ 범위의 농도로 시험하였다.

임의로 건조시킨 다음 동일한 용매 또는 용매의 혼합물(예: 부탄올/아세트산/물)에 재현탁시킨 유기상을 농축시킨 후에, 미조리빈을 함유하는 조악한 침전물을 수득하였다.

발효시킨 후에, 당해 조악한 생성물의 정제는, 예를 들면, 용출액으로서 물과 유기 용매(예: 아세톤, 아세트산, 메탄올, 부탄올, 클로로포름)의 혼합물을 사용하는 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 1

균주 증식

에우페니실륨 자바니쿰 균주를 하기 조성을 갖는 사면 한천(MEA: 맥아 추출물 한천) 위에 공급하였다:

맥아 추출물[디프코(Difco) 제조] 20.0g/ℓ

펩톤[디프코 제조] 1.0g/ℓ

덱스트로스[로케트(Roquette) 제조] 20.0g/ℓ

한천[디프코 제조] 20.0g/ℓ

증류수 1000㎖

당해 사면 배지를 26℃에서 15 내지 18일 동안 항온처리하였다.

증류수 5㎖를 사용하여 표면을 스크랩핑시켜 약 1/3의 증식물을 제거하여, 포자 현탁액을 수득하였다.

예비 배양

상기한 바와 같이 균주 증식물로부터 생성시킨 현탁액을 예비 배양물로서 진탕 플라스크 속에 접종하였다.

진탕 플라스크내의 배양물은 하기 조성을 가졌다:

카제인의 효소 가수분해물[디프코 제조] 3g/ℓ

옥수수 침지액[로케트 제조] 1g/ℓ

덱스트로스[로케트 제조] 20g/ℓ

증류수 1000㎖

살균을 121℃에서 20분 동안 수행하였다.

배플을 2개 갖고 상기한 배지 100㎖를 함유하는 500㎖ 플라스크들 속에 배지를 분배시켰다. 플라스크들을 250rpm의 회전 진탕기 상에서 26℃에서 24시간 동안 항온처리하였다.

배플을 3개 갖고 상기한 배지 750㎖를 함유하는 2ℓ플라스크에 제1 예비 배양물을 2%에 상당하는 양을 접종하여, 제2 예비 배양을 수행하였다.

당해 플라스크를 200rpm의 회전 진탕기 상에서 26℃에서 약 48시간 동안 항온처리하였다.

발효

제2 예비 배양물 약 2%를 사용하여, 하기 조성을 갖는 영양 배지 15ℓ를 함유하는 발효조(jar fermenter)에 접종하였다:

황산암모늄[머크(Merck) 제조] 10g/ℓ

질산암모늄[머크 제조] 10g/ℓ

1염기성 인산칼륨[머크 제조] 2g/ℓ

황산마그네슘 7수화물[머크 제조] 0.2g/ℓ

옥수수 침지액[로케트 제조] 20g/ℓ

덱스트로스[로케트 제조] 50g/ℓ

수돗물 1000㎖

발효물을 600rpm에서의 교반하에 1v/v/min으로 에어레이션시키는 호기성 조건에서 26 내지 28℃에서 96시간 동안 수행하였다.

미조리빈의 생산을 HPLC에 의해 배양액 여액 상에서 간격을 두고 시험하였다.

600 내지 700mcg/㎖에 상당하는 최고의 효능이 4 내지 5일 후에 기록되었다.

실시예 2

균주 증식

에우페니실륨 자바니쿰 균주를 하기 조성을 갖는 사면 한천 위에 공급하였다:

맥아 추출물[디프코 제조] 20.0g/ℓ

1염기성 인산칼륨 1.0g/ℓ

덱스트로스[로케트 제조] 20.0g/ℓ

황산마그네슘 7수화물[머크 제조] 0.2g/ℓ

옥수수 침지액[로케트 제조] 20.0g/ℓ

한천[디프코 제조] 20.0g/ℓ

증류수 1000㎖

상기 사면 배지를 26℃에서 15 내지 20일 동안 항온처리하였다.

예비 배양

상기한 바와 같이 균주 증식물로부터 생성시킨 현탁액을 예비 배양물로서 하기 조성을 갖는 영양 배지를 함유하는 진탕 플라스크 속에 접종하였다:

카제인의 효소 가수분해물 2g/ℓ

콩 펩톤 5g/ℓ

덱스트로스 10g/ℓ

증류수 1000㎖

살균을 121℃에서 20분 동안 수행하였다.

배플을 2개 갖고 상기한 배지 100㎖를 함유하는 500㎖ 플라스크 속에 배지를 분배시켰다.

플라스크를 250rpm의 회전 진탕기 상에서 26℃에서 약 40시간 동안 항온처리하였다.
실시예 1에서와 같이, 제2 예비 배양물을 제조하고 항온처리하였다.

제2 예비 배양물을 제조하여 실시예 1과 같이 배양한다.

증식 후에, 예비 배양물을 하기 조성을 갖는 영양 배지를 함유하는 15ℓ발효기에 접종하였다:

황산암모늄 5g/ℓ

1염기성 인산칼륨 2g/ℓ

황산마그네슘 7수화물 0.2g/ℓ

대두 펩톤 20g/ℓ

수돗물 1000㎖

당해 발효액을 실시예 1에서와 동일한 조건으로 항온처리하였으며, HPLC에 의해 시험된 미조리빈의 생산은, 4일 후에 750 내지 800mcg/㎖의 효능을 나타내었다.

상기 발효액을 실시예 1에서와 동일한 조건으로 배양하며, HPLC에 의해 시험된 미조리빈의 생산은 4일 후에 750 내지 800mcg/ml의 효능을 나타낸다.

실시예 3

pH가 5.6이고 미조리빈을 700mcg/㎖ 함유하는 배양액(실시예 1에서 생성됨) 50ℓ를 와트만지(Wathman^®paper) 상에서 여과시켜, 투명한 여액 40ℓ를 수득하였다.

당해 여액을 XAD 1180[롬 앤드 하스(ROHM & HAAS) 제조] 수지 8ℓ를 사용하는 칼럼(ø12cm)을 유속 330㎖/min으로 통과시켜 배양액을 탈색시킨 다음, 420nm에서의 흡광도를 판독하였다. 이어서, 수지를 상기한 바와 동일한 유속의 물 20ℓ로 세척하였다.

생성된 탈색 액체(pH = 5.8) 60ℓ에 20% NaOH를 첨가하여, pH를 9.0으로 조정하였다.

당해 액체를 30ℓ렐라이트 2AS(Relite 2AS)[레진디온 에스.알.엘.(RESINDION S.R.L.) 제조](OH^- 형태) 칼럼(ø20cm)을 유속 500㎖/min으로 통과시켜 미조리빈을 흡수시킨다.

당해 수지를 탈염수 120ℓ로 세척한 다음, 2% 아세트산으로 용출시켜 10ℓ분획을 수집하였다.

HPLC로 시험한 활성 분획을 수집하고 진공하에 농축시켜 유성 잔사 220g을 수득하였다.

당해 잔사를 메탄올 400㎖ 및 아세톤 1ℓ와 혼합하고 침전시킨 다음, 4℃에서 5시간 동안 정치시켰다. 당해 침전물을 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켜 조악한 미조리빈(순도: 15%) 150g을 수득하였다. 수득된 분말을 부탄올:아세트산:물(10:1:2)의 용매 혼합물에 현탁시키고, 동일한 용매 혼합물로 패킹된 실리카겔 60(Silicagel 60) 칼럼(ø7cm)에서 정제하였다.

분획 500㎖를 수집하고, 이 중 가장 풍부한 분획을 유성 잔사(순도: 44%) 33g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨 다음, 메탄올 30㎖에 재현탁시키고 아세톤 90㎖로 침전시켰다.

당해 침전물을 진공하에 아세톤으로 세척하여 회색 분말 28g을 수득하고, 이를 메탄올에 현탁시키고, 클로로포름:메탄올:아세트산(30:1:1)의 용매 혼합물로 패킹된 1ℓ실리카겔 60 칼럼(ø4cm)에 충전시켜, 1:7:7의 혼합물이 수득될 때까지 구배 용출시켰다. 분획 500㎖를 수집하고, 이 중 가장 풍부한 분획을 진공하에 농축시켜 유성 잔사(순도: 85%) 14.5g을 수득한 다음, 동일한 용적의 아세톤을 가하고 진공하에 밤새 정치시켰다.

무색 미조리빈 결정(11g)을 수득하였다.

무색 미조리빈 결정(11g)을 수득한다.

실시예 4

미조리빈을 700mcg/㎖ 함유하는 배양액(실시예 1에서 생성됨)(pH = 5.6) 50ℓ를 디칼라이트(Dicalite)[디칼라이트 오이로페 에스우데(DICALITE EUROPE SUD) 제조] 상에서 진공하에 여과하였다.

투명한 여액 40ℓ에 20% H₂SO₄를 첨가하여 당해 여액의 pH를 4.5로 조정하고, pH 4.5의 0.05M 아세트산염 완충액 20ℓ로 패킹된 5ℓCM 세파로즈 페스트 플로우(CM SEPHAROSE FAST FLOW) 칼럼(ø12cm)을 통과시켰다.

당해 여액을 유속 83㎖/min에서 흡수시킨 다음, 0.05M 아세트산염 완충액(pH = 4.5) 5ℓ로 세척하고, 0.05M 아세트산염 완충액(pH = 4.5) 25ℓ를 추가의 0.05M 아세트산염 완충액(pH = 4.5) 25ℓ및 0.5M NaCl과 혼합하면서 구배 용출시켰다.

분획 1ℓ를 수집하고, 이 중 가장 풍부한 분획을 진공하에 농축시켜 회색 분말(순도: 55%) 45g을 수득하였다.

메탄올에 현탁된 분말을 클로로포름/메탄올/아세트산(1:7:7)의 용매 혼합물로 패킹된 1ℓ실리카겔 60 칼럼(ø4cm) 상에서 정제하였다.

분획 500㎖를 수집하고, 이 중 가장 풍부한 분획을 미조리빈의 무색 결정(순도: 97%)이 수득될 때까지 진공하에 농축시켰다.

500ml 분획을 수집하여, 가장 풍부한 분획을 미조리빈의 무색 결정(순도: 97%) 18g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨다.

실시예 5

미조리빈을 700mcg/㎖ 함유하는 배양액(실시예 1에서 생성됨)(pH = 5.6) 50ℓ를 디칼라이트[디칼라이트 오이로페 에스우데 제조] 상에서 진공하에 여과하였다.

또한, 투명한 여액 40ℓ를 설폰산 폴리에테르 막을 통한 한외여과로 정제하였다. 당해 액체에 20% NaOH를 첨가하여, pH를 9.0으로 조정하였다.

당해 액체를 유속 500㎖/min으로 30ℓ렐라이트(레진디온 에스.알.엘. 제조)를 통과시켜 미조리빈을 흡수시켰다.

당해 수지를 탈염수 120ℓ로 세척한 다음, 2% 아세트산으로 용출시켜 분획 10ℓ를 수집하였다.

HPLC로 시험한 활성 분획을 수집하고 진공하에 농축시켜, 오일 150g을 수득하였다.

당해 잔사를 메탄올 150㎖ 및 아세톤 300㎖와 혼합하고 침전시킨 다음, 4℃에서 5시간 동안 정치시켜 침전시켰다. 당해 침전물을 아세톤으로 세척하고 진공하에 건조시켜 조악한 미조리빈(순도: 20%) 150g을 수득하였다. 수득된 분말을 부탄올:아세트산:물(10:1:2)의 용매 혼합물에 현탁시키고 동일한 용매 혼합물로 패킹된 실리카겔 60 칼럼(ø7cm) 내에서 정제하였다.

분획 500㎖를 수집하고, 이 중 가장 풍부한 분획을 유성 잔사(순도: 55%) 30g이 수득될 때까지 진공하에 농축시킨 다음, 메탄올 10㎖에 재현탁시키고, 마지막으로 아세톤 30㎖로 침전시켰다.

당해 침전물을 진공하에서 아세톤으로 세척한 다음, 진공하에 밤새 정치시켰다.

무색 미조리빈 결정(13g)을 수득하였다.

본 발명에 따라, 에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에서의 발효를 동화 가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행하여, 미조리빈을 제조할 수 있다.

본 발명에 따라, 에우페니실륨 자바니쿰 균주의 존재하에서 발효를 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함으로써, 미조리빈을 발효에 의해 제조할 수 있다.

Claims

에우페니실륨 자바니쿰(Eupenicillium javanicum) 균주의 존재하에서의 발효를 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 액체 배지에서 호기성 조건하에 수행함을 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제1항에 있어서, 균주를 예비 배양하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 23 내지 33℃의 온도에서 3 내지 7일의 기간 동안 수행하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제3항에 있어서, 25 내지 29℃의 온도에서 4 내지 6일의 기간 동안 수행하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 부가된 광물염의 존재하에 발효를 수행하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제3항에 있어서, 부가된 광물염의 존재하에 발효를 수행하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제4항에 있어서, 부가된 광물염의 존재하에 발효를 수행하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제3항에 있어서, 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제4항에 있어서, 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.
제5항에 있어서, 미조리빈의 정제 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 포함하는, 미조리빈의 제조를 위한 발효방법.