CN109223668A - 一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法和应用，所述方法包括如下步骤：A、菌类植物固体发酵：将药性培养基质接种菌类植物液体菌种，进行双向固体发酵制备药性菌质；B、酿酒酵母菌液体深层发酵：将步骤A制得的药性菌质接种酿酒酵母菌进行液体深层发酵，得二步发酵液；C、将步骤B所得二步发酵液灭菌、离心后，所得上清液即为二步发酵产物。本发明制备得到的二步发酵产物安全、无毒、无刺激、抗氧化能力强，具有非常明显的皮肤修复功效，且其总氨基酸含量和β‑葡聚糖含量在一定范围内，具有良好的肤感，可广泛应用于化妆品中制成具有皮肤修复功效的面膜、精华液或爽肤水等，市场前景广阔。且该制备方法稳定，适合大规模生产。

Description

一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物发酵及其制备领域，具体涉及一种皮肤修复功效的二步发酵产物制备的方法和应用。
背景技术
延缓皮肤衰老，使皮肤提高弹性是美容领域永恒的话题。随着靠科学技术的日新月异，药物美容和外科美容是两种主流的美容方式，然而皮肤，尤其是角质层皮肤，对药物透皮吸收具有屏障作用，能够阻碍皮肤对药物的吸收；而且，一些药物，主要是糖皮质激素，虽然短期内效果明显，长期使用但却有非常严重的副作用，如依赖性皮炎等，目前已被禁止添加到化妆品中。目前，还未发现药效明显且无副作用的药物；而外科美容手术，就目前来看，伴随着风险高、并发症和副作用多等缺点，往往让人们望而却步。因此，具有一定功效，无刺激、安全无副作用的修复美容化妆品拥有广阔的市场前景。
近年来有学者提出新型固体发酵技术—双向发酵技术，即利用一定的药用真菌菌种接种到含有经筛选的中药基质上，在一定环境条件下，经过一定时间发酵，在特定的质量指标控制下达到发酵终点而产生的药性菌质。如中国专利CN103948023B公开了一种增强免疫力及改善睡眠的保健食品及其二步发酵制备方法，该方法包括：灵芝(多孔菌属)固体发酵，接种灵芝液体菌种进行双向固体发酵制备具有增强免疫力功能的药性菌质；乳酸菌(乳杆菌属)液体深层发酵；以药性菌质为原料，粉碎后添加酵母粉、谷氨酸钠、水制成发酵培养基，接种乳酸菌进行液体深层发酵生产促进睡眠的γ-氨基丁酸，制备同时具有增强免疫力和改善睡眠功能的发酵液。该专利的主要的应用方向为保健食品类，发酵后产物主要为γ-氨基丁酸。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法和应用。本发明采用真菌双向发酵技术进行发酵，旨在增加两者的生物活性成分及增强药效，尤其是增强其抗氧化功效；利用菌类植物在发酵中能分泌纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等多种胞外酶系统,使其作用于植物成分以提高其药物析出率，增加次生代谢产物的变化，此外，通过与酿酒酵母菌发酵相耦合进行进一步发酵可对前一步的双向固体发酵产生的药性菌质进行进一步分解和转化，得到的二步发酵产物抗氧化能力强，具有优异的修复皮肤功效；同时其总氨基酸含量和β-葡聚糖含量在一定的范围内，具有良好的肤感；而且对皮肤安全、无毒、无刺激。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，包括如下步骤：
A、菌类植物固体发酵：将药性培养基质接种菌类植物液体菌种，进行双向固体发酵制备药性菌质；
B、酿酒酵母菌液体深层发酵：将步骤A制得的药性菌质接种酿酒酵母菌进行液体深层发酵，得二步发酵液；
C、将步骤B所得二步发酵液灭菌、离心后，所得上清液即为二步发酵产物。
优选地，步骤A中，所述药性培养基质包括以下重量百分含量的各组分(以干重计)：青稞60％-75％，山茶叶5％-15％、山茶花5％-10％、山茶籽5-10％、五味子3％-6％、竹叶3％-5％、人参1％-2％、甘草1％-2％、党参1％-2％、枸杞1％-2％。
青稞，具有三高两低的结构组成，即高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖，具有丰富的营养价值，在药性功效方面，青稞具有补脾、养胃、益气、止泻、强筋力之功效，主要成分有淀粉、β-葡聚糖、粗脂肪、氨基酸以及铜、锌、钼十余种营养元素。
山茶叶，民间用于治疗吐血、肠风下血、痔疮出血等。化学成分有含槲皮素、山茶皂甙、Ⅱ,维生素C,可可豆碱，左旋表儿茶精和右旋儿茶精、山茶鞣质A、B、C等。
山茶花，具有凉血止血；散瘀；消瘀肿。其药用价值，始见于明代李时珍《本草纲目》，清乾隆名医吴仪洛的《本草从新》中已有详述："山茶花微辛、甘寒、凉血。治吐衄肠风下血，汤、火伤灼(麻油调涂)用红者。子、妇人发直，研末掺之。"据报道，含有黄酮、多酚以及皂苷类物质。
山茶籽，李时珍的《本草纲目》：“茶籽，苦寒香毒，主治喘嗽、去疾垢……”。《农政全书》中有山茶籽油可疗痔疮、退湿热的记录。《本草纲目拾遗》说，茶油可润肠、清胃，解毒杀菌。《农息居饮食谱》中有“茶油润燥、清热、息风和清利头目”。山茶籽榨制的茶油其不饱和脂肪酸含量在90％以上，而且不含芥酸，比其他食用油更耐贮藏，不易酸败。山茶籽油含有丰富的维生素E、维生素D、维生素K、胡萝卜素和微量的角鲨稀、黄酮、皂素、抗氧化剂等，其脂肪酸和多种天然脂溶性维生素对滋养肌肤十分有利。直接使用山茶籽油护肤能防止皮肤皱纹和粗糙，使皮肤恢复自然弹性，光泽而柔嫩，对紫外线有特殊的吸收能力，是防止烈日曝晒和严寒冰霜对皮肤伤害的上乘佳品。
五味子，味酸、甘、性温。列于神农本草经的上品中药，能滋补强壮之力，药用价值极高，有强身健体之效。科学研究证明，含挥发油、木脂素、有机酸、微生素、三萜、倍半萜以及多糖。
竹叶，为禾本科植物淡竹(竹子)的叶，是国家认可并批准的药、食两用的天然植物，有清热除烦，生津利尿的功效。研究表明，竹叶有效成分包括黄酮、酚酮、蒽醌、内酯、多糖、氨基酸、微量元素等，具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血脂、预防心脑血管疾病、保护肝脏、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑、促进记忆、改善睡眠、抗癌症、美化肌肤等功效。
人参，五加科植物，自古誉为“百草之王”“滋阴补生，扶正固本”之极品，含多种皂甙、多糖类、多肽类、木质素、黄酮类、甾醇等多种成分，适用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症，也有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。
甘草，《神农本草经》即有记载，《中国药典》收录，为常用大宗药材，药食兼用品种，具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增强免疫功能等作用。主要成分有黄酮类、三萜、生物碱、雌激素和多种有机酸。
党参，为桔梗科植物，常用的传统补益药，具有补中益气，健脾益肺之功效。党参有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用。主要化学成分有多糖、皂苷、甾醇、三萜、倍半萜和酚酸类物质。
枸杞，茄科植物，广泛应用于临床，能养肝，滋肾，润肺，对免疫功能有影响作用。主要成分有枸杞多糖、枸杞色素、甜菜碱，β-谷甾醇等。枸杞多糖是一种水溶性多糖，具有促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基、抗疲劳、抗辐射、保肝等作用。枸杞色素是存在于枸杞浆果中的各类呈色物质，是枸杞籽的重要生理活性成分。枸杞所含有的类胡萝卜素是枸杞色素的主要活性成分，具有抗氧化和作为维生素A的合成前体等重要的生理功能。
本发明以青稞、山茶叶、山茶花、山茶籽、五味子、竹叶、人参、甘草、党参、枸杞按照一定比例制备的药性培养基一方面作为营养源影响菌类植物菌丝体生长代谢过程，同时菌类植物菌丝体的生长代谢发过来影响药性培养基的代谢分解。实验表明，青稞、山茶叶、山茶花、山茶籽、五味子、竹叶、人参、甘草、党参、枸杞按照本发明的比例制备的药性培养基可以起到比单个药材或几种药材按以一定比例组成的培养基的的效果更好,其搭配具有协同增效的作用。
更优选地，所述药性培养基质包括以下重量百分含量的各组分(以干重计)：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
优选地，所述药性培养基质的制备方法如下：将各组分按比例混合、粉碎，然后加水至水含量为50-55％，120℃-122℃灭菌1.0h-1.2h，即得。
优选地，所述药性培养基质的制备方法中，加水至水含量为53-55％，121℃灭菌1.0h。优选地，步骤A中，所述菌类植物液体菌种的接种量为5-10％。即所述的菌类植物液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％-10％(mL/g)，以100g药性培养基质为基准，加入5-10mL的菌类植物液体菌种。
优选地，所述菌类植物可采用目前在用的已知的菌类植物，如云芝、灵芝、香菇、蘑菇等。所述菌类植物液体菌种采用现有的常规工艺制得。
更优选地，所述菌类植物为云芝，具体如采用的菌类植物菌种为菌类植物CICC50001，即中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的菌种。
优选地，步骤A中，所述双向固体发酵的条件为：发酵温度在28-30℃，发酵时间在25-28天。
优选地，步骤B中，所述酿酒酵母菌接种量为1％-2％，酿酒酵母菌的浓度为105-107CFU/mL。
优选地，所述酿酒酵母菌为酿酒酵母CICC1002，即中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏的菌种。
优选地，步骤B中，所述液体深层发酵的条件为：发酵温度28-30℃，发酵时间60-75h。
优选地，步骤B中，接种酿酒酵母菌前，所述药性菌质需进行前处理；所述前处理的步骤包括：将药性菌质溶于水，添加缓冲液后，120℃-122℃灭菌1.0h-1.2h；所述药性菌质与水的重量比为1-1.2:9。
优选地，所述缓冲液采用磷酸和磷酸二氢钾配置，缓冲液的pH值为5.5-6.5；缓冲液的添加量为总体积的10-15％。
优选地，所述二步发酵产物中的总氨基酸含量范围在100-200mg/ml，β-葡聚糖的含量在40-80mg/L。所述总氨基酸和β-葡聚糖的含量控制在该范围内，可达到最佳的皮肤保湿感。
本发明还提供了一种前述方法制备的二步发酵产物在制备具有皮肤修复功效化妆品中的应用。
优选地，所述化妆品包括精华液、面膜、爽肤水。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明的菌类植物与药性培养基质双向发酵可制备增强的抗氧化活性的药性菌质，同时有利于菌类植物菌的生长代谢，通过双向性固体发酵后得到新型的药性菌质；然后以该药性菌质为原料，添加酿酒酵母菌液体进行发酵，制备具有修复功效的二次发酵产物。双向发酵过程可将药性培养基质中的大分子碳源降解为酿酒酵母菌易于利用的小分子碳源，为第二步酿酒酵母菌菌液体深层发酵产生提供了营养物质和发酵基质。
(2)本发明制备的二次发酵产物经实验证明具有显著抗氧化功能、对皮肤有明显的修复功效，安全、无毒、无刺激。
(3)本发明制备的二次发酵产物经实验证明其总氨基酸含量和β-葡聚糖含量在一定的范围内，具有良好的肤感。
(4)本发明采用的制备方法，不仅原料成本低，整个生产过程都采用低温发酵，条件温和，没有添加其他有毒有害物质，产品附加值高，易于实现规模化生产，市场前景广阔。
(5)本发明制备的产品可以广泛应用于化妆品行业。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的二步发酵液产物制备方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001(购买所得)的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002(购买所得)液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
3、所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物(制备流程如图1所示)。
实施例2
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：青稞72％，山茶叶5％、山茶花5％、山茶籽5％、五味子4％、竹叶3％、人参1％、甘草1.5％、党参1.5％、枸杞2％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的51％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按10％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的10％(mL/g)，28℃培养28天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质120g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为5.5的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的2％，30℃静置培养60h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
实施例3
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：青稞68％，山茶叶5.5％、山茶花5％、山茶籽9.5％、五味子3％、竹叶3.5％、人参2％、甘草1.5％、党参1％、枸杞1％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的50％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质110g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.5的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1.5％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1.5％，30℃静置培养75h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
实施例4
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制作
配方：青稞67％，山茶叶6.5％、山茶花7.5％、山茶籽6％、五味子5％、竹叶3％、人参1.5％、甘草1％、党参1％、枸杞1.5％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的50％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按8％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的8％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质105g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.2的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按2％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积2％，30℃静置培养62h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例1
直接以药用菌质的配方作为提取基质，不进行酿酒酵母菌液体深层发酵，配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为55％，配制1000g，100℃热回流，得水提取液，再121℃灭菌1h，得最终水提液产物。
配方与实施例1的配方相同：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
对比例2
1、培养基制备：直接以药性培养基质的配方作为发酵基质，不进行菌类植物固体发酵，配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为55％。
配方与实施例1的配方相同：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
2、酿酒酵母菌菌液体发酵：
①发酵培养基制作
配方：上述步骤1配制的培养基100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将培养基置于去离子水中，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的发酵液；
3、将所述的发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到具有皮肤修复功效的发酵产物。
对比例3
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤1中，菌类植物CICC50001的液体菌种接种量为20％。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种按20％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的20％(mL/g)，25℃培养10天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制备
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例4
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤2中，酿酒酵母CICC1002的浓度为102-104CFU/mL。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总量的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的中药性培养基质，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制备
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为6.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为102-104CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，20℃静置培养65h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例5
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤2中，发酵培养基制作采用的缓冲液的pH为4.0。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：青稞64％，山茶叶7％、山茶花7％、山茶籽8％、五味子5％、竹叶3％、人参2％、甘草1％、党参1.5％、枸杞1.5％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为4.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
3、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例6
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤1中，药性培养基的制备选择一种药材。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：青稞100％，
配制方法：按配方比例将青稞粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为4.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
4、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例7
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤1中，药性培养基的制备选择其中4种药材，且配比与不在本发明的范围之内。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：五味子20％、竹叶25％、人参40％、甘草15％。
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为4.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
5、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例8
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤1中，药性培养基的制备选择其中6种药材，且配比与不在本发明的范围之内。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：山茶叶30％、五味子20％、竹叶10％、人参10％、甘草15％、枸杞15％,
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为4.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
6、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
对比例9
本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：步骤1中，药性培养基的制备10种药材配比与不在本发明的范围之内。具体步骤如下：
1、菌类植物固体发酵：
①药性培养基质的制备
配方：青稞23％，山茶叶10％、五味子10％、山茶花1％、竹叶2％、人参2％、甘草10％、党参20％、枸杞20％,山茶籽2％
配制方法：按配方比例将各组分混合、粉碎，加水至水分重量含量为总重的55％；121℃灭菌1h，得到药性培养基质；
②接种发酵
将菌类植物云芝菌CICC50001的液体菌种按5％体积质量比接种到①所制备的药性培养基质中，即菌类植物云芝菌CICC50001液体菌种的加入的体积量(mL)为药性培养基质的质量(g)的5％(mL/g)，28℃培养25天制备药性菌质；
2、酿酒酵母菌菌液体深层发酵：
①发酵培养基制作
配方：药性菌质100g、去离子水900g；
配制方法：按配方比例将药性菌质溶于水，添加磷酸和磷酸二氢钾配制成pH为4.0的缓冲液，121℃灭菌1h，得到二次发酵培养基；
②接种发酵
将浓度为105-107CFU/mL的酿酒酵母CICC1002液体，按1％比例接种到①的发酵培养基中，即酿酒酵母菌液体加入的体积量为发酵培养基体积的1％，30℃静置培养65h制备的二步发酵液；
7、将所述的二步发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液得到最终具有皮肤修复功效的二步发酵产物。
试验例1
本发明对实施例1-4获得的二步发酵产物进行毒理试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
(1)多次皮肤刺激性试验
受试物配制方法：实施例1所制备的二步发酵产物，原液直接测试
受试动物：普通级白色新西兰种家兔4只，体重2.4-2.8kg,
饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40％-70％
试验方法：试验前24h将动物背部脊柱两侧毛剃掉，剃毛范围左右各3cm×3cm，试验时将受试物0.5mL均匀涂抹在左侧试验区皮肤上，右侧用蒸馏水做对照。每天涂抹一次，连续14d，从第二天开始，每天涂抹前去毛，用温水清洗，1h后观察皮肤反应并按照《化妆品安全技术规范》(2015版)中的有关规定进行皮肤刺激反应评分，试验结束后，分别计算14天总积分、14天每只动物积分均值，每天每只动物积分均值，并进行皮肤强度分级。
试验结果：受试物对家兔多次皮肤刺激性试验中，每天每只动物皮肤刺激反应积分均值为0，属于无刺激性。
(2)皮肤变态反应试验
受试物配制方法：实施例1所制备的二步发酵产物，原液直接测试
受试动物：普通级英国种白化豚鼠，分成3组，受试物实验组和阳性物实验组，每组20只，受试物对照组10只。体重223-293g。
饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40％-70％
试验方法：试验前24h将豚鼠背部左侧剃毛，面积约6cm2。
诱导接触：将诱导用的受试物0.2mL涂在受试物实验组动物左侧剃毛2cm×2cm区域的皮肤上，以2层纱布，一层玻璃纸覆盖，胶布固定，封闭6h。第7天和第14天以同样的方法重复一次。阳性物实验组用0.4％2,4-二硝基氯代苯丙酮溶液代替受试物进行相同试验，受试物对照组用蒸馏水代替受试物作同样的处理。
激发接触：在末次诱导后14天，将激发用受试物0.2mL涂在受试物实验组和受试物对照组右侧已在24h前剃毛2cm×2cm区域的皮肤上，以2层纱布，一层玻璃纸覆盖，胶布固定，封闭6h；而阳性物实验组用0.2％2,4-二硝基氯代苯丙酮溶液作同样的激发接触。于激发接触后24、48h观察皮肤反应，按照按照《化妆品安全技术规范》(2015版)中的有关规定进行皮肤反应评分和致敏强度分级。
试验结果：受试物对豚鼠皮肤变态反应试验结果，红斑水肿总分≥2中的动物0例，致敏率为0％，未见皮肤变态反应。
(3)皮肤光毒性试验
受试物配制方法：实施例1所制备的二步发酵产物，原液直接测试
受试动物：普通级英国种白化豚鼠，每组6只，雌雄各半，体重245-281g.
饲养条件：温度20-25℃、相对湿度40％-70％
试验方法：试验前24h将豚鼠背部剃毛，在背部两测选好皮肤四块，每块2cm×2cm，左侧为1、3区，右侧为2、4区。将动物固定，在1、2区均匀涂敷受试物0.2mL,3、4区为不涂受试物。30min后，左侧1、3区用铝箔覆盖，胶带固定，右侧用UVA进行照射，分笼饲养。分别于照射后1、24、48h观察皮肤反应，并根据皮肤反应评分标准评分，记录每只动物不同观察期积分值。阳性对照组按同样方法进行，阳性对照物用0.05％8-甲氧基补骨脂。
试验结果：受试物对豚鼠皮肤光毒性试验结果为未见皮肤光毒性。
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果。
试验例2总氨基酸含量、β-葡聚糖含量测试以及皮肤感官评价测试
对于上述实施例1-4及比较例1-9的二次发酵产物进行了二步发酵产物的总氨基酸含量、β-葡聚糖含量测试以及皮肤感官评价测试
2.1β-葡聚糖含量测试
1)标准曲线的绘制：准确称取标准葡聚糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml，各补水至2.0ml,然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸，静置10min,摇匀，室温放置20min后于490nm测定光密度，以2.0ml水按同样显色操作作为空白，做出标准曲线。2、样品测试：吸取样品液1.0ml,按上述步骤操作，测定光密度，以标准曲线计算β-葡聚糖含量。
总氨基酸含量的测试，
利用L-8800型全自动氨基酸分析仪进行测试，分别得到各个游离氨基酸含量，最后计算总氨基酸的含量(mg/mL)。
感官评价测试以女性(25-40岁)20名经过训练的检查员为对象，对上述二次发酵产物的皮肤保湿感的项目进行了评估并求出其平均(以1-5为评估标准，1：非常差、2：差、3：一般、4：良好、5：优秀)。
上述3项测试结果在下列表1中列出其结果。
表1、总氨基酸含、β-葡聚糖含量测试以及皮肤感官评价测试结果
从表1结果可以看出，对于总氨基酸含量，实验例1-4的总氨基酸含量基本在100-200(mg/ml)，与对比例1(直接水提法)16.85mg/ml、对比例2(无双向发酵，直接发酵)76.54mg/ml、对比例3(菌类植物菌种接种量不同)82.98mg/ml、对比例4(酿酒酵母浓度不同)83.24mg/ml、对比例5(缓冲液pH不同)53.76mg/ml相比较，差异明显，说明在同样药性培养基配比情况下，如果不按照在本发明的操作步骤或条件，无法达到本发明的有益的效果；与对比例6-9相比(药用菌质配比不同)，差异明显，说明在依照本发明的操作步骤或条件下，但不按照本发明的药性培养基配比，依然无法达到本发明的有益的效果。按照本发明的药性培养基比例制备的药性培养基可以起到比单个药材或几种药材组成的培养基的的效果更好，能起到最佳的效果。
从表1结果可以看出，对于β-葡聚糖含量，实验例1-4的β-葡聚糖含量基本在40-80(mg/L)，与对比例1(未检出)、对比例2(106.75mg/L)、对比例3(116.32mg/L)、对比例4(187.38mg/L)、对比例5(14.64mg/L)相比较，差异明显。说明在同样药性培养基配比情况下，如果不按照在本发明的操作步骤或条件，无法达到本发明的有益的效果；与对比例6为102.88mg/L、对比例7和对比例8为未检出、对比例9为10.33mg/L(药用菌质配比不同)，差异明显，说明在依照本发明的操作步骤或条件下，但不按照本发明的药性培养基配比，依然无法达到本发明的有益的效果。按照本发明的药性培养基比例制备的药性培养基可以起到比单个药材或几种药材组成的培养基的的效果更好，能起到最佳的效果。
从表1结果可以看出，对于保湿功效评价，实验例1-4的的评分在4.1-4.2，与对比例1(评分为3.0)、对比例2(评分为3.8)、对比例3(评分为3.7)、对比例4(评分为3.1)、对比例5(评分为3.3)相比较，结果具有一定差异，尤其是对比例1与对比例4，差异明显，说明在同样药性培养基配比情况下，如果不按照在本发明的操作步骤或条件，无法达到本发明的有益的效果；与对比例6(评分为3.8)、对比例7(评分为3.0)、对比例8(评分为3.0)、对比例9(评分为3.3)相比(药用菌质配比不同)，有一定的差异，尤其是对比例7、对比例8和对比例9，差异明显，说明在依照本发明的操作步骤或条件下，但不按照本发明的药性培养基配比，依然无法达到本发明的有益的效果。按照本发明的药性培养基比例制备的药性培养基可以起到比单个药材或几种药材组成的培养基的的效果更好，能起到最佳的效果。
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果。
实验例3抗氧化性能检测
DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基其乙醇溶液呈紫色并在517nm处有强烈吸收在有自由基清除剂存在时自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色褪色程度与其接受的电子呈定量关系在517nm处的吸光度变小其变化程度与自由基清除程度呈线形关系即自由基清除剂的清除自由基能力越强吸光度越小。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(2mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1)；(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2)；(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A3)；(4)反应40min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[1－(A1－A3)/A2]×100％
IC50为半数抑制率浓度：也就是指自由基清除率为50％时的自由基清除剂的浓度。IC50值是评价自由基清除剂效果的常用指标，其值越小表示达到50％自由基清除率时所用的自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果也就越好。在作出二步发酵产物对DPPH自由基清除作用曲线后，计算IC50值表示其抗氧化活性。结果如下表2所示：
表2、二步发酵产物清除DPPH自由基的IC50值
样品 IC<sub>50</sub>(μg/mL)
实施例1 10.24
实施例2 29.35
实施例3 35.98
实施例4 38.43
对比例1 854.55
对比例2 142.54
对比例3 103.42
对比例4 243.38
对比例5 264.13
对比例6 143.65
对比例7 189.54
对比例8 164.38
对比例9 174.88
由表2可知，实施例1所得二步发酵产物对DPPH清除作用的IC50＝10.24μg/mL，而与传统的水提法的854.55μg/mL(对比例1)和直接发酵法的142.55μg/mL(对比例2)相比，有显著性差异(P＜0.05),与不同发酵条件下的比对(对比例3、对比例4、对比例5)同样有显著性差异(P＜0.05)。从上述结果可以看出，在相同药性培养基比例条件下，二次发酵产物的抗氧化性效果远优于传统水提法和直接发酵法，而且不在本发明的发酵条件范围内，其他的发酵条件所得到的二次发酵产物其抗氧化性效果也低于实施例1；在与不同比例药用培养基相比，(对比例6、对比例7、对比例8、对比例9)仍然有显著性差异(P＜0.05)。从结果可以看出，按照本发明的药性培养基比例制备的药性培养基可以起到比单个药材或几种药材组成的培养基的的效果更好。上述结果可以说明二步发酵产物具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，从而延缓细胞老化，促进皮肤的修复。
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果。
试验例4
体外实验探讨二步发酵产物对角质形成细胞株HaCaT细胞分泌神经酰胺、游离脂肪酸和透明质酸的影响。
用10％FBS的DMEM培养基培养角质形成细胞株HaCaT细胞，设空白对照组(不添加二步发酵产物)、实施例1的二步发酵产物(50μmol/ml)组(实验组)，分别于0h,24h,48h取实验组与对照组上清液，用ELISA方法检测上清液中神经酰胺、游离脂肪酸、透明质酸含量，结果见表2。
表3、ELISA法检测二步发酵产物对角质形成细胞HaCaT细胞分泌神经酰胺、游离脂肪酸和透明质酸的影响结果
*P&lt;0.05
通过上述体外试验的结果显示,与空白对照相比，二步发酵产物能够明显促进角质形成细胞HaCaT分泌神经酰胺、游离脂肪酸和透明质酸等促进皮肤修复的成分，而这些物质能够促进皮肤表层屏障修复。
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果。
试验例5
体外实验探讨二步发酵产物对紫外线照射下皮肤成纤维细胞的保护作用研究。
用10％FBS的DMEM培养基培养HSf人皮肤成纤维细胞株，设立正常对照组(不进行紫外线照射、不加二步发酵产物)、紫外线照射组(进行紫外线照射、不加二步发酵产物)和紫外线照射+实施例1的二步发酵产物(50μg/ml)组,用日光模拟器SUV-1000照射连续照射10天，每天30min，照射量0.8J/cm2，总累计照射量8.0J/cm2，用细胞免疫组化法观察紫外线照射下成纤维细胞衰老标志物β-半乳糖糖苷酶以及基质金属蛋白酶MMP-1的变化。结果见表3：
表3、用细胞免疫组化法观察紫外线照射下成纤维细胞衰老标志物β-半乳糖糖苷酶以及基质金属蛋白酶MMP-1的变化结果
*P&lt;0.05
通过上述体外试验的结果显示，与紫外线照射组的结果相比，二步发酵产物对紫外线引起的皮肤成纤维细胞衰老及胶原蛋白的降解有明显的抑制和保护作用。
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果。
剂型例1：水剂
本实施例为制备一种水剂，各原料及含量如表4所示。制备步骤为：先在水中加入丙二醇、丁二醇、EDTA-2Na、透明质酸，加热调整至85℃，搅拌均匀，冷却至45度，加入实施例1的二次发酵产物，防腐剂，搅拌均匀。最后将PEG-40氢化蓖麻油和香精溶解于变性乙醇中，加入上述水溶液中，搅拌均匀，过滤，出料。
表4
原料 含量(％)
丙二醇 3.0
丁二醇 5.0
二次发酵产物 10.0
EDTA-2NA 0.1
透明质酸 0.1
变性乙醇 5
PEG-40氢化蓖麻油 适量
香精 适量
防腐剂 适量
水 余量
采用本发明实施例2-4的二步发酵产物进行相同的试验，同样可获得与实施例1相当的效果，制备得到水剂。
综上所述，本发明制备得到的二步发酵产物安全、无毒、无刺激、抗氧化能力强，具有非常明显的皮肤修复功效，可广泛应用于化妆品中，制备成具有皮肤修复功效的面膜、精华液或爽肤水等，市场前景广阔。且该制备方法稳定，适合大规模生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (11)

1.一种具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、菌类植物固体发酵：将药性培养基质接种菌类植物液体菌种，进行双向固体发酵制备药性菌质；
B、酿酒酵母菌液体深层发酵：将步骤A制得的药性菌质接种酿酒酵母菌进行液体深层发酵，得二步发酵液；
C、将步骤B所得二步发酵液灭菌、离心后，所得上清液即为二步发酵产物。
2.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤A中，所述药性培养基质包括以下重量百分含量的各组分：青稞60％-75％，山茶叶5％-15％、山茶花5％-10％、山茶籽5-10％、五味子3％-6％、竹叶3％-5％、人参1％-2％、甘草1％-2％、党参1％-2％、枸杞1％-2％。
3.根据权利要求2所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，所述药性培养基质的制备方法如下：将各组分按比例混合、粉碎，然后加水至水含量为50-55％，120℃-122℃灭菌1.0h-1.2h，即得。
4.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤A中，所述菌类植物液体菌种的接种量为5-10％。
5.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤A中，所述双向固体发酵的条件为：发酵温度在28-30℃，发酵时间在25-28天。
6.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤B中，所述酿酒酵母菌接种量为1％-2％，酿酒酵母菌的浓度为105-107CFU/mL。
7.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤B中，所述液体深层发酵的条件为：发酵温度28-30℃，发酵时间60-75h。
8.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，步骤B中，接种酿酒酵母菌前，所述药性菌质需进行前处理；所述前处理的步骤包括：将药性菌质溶于水，添加缓冲液后，120℃-122℃灭菌1.0h-1.2h；所述药性菌质与水的重量比为1-1.2:9。
9.根据权利要8所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，所述缓冲液采用磷酸和磷酸二氢钾配制，缓冲液的pH值为5.5-6.5；缓冲液的添加量为总体积的10％-15％。
10.根据权利要求1所述的具有皮肤修复功效的二步发酵产物制备方法，其特征在于，所述二步发酵产物中的总氨基酸含量范围在100-200mg/ml，β-葡聚糖的含量在40-80mg/L。
11.一种根据权利要求1所述方法制备的二步发酵产物在制备具有皮肤修复功效化妆品中的应用。
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