CN108567912A - 一种中药提取物及其酶解和发酵产物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精提取得到的中药提取物。还涉及对该中药提取物采用生物酶解技术和发酵技术制备得到的酶解产物和发酵产物。本发明还涉及包含所述中药提取物、所述酶解产物和/或所述发酵产物的皮肤外用剂。

Description

一种中药提取物及其酶解和发酵产物
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域，具体涉及一种具有保湿、抗衰老、美白功效的中药提取物及其酶解和发酵产物在皮肤外用剂中的应用。
背景技术
中医药是中华民族的瑰宝，数千年来为中华民族的繁荣昌盛做出了不可磨灭的贡献，并越来越受到世界人民的关注和重视。但由于传统中医药理论与现代科学理论脱节以及中药研究手段相对落后，很长一段时间，使中药资源的开发受到较大的影响和限制。中草药的开发利用目前主要聚焦在从现有中药中寻找有效成分，并与现在科技结合开发各种提取的手段如超声波提取、超临界萃取、膜萃取技术等。而以现有中药资源为基础，将传统中药的优势与现代生物技术相结合提升中药的开发潜力，目前尚未引起人们的广泛重视。
生物发酵技术和酶解技术是现代生物科学研究的两大重点领域。自古以来，人类就开始使用微生物以及酶的作用对天然的产物进行加工，比如，希腊的酸奶、日本的纳豆、法国的红酒、中国的红茶等。现代的生物发酵技术和酶解技术，主要是通过对微生物的改造或者酶的作用使物质得到充分分解、转化，得到生物工程所需要的特定的化合物，如抗生素类、胰岛素、疫苗、氨基酸等。同时，在微生物的代谢过程中，会产生许多原本天然物中不含有的物质。生物技术的应用已经涉及到人们日常生产、生活的方方面面。在化妆品中，韩国、日本的护肤品界十分流行发酵护肤品，其中最出名的就是日本的SK-II，但是它还是停留在较传统的发酵阶段。
中医理论体系与分子生物学虽然属于两种不同的思想体系，但研究生命活动的物质基础是一致的，是人类关于生命与健康在不同程度上的认识和探索的产物。按中医药组方理论，将一些具有类似或协同作用的名贵中草药材组方按照君、臣、佐、使配伍体系，并与现代生物技术相结合，利用微生物和酶强大的分解转化能力，不仅可对培养基中中药的纤维、糖类和蛋白等物质加以利用，而且在代谢过程中可以对中药中的一些成分进行转化，从而提高中药活性成分在复合制剂中的比例及效价。因而产生具有多方面功效相生相长、同时降低单一药物不良作用和风险成分的复合体系，这也是本发明的主要方向。利用该手段，从分子水平研究中医理论及中医药，并将中医理论及现代中医药的新成果应用到现代生物学技术中去，对推动中医药在化妆品领域的发展和应用具有重要的意义。
本发明首次将生物酶解技术和发酵技术应用于中药提取物，得到了酶解产物和发酵产物甚至比中药提取物本身包含更多的活性成分，同时在美白、保湿和抗氧化方面表现出预料不到的有益效果。本发明中药组合物采用天然、珍贵的中药道地药材。
发明概述
一方面，本发明提供了一种中药提取物，所述提取物通过以下方法制备得到：
a)按照重量份数取人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精并混合；
b)溶剂煮沸提取，
c)醇沉，
d)收集滤液得到中药提取物。
在优选的实施方式中，本发明中药提取物的提取过程中人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精的重量份数比为2:1.75-2:1:0.5-1:0.3-0.4:0.3-0.5。
在更优选的实施方式中，本发明中药提取物的提取过程中人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精的重量份数比为6:6:3:3:1:1。
在优选的实施方式中，本发明所述中药提取物含有367-450ppm人参皂苷Rg1，0-9ppm人参皂苷Re，8-37ppm人参皂苷Rf，0-12ppm人参皂苷Rb1，8-15ppm人参皂苷Rc，13-24ppm人参皂苷Rg2，10-38ppm人参皂苷Rb2，7-18ppm人参皂苷Rd，0-2ppm人参皂苷F1，0-21ppm人参皂苷Rg5和32-82ppm人参皂苷Rg3。
另一方面，本发明提供了一种酶解产物，所述酶解产物通过以下方法制备得到：
a)将权利要求1所述的中药提取物用包含果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的复合酶进行酶解；
b)钝化处理，得到酶解产物。
在优选的实施方式中，酶解过程中采用的果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的重量比为2.3:1.2:0.8。
在优选的实施方式中，酶解过程中采用的中药提取物与复合酶的重量比为10:1至40:1。
在优选的实施方式中，本发明所述酶解产物含有0-72ppm人参皂苷Rg1，0-7ppm人参皂苷Re，0-22ppm人参皂苷Rf，0-27ppm人参皂苷Rb1，0-10ppm人参皂苷Rc，0-7ppm人参皂苷Rg2，121-488ppm人参皂苷Rb2，0-52ppm人参皂苷Rd，0-11ppm人参皂苷F1，0-31ppm人参皂苷F2，0-108ppm人参皂苷Rg5和59-279ppm人参皂苷Rg3。
另一方面，本发明提供了一种发酵产物，所述发酵产物通过以下方法制备得到：
将权利要求3所述的酶解产物与发酵菌一起培养进行发酵，得到发酵产物，其中，所述发酵菌选自：酿酒酵母、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、沙克乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌。
在优选的实施方式中，发酵的时间为72、120或168小时。
在优选的实施方式中，发酵过程采用的碳源是葡萄糖，氮源是胰蛋白胨。
在优选的实施方式中，发酵过程中所述酶解产物与发酵菌的重量比为1:1。
在优选的实施方式中，所述发酵菌选自保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌或沙克乳酸杆菌。
在优选的实施方式中，发酵时间为72小时，所得发酵产物包含286-322.6ppm人参皂苷Rg3。在优选的实施方式中，发酵时间为120小时，所得发酵产物包含286.8-344.9ppm人参皂苷Rg3、6.53mg/ml总多糖和60μg/ml总黄酮。在优选的实施方式中，发酵时间为168小时，所得发酵产物包含287.7-343.2ppm人参皂苷Rg3。
另一方面，本发明提供了本发明所述中药提取物或本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在具有抗氧化作用、美白作用、抗衰老作用和/或保湿作用的产品中的应用。
在优选的实施方式中，所述抗衰老作用为促进皮肤前胶原蛋白的合成。在优选的实施方式中，所述保湿作用为透明质酸受体(CD44)表达。
另一方面，本发明提供了一种包含本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物的皮肤外用剂，其特征在于，所述中药提取物、酶解产物、发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-20％(w/w)，优选的重量百分比为0.01％-20％，更优选的重量百分比为0.01％-10％(w/w)，最优选的重量百分比为0.1％-5％(w/w)。
发明内容
人参为阳焕活能量，滋补润泽；地黄为阴滋养肌底，阴阳调和，共养共生。灵芝，铁皮石斛位列中华九大仙草，养阴补益，相须为用，修复肌肤之功效。桂花和黄精，生津活血，活润肌肤表里，六位中药材互相配合，相生相长，互为助力，具有较好的协同增效性。迄今为止尚未发现针对这六味中药材进行复配的文献。因此，本发明首次将这六种中药材进行复配，提取得到的中药提取物应用于皮肤后意外地具有抗氧化、美白、抗衰老和/或保湿作用。
本发明中药复合物，经过萃取工艺、酶切工艺、低温发酵工艺等生物转化技术增强中药复合物的功效和提高活性成分含量，改善中药复合物的特殊气味和颜色，改善中药复合物的生物利用度，降低风险物质等，提供一种具有保湿、抗老和美白等功效作用又非常安全的中药发酵产物，可直接用于皮肤，也可作为功效添加剂加入到化妆品配方中使用，大幅提升化妆品应用的功效和安全性，且可以有效降低成本。
本发明中药组合物采用天然、珍贵的中药道地药材，其中含有中华9大仙草核心组分，彼此相辅相成，相生相长，协同增效，达到1+1远大于2的效果，研究显示采用的中药材具有帮助成纤维母细胞迁移与增殖、促进免疫系统健康、抑制多种炎症因子、抑制透明质酸酶和金属蛋白酶的表达、保护DNA不受外界损伤、促进细胞自噬、帮助调节人体节律平衡、延长端粒酶等功效，在美白、保湿、抗衰老、敏感性肌肤修复等方面均有较好的效果。
本发明所述中药提取物的制备过程如下：
按比例称取人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精，以适宜溶媒和方法进行提取。
本发明适宜的提取溶媒包括：水(包括蒸馏水、去离子水等)，不同浓度的乙醇溶液，不同浓度的多元醇溶液以及其他极性相似的溶剂。提取方法可以是浸提、煎煮、回流提取、渗漉等方法。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝20:20:10:5:3:3进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，加入乙醇进行醇沉，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝6:6:3:3:1:1进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，加入乙醇进行醇沉，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝40:35:20:20:8:10进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，加入乙醇进行醇沉，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，醇沉过程中采用的乙醇是体积浓度70％的乙醇。
在一些优选的实施方式中，煮沸提取过程长达1小时。
在一些优选的实施方式中，提取过程中中药原料与提取溶剂的重量比为1:12。
本发明所述酶解产物的制备过程如下：
称取本发明所述的中药提取物，加入复合酶进行酶解；
钝化处理后得到所需的酶解产物。
在优选的实施方式中，酶解过程保持pH 6.0。
在优选的实施方式中，酶解过程保持温度60℃。
在优选的实施方式中，酶解过程长达24小时。
在优选的实施方式中，在80℃下进行钝化处理。在优选的实施方式中，钝化处理持续30分钟。
在优选的实施方式中，酶解过程中采用重量比为2.3:1.2:0.8的果胶酶、纤维素酶和蛋白酶进行。
在优选的实施方式中，酶解过程中采用的中药提取物与复合酶的重量比为10:1至40:1。在更优选的实施方式中，酶解过程中采用的中药提取物与复合酶的重量比为20:1。
本发明所述发酵产物的制备过程如下：
将本发明所述酶解产物与发酵菌一起培养进行发酵，得到发酵产物。
在优选的实施方式中，发酵菌选自：酿酒酵母、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、沙克乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌。
在优选的实施方式中，发酵的时间为72、120或168小时。
在优选的实施方式中，发酵过程采用的碳源是葡萄糖，氮源是胰蛋白胨。
在优选的实施方式中，发酵过程中所述酶解产物与发酵菌的重量比为1:1。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在抗衰老方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在清除自由基方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在美白方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在抑制酪氨酸酶方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在保湿方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在促进皮肤前胶原蛋白的合成方面的应用。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物在促进透明质酸受体表达方面的应用。
本发明的中药提取物及其酶解和发酵产物可以作为功效添加剂加入到化妆品中使用，用于皮肤护理，实现保湿、抗衰老和美白的目的。因此，本发明提供了一种包含本发明所述中药提取物、本发明所述酶解产物或本发明所述发酵产物的皮肤外用剂。
在本发明的另一方面，提供了一种具有保湿、美白和/或抗衰老作用的皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含按照本发明方法制备得到的中药提取物和/或酶解产物和/或发酵产物以及皮肤外用剂领域可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种皮肤外用剂，该皮肤外用剂含有本发明所述中药提取物和/或酶解产物和/或发酵产物。在一个优选的实施方式中，所述中药提取物和/或酶解产物和/或发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.01％-20％。更优选的重量百分比为0.01％-10％(w/w)。最优选的重量百分比为0.1％-5％(w/w)。
所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。
所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。
所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。
当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。
所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。
本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。
通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。
本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。
本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。
颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。
珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。
填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。
本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。
可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
附图说明
图1显示了实施例2的中药提取物和实施例15的发酵产物对透明质酸受体表达的影响。其中，A代表阴性对照；B代表实施例2的中药提取物；C代表实施例15的发酵产物。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
1.实验材料
1.1所使用的溶剂：去离子水、乙醇、1,2己二醇、磷酸等溶剂为分析纯；
1.2发酵工艺使用的菌种包括但不限于：
酿酒酵母ATCC9080
保加利亚乳酸杆菌CGMCC 7133
短乳酸杆菌CGMCC 1.3257
沙克乳酸杆菌ATCC 15521
枯草芽孢杆菌CICC 24434
以上均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.3使用的酶切复合制剂
果胶酶，主要含有β-葡糖苷酶，可以将葡萄糖苷键分解为糖和糖苷配基，即将植物细胞壁间的D-半乳聚糖、L-阿拉伯聚糖、D-半乳糖醛酸聚糖等果胶成分分解，从而使得植物细胞内容物分离释放出来。
纤维素酶，主要含有内(外)切葡聚糖酶和糖苷酶，能够将纤维素分解为寡糖和纤维二糖，并最终水解为葡萄糖。
蛋白酶，主要为分解植物蛋白中的肽键，使其分子量转化为较小的肽、氨基酸等。
果胶酶，购自上海蓝季科技发展有限公司。
纤维素酶，购自上海蓝季科技发展有限公司。
蛋白酶，购自上海蓝季科技发展有限公司。
以上酶制剂主要来自于食品用酶制剂。
1.4发酵工艺培养基
碳源：以果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖为碳源选择，优选葡萄糖。
氮源：以透明质酸、干酪素、酵母提取物、氯化铵、胰蛋白胨和柠锰酸铵为氮源选择，优选胰蛋白胨。
1.5以下实施例中使用的中药原料均购自亳州市京皖中药饮片厂。实施例中使用的人参皂苷Rg3的供应商为上海源叶生物科技有限公司。
2.实验仪器
高速万能粉碎机(FW100型)，紫外可见分光光度仪(赛默飞)，称量天平(METTLERTOLEDO PL602-S)，高效液相色谱仪(Waters 2690 HPLC)，中药材提取浓缩罐(TNH型)，生物发酵罐(PF1G2SL05 5L)，酶反应器(搅拌罐式HR)，固定搅拌器(IKA RW20)，电热恒温CO2培养箱(Hereaus公司)，高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50A型)，恒温水浴锅(HWS 28型)，色彩色差计(Minolta CR-300)等
实施例1：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝4:4:2:1:0.6:0.6，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例2：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝6:6:3:3:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例3：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝8:7:4:4:1.6:2，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
比较例1：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:灵芝:桂花:黄精＝4:4:1:0.6:0.6，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
比较例2：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:铁皮石斛:桂花:黄精＝6:3:3:1:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
比较例3：中药提取物的制备
按重量比例称取人参:熟地黄:肉苁蓉:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝4:3.5:2.5:2:2:0.8:1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得粗粉1kg，加12kg去离子水于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1小时，过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5kg，冷却，边搅拌边加入乙醇至乙醇体积浓度70％，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至1kg，即得中药提取物备用。
实施例4：酶解反应
称取0.3kg实施例1的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.03kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例5：酶解反应
称取0.3kg实施例2的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.03kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例6：酶解反应
称取0.3kg实施例3的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.03kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例7：酶解反应
称取0.3kg实施例1的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.015kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例8：酶解反应
称取0.3kg实施例2的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.015kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例9：酶解反应
称取0.3kg实施例3的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.015kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例10：酶解反应
称取0.3kg实施例1的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例11：酶解反应
称取0.3kg实施例2的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例12：酶解反应
称取0.3kg实施例3的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
比较例4：酶解反应
称取0.3kg比较例1的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
比较例5：酶解反应
称取0.3kg比较例2的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
比较例6：酶解反应
称取0.3kg比较例3的中药提取物置于酶反应器中，加入0.7kg去离子水稀释，再加入由果胶酶:纤维素酶:蛋白酶按照2.3:1.2:0.8的比例组合成的复合酶0.0075kg，在pH值为6.0，温度为60℃下，以100rpm搅拌发生酶解反应24小时，在80℃下，经过30分钟的钝化处理，得到酶解反应的粗产物1.0kg，备用。
实施例13：活性物检测
取实施例1-3中药提取物和实施例4-12酶解反应粗产物，比较例1-3中药提取物和比较例4-6酶解反应粗产物分别检测其中活性物含量。
高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(45:55)为流动相；梯度洗脱后，检测波长为203nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL。理论板数按照人参皂苷Rg3峰值计算应不低于6000。
对照品溶液的制备，精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg3对照品，加入甲醇制成每1mL含0.2mg的混合溶液，摇匀即得。
待测样品制备，取实施例1-3中药提取物和实施例4-6酶解反应粗产物各1mL，精密称定，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
测定，分别精密吸取对照品溶液和待测样品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录HPLC图谱，即得。
测定实施例1-3中药提取物和实施例4-12酶解反应粗产物，比较例1-3中药提取物和比较例4-6酶解反应粗产物中人参皂甙含量变化结果如下表所示。
表1：中药提取物及其酶解反应粗产物中人参皂甙含量的变化
备注：N.D表示未检出
人参皂苷Rg3是人参二醇型皂苷单体，相对分子质量784，是人参皂苷家族中具有较好的抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫功能和抗脂质过氧化等性能，是人参中最主要的功能性活性成分。人参皂苷Rb2对物质代谢的影响能明显增加大鼠骨髓细胞DNA、蛋白质的合成，促进血清蛋白质合成，也具有抗疲劳作用、人参皂甙Rb2可明显增加小鼠被强迫行走后的自发活动。结果显示，经过复合酶的酶解作用后，实施例4-12酶解反应粗产物中人参皂苷Rg3的含量较实施例1-3中药提取物增加约0.31-5.81倍。实施例4-12酶解反应粗产物中人参皂苷Rb2的含量较实施例1-3中药提取物增加约9.08-39.2倍。在复合酶的浓度为1.5-3.0％时人参皂苷Rb2和人参皂苷Rg3的含量增加倍数较高，在复合酶的浓度为1.5％时，人参皂苷Rb2和人参皂苷Rg3的含量增加倍数最高。
比较例1与实施例1的中药提取物中的人参皂苷Rg1低约27％，人参皂苷Rg3低约73％。比较例4与实施例10的酶解反应粗产物中的人参皂苷Rg1低数十倍，人参皂苷Rg3的含量低约43％，未能将其中有效的转化成其他更具活性的人参皂苷产物。由此可见，比较例1经酶解反应后，转化效率低。
比较例2与实施例2的中药提取物中的人参皂苷Rg1低约23％，人参皂苷Rg3低约61％。比较例5与实施例11的酶解反应粗产物中的人参皂苷Rg1比较，实施例11中人参皂苷Rg1被完全转化成其他活性成分，而比较例5中的人参皂苷Rg1却有大量残余，转化率低。比较例5与实施例11的酶解反应粗产物中的人参皂苷Rg3的含量低约53％，由此可见，比较例2经酶解反应后，转化效率低。
比较例3与实施例3的中药提取物中的人参皂苷Rg1低约40％，人参皂苷Rg3低约40％。比较例6与实施例12的酶解反应粗产物中的人参皂苷Rg1比较，实施例12中人参皂苷Rg1几乎被完全转化成其他活性成分，而比较例6中的人参皂苷Rg1却有大量残余，转化率低。由此可见，比较例3经酶解反应后，转化效率低。
实施例14：发酵反应
取出保存的酿酒酵母菌种，经活化、培养后每种菌种中有效菌种数约为1.0 x109cfu/mL，备用。发酵反应的培养基碳源选择为葡萄糖，氮源选择为胰蛋白胨。
称取实施例8酶解反应粗产物0.2kg置于生物发酵罐中，然后加入0.1kg葡萄糖和0.2kg胰蛋白胨，再加入0.2kg酿酒酵母，最后再加入1.3kg去离子水，以100rpm搅拌均匀，在37℃下发酵反应，通气量控制0.6v/v/m，然后分别在发酵72小时、120小时、168小时后取发酵产物，经滤纸过滤后，滤过液经65℃，30mins巴氏灭菌，用活性炭脱色后滤纸过滤，得发酵产物，置于4℃冰箱冷藏，备用。
实施例15：发酵反应
取出保存的保加利亚乳酸杆菌菌种，经活化、培养后每种菌种中有效菌种数约为1.0 x 109cfu/mL，备用。发酵反应的培养基碳源选择为葡萄糖，氮源选择为胰蛋白胨。
称取实施例8酶解反应粗产物0.2kg置于生物发酵罐中，然后加入0.1kg葡萄糖和0.2kg胰蛋白胨，再加入0.2kg保加利亚乳酸杆菌，最后再加入1.3kg去离子水，以100rpm搅拌均匀，在37℃下发酵反应，通气量控制0.6v/v/m，然后分别在发酵72小时、120小时、168小时后取发酵产物，经滤纸过滤后，滤过液经65℃，30mins巴氏灭菌，用活性炭脱色后滤纸过滤，得发酵产物，置于4℃冰箱冷藏，备用。
实施例16：发酵反应
取出保存的短乳酸杆菌、沙克乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌菌种，经活化、培养后每种菌种中有效菌种数约为1.0 x 109cfu/mL，备用。发酵反应的培养基碳源选择为葡萄糖，氮源选择为胰蛋白胨。
称取实施例8酶解反应粗产物0.2kg置于生物发酵罐中，然后加入0.1kg葡萄糖和0.2kg胰蛋白胨，再加入0.2kg短乳酸杆菌，最后再加入1.3kg去离子水，以100rpm搅拌均匀，在37℃下发酵反应，通气量控制0.6v/v/m，然后分别在发酵72小时、120小时、168小时后取发酵产物，经滤纸过滤后，滤过液经65℃，30mins巴氏灭菌，用活性炭脱色后滤纸过滤，得发酵产物，置于4℃冰箱冷藏，备用。
实施例17：发酵反应
取出保存的沙克乳酸杆菌菌种，经活化、培养后每种菌种中有效菌种数约为1.0 x109cfu/mL，备用。发酵反应的培养基碳源选择为葡萄糖，氮源选择为胰蛋白胨。
称取实施例8酶解反应粗产物0.2kg置于生物发酵罐中，然后加入0.1kg葡萄糖和0.2kg胰蛋白胨，再加入0.2kg沙克乳酸杆菌，最后再加入1.3kg去离子水，以100rpm搅拌均匀，在37℃下发酵反应，通气量控制0.6v/v/m，然后分别在发酵72小时、120小时、168小时后取发酵产物，经滤纸过滤后，滤过液经65℃，30mins巴氏灭菌，用活性炭脱色后滤纸过滤，得发酵产物，置于4℃冰箱冷藏，备用。
实施例18：发酵反应
取出保存的枯草芽孢杆菌菌种，经活化、培养后每种菌种中有效菌种数约为1.0 x109cfu/mL，备用。发酵反应的培养基碳源选择为葡萄糖，氮源选择为胰蛋白胨。
称取实施例8酶解反应粗产物0.2kg置于生物发酵罐中，然后加入0.1kg葡萄糖和0.2kg胰蛋白胨，再加入0.2kg枯草芽孢杆菌，最后再加入1.3kg去离子水，以100rpm搅拌均匀，在37℃下发酵反应，通气量控制0.6v/v/m，然后分别在发酵72小时、120小时、168小时后取发酵产物，经滤纸过滤后，滤过液经65℃，30mins巴氏灭菌，用活性炭脱色后滤纸过滤，得发酵产物，置于4℃冰箱冷藏，备用。
实施例19：发酵产物活性物检测
检测发酵产物中活性物的含量采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg3的含量：色谱条件与系统适用性试验是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(45:55)为流动相；梯度洗脱后，检测波长为203nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL。理论板数按照人参皂苷Rg3峰值计算应不低于6000。
对照品溶液的制备，精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg3对照品，加入甲醇制成每1mL含0.2mg的混合溶液，摇匀即得。
待测样品制备，取实施例14-18发酵产物1mL，精密称定，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
测定，分别精密吸取对照品溶液和待测样品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录HPLC图谱，即得。
本实施例中的活性物主要检测人参皂苷Rg3的含量。
表2：实施例14-18发酵产物中人参皂甙Rg3含量
对比实施例8酶解反应粗产物与实施例14-18不同菌株发酵产物中人参皂苷Rg3的含量又进一步发生明显变化。整体而言，乳酸杆菌类发酵效果优于酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，其中以保加利亚乳酸杆菌最优，Rg3含量经120小时发酵后增加达到23.6％。而酿酒酵母和枯草芽孢杆菌发酵产物中Rg3含量反而有一定程度的降低。
实施例20：总多糖含量的测定
葡萄糖储备液的制备：精确称取10mg葡萄糖于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml，即得0.1g/L的葡萄糖储备溶液。
葡萄糖标准液的制作：精确移取葡萄糖储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml分别置于5支具塞试管中，用蒸馏水补充至1ml。配制成的溶液浓度分别为0.02g/L，0.04g/L，0.06g/L，0.08g/L，0.1g/L。
样品溶液的制作：精确移取中草药提取液1ml于1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。精确移取该样品溶液1ml于具塞试管中，待测。
标准曲线的制作及样品(实施例15发酵产物)的测定：在上述配制的葡萄糖标准液及样品溶液中分别加入5％苯酚溶液1ml，盖上塞子摇匀，同时将试管置于冰浴中冷却，并立即缓慢滴加浓硫酸5ml，摇匀后置于冰浴中冷却10min。然后置于沸水浴中加热15min，取出后用流动水冷却至室温。(同时作一空白参比，即另以1ml蒸馏水重复上述操作。)将标准液、样品溶液与空白参比液注入比色皿中，在489nm处读取扣除空白参比液的吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线或计算出回归方程，利用标准曲线或回归方程计算出样品中的多糖含量，每个样品平行测定二次。
结果计算：C(g/L)样品中多糖含量(mg/mL)＝V/1000，式中：
C──从标准曲线或回归方程中查得或求出样品中多糖含量，g/L
1000──样品稀释的倍数；
V──测定时移取的中草药提取液的体积；ml
注：两次平行试验计算结果相对误差不得大于10％，取两次试验的平均值为最后结果。
表3：实施例15发酵产物中总多糖的含量
含量 发酵时间(小时) 实施例15
总多糖(mg/ml) 120 6.53
实施例21：总黄酮含量的测定
待测样品溶液的制备：精确吸取提取液1.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，取上述稀释液0.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至50mL，即得。(或根据样品中黄酮含量进行稀释)。
样品中黄酮含量的测定：精确吸取待实施例15发酵产物1.0mL于10mL具塞比色管中，加甲醇0.2mL，然后分别加入5％亚硝酸钠溶液0.2mL，混匀，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.2mL，摇匀，放置6min，再分别加入1M氢氧化钠溶液2mL，加水补至5.0mL，混匀，放置15min，以甲醇作为空白对照，于500nm处测定吸光度值A。根据标准曲线及公示计算各提取液样品中的总黄酮含量M(mg/g)。
M＝(C×5.0×1000)/(CM×1.0)
式中，C为由标准曲线计算得到的被测液中的黄酮含量，mg/mL；CM为提取液的生药浓度，g/g。
表4：实施例15发酵产物中总黄酮的含量
含量 发酵时间(小时) 实施例15
总黄酮*(μg/ml) 120 60
实施例22：DPPH自由基清除实验
自由基是一类性质活泼、具有极强氧化能力的化学物质。皮肤中产生的大量自由基，对机体造成损伤，加速衰老。DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH光吸收减弱，DPPH乙醇溶液退色程度与其接受的电子数呈定量关系，借此可评价物质清除自由基的能力。
样品配制：将实施例2的中药提取物原液，实施例14-15不同发酵时间下的发酵产物，以及将实施例2中药提取物原液与实施例14-15不同发酵时间下的发酵产物用去离子水稀释5倍后进行溶液配制，于试管中加入2mL不同浓度的样品溶液和2mL 0.2mmol/L的新鲜DPPH溶液(95％乙醇配制)，混匀后，37℃下避光反应30min。反应结束后在波长517nm处测定其吸光度。DPPH自由基的清除率按下式计算：
自由基清除率(％)＝[(Ac–As/Ac)]x 100％
式中As为含有待测物样品在517nm处的吸光度；Ac为去离子水代替样品溶液的吸光度。
表5.不同浓度实施例2中药提取液和实施例14-15代表性发酵菌种发酵产物自由基清除率
对比相同浓度下的中药提取物和发酵产物抗氧化DPPH能力的差异。其中实施例14和实施例15发酵液的抗氧化DPPH能力较实施例2中药提取物均有较好的提升。其中实施例15发酵产物相较于实施例2中药提取物的抗氧化DPPH能力提升达到了13.1-96.9％。
实施例23：酪氨酸酶抑制率效果对比
在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸缓冲液中，可催化多巴转化成多巴醌(呈肾上腺素红色)，在分光光度计475nm处可测定光密度值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据光密度值的变化，评估原料对酪氨酸酶的抑制作用。
抑制酪氨酸酶形成多巴醌的能力测定是取1mL的实施例2中药提取物和实施例14-15发酵产物，加入0.9mL pH6.8的磷酸缓冲液(K2HPO4 8.71g/500mL+KH2PO4 6.805g/500mL)及1mL 0.03％的酪氨酸溶液于试管中混和，并置于37℃的恒温槽中10min，再加入0.1mL的酪氨酸酶(350units/mL)水溶液，将溶液混和均匀，置于恒温槽中反应25min后，以紫外分光光度计测定475nm时的吸光度，酪氨酸酶抑制率(％)按下式计算：
抑制率(％)＝[1-(S-SB)/(C-CB)]x 100％
式中S为含有酪氨酸酶溶液的实施例2或者实施例14-15发酵产物样品的吸光度；SB为未添加酪氨酸酶溶液的实施例2或者实施例14-15发酵产物样品的吸光度；C为去离子水取代实施例样品的吸光度；CB为去离子水取代实施例样品且未加入酪氨酸酶溶液的吸光度。
表6.实施例2中药提取物和实施例14-15发酵产物的酪氨酸酶抑制率
由上表可知，实施例14发酵产物相较于实施例2中药提取物的对酪氨酸酶抑制率基本相当；而实施例15发酵产物相较于实施例2中药提取物的对酪氨酸酶抑制率提升约6.8-16.2％。
实施例24：成纤维细胞促进皮肤前胶原蛋白的合成
TGF-β1是调节细胞生长和分化的生长因子，在细胞活跃的组织含有较高水平的TGF-β1，在肌肤成纤维细胞贴壁受体一系列信号传导后，会促进前胶原蛋白的合成。
首先，实验采用组织块法原代培养成纤维细胞，成纤维细胞来源于手术切除的人皮肤烧伤治疗后形成的增生性疤痕，培养液为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，使用第3～5代细胞进行实验。将实施例15发酵产物按照不同浓度10％、20％、30％考察促进皮肤前胶原蛋白的增殖情况，并与实施例2中药提取物不同浓度10％、20％、30％进行对比，结果用MTT法测定。即在一定细胞数范围内，MTT结晶形成量与活细胞数成正比。调整细胞混悬液浓度，按1x105/mL每孔加入400μL接种于96孔平底板，置37℃，5％CO2培养箱孵育48h。不同浓度的发酵产物及实施例2中药提取物，每一组重复4孔，加入400μL进行培养，培养48h后，每孔加入0.5％MTT，再培养4小时，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜，低速振荡15min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490nm处测各孔的吸光值。Quantity One软件分析。
表7：
实施例2中药提取物和实施例15发酵产物促进皮肤前胶原蛋白的合成
结果显示不同浓度下实施例15发酵产物对于TGF-β1含量促进效果优于同浓度下的实施例2中药提取物。实施例15发酵产物在发酵时间为120-168小时时，TGF-β1含量相较于实施例2中药提取物提高了1.6-3.4倍。
实施例25：免疫荧光法对透明质酸受体CD44的测定。
透明质酸受体(CD44)是存在于角质形成细胞表面的一种跨膜糖蛋白，是透明质酸在角质形成细胞膜上的重要受体，研究证明，含水量高的皮肤中透明质酸受体的表达量也高于平均水平。如果在表皮中同时增加CD44和透明质酸的含量就可以更加有效的提高表皮中的含水量，同时有助于保持皮肤的紧密度，达到皮肤充溢饱满的效果。免疫荧光法利用抗体抗原结合的原理，将荧光蛋白标记于角质细胞透明质酸受体(CD44)上，因此最后生成荧光的强度和细胞内合成的目标蛋白量成正比。
具体的实验方法为使用实施例15发酵产物和实施例2中药提取物，未添加的组别为阴性对照，预处理过的细胞/皮片上先加入一抗(未标记的特异抗体)，4℃处理12小时，然后经磷酸缓冲液冲洗3次后(3min/次)洗去一抗，加入二抗(荧光标记的抗体)，避光室温下培养2小时，使用缓冲液洗去二抗，加入DAPI染细胞核5分钟，洗去封片，即可用荧光显微镜观察结果，结果如图1所示。其中绿色荧光部分显示的是透明质酸受体CD44蛋白表达情况，蓝色荧光显示细胞核。
结果显示，实施例15发酵产物对透明质酸受体(CD44)表达有较明显的促进作用。
取实施例1-3中药提取物，实施例4-12酶解产物以及实施例14-18发酵产物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述实施例1-3中药提取物，实施例4-12酶解产物以及实施例14-18发酵产物，在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)。更优选的重量百分比为0.001％-5％(w/w)。最优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。
以下是实施例1-3中药提取物，实施例4-12酶解产物以及实施例14-18发酵产物，在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。
实施例26：面霜的制备
实施例27：乳液的制备
实施例28：啫喱的制备
实施例29：化妆水的制备
实施例30：精华液的制备
实施例31：面膜的制备
实施例32：眼霜的制备
实施例33：气雾(清洁泡)的制备
实施例34：喷雾的制备
实施例35：沐浴露的制备
实施例36：洗面奶的制备
实施例37精华水的制备
以上所有皮肤外用剂中的具体应用的实施例中，实施例1-3中药提取物，实施例4-12酶解产物以及实施例14-18发酵产物均可部分或者全部取代去离子水直接应用于配方中。

Claims (10)

1.一种中药提取物，所述提取物通过以下方法制备得到：
a)按照重量份数取人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精并混合；
b)溶剂煮沸提取，
c)醇沉，
d)收集滤液得到中药提取物，
其中，所述步骤a)中人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精的比率为2:1.75-2:1:0.5-1:0.3-0.4:0.3-0.5。
2.如权利要求1所述的中药提取物，其特征在于，所述中药提取物含有367-450ppm人参皂苷Rg1，0-9ppm人参皂苷Re，8-37ppm人参皂苷Rf，0-12ppm人参皂苷Rb1，8-15ppm人参皂苷Rc，13-24ppm人参皂苷Rg2，10-38ppm人参皂苷Rb2，7-18ppm人参皂苷Rd，0-2ppm人参皂苷F1，0-21ppm人参皂苷Rg5和32-82ppm人参皂苷Rg3。
3.一种酶解产物，所述酶解产物通过以下方法制备得到：
a)将权利要求1所述的中药提取物用包含果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的复合酶进行酶解；
b)钝化处理，得到酶解产物，
其中，所述步骤a)中果胶酶:纤维素酶:蛋白酶的重量比为2.3:1.2:0.8，
其中，所述步骤a)中的中药提取物:复合酶的重量比为10:1至40:1。
4.如权利要求3所述的酶解产物，其特征在于，所述酶解产物含有0-72ppm人参皂苷Rg1，0-7ppm人参皂苷Re，0-22ppm人参皂苷Rf，0-27ppm人参皂苷Rb1，0-10ppm人参皂苷Rc，0-7ppm人参皂苷Rg2，121-488ppm人参皂苷Rb2，0-52ppm人参皂苷Rd，0-11ppm人参皂苷F1，0-31ppm人参皂苷F2，0-108ppm人参皂苷Rg5和59-279ppm人参皂苷Rg3。
5.一种发酵产物，所述发酵产物通过以下方法制备得到：
将权利要求3所述的酶解产物与发酵菌一起培养进行发酵，得到发酵产物，
其中，所述发酵菌选自：酿酒酵母、保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌、沙克乳酸杆菌或枯草芽孢杆菌，
其中，发酵的时间为72、120或168小时，
其中，发酵过程采用的碳源包括葡萄糖，氮源包括胰蛋白胨，
其中，所述酶解产物与发酵菌的重量比为1:1。
6.如权利要求5所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵菌选自：保加利亚乳酸杆菌、短乳酸杆菌或沙克乳酸杆菌。
7.如权利要求6所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵时间为72小时的发酵产物包含286-322.6ppm人参皂苷Rg3，发酵时间为120小时的发酵产物包含286.8-344.9ppm人参皂苷Rg3、6.53mg/ml总多糖和60μg/ml总黄酮，发酵时间为168小时的发酵产物包含287.7-343.2ppm人参皂苷Rg3。
8.一种如权利要求1-2中任一项所述的中药提取物或如权利要求3-4中任一项所述的酶解产物或如权利要求5-7中任一项所述的发酵产物在抗氧化、美白、抗衰老和/或保湿方面的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗衰老为促进皮肤前胶原蛋白的合成，所述保湿为透明质酸受体(CD44)表达。
10.一种包含如权利要求1-2中任一项所述的中药提取物或如权利要求3-4中任一项所述的酶解产物或如权利要求5-7中任一项所述的发酵产物的皮肤外用剂，其特征在于，所述中药提取物或酶解产物或发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-20％，优选的重量百分比为0.01％-20％，更优选的重量百分比为0.01％-10％，最优选的重量百分比为0.1％-5％。
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