JP3176672B2

JP3176672B2 - 抗ウイルス活性を有する新規なグルタールイミド系抗生物質およびその製造方法

Info

Publication number: JP3176672B2
Application number: JP34033991A
Authority: JP
Inventors: 田勝上; 戸裕城; 木基青; 島久仁子中; 野洋一郎城
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1991-11-28
Filing date: 1991-11-28
Publication date: 2001-06-18
Anticipated expiration: 2016-06-18
Also published as: JPH05148230A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規抗ウイルス性物質Ａ
Ｈ-１３５Ｙ、その製造方法並びにそれを有効成分とす
る抗ウイルス剤に関する。本発明の物質ＡＨ-１３５Ｙ
は、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属する抗ウイ
ルス性物質ＡＨ-１３５Ｙ生産菌を培養して、その培養
物中から分離採取される文献未記載の抗ウイルス作用を
有する新規抗生物質である。

【０００２】

【発明の背景並びに発明が解決しようとする問題点】本
発明者は、新規な抗ウイルス剤の検索を目的として、広
く微生物の培養物を検討した結果、ストレプトミセス(S
treptomyces)属に属する微生物ストレプトミセス・アル
ボビナセウス・ＡＨ-１３５株(Streptomyces albovinace
us No.ＡＨ-１３５)の培養物中に、強い抗ウイルス活性
を有する新規なグルタールイミド系抗生物質(Antiherpe
s-135Y、以下ＡＨ-１３５Ｙと称する。)が産生、蓄積さ
れることの知見を得、その単離・精製に成功した。本発
明は、この知見に基づいて完成されたものである。

【０００３】

【発明の構成】

＜使用する微生物＞本発明で使用される微生物は、スト
レプトミセス属に属し、新規グルタールイミド系抗ウイ
ルス性活性を有する抗生物質(ＡＨ-１３５Ｙ)生産能を
有する放線菌である。

【０００４】例えば、ストレプトミセス・アルボビナセ
ウス・ＡＨ-１３５株 (Streptomycesalbovinaceus No.Ａ
Ｈ-１３５)(以下"ＡＨ-１３５株")と呼称される微生物
は上記の特性を有し、本発明の抗ウイルス性活性を有す
る抗生物質ＡＨ-１３５Ｙを有利に生産するものであ
り、本発明の方法に有効に利用し得るものである。

【０００５】また、上記ＡＨ-１３５株の自然的及び人
工的変異株はもちろん、ストレプトミセス属に属する菌
種で後述の抗生物質ＡＨ-１３５Ｙの生産能を有する微
生物はすべて本発明の方法において使用することができ
る。

【０００６】上記ＡＨ-１３５株は、本発明者により鹿
児島県熊毛郡屋久町で採取された土壌中より発見された
土壌放線菌であり、工業技術院微生物工業技術研究所に
平成３年11月13日付けで寄託され、その微生物受託番号
は、微工研菌寄第１２６０３号(ＦＥＲＭＰ-１２６０
３)である。

【０００７】ＡＨ-１３５株は、以下の菌学的性質を有
する。

【０００８】(I) 形態イースト・マルツエキス寒天培地上に発育したＡＨ-１３
５株を光学及び電子顕微鏡により観察した。これによる
と、成熟気菌糸は直鎖状ないし波状(Rectus-flexibile
s)で、連なった胞子の数は長いものは50〜60個である。
胞子表面は平滑(smooth)であり、本菌株には遊走子、胞
子嚢、菌核は観察されなかった。

【０００９】本菌株を菌体成分分析用液体培地(ブレイ
ン・ハート・インフュージョン・ブイヨン培地)で培養し、
菌体を分離し、これを６規定塩酸中で105℃、18時間加
水分解した。この加水分解物をジアミノピペリン酸分析
用のペーパークロマトグラフィーにかけて各成分の分析
をしたところ、LL型ジアミノピペリン酸のみを検出し
た。また、アミノ酸の薄層クロマトグラフィーではグリ
シンを検出した。

【００１０】(II) 各種培地中における生育状態(28℃、
３週間培養) 1. ツアペック寒天培地生育: 普通気菌糸の着生: 普通可溶性色素: わずかに黄味を帯びる 2. グリセロール・ツアペック寒天培地生育: 良好気菌糸の着生: 豊富可溶性色素: 褐色 3. グルコース・アスパラギン寒天培地生育: 不良気菌糸の着生: 乏しい可溶性色素: なし 4. グリセロール・アスパラギン寒天培地生育: 良好気菌糸の着生: 豊富可溶性色素: 淡緑褐色 5. 栄養寒天培地生育: 不良気菌糸の着生: なし可溶性色素: なし 6. スターチ無機塩寒天培地生育: 良好気菌糸の着生: 豊富可溶性色素: 淡橙色 7. 酵母エキス寒天培地生育: 良好気菌糸の着生: 豊富気菌糸の色: 白色可溶性色素: 褐色

【００１１】(III) 炭素源の資化性(プリーダム・ゴット
リーブ寒天培地、28℃培養) 1. D-グルコース＋＋ 2. L-アラビノース＋＋ 3. シュクロース＋ 4. D-キシロース＋＋ 5. L-イノシトール − 6. D-マンニトール＋＋ 7. D-フラクトース＋＋ 8. ラムノース − 9. ラフィノース＋ 10. ガラクトース＋ 11. サリシン＋ 12. スターチ＋ 13. セルロース ±

【００１２】(IV) その他の生理的性質 (28℃培養) 1. ゼラチンの液化 (ブイヨン・ゲラチン培地) 液化しない。 2. 硝酸塩の還元性グリースの試薬添加で赤変し、硝酸塩を還元して亜硝酸
にする。 3. スターチの加水分解 (スターチ・無機塩寒天培地) 加水分解する。 4. 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化ペプトン化するが凝固しない。 5. メラニン色素の形成チロシン寒天培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培地で典
型的な黒色のメラニン色素の生成は認められない。 6. 生育温度 12℃〜37℃ 最適温度: 28℃

【００１３】上記のような諸特徴、特に細胞壁成分中に
LL型ジアミノピペリン酸を有すること、及びアミノ酸と
してグリシンが検出されることから、典型的なストレプ
トミセス属に属し、シュークロース、ラムノース及びラ
フィノースに対する資化性の挙動が異なるが、概ねスト
レプトミセス・アルボビナセウス(Streptomyces albo-vi
naceus)に属する菌株と同定し、ストレプトミセス・アル
ボビナセウス・ＡＨ-１３５株と命名する。

【００１４】＜培養及び単離・精製＞本発明を実施する
に当たっては、ストレプトミセス属に属するＡＨ-１３
５Ｙ生産菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養す
ることができる。培養の形態は、液体培養でも固体培養
でもよく、工業的に有利に培養するためには、上記生産
菌の胞子懸濁液または培養液を培地に接種し、振盪培
養、通気撹拌培養等好気的条件下に培養が行なわれる。

【００１５】培地の栄養源としては特に限定されること
なく、即ち、ＡＨ-１３５Ｙ生産菌が資化しうる炭素
源、窒素源及び無機塩、更に必要ならば微量栄養素を含
有するものであればよい。

【００１６】炭素源としては、例えばグルコース、フラ
クトース、マルトース、スターチ、デキストリン、澱粉
加水分解物、廃糖蜜等の炭水化物、コハク酸、フマール
酸、酢酸等の有機酸類及びグリセリン等のアルコール類
が用いられる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、尿素、アンモニ
ア水、アンモニアガス、アミノ酸類、さらにペプトン、
大豆ホエー、大豆粉及びそれらの加水分解物の蛋白質、
米糠類が用いられる。その他、無機塩としては、例えば
マグネシウム塩、リン酸塩が適宣用いられ、また、有機
微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン及びこれらを含
有するペプトン、酵母エキス等が適宣用いられる。ま
た、消泡剤としての動、植、鉱物油等を添加してもよ
い。

【００１７】培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌
の発育に適し、しかも物質ＡＨ-１３５Ｙの生産が最
高となるような条件が選ばれる。例えば、培地のｐＨは
６.０〜８.０が、培養の適温は２０℃〜３０℃程度が望
ましい。また、培養時間は通常４８〜９６時間程度が好
適であり、回転振盪培養、通気攪拌培養等好気的条件下
に行なわれる。

【００１８】しかし、これらの培養組成物、培地の液
性、培養温度、攪拌条件などの培養条件は使用する菌株
の種類や外部の条件等に応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節選択されるべきであることは申すまでも
ない。

【００１９】このようにして得られる培養物から、ＡＨ
-１３５Ｙ物質を得るには、代謝産物を採取するのに通
常用いられる手段が適宜に使用される。例えば、本発明
の物質ＡＨ-１３５Ｙと不純物質との溶解度差を利用す
る手段、吸着親和力の差を利用する手段、イオン結合力
の差を利用する手段、有機溶剤との間の分配の差を利用
する手段のいずれも、それぞれ単独で、または、適宜組
み合わせて、あるいは反復して利用される。

【００２０】本発明のＡＨ-１３５Ｙは、該化合物生産
菌の培養液中及び菌体内に存在するが、大部分は培養液
中に存在する。ＡＨ-１３５Ｙを培養液より単離するに
は、例えばクロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒によ
る抽出、イオン交換、吸着、分配、ゲル濾過等のクロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィーを適宣組み
合わせて行なう。例えば、菌体を除去して得られる培養
濾液を多孔性カラムを用いて吸着クロマトを行ない、含
水メタノール等の有機溶媒で抽出し、濃縮後、酸性下に
酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、再度、多孔性カラム
を用いて吸着クロマトを行ない、含水メタノール等で溶
出する。要すれば、再度吸着クロマトを行なうことによ
り、有効に脱色することができる。

【００２１】分離精製されたＡＨ-１３５Ｙは、溶媒を
除去することにより白色粉末として得られる。また、該
化合物濃縮液をアセトン、エーテル存在下に放置して柱
状結晶として得ることもできる。

【００２２】前述の方法で得られた新規なグルタールイ
ミド系抗ウイルス性物質、ＡＨ-１３５Ｙは下記の特徴
を有し、以下に示す放線菌の生産する公知の当該抗生物
質とはその構造を異にしているので、明確に区別するこ
とができる。１. イナクトン (Inacton) 文献 R.Paul, S.Tchelitcheff:Bull.Soc.Chim. France
1316(1955) ２. アクチフェノール (Actiphenol) 文献 R.J.Highet,V.Prelog:Helv.Chim.Acta 42,1523(19
59) ３. アクチケタール (Actiketal) 文献 T.Sonoda,H.Osada,J.Uzawa,K.Isono:J.Antibiot.
44(2),160(1991) ４. ノン・カン１０１-Ｇ (Nong-Kang 101-G) 文献 J-C.Hua,Y-Y.Xie:Hua Hsueh Hsueh Pao 38(3),275
(1980)(Chinese) ５. エピデルスタチン (Epiderstatin) 文献 T.Sonoda,H.Osaka,M.Uramoto,J.Uzawa,K.Isono:J.
Antibiot. 42(11)1607(1989)

【００２３】以下に、本発明のＡＨ-１３５Ｙの理化学
的性質を示す。元素分析: Ｃ:61.81％、Ｈ:5.98％、Ｎ:4.79％、
Ｏ:27.42％分子量: ２９１分子式: Ｃ₁₅Ｈ₁₇ＮＯ₅ 融点: ２１０〜２３０℃ (分解) 紫外線吸収スペクトル(メタノール中):図１のとおり λmax nm(Ｅ_1%,1cm) = 218(634.8) = 259.5(311.5) = 342.5(138.4) 赤外線吸収スペクトル(臭化カリウム法):図２のとおり 3510, 1715, 1660, 1270cm^-1 プロトン核磁気共鳴スペクトル(重ジメチルスルホキシ
ド中):図３のとおり 2.29, 2.39, 2.62, 3.19, 4.51, 5.17,7.49, 7.65,10.7
7, 12.2 (ppm)¹³ Ｃ核磁気共鳴スペクトル(重ジメチルスルホキシド中)
図４のとおり 20.1, 25.9, 36.9, 42.3, 57.1, 118.1, 127.2, 128.3,
130.6, 134.8, 156.2, 172.8, 205.3 (ppm) 溶剤に対する溶解性: 可溶: メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エ
チル、ジメチルスルホキシド難溶: ベンゼン、エーテル、ヘキサン、クロロホル
ム、水呈色反応:アルコール性塩化第２鉄溶液で濃緑色を呈す
る。(Phenol環) 薄層クロマトグラフィー:キーゼル・ゲル６０Ｆ₂₅₄(メル
ク社製)、検出は紫外線照射またはヨウ素発色によっ
た。下記の条件下において単一のスポットを与える。 1. クロロホルム：アセトン(３：１) Ｒｆ=０.３８ 2. ヘキサン：酢酸エチル：メタノール：酢酸(１０：
５：０.５；０.１)Ｒｆ=０.０８５物質の色:白色粉末抗菌活性:ＡＨ-１３５Ｙの各種微生物に対する最小生育
阻止濃度を第１表に示す。抗ウイルス活性:ＡＨ-１３５Ｙは、当該抗生物質群でこ
れまで余り指摘されていない作用、すなわち強力、且つ
広範な抗ウイルス活性を有している。抗ウイルス活性と
しては、単純ヘルペスウイルスおよびインフルエンザウ
イルスに対して抗ウイルス効果を示す(第２表)。

【００２４】ＡＨ-１３５Ｙは前記した如き理化学的性
状を有する新規物質であり、第１表中のグラム陽性菌及
び陰性菌には無効で、わずかにサッカロミセス・セレビ
シエの酵母に有効であり抗真菌活性を示すのみであっ
た。しかしながら、驚くべきことに優れた抗ウイルス活
性を示した(第２表参照)。

【００２５】

【００２６】

【００２７】以下、本発明を具体的な実施例及び試験例
によって詳述するが、本発明はこれらに何ら限定される
ものではない。。

【００２８】

【実施例】実施例１水１lにつき、グルコース２０ｇ、スターチ３０ｇ、ペ
プトン５ｇ、コーン・スティープ・リカー１０ｇ、大豆粉
１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、炭酸カルシウム５ｇを含
有する培養基をｐＨ７.０に調整後、２００mlエルレン
マイヤーフラスコ８本に、夫々５０ml分注し、１２０℃
で１５分間殺菌した。この培地にストレプトミセス・ア
ルボビナセウス・ＡＨ-１３５株の斜面培地より、夫々１
白金耳を接種し、２８℃、４８時間振盪培養(１８０回
／分)を行なった。

【００２９】この前培養液４００mlを上記の培地５.０l
の入った１０l容ガラス製ジャーファーメンター２バッ
チに移し、２８℃で毎分４lの無菌空気を送り、４００
回転の撹拌で本培養を行なった。９６時間で培養をや
め、培養液(培養液のｐＨはほぼ中性)を遠心分離により
菌体を除去し、上清７.２lを得た。この上清液の１,８
００倍希釈液は、プラーク形成を５０％減少させた。

【００３０】この上清液７.２lを２規定塩酸を用いてｐ
Ｈ３〜４に調整した後、４.８lの酢酸エチルにて抽出を
行なう。酢酸エチル層を減圧にて濃縮し、完全に酢酸エ
チルを除去後、２００mlになるように水を加えこれを予
め、水で十分に洗浄したＤｉａｉｏｎＨＰ−１０(三菱
化成製)の３.２cm×２５cmのカラムに注ぎ、カラムを１
lの水で洗浄後、２０％、４０％、６０％、８０％メタ
ノール各々５００mlで段階溶出を行ない、活性分画であ
る４０％、６０％、８０％メタノール溶出液６００mlを
減圧にて濃縮し、メタノールを完全に除去し、水を加え
て４００mlとした。

【００３１】この活性画分を予め水で十分に洗浄したＤ
ｉａｉｏｎＨＰ−１０(三菱化成製)の１.８cm×１６cm
のカラムに注ぎ２００mlの水で洗浄し、４０％、６０
％、８０％メタノール各々２００mlで溶出し、活性画分
を減圧にて濃縮する。この操作をＨＰＬＣによる純度が
５０〜６０％になるまで繰り返し行なう。Ｄｉａｉｏｎ
ＨＰ-１０(三菱化成製)カラムクロマトグラフィーによ
って５０mlの活性画分が得られ、この溶液の３３,００
０倍希釈液は、プラーク形成を５０％減少させた。

【００３２】この活性画分を減圧乾固後、５０mlのメタ
ノールに溶解させ、メタノールで洗浄した少量のＤｉａ
ｉｏｎＨＰ-２０ｓｓ(三菱化成製)を加え、３００mlの
ナス型フラスコを用いて減圧乾固し、微黄色の粉末を得
た。この粉末を水で十分に洗浄したＤｉａｉｏｎＨＰ-
２０ｓｓ(三菱化成製)の１.８cm×１８cmのカラムに重
層し、２００mlの水、２００mlの４０％メタノールで洗
浄後、６０％メタノールで溶出を行ない１００mlの活性
画分を得た。この操作を色素が消失するまで繰り返し行
ない、ＨＰＬＣによる純度が９５％以上の活性画分５０
mlが得られ、この溶液の３０,０００倍希釈は、プラー
ク形成を５０％減少させた。

【００３３】この溶液を減圧にて濃縮乾固後、極少量の
メタノールを加え、溶解させ、少量のアセトンを加え白
濁したところでエーテルを加えることにより、白色沈澱
を得た。デカンテーションによって有機溶媒を除去後、
減圧下にて乾固させ、１時間以上減圧下にてデシケータ
ー中に放置し、約２０mgの白色粉末を得た。

【００３４】試験例１精製した標品を用いて、抗ウイルス活性を測定した。精
製標品を１mg/mlの濃度でイーグルＭＥＭ培地に懸濁
し、同じ培地を用いて段階希釈した液を、２００ＰＦＵ
の単純ヘルペスウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞に加
えた。同様に２００ＰＦＵのインフルエンザウイルスを
感染させたＭＤＣＫ細胞を段階希釈した標品を含む培地
で培養した。感染３日後にプラーク数を計測し、標品液
を加えない対照のプラーク数と比較した。対照として単
純ヘルペスの場合にはアシクロビールを、インフルエン
ザウイルスの場合にはアマンタジンを用いた。

【００３５】

【図面の簡単な説明】

図１はＡＨ-１３５Ｙのメタノール及び酸性メタノール
溶液中での紫外部吸収スペクトルを示し、縦軸に吸光
度、横軸に波長(nm)を示す。図２はＡＨ-１３５Ｙを臭
化カリウムに混ぜて測定した赤外線吸収スペクトルを示
す。縦軸に透過率(％)、横軸に波長(cm^-1)を示す。図３
はＡＨ-１３５Ｙの重ジメチルスルホキシド溶液中での
水素核(¹Ｈ)の核磁気共鳴スペクトルを示し、縦軸にピ
ーク強度、横軸に化学シフト(ppm)を示す。図４はＡＨ-
１３５Ｙの炭素核(¹³Ｃ)の核磁気共鳴スペクトルを示
し、縦軸にピーク強度、横軸に化学シフト(ppm)を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献特開昭52−83571（ＪＰ，Ａ) 特公昭38−4064（ＪＰ，Ｂ１) 上田勝、外３名，“放線菌の産生する新規抗ウイルス剤について”，平成３年度日本薬学会九州支部大会講演要旨集，社団法人日本薬学会九州支部, 平成３年11月３日 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 211/88 A61K 31/45 A61P 31/12 C12P 17/12 C12R 1:465 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の化学的性状を有し、式(Ｉ)で表され
る抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５Ｙ。【化１】元素分析: Ｃ:61.81％、Ｈ:5.98％、Ｎ:4.79％、
Ｏ:27.42％分子量: ２９１分子式: Ｃ₁₅Ｈ₁₇ＮＯ₅ 融点: ２１０〜２３０℃ (分解) 紫外線吸収スペクトル(メタノール中): λmax nm(Ｅ_1%,1cm) = 218(634.8) = 259.5(311.5) = 342.5(138.4) 赤外線吸収スペクトル(臭化カリウム法): 3510, 1715, 1660, 1270 cm^-1 プロトン核磁気共鳴スペクトル(重ジメチルスルホキシ
ド中):ppm 2.29, 2.39, 2.62, 3.19, 4.51, 5.17,7.49, 7.65,10.7
7, 12.2¹³ Ｃ核磁気共鳴スペクトル(重ジメチルスルホキシド
中):ppm 20.1, 25.9, 36.9, 42.3, 57.1, 118.1, 127.2, 128.3,
130.6, 134.8, 156.2, 172.8, 205.3 溶剤に対する溶解性: 可溶: メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エ
チル、ジメチルスルホキシド難溶: ベンゼン、エーテル、ヘキサン、クロロホル
ム、水呈色反応:アルコール性塩化第２鉄溶液で濃緑色を呈す
る。(Phenol環) 薄層クロマトグラフィー:キーゼル・ゲル６０Ｆ₂₅₄(メル
ク社製)、検出は紫外線照射またはヨウ素発色によっ
た。下記の条件下において単一のスポットを与える。 1.クロロホルム：アセトン(３：１) Ｒｆ=０.３８ 2.ヘキサン：酢酸エチル：メタノール：酢酸(１０：
５：０.５；０.１)Ｒｆ=０.０８５物質の色:白色粉末
【請求項２】ストレプトミセス(Streptomyces)属に属
する抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５Ｙ生産菌を培養し、
その培養物中に抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５Ｙを生産
蓄積させ、該培養物から抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５
Ｙを分離採取することを特徴とする抗ウイルス性物質Ａ
Ｈ-１３５Ｙの製造方法。
【請求項３】抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５Ｙ生産菌
がストレプトミセス・アルボビナセウス・ＡＨ-１３５株
(Streptomyces albovinaceus No.ＡＨ-１３５)である請
求項２に記載の製造方法。
【請求項４】抗ウイルス性物質ＡＨ-１３５Ｙを有効
成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。