CN112245538A - 一种中药组合物、含有其的中药发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中药组合物、含有其的中药发酵物及其制备方法和应用，所述中药组合物包括杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉，运用君臣佐使的遣方用药原则，杏花为君药、豌豆为臣药、黑米为佐药、山茶花蜂花粉为使药，使得君药、臣药、佐药的功效得到高效发挥，各组分间协同增效，显著提高了中药组合物的美白抗氧化功效，利用所述中药组合物进行发酵反应，获得中药发酵物，所述中药发酵物具有优良的美白、抗氧化效果，且刺激性低，在美白、抗氧化化妆品领域具有广阔的发展前景。

Description

一种中药组合物、含有其的中药发酵物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于发酵技术领域，涉及一种中药组合物、含有其的中药发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
年龄增长、皮肤新陈代谢减慢，以及生活、工作压力和环境污染等各种因素，导致越来越多的人出现皮肤暗沉、斑点和松弛等肌肤问题，因此，美白抗氧化化妆品备受消费者青睐。
目前市场上美白抗氧化化妆品中的美白抗氧化剂主要为熊果苷、曲酸、BHT和维生素C 及其衍生物等，美白、抗氧化功效显著，但一定程度上会使皮肤产生过敏、刺激等不良反应，同时还存在不稳定和作用单一等问题。
中药发酵是根据中药(天然药物)的特性，采用发酵工程技术对中药进行加工，得到发酵组合物(包含中药成分、微生物、微生物代谢产物等)，并进行分离或不分离制成药剂。中药发酵的优点在于，发酵条件温和，中药活性成分结构不易被破坏，能够较完整地保留甚至提高中药的活性及功效。另外，研究表明，大部分的天然中药经微生物发酵后其毒性都有不同程度的降低，因为微生物在代谢过程中能将一些有毒物质分解或转化成毒性较低或无毒的物质，甚至能产生新的有效成分，因此，中药发酵物具有更加安全、高效、稳定的特点。
CN108578338A公开了一种提高中药抗氧化力的发酵方法，以总还原力、羟自由基清除率、总酚含量及酪氨酸酶抑制率为指标，筛选出一种新型美白中药五倍子，并通过发酵反应提高其抗氧化能力、总酚含量及美白能力，通过酵母菌发酵五倍子，提高了其抗氧化能力和总酚含量，但其不能解决皮肤暗沉的问题。
CN108567912A公开了一种中药提取物及其酶解和发酵产物，所述中药提取物包括人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精，所述发酵产物为所述中药提取物经酶解反应和发酵反应获得，有效成分含量提高，且美白、保湿和抗氧化效果增强，但制备工艺复杂且成本高。
综上所述，提供一种具有美白抗氧化效果，能改善皮肤暗沉、斑点、松弛等问题且制备工艺简单、成本低的中药组合物及其发酵物，对于制备美白、抗氧化化妆品领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种中药组合物、含有其的中药发酵物及其制备方法和应用，所述中药组合物具备美白抗氧化功效，且制备工艺简单、成本低，含有其的化妆品能改善皮肤暗沉、斑点和松弛等皮肤问题。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种中药组合物，所述中药组合物包括杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉。
本发明的中药组合物中，杏花具有促进皮肤血液循环，延缓皮肤衰老，减少黑色素沉着的功效；豌豆含有多糖类和黄酮类等成分，能够促进皮肤新陈代谢及延缓皮肤衰老；黑米富含花色苷类成分，具有美白、抗氧化的功效；山茶花蜂花粉能够维持皮肤营养平衡。
本发明的中药组合物以中医理论为基础，运用君臣佐使的遣方用药原则，杏花为君药、豌豆为臣药、黑米为佐药、山茶花蜂花粉为使药，臣药豌豆能够增强君药杏花的促进皮肤新陈代谢和延缓皮肤衰老的功效，而佐药黑米能和君药、臣药相互配合，进一步提高美白和抗氧化效果，使药山茶花蜂花粉能够维持皮肤营养平衡及中药组合物体系稳定，使得君药、臣药、佐药的功效得到高效发挥，各组分间协同增效，显著提高了中药组合物的美白抗氧化功效。
优先地，所述杏花在所述中药组合物中的质量百分比为15％～50％，包括但不限于18％、 20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、38％、40％、42％、45％或48％，优选为30％～45％。
优选地，所述豌豆在所述中药组合物中的质量百分比为10％～40％，包括但不限于12％、 15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％或38％，优选为20％～35％。
优选地，所述黑米在所述中药组合物中的质量百分比为10％～30％，包括但不限于12％、 15％、18％、20％、22％、25％、26％或28％，优选为15％～25％。
优选地，所述山茶花蜂花粉在所述中药组合物中的质量百分比为5％～25％，包括但不限于8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％或24％，优选为10％～20％。
优选地，所述中药组合物按质量百分比包括杏花15％～50％、豌豆10％～40％、黑米10％～30％和山茶花蜂花粉5％～25％。
优选地，所述中药组合物按质量百分比包括杏花30％～45％、豌豆20％～35％、黑米15％～25％和山茶花蜂花粉10％～20％。
第二方面，本发明提供一种中药发酵组合物，所述中药发酵组合物包括第一方面所述的中药组合物。
优选地，所述中药发酵组合物还包括微生物菌液。
优选地，所述中药组合物和所述微生物菌液的配比为(3～12)g:(5～15)mL，包括但不限于4 g:7mL、6g:9mL、8g:10mL、10g:13mL或11g:14mL。
优选地，所述微生物菌液包括枯草芽孢杆菌菌液。
优选地，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌ATCC 6633(Bacillus subtilisATCC 6633)。
优选地，所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度为106CFU/mL～108CFU/mL。
第三方面，本发明提供一种中药发酵物，所述中药发酵物的制备原料含有第二方面所述的中药发酵组合物。
第四方面，本发明提供第三方面所述中药发酵物的制备方法，所述制备方法包括对第二方面所述的中药发酵组合物进行发酵反应，得到所述的中药发酵物。
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉粉碎后混合，制备中药组合物；
(2)向中药组合物中接种微生物菌液，进行发酵反应；
(3)收集清液，即得到所述中药发酵物。
优选地，所述步骤(1)在粉碎后还包括过筛的步骤。
优选地，所述过筛的目数为100～150目，包括但不限于110目、120目、130目或140目。
优选地，步骤(2)所述发酵反应的pH为6～8，包括但不限于6.5、7或7.5。
优选地，步骤(2)所述发酵反应的转速为100～150rpm，包括但不限于110rpm、120rpm、 130rpm或140rpm。
优选地，步骤(2)所述发酵反应的温度为35～42℃，包括但不限于36℃、38℃、40℃或41℃。
优选地，步骤(2)所述发酵反应的时间为36～60h，包括但不限于38h、40h、44h、48h、52h、56h或58h。
优选地，步骤(3)所述收集清液包括：收集发酵反应液离心，取上清液进行过滤。
优选地，所述离心的转速为8000～12000rpm，包括但不限于9000rpm、9500rpm、10000 rpm、11000rpm或11500rpm。
优选地，所述离心的时间为20～40min，包括但不限于22min、25min、30min、32min、35min或38min。
优选地，所述过滤为使用滤膜进行过滤。
优选地，所述滤膜的规格为0.2～0.4μm滤膜。
作为优选的技术方案，所述中药发酵物的制备方法包括如下步骤：
(1)将杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎并过100～150目筛，按重量百分比为杏花30％～45％、豌豆20％～35％、黑米15％～25％和山茶花蜂花粉10％～20％，将各原料混合制备中药组合物；
(2)向中药组合物中接种浓度为106CFU/mL～108CFU/mL的枯草芽孢杆菌菌液，并加入无菌水，中药组合物和枯草芽孢杆菌菌液的配比为(3～12)g:(5～15)mL，调节pH为6～8，100～150rpm、35～42℃下发酵36～60h；
(3)将发酵反应液于8000～12000rpm离心20～40min，取上清液过0.2～0.4μm滤膜，即得到所述中药发酵物。
本发明中，将枯草芽孢杆菌接种于第一方面所述的中药组合物中进行发酵反应，发酵反应过程中，枯草芽孢杆菌的代谢活动能够改变中药组合物的组成，获得的中药发酵物的美白、抗氧化效果进一步增强。
第五方面，本发明提供一种化妆品，所述化妆品包括第二方面所述的中药发酵组合物或第三方面所述的中药发酵物。
优选地，所述中药发酵物在所述化妆品中的质量百分比为1％～10％，包括但不限于1.5％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％。
优选地，所述化妆品还包括多元醇、防腐剂、增稠剂、油脂或pH调节剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述化妆品的剂型包括水剂、乳剂、膏霜、面膜、精华、啫喱或喷雾剂中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的中药组合物以中医理论为基础，运用君臣佐使的遣方用药原则，杏花为君药、豌豆为臣药、黑米为佐药、山茶花蜂花粉为使药，臣药豌豆能够增强君药杏花的促进皮肤新陈代谢和延缓皮肤衰老的功效，而佐药黑米能和君药、臣药相互配合，进一步提高美白和抗氧化效果，使药山茶花蜂花粉能够维持皮肤营养平衡及中药组合物体系稳定，使得君药、臣药、佐药的功效得到高效发挥，各组分间协同增效，显著提高了中药组合物的美白抗氧化功效；
(2)本发明中，将枯草芽孢杆菌接种于所述中药组合物中进行发酵反应，发酵反应过程中，枯草芽孢杆菌的代谢活动能够改变中药组合物的组成，获得的中药发酵物的美白、抗氧化效果进一步增强，酪氨酸酶半抑制率均低于123.13μg/mL，最低为99.26μg/mL，DPPH半清除率均低于15.21μg/mL，最低为12.58μg/mL；
(3)本发明的中药发酵物的制备方法，操作简单，成本低，适合应用于大规模生产；
(4)本发明的含有所述中药发酵物的化妆品，具备优良的美白提亮功效，受试志愿者皮肤黑红色素总量明显降低，平均降低15.1％，最高为15.5％，还具备优良的抗氧化功效，能够改善皮肤暗沉、斑点、松弛、皱纹、粗糙及干燥等问题，具体表现为受试志愿者使用30 天后的皮肤弹性平均增加8.6％以上，最高为10.3％；皱纹平均减少9.1％以上，最高为10.8％；皮肤光滑度平均提高17.9％以上，最高为18.6％；水润度平均提高19.1％以上，最高为20.1％；
(5)含有本发明的中药发酵物的化妆品在美白、抗氧化化妆品领域具有广阔的发展前景。
附图说明
图1为应用实施例1样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图2为应用实施例2样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图3为应用实施例3样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图4为应用实施例4样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图5为应用实施例5样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图6为应用实施例6样品皮肤红黑色素变化测试结果；
图7为应用实施例1样品皮肤状态变化测试结果；
图8为应用实施例2样品皮肤状态变化测试结果；
图9为应用实施例3样品皮肤状态变化测试结果；
图10为应用实施例4样品皮肤状态变化测试结果；
图11为应用实施例5样品皮肤状态变化测试结果；
图12为应用实施例6样品皮肤状态变化测试结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中，Bacillus subtilis ATCC 6633购买于广东微生物菌种保藏中心。
实施例1
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花15％、豌豆40％、黑米30％和山茶花蜂花粉15％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过150目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取5g所述中药组合物加入100g无菌水，将8mL浓度为108CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至7.0，置于37℃、120rpm的摇床中培养48h，得到发酵反应液；
(3)将发酵反应液于10000rpm下离心30min，收集上清液，过0.4μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
实施例2
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花50％、豌豆10％、黑米15％和山茶花蜂花粉25％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过100目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取5g所述中药组合物加入100g无菌水，将8mL浓度为108CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至6，置于35℃、150rpm 的摇床中培养60h，得到发酵反应液；
(3)将发酵反应液于8000rpm下离心40min，收集上清液，过0.2μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
实施例3
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花50％、豌豆35％、黑米10％和山茶花蜂花粉5％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过150目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取5g所述中药组合物加入100g无菌水，将8mL浓度为108CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至8，置于42℃、100rpm 的摇床中培养36h，得到发酵反应液；
(3)将发酵反应液于12000rpm下离心20min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
实施例4
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花35％、豌豆30％、黑米20％和山茶花蜂花粉15％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过150目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取5g所述中药组合物加入100g无菌水，将8mL浓度为108CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至7，置于37℃、120rpm 的摇床中培养48h，得到发酵反应液；
(3)将发酵反应液于10000rpm下离心30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
实施例5
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花35％、豌豆35％、黑米20％和山茶花蜂花粉10％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过150目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取3g所述中药组合物加入100g无菌水，将5mL浓度为106CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至6，置于35℃、100rpm 的摇床中培养36h，得到发酵反应液；
(3)将发酵反应液于10000rpm下离心30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
实施例6
本实施例提供一种中药发酵物，所述中药发酵物以中药组合物为原料进行发酵得到，所述中药组合物按质量百分比为杏花40％、豌豆20％、黑米30％和山茶花蜂花粉10％，制备方法包括以下步骤：
(1)按比例取杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎，过150目筛，即获得所述中药组合物；
(2)取12g所述中药组合物加入100g无菌水，将15mL浓度为106CFU/mL的Bacillussubtilis ATCC 6633菌液接种至中药组合物与无菌水中，调节pH至7，置于37℃、120rpm 的摇床中培养48h，得到发酵反应液；
(2)将发酵反应液于10000rpm下离心30min，收集上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液，即得到所述中药发酵物。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为杏花100％，其它与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为豌豆100％，其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为黑米100％，其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为山茶花蜂花粉100％，其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为杏花40％、豌豆35％和黑米25％，其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为杏花40％、豌豆35％和山茶花蜂花粉25％，其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为杏花40％、黑米35％和山茶花蜂花粉25％，其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，区别仅在于所述中药组合物按质量百分比为豌豆40％、黑米35％和山茶花蜂花粉25％，其它与实施例1相同。
对比例9
与实施例1相比，区别仅在于将8mL浓度为108CFU/mL的Bacillus subtilis ATCC6633 菌液替换为8mL无菌水，其它与实施例1相同。
应用实施例1
本应用实施例提供一种美白抗氧化柔肤水，所述爽肤水的配方如表1所示。
表1
成分 质量分数(％)
去离子水 余量
1,3-丁二醇 7.00
甘油 5.00
EDTA二钠 0.02
D-泛醇 0.50
对羟基苯乙酮 0.50
苯氧乙醇 0.30
实施例2中药发酵物 5.0
制备方法：将丁二醇、甘油、EDTA二钠、D-泛醇、对羟基苯乙酮、苯氧乙醇和中药组合物发酵液加入去离子水中，搅拌至完全溶解，并进行真空脱气处理，即得到所述美白抗氧化柔肤水。
应用实施例2
本应用实施例提供一种美白抗氧化精华液，所述美白抗氧化精华液的配方如表2所示。
表2
Figure BDA0002747990520000091
Figure BDA0002747990520000101
制备方法包括以下步骤：
(1)将A相加热至70℃溶解完全；
(2)降温至45℃，加入B相，搅拌均匀；
(3)加入C相，溶解，搅拌均匀，即获得所述美白抗氧化精华液。
应用实施例3
本应用实施例提供一种美白抗氧化霜，所述美白抗氧化霜的配方如表3所示。
表3
Figure BDA0002747990520000102
制备方法包括以下步骤：
(1)将A相加热到70℃溶解完全；
(2)将B相加热至70℃溶解完全；
(3)边搅拌边将A相加入到B相中，70℃搅拌20min，均质1min；
(4)降温至45℃，加入C相，搅拌均匀，即获得所述美白抗氧化霜。
应用实施例4
本应用实施例提供一种美白抗氧化霜，所述美白抗氧化霜的配方如表4所示。
表4
Figure BDA0002747990520000111
制备方法同应用实施例3。
应用实施例5
本应用实施例提供一种美白抗氧化霜，所述美白抗氧化霜的配方如表5所示。
表5
Figure BDA0002747990520000121
制备方法同应用实施例3。
应用实施例6
本应用实施例提供一种美白抗氧化精华液，所述美白抗氧化精华液的配方如表6所示。
表6
Figure BDA0002747990520000122
Figure BDA0002747990520000131
制备方法包括以下步骤：
(1)将A相加热至70℃溶解完全；
(2)降温至45℃，加入B相，搅拌均匀；
(3)加入C相，溶解，搅拌均匀，即获得所述美白抗氧化精华液。
试验例1红细胞溶血实验
红细胞溶血实验是兔眼刺激性实验的替代方法之一，基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤，本试验例依照欧洲替代方法验证中心的红细胞溶血实验测试方法(ECVAM.ECVAM DB-ALM:INVITOX Protoco,Red bloodcells test system.INVITOX No.37.Ispra.Italy:ECVAM,1994.)，分级标准如表7所示，其中HD50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，DI为蛋白质变性指数，L/D为HD50与DI的比值，取实施例 1-6以及对比例1～9制备的样品进行红细胞溶血实验，实验结果如表8所示，
表7
L/D 分级
>100 无刺激性
10<L/D≤100 微刺激性
1<L/D≤10 轻度刺激性
0.1<L/D≤1 中度刺激性
L/D≤0.1 重度刺激性
表8
Figure BDA0002747990520000132
Figure BDA0002747990520000141
由表8可知，实施例1-6和对比例1-9制备的样品分级均为无刺激性，实施例1-6采用含有杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉的中药组合物为原料制备中药发酵物，所述中药发酵物的HD50均高于76027mg/L，最高为80234mg/L，DI均低于0.36％，最低为0.25％，与之相比，对比例1-8未采用同时含有杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉的中药组合物为原料，对比例9未接种枯草芽孢杆菌进行发酵反应，对比例1-9制备的中药发酵物的HD50均低于66159mg/L，最低为40235mg/L，DI均高于0.45％，最高为1％，表明对比例1-9制备的中药发酵物在较低浓度下就能使50％的红细胞发生溶血，且对蛋白质的破坏程度更高，由此说明，本发明同时采用杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉，使得各组分间协同增效，结合接种枯草芽孢杆菌进行发酵反应，能够显著降低中药发酵物的毒副作用和刺激性。
试验例2抑制酪氨酸酶活性研究
酪氨酸酶是皮肤黑色素形成过程中的关键酶及限速酶，黑色素合成的数量和速度与酪氨酸酶的活性成正相关，抑制酪氨酸酶的活性则可减少或阻止黑色素的生成，从而达到美白效果。
取实施例1-6以及对比例1-9制备的样品进行试验。
分别将实施例1-6和对比例1-9制备的样品以及曲酸标准溶与0.5mmol/L的L-酪氨酸溶液、pH为6.86的PBS缓冲溶液、100U/mL的酪氨酸酶水溶液混合，置于37℃恒温水浴锅中保温备用。
(1)酪氨酸酶活力的测定
向比色皿中依次加入1.4mL PBS缓冲溶液、0.8mL L-酪氨酸溶液，再加入0.4mL的100 U/mL的酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，并测定混合液在波长为475nm下的吸光值，每30s检测一次，共检测10min，绘制吸光值随时间变化的增长直线，并计算直线斜率，记为k0。
(2)待测样品对酪氨酸酶抑制率的测定
向比色皿中依次加入0.4mL待测样品、1.0mL PBS缓冲溶液、0.8mL酪氨酸溶液，再加入0.4mL 100U/mL的酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，测定混合液在波长为475nm下的吸光值，每30s检测一次，共检测10min，绘制吸光值随时间变化的增长直线，并计算直线斜率，记为k，酪氨酸酶抑制率(I，％)按式(1)所示公式进行计算，酪氨酸酶半抑制率(μg/mL) 为酪氨酸酶抑制率达到50％时样品的浓度，酪氨酸酶半抑制率越低，说明样品抑制酪氨酸酶活性的能力越强，美白效果越好。
I＝(1-k/k0)×100％ (1)
按上述步骤依次测定丁二醇、曲酸、实施例1-6、对比例1-9制备的样品的酪氨酸酶半抑制率，结果如下表9所示。
表9
Figure BDA0002747990520000151
Figure BDA0002747990520000161
由表9可知，实施例1-6采用含有杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉的中药组合物为原料制备中药发酵物，所述中药发酵物的酪氨酸酶半抑制率均低于123.13μg/mL，最低为99.26 μg/mL，与之相比，对比例1-9制备的中药发酵物的酪氨酸酶半抑制率均较高，均高于171.35 μg/mL，最高为401.44μg/mL，酪氨酸酶半抑制率越低，表明样品抑制酪氨酸酶活性的能力越强，美白效果越好，综合上述表明，本发明同时采用杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉，使得各组分间协同增效，结合接种枯草芽孢杆菌进行发酵反应，能够显著提高中药发酵物的美白效果。
试验例3清除DPPH自由基能力的研究
清除DPPH自由基能力在一定程度上能反应样品的抗氧化能力，DPPH自由基清除率越大，表明抗氧化能力越强，抗衰老能力越强，因此，可以通过检测DPPH自由基清除率来判断样品的抗衰老效果。
取实施例1-6以及对比例1-9制备的样品进行试验。
向试管中加入2mL质量浓度为47.7mg/L的DPPH测试液和一定量的待测样品，总体积用无水乙醇补充至3mL，摇匀，避光反应30min后，将混合液置于1cm的比色皿中检测在517nm波长处的吸光度，记为As；向试管中加入2mL无水乙醇和0.4mL待测样品，总体积用无水乙醇补充至3mL，并检测其在517nm波长处的吸光度，记为Ar；向试管中加入2mL DPPH测试液和1mL无水乙醇，并检测其在517nm波长处的吸光度，记为Ao。
DPPH自由基清除率(Y，％)的计算公式为如式(2)所示，DPPH半清除率(μg/mL) 为DPPH自由基清除率达到50％时样品的浓度，DPPH半清除率越低，表明样品清除DPPH 自由基能力越强，抗氧化效果越好。
Y＝[1-(As-Ar)/Ao]×100％ (2)
按上述步骤依次测定丁二醇、VC标准溶液、实施例1-6以及对比例1-9制备的样品的DPPH半清除率，结果如表10所示。
表10
样品名称 DPPH半清除率(μg/mL)
实施例1 15.21
实施例2 14.98
实施例3 14.32
实施例4 12.58
实施例5 13.71
实施例6 13.35
对比例1 43.98
对比例2 46.66
对比例3 50.43
对比例4 66.39
对比例5 30.62
对比例6 31.37
对比例7 35.16
对比例8 34.67
对比例9 29.25
VC 9.67
丁二醇 >500000
由表10可知，实施例1-6采用含有杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉的中药组合物为原料制备中药发酵物，所述中药发酵物的DPPH半清除率均低于15.21μg/mL，最低为12.58μg/mL，与之相比，对比例1-9制备的中药发酵物的DPPH半清除率均较高，均高于29.25 μg/mL，最高为66.39μg/mL，DPPH半清除率越低，表明样品清除DPPH自由基能力越强，抗氧化效果越好，综合上述表明，本发明同时采用杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉，使得各组分间协同增效，结合接种枯草芽孢杆菌进行发酵反应，能够显著提高中药发酵物的抗氧化效果。
应用试验例1对人体皮肤美白效果的研究
人体皮肤的颜色与皮肤中的色素种类和数量有关，其中黑红色素对皮肤颜色的影响最大。皮肤中含有的黑红色素越多则肤色越深，反之，皮肤中含有的黑色素红越少则肤色越浅。因此，可以通过测量皮肤中黑红色素的含量变化评价样品的美白效果。
以应用实施例1-6制备的样品进行人体皮肤试验。
选取健康、皮肤正常且无化妆品过敏史的女性志愿者60名，年龄为25～40岁，测试前，先对志愿者的脸部进行空白测试，将志愿者均分为6组，每组志愿者分别使用应实施例1-6 制备的样品，每天早晚各使用一次，并在使用后第2、4、6和8周使用皮肤黑色素和血红素测试仪(MX18)进行皮肤黑红色素含量测试，计算各组志愿者皮肤黑红色素的平均变化率，结果如图1-图6所示。
从图1-图6可知，志愿者在使用应实施例1-6制备的样品的第2周、4周、6周和8周后，黑色素和红色素含量均明显降低，黑红色素总含量降低显著，志愿者肤色亮度增加，说明由本发明中药发酵物制备的化妆品，具有优良的美白提亮的功效。
应用试验例2对人体皮肤抗衰效果的研究
以应用实施例1-6制备的样品进行试验。
选取健康、皮肤正常且无化妆品过敏史的女性志愿者60名，年龄为25～40岁，将志愿者均分为6组，每组志愿者分别使用应用实施例1-6制备的样品，连续使用30天，并使用面部图像分析仪(Visia)、皮肤弹性测试仪(MPA580)、皮肤水份测试仪(Probe CorneometerCM825)跟踪检测志愿者面部皮肤变化情况，以皮肤弹性、皱纹、光滑度、水润度为指标来评价样品的抗衰老效果。试验结果如图7-图12所示，结果为所得实验数据平均值。
人体皮肤衰老的主要表现为皮肤开始松弛、出现皱纹、变得粗糙、干燥等现象的出现，由图7-图12可知，志愿者在使用添加了本发明的中药发酵物的样品后，30天后的皮肤弹性平均增加8.6％以上，最高为10.3％，皱纹平均减少9.1％以上，最高为10.8％，皮肤光滑度平均提高17.9％以上，最高为18.6％，水润度平均提高19.1％以上，最高为20.1％，皮肤衰老情况均明显改善，说明由本发明的中药发酵物制备的化妆品具备优良的抗衰老功效。
综上所述，本发明中，中药组合物以中医理论为基础，运用君臣佐使的遣方用药原则，杏花为君药、豌豆为臣药、黑米为佐药、山茶花蜂花粉为使药，使得君药、臣药、佐药的功效得到高效发挥，各组分间协同增效，显著提高了中药组合物的美白抗氧化功效；将枯草芽孢杆菌接种于所述中药组合物中进行发酵反应，发酵反应过程中，枯草芽孢杆菌的代谢活动能够改变中药组合物的组成，获得的中药发酵物的美白、抗氧化效果进一步增强；含有所述中药发酵物的化妆品在美白、抗氧化化妆品领域具有广阔的发展前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物包括杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述杏花在所述中药组合物中的质量百分比为15％～50％，优选为30％～45％；
优选地，所述豌豆在所述中药组合物中的质量百分比为10％～40％，优选为20％～35％；
优选地，所述黑米在所述中药组合物中的质量百分比为10％～30％，优选为15％～25％；
优选地，所述山茶花蜂花粉在所述中药组合物中的质量百分比为5％～25％，优选为10％～20％；
优选地，所述中药组合物按质量百分比包括杏花15％～50％、豌豆10％～40％、黑米10％～30％和山茶花蜂花粉5％～25％；
优选地，所述中药组合物按质量百分比包括杏花30％～45％、豌豆20％～35％、黑米15％～25％和山茶花蜂花粉10％～20％。
3.一种中药发酵组合物，其特征在于，所述中药发酵组合物包括权利要求1或2所述的中药组合物。
4.根据权利要求3所述的中药发酵组合物，其特征在于，所述中药发酵组合物还包括微生物菌液；
优选地，所述中药组合物和所述微生物菌液的配比为(3～12)g:(5～15)mL；
优选地，所述微生物菌液包括枯草芽孢杆菌菌液；
优选地，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌ATCC 6633；
优选地，所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度为106CFU/mL～108CFU/mL。
5.一种中药发酵物，其特征在于，所述中药发酵物的制备原料含有权利要求3或4所述的中药发酵组合物。
6.根据权利要求5所述中药发酵物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对权利要求3或4所述的中药发酵组合物进行发酵反应，得到所述的中药发酵物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉粉碎后混合，制备中药组合物；
(2)向中药组合物中接种微生物菌液，进行发酵反应；
(3)收集清液，即得到所述中药发酵物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)在粉碎后还包括过筛的步骤；
优选地，所述过筛的目数为100～150目；
优选地，步骤(2)所述发酵反应的pH为6～8；
优选地，步骤(2)所述发酵反应的转速为100～150rpm；
优选地，步骤(2)所述发酵反应的温度为35～42℃；
优选地，步骤(2)所述发酵反应的时间为36～60h；
优选地，步骤(3)所述收集清液包括：收集发酵反应液离心，取上清液进行过滤；
优选地，所述离心的转速为8000～12000rpm；
优选地，所述离心的时间为20～40min；
优选地，所述过滤为使用滤膜进行过滤；
优选地，所述滤膜的规格为0.2～0.4μm滤膜。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将杏花、豌豆、黑米和山茶花蜂花粉进行粉碎并过100～150目筛，按重量百分比为杏花15％～50％、豌豆10％～40％、黑米10％～30％和山茶花蜂花粉5％～25％，将各原料混合制备中药组合物；
(2)向中药组合物中接种浓度为106CFU/mL～108CFU/mL的枯草芽孢杆菌菌液，并加入无菌水，中药组合物和枯草芽孢杆菌菌液的配比为(3～12)g:(5～15)mL，调节pH为6～8，100～150rpm、35～42℃下发酵36～60h；
(3)将发酵反应液于8000～12000rpm离心20～40min，取上清液过0.2～0.4μm滤膜，即得到所述中药发酵物。
10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包括权利要求3或4所述的中药发酵组合物或者权利要求5所述的中药发酵物；
优选地，所述中药发酵物在所述化妆品中的质量百分比为1％～10％；
优选地，所述化妆品还包括多元醇、防腐剂、增稠剂、油脂或pH调节剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述化妆品的剂型包括水剂、乳剂、膏霜、面膜、精华、啫喱或喷雾剂中的任意一种。
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