KR20170085872A - 율피 효소 분해물의 발효물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents

율피 효소 분해물의 발효물을 포함하는 미백용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 미백활성을 갖는 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 식품 조성물 및 색소 침착 저해용 약학 조성물 및 이들을 포함하는 화장품, 식품 및 약재에 관한 것으로 본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물은 세포독성을 나타내지 않으면서도, 우수한 티로시나아제의 효소 저해 활성, 멜라닌 생합성 및 그와 관련된 유전자들의 발현을 저해하는 효과가 있어 피부 미백, 색소 침착의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 오랫동안 식용으로 사용되던 식물로부터 유래된 것으로 인공적으로 합성된 화합물과 달리 부작용 및 안전성이 문제되지 않아 화장품, 의약품 또는 건간식품 등의 제조에 유용하다.

Description

율피 효소 분해물의 발효물을 포함하는 미백용 조성물{COMPOSITION FOR WHITENING CONTAINING Fermented Castanea crenata inner shell extracts}
본 발명은 발효 율피 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
최근 급속한 산업화에 따른 환경오염으로 인한 오존층의 파괴와 잦은 야외활동으로 인한 자외선 노출이 피부변화를 증가시키는 추세이다. 자외선으로 인한 피부 손상, 광노화 및 색소침착 등은 현대인들로부터 피부에 대한 관심을 유도시켰으며, 화장품 기술의 발전에 따라 화장품의 고급화와 다양한 효능을 갖는 복합성 및 기능성 제품에 관심이 날로 높아지고 있다. 최근 기능성 화장품 산업에서 연구가 가장 활발하게 진행되고 있는 분야는 피부 노화 방지와 피부 미백이며, 국내 화장품 시장에서의 기능성 화장품 매출과 세계 화장품 시장의 규모 또한 꾸준히 증가하고 있다.
인간의 피부색을 결정짓는데 가장 근본적인 내적인자는 멜라닌(melanin)이다. 멜라닌은 천연 피부 색소로, 표피 기저층에 존재하는 멜라닌세포의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되어 수상돌기를 통해 표피의 각질세포로 이동하여 피부의 색상을 결정하는 주요한 인자이며, 자외선이나 외부 자극물질로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 그러나, 멜라닌 색소의 과발현 및 축적은 기미, 주근깨, 피부반점 등과 같은 과색소 침착 현상을 유발하며, 피부노화를 촉진하는 등 미용적인 면에서 부정적인 기능을 나타낸다.
멜라닌 세포가 자외선, 약물, α-MSH 또는 사이토카인(cytokine)등의 외인성 및 내인성 인자에 노출되면, 아미노산인 티로신(tyrosine)이 티로시나아제(tyrosinase)의 촉매작용으로 수산화(hydroxylation)되어 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)를 생성하며, 다시 DOPA가 티로로시나아제(tyrosinase)에 의해 산화되어 도파퀴논(DOPA-quinone)이 되면서 두 가지 방향으로 멜라닌 색소를 형성한다. 첫째, 검은색이나 갈색을 나타내는 유멜라닌(eumelanin) 색소가 생성되는 경로는 다음과 같다. 도파퀴논(DOPA-quinone)이 도파크롬(DOPA-chrome)으로 전환되고, 도파크롬(DOPA-chrome)이 TRP-2 (DOPA-chrome tautomerase)에 의해 DHICA(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)로 변환되고, TRP-1(DHICA oxidase)에 의해 인돌-5,6-퀴논-2-카르복시산(indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid)으로 전환되어 유멜라닌(eumelanin)을 생성하는 경로와, 도파크롬(DOPA-chrome)이 자동산화 되어 DHI(5,6-dihydroxyindole)으로 전환된 후 티로시나아제(tyrosinase) 작용에 의해 인돌-5,6-퀴논(indole-5,6-quinone)으로 전환되어 유멜라닌(eumelanin)을 생성하는 경로가 있다. 둘째, 노란색이나 붉은색을 나타내는 페오멜라닌(pheomelanin) 색소가 생성되는 경로는 다음과 같다. 도파퀴논(DOPA-quinone)이 시스테인(cysteine)과 글루타티온(glutathion)의 작용을 받아 시스테닐--DOPA (cystenyl-DOPA)로 전환되고, 엔조티아진 알라닌(enzothiazine alanine)으로 전환되면서 페오멜라닌(pheomelanin)을 생성하는 경로이다.
멜라닌은 몇 가지 세포 내 신호전달 메커니즘(mechanism)을 통하여 합성되는데, 고리형 아데노신 1인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/프로테인 키나아제 A(PKA, protein kinase A)에 의한 경로, 다이아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)/프로테인 키나아제 C(protein kinase C, PKC)에 의한 경로 및 Ras 활성에 의존적인 미토겐 활성화 단백질 키나아제(mitogen activated protein kinase, MAPK)경로 등이 알려져 있다. 그 중, cAMP/PKA경로가 멜라닌 합성(melanogenesis)의 주요 경로로서 피부가 UV에 노출되었을 때, 세포 내 cAMP 농도가 증가되고, 하위 신호전달 분자인 PKA를 활성화 시키며, cAMP 반응요소결합단백질(cAMP response element binding protein, CREB)을 거쳐 마이크로프탈미아 전사 요소(microphthalmia transcription factor, MITF)의 발현을 증가시킨다. MITF는 멜라닌(melanin) 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로, 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2의 발현을 촉진한다. 또한, MAPKs에 속하는 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal regulated-kinase, ERK)는 세포의 증식과 분화에 관여하는데, ERK의 인산화(phosphorylation)와 활성화(activation)는 MITF의 인산화를 유도하여 MITF의 분해를 야기시켜 티로시나아제(tyrosinase)의 전사를 저해함으로써 멜라닌 합성을 억제한다.
최근 미백 기능성 화장품 소재로서의 사용을 목적으로 한 천연 향장 소재 개발에 관한 연구는 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성을 억제하는 물질의 연구, 멜라닌 생성(melanogenesis) 기전에 관련된 단백질의 발현을 조절하는 물질 및 멜라노좀의 이동을 억제하는 물질 등의 연구로 다양하게 이루어지고 있다. 현재 미백제로 사용되고 있는 원료는 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 아스코르브산(ascorbic acid) 등으로, 티로시나아제(tyrosinase) 저해재로 알려져 있다. 그러나 이들은 피부 안전성, 제형 안정성 등을 포함한 문제점이 있어 제한된 양만 사용하고 있다. 따라서 최근에는 인체에 무해하고 안정성이 높은 천연물, 한방 약용식물 등 천연 소재로 한 미백 작용기전 및 미백 효능에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
밤(Castanea creanata)은 폴리페놀성 탄닌이 많이 함유되어 있는 식품으로, 노화방지, 질병예방, 피로회복, 성인병 등에 유용한 효능을 나타내며, 카테킨 또한 함유되어 있어 노화와 암 발병 예방에 효과가 있으며, 식용, 약용, 가공식품 등으로 이용되고 있다. 밤은 과실뿐 아니라 밤나무 잎, 밤나무 껍질, 밤 열매의 외피 및 내피 등도 약재로 사용되고 있다. 밤 내피는 밤의 속껍질로 율피라고도 하며, 엘라그산(ellagic acid), 실린직산(syringic acid), 프로토카테쿠산(protocatechuic acid) 등의 페놀산(phenolic acid)이 다량 함유되어 있으며, 쿠마린(coumarin), 갈산(gallic acid) 그리고 카테킨(catechin)이 주로 함유되어 있다.
발효는 넓은 뜻으로 미생물에 의한 유용한 물질 생산으로 여길 수 있으며, 천연물 발효는 일반적으로 식물성 원료에 당을 첨가하여 자연발효 시키거나, 유산균 등의 미생물을 첨가하여 발효시킨다. 현재, 기존에 기능성이 알려진 다양한 천연물들을 발효시킴으로써 새로운 생리활성을 나타내는 물질 및 기능성을 강화하는 소재를 탐색하고, 이를 화장품 소재로써 활용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
따라서 본 발명자들은 기존의 율피 효능의 강화 방안 모색을 위한 연구의 일환으로 율피를 발효시켜 여러 생리활성에 대해 연구해왔으며, 발효 율피 추출물로부터 뛰어난 피부 미백 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-1554537 B KR 10-1564825 B
본 발명의 목적은 부작용 혹은 안정성에 대한 문제가 없으면서, 미백활성을 갖는 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 식품 조성물 및 색소 침착 저해용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품을 제공한다.
또한, 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물은 세포독성을 나타내지 않으면서도, 우수한 티로시나아제의 저해 활성, 멜라닌 생합성 및 그와 관련된 유전자들의 발현을 저해하는 효과가 있어 피부 미백, 색소 침착의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 오랫동안 식용으로 사용되던 식물로부터 유래된 것으로 인공적으로 합성된 화합물과 달리 부작용 및 안전성이 문제되지 않아 화장품, 의약품 또는 건강식품 등의 제조에 유용하다.
도 1은 발명의 일 실시예에 따른 율피 열수 추출물과 율피 효소 분해액의 발효물의 세포생존률을 확인한 그래프로, 가로축은 각 처리군을 나타내고, 세로축은 세포독성을 나타낸다. D.W./IBMX-는 대조군, D.W./IBMX+는 IBMX만 처리한 대조군, Arbutin/IBMX+는 알부틴 처리군을 나타낸다. A는 율피 열수 추출물 처리군, B는 율피 효소 분해액 처리군, C는 효모(yeast, S. cerevisiae)를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, D는 L. acidophilus를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, E는 L. plantarum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, F는 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, G는 L. fermentum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군 그리고 H는 B. subtilis를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군을 나타낸다.
도 2는 율피 열수 추출물과 율피 효소 분해액의 발효물의 멜라닌 생성 저해 효과를 보인 그래프로, 가로축은 각 처리군을 나타내고, 세로축은 대조군에 대한 멜라닌 함량의 상대값을 나타낸다. D.W./IBMX-는 대조군, D.W./IBMX+는 IBMX만 처리한 대조군, Arbutin/IBMX+는 알부틴 처리군을 나타낸다. A는 율피 열수 추출물 처리군, B는 율피 효소 분해액 처리군, C는 효모(yeast, S. cerevisiae)를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, D는 L. acidophilus를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, E는 L. plantarum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, F는 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, G는 L. fermentum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군 그리고 H는 B. subtilis를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군을 나타낸다.
도 3은 율피 효소 분해액의 발효물 (L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물)의 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 보인 그래프로, 가로축은 각 처리군을 나타내고, 세로축은 티로시나아제 활성을 나타낸다. Control은 대조군, Arbutin은 알부틴 처리군을 나타낸다.
도 4는 율피 효소 분해액의 발효물 (L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물)의 멜라닌 생성 저해 효과를 보인 그래프로, 가로축은 각 처리군을 나타내고, 세로축은 대조군에 대한 멜라닌 함량의 상대값을 나타낸다. D.W./IBMX-는 대조군, D.W./IBMX+는 IBMX만 처리한 대조군, Arbutin/IBMX+는 알부틴 처리군을 나타낸다.
본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 율피 효소 분해물의 발효물은 율피 추출물과 비교하여서도 우수한 멜라닌 합성 및 티로시나아제 활성을 효과적으로 억제할 수 있어 피부 미백에 우수한 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 용어 '율피'는 밤 외피를 제외한 밤 과육을 둘러싸고 있는 밤의 내피를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 율피는 율피 추출물 또는 열처리된 율피와 같은 율피에 처리를 가한 형태도 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 '율피 효소 분해물의 발효물'은 효소를 이용하여 율피를 분해시킨 분해물을 발효시킨 것을 의미한다. 일 예로, 상기 율피는 효소를 이용하여 율피 추출물을 분해하고, 상기 분해물을 발효시킨 것일 수 있다. 따라서, 상기 율피 효소 분해물의 발효물은 율피 효소 분해액의 발효물 일 수 있다.
본 명세서에서 '율피 효소 분해물의 발효물'은 '발효 율피 추출물'과 혼용하여 사용된다.
상기 '율피 효소 분해물'은 율피에 효소를 첨가하여 상기 효소에 의한 분해를 수행함으로써 제조할 수 있다. 상기 효소 분해물은 그 제형이 한정되지 않으며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다. 또한, 바람직하게는 액체 형태의 효소 분해액일 수 있다.
상기 효소로는 당분해 효소, 단백질분해효소, 섬유소분해효소, 펙틴분해효소, 셀루라아제 및 크실라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 '발효물'이란 상기 발효에 의하여 얻어진 결과물을 의미하고, 상기 '발효'란 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물과 같은 물질을 분해시키는 과정을 의미한다. 상기 발효는 발효의 대상 물질과 미생물을 함께 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 '발효물'은 '배양물'과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 발효물은 발효 미생물을 포함하는 것, 또는 발효 후에 미생물을 제균 즉 미생물을 제거한 여액일 수 있다. 상기 발효물은 그 제형이 한정되지 않으며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다. 또한, 상기 발효물은 발효에 의하여 얻어진 것 외에 상기 발효물을 가공한 가공물을 모두 포함한다. 구체적인 예로, 율피 효소 분해물을 발효한 후 얻어진 것을 감압 증류 및 동결건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것 일 수 있다.
상기 배양배지는 동물세포나 식물세포 또는 세균과 같은 미생물을 기르는데 필요한 영양소가 포함된 고체 또는 액체를 의미한다. 본 발명에 일 예로, 발효를 위한 발효 미생물을 기르기 위한 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, '미생물'은 단일세포 또는 균사로 몸을 이루며, 최소 생활단위를 영위하는 미세한 생물을 의미한다. 구체적으로는 율피 효소 분해액을 발효하는데 사용되는 접종 균주를 의미한다.
구체적인 일 예에 있어서, 상기 미생물은 바실러스, 유산균 및 효모를 포함하는 발효 균주 일 수 있다. 상기 바실러스, 유산균 또는 효모는 종래 통상적으로 이용되는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 바실러스는 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 사용할 수 있다.
또한, 유산균은 예를 들어, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidphilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 페디오코코스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
한편, 효모는 사카로마이세스 세레비세(Saccharomyces cerevisiae)를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 발효 균주로 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 바람직하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물은 락토바실러스 카세이에 의하여 발효된 것 일 수 있다. 상기 락토바실러스 카세이에 의하여 발효된 발효물은 다른 종을 이용한 발효물과 비교하여 우수한 멜라닌 합성 억제 효과와 티로시나아제 억제 효과를 갖는다.
상기 조성물은 피부 미백용일 수 있고, 다르게 표현하면 미백활성을 갖는 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 일 수 있다. 본 발명의 발효물은 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해 및/또는 멜라닌 억제를 통한 미백 활성을 갖다. 바람직하게는 상기 작용의 복합적인 효과에 의하여 미백활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 '미백'이란 멜라닌 등의 색소 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나, 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 모두 포함하는 의미 이다.
상기 멜라닌 억제는 멜라닌의 합성을 억제하는 것뿐만 아니라, 기존에 생성된 멜라닌을 억제, 그와 관련된 유전자들의 발현 억제를 모두 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 율피 효소 분해물의 발효물은
a) 율피를 열처리하는 단계;
b) 율피에 효소를 첨가하여 효소분해하는 단계;
c) 율피 효소 분해액을 멸균하는 단계;
d) 율피 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모를 접종하여 발효하는 단계;
e) 발효된 발효물을 살균하는 단계; 및
f) 여과, 농축, 건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
단계 a)는 율피를 열처리하는 단계로, 율피 중량 대비 5 내지 20배의 물을 첨가하고, 90℃ 이상에서 0.5 내지 3 시간 동안 열처리한 후, 45 내지 55℃까지 냉각할 수 있다.
단계 b)는 율피에 효소를 첨가하여 효소 분해하는 단계로, 상기 단계 a)에서 열처리된 율피에 효소를 율피 고형분 대비 1 내지 5 중량%를 가하고, 40-60℃에서 14 내지 18시간 동안 효소 분해할 수 있다.
상기 단계에 사용되는 효소의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 전술한 종류를 사용할 수 있고, 구체적으로, 셀룰라아제 및 아밀라아제를 사용할 수 있다.
상기 단계에 의해 율피 효소 분해물, 구체적으로 율피 효소 분해액이 제조된다.
단계 c)는 율피 효소 분해액을 멸균하는 단계로, 상기 단계 b)에서 제조된 효소분해액을 100 내지 150℃, 구체적으로 120 내지 130℃에서 20 내지 60 분간 멸균할 수 있다.
단계 d)는 율피 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모를 접종하는 단계로, 상기 단계 c)에서 멸균된 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모 배양액을 접종하여, 각 미생물(바실러스, 유산균, 효모)의 최적 배양조건으로 1 내지 3 일간 배양할 수 있다.
상기 바실러스, 유산균 또는 효모는 종래 일반적으로 이용되는 것을 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로, 전술한 종류를 사용할 수 있다.
상기 단계에 의해 율피 효소 분해액의 발효물이 제조된다.
단계 e)는 발효물을 살균하는 단계로, 상기 d) 단계에서 제조된 발효물을 90℃ 이상에서 1 내지 2 시간 동안 살균할 수 있다.
또한, 단계 f)는 여과, 농축 및 건조하는 단계로, 상기 단계 e)에의해 멸균된 발효액을 여과하고, 농축 및 건조하여, 율피 효소 분해액의 발효물의 분말을 최종 제조할 수 있다.
상기 단계에서 여과시, 여과 보조제를 추가로 첨가하여 여과할 수 있다. 여과에는 여과지를 사용할 수 있으며, 감압 여과 또는 가압여과 등의 방법을 사용할 수 있다.
농축은 발효액을 5 내지 10 vol%로 감압농축할 수 있으며, 건조는 분무건조 또는 동결건조를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 율피 효소 분해액의 발효물 분말의 예시적인 제조방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.
단계 a) 건조상태의 율피(밤 내피) 2 kg에 20 kg의 상수를 첨가하여 30 L 발효조에서 혼합하고, 95℃ 및 100 rpm에서 1시간 열처리하고 50℃까지 냉각하였다.
단계 b) 상기 단계 a)의 냉각액에 셀룰라아제 및 아밀라아제를 각각 율피 고형분 대비 1 중량%씩 가하여 50℃에서 16 시간 동안 효소분해하여 율피 효소 분해액을 얻었다.
단계 c) 상기 단계 b)에서 얻어진 효소 분해액을 회수하여, 121℃에서 30 분간 멸균하였다.
단계 d) 상기 단계 c)에서 멸균된 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모를 2% 농도로 접종하고, 37℃에서 2 일간 배양하여 발효물을 얻었다.
단계 e) 상기 단계 d)에서 얻어진 발효물을 95℃에서 100 rpm으로 1시간 동안 살균하였다.
단계 f) 상기 단계 e)의 살균된 율피 발효액을 여과(≤1μm)하였다. 상기 여과된 율피 발효액은 여과액 부피의 5 내지 10 vol%로 감압농축하고, 농축액은 건조하여 율피 효소 분해액의 발효물을 얻었다. 건조는 분무건조 또는 동결건조를 사용할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것 일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 제형에 따라서 통상적으로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있고, 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있고, 일 예로 유지 성분, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 자외선흡수제, 정제수 및 향로를 포함하는 통상적인 보조제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 추출물을 전체 조성물 대비 0.001 내지 50 중량%로 포함하는 것 일 수 있다. 상기 농도로 추출물을 포함하는 경우 세포독성을 나타내지 않아 안전하면서도, 우수한 미백효과를 가질 수 있다.
또한 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장품에 관한 것이다.
상기 화장품은 화장수류, 에센스류, 스킨류, 로션류, 크림류, 팩류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것 일 수 있다.
상기 화장품은 일 예로 스킨, 스킨소프터, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비소, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 및 상기 식품 조성물을 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.
일 예로, 율피 효소 분해액의 발효물은 식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 내지 50 중량부로 포함될 수 있다.
상기 율피 효소 분해액은 율피를 당분해효소, 단백질분해효소, 섬유소분해효소, 펙틴분해효소, 셀루라아제 및 크실라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소에 의해 분해하여 얻은 것 일 수 있다.
본 발명에서, 용어 '식품'이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서 건강기능식품, 기능성식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의도이다.
상기 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 및 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품, 기능성식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며, 건강기능음료를 포함하는 의도이다.
상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 포도당이나 과당 등과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 등과 같은 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등일 수 있다. 상기 향미제는 타우마틴이나 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제일 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 첨가량은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 중요하지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 포도당이나 과당 등과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 등과 같은 디사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등일 수 있다. 상기 향미제는 타우마틴이나 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제 또는 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제일 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 첨가량은 본 발명의 식품 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다.
그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 율피 효소 분해물의 발효물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있고, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
본 발명의 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명의 추출물은 필요에 따른 그 함량을 적절히 가감할 수 있고, 바람직하게는 전체 식품 100 중량%에 대하여 1 내지 15 중량%로 포함되도록 첨가할 수 있다.
또한 본 발명은 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 율피 효소 분해물의 발효물은 색소가 과다 침착된 피부에 적용되었을 때, 피부에서 멜라닌 합성 및 관련된 유전자의 활성을 효과적으로 억제, 티로시나아제 활성을 억제할 수 있어, 색소 침착과 관련된 질환 및 병변을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료(제거) 할 수 있다.
상기 색소 침착 질환은 색소가 과도하게 증식하거나, 침착되는 증상과 관련된 모든 질환을 의미하고, 바람직하게는 주근깨, 노인성 반점, 간반(chloasma), 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cynic melisma), 약물 사용 후의 과다 색소 침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 피부 색소 증식증 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간을 포함한 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 도는 예방을 목적으로 사용하는 약재를 의미한다.
상기 조성물 내의 율피 효소 분해물의 발효물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태, 투여 방법 및 제제의 형태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 10 중량부 또는 0.001 내지 1 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 의약 조성물은 율피 효소 분해액의 발효물 외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기 의약 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상 투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 상기 의약 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 의약 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한 본 발명은 치료상 유효량의 율피 효소 분해액의 발효물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 율피 효소 분해액의 발효물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01 ㎎/kg~200 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 피부 색소 침착의 개선, 완화, 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 화장료 조성물에 대한 기재는 식품 조성물 및 약학 조성물에도 준용하여 적용될 수 있다. 또한, 이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
실시예1 . 율피 효소 분해물 및 상기 분해물의 발효물의 제조
부여밤 영농조합으로부터 구입한 율피를 세척하여 건조한 후, 율피 2 kg에 20 kg의 상수를 사용하여 30 L 발효조에서 혼합하고 95 ℃, 100 rpm으로 1 시간 열처리 한 뒤, 50℃까지 냉각하였다. 셀룰라아제 20 g 및 아밀라아제 20 g 각각을 율피 추출액에 첨가하여 50℃에서 16 시간 동안 반응시켜 율피 효소 분해액을 제조하였다.
또한, 상기 효소 분해액을 121℃에서 30 분간 멸균하고, 37℃로 냉각한 후에 발효 균주의 배양액 400 mL를 각각 첨가하여 50 rpm에서 36 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 95℃에서 1 시간 동안 살균하였다. 50℃로 냉각하여 여과한 뒤 농축, 분무건조 하여, 율피 효소 분해액 발표물을 제조하였다. 발효에 사용한 균주는 하기와 같다.
1) 효모(Saccharomyces cerevisiae, 이하 S. cerevisiae)
2) 유산균:
락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus, 이하 L. acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, 이하 L. plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, 이하 L. casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacilus fermentum, 이하 L. fermentum)
3) 바실러스균: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, 이하 B. subtilis)
비교예1 . 율피 추출물의 제조
본 발명에 사용된 시료는 부여밤 영농조합으로부터 구입한 율피(밤 내피)를 대상으로 하였으며, 세척한 후 건조하여 건조 율피 2 kg에 20 kg의 상수를 첨가하여 30 L 발효조에서 95℃, 100 rpm으로 1 시간 열처리하고, 50℃까지 냉각하였다. 추출액을 여과한 후 농축, 분무건조하여 추출물 340 g을 수득하였다.
실험예 1. 세포 독성 평가
비교예 1의 율피 열수 추출물과 실시예 1의 율피 효소 분해액의 발효물을 대상으로 세포 독성을 확인하기 위해 세포 생존률을 측정하였다. 이를 위해 마우스 유래의 멜라노사이트(melanocyte)인 B16/F10 세포주(murine melanoma cells)를 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1x104 cells/well의 농도로 96 well-plate에 접종하여 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 원 배지를 제거하고, 혈청(serum)이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 율피 열수 추출물 및 발효물을 각각 0.1 mg/mL 농도로 처리한 후, 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 24시간 배양하였다.
처리된 율피 추출물 및 발효물은 다음과 같다.
A는 율피 열수 추출물 처리군, B는 율피 효소 분해액 처리군, C는 효모(yeast, S. cerevisiae)를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, D는 L. acidophilus를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, E는 L. plantarum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, F는 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, G는 L. fermentum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군 그리고 H는 B. subtilis를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군을 나타낸다.
추출물을 처리하지 않은 대조군(control)을 제외한 전 처리군에 멜라닌 생합성(melanogenesis)을 유도하기 위해 0.1 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)을 함께 처리하였다. 미백효과가 잘 알려진 물질인 알부틴(arbutin)을 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 0.1 mg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, 세포생존률 측정을 위해 배지를 제거하고, MTT solution(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 100 ㎕를 첨가하여 3시간 반응 시킨 후 배지를 제거하였다. 세포 내 생성된 포르마잔(formazan)을 다이메틸설폭시화물(DMSO, dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후 마이크로플레이트리더(Model 680 microplate reader, Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 측정된 값은 [계산식 1]에 따라 계산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
[계산식 1]
세포생존률(%) = (시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 추출물을 처리하지 않은 대조군(control)의 세포 생존률을 100%로 비교하였을 때, IBMX만 처리한 대조군(IBMX control)의 세포 생존률은 약 98%이었고, 양성대조군인 알부틴(arbutin) 처리군의 세포 생존률은 약 100%이었다. (A)의 세포 생존률은 약 100%, (B)의 세포 생존률은 약 98%, (C)의 세포 생존률은 약 97%, (D)의 세포 생존률은 약 98%, (E)의 세포 생존률은 약 100%, (F)의 세포 생존률은 약 100%, (G)의 세포 생존률은 약 99% 및 (H)의 세포 생존률은 약 100%이었다. 상기 결과를 토대로, 율피 열수 추출물 및 발효물은 0.1 mg/mL 이하 농도에서 B16/F10 세포에 대해 독성이 없을 확인하였다.
실험예 2. 멜라닌 생성 저해 효과 확인
율피 열수 추출물과 율피 효소 분해액의 발효물을 대상으로 멜라닌 생성 저해효과를 검토하기 위해 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하여 멜라닌 생성을 유도시킨 B16/F10 세포에서 멜라닌 함량을 측정하였다. B16/F10 cell을 10% FBS(Fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1x10cells/well의 농도로 6 well-plate에 접종하여 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 원 배지를 제거하고, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지와 함께 율피 열수 추출물 및 발효물을 각각 0.1 mg/mL 농도로 처리하여 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 48시간 배양하였다.
실험군은 다음과 같다.
A는 율피 열수 추출물 처리군, B는 율피 효소 분해액 처리군, C는 효모(yeast, S. cerevisiae)를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, D는 L. acidophilus를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, E는 L. plantarum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, F는 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군, G는 L. fermentum을 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군 그리고 H는 B. subtilis를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군을 나타낸다.
아무것도 처리하지 않은 대조군(control)을 제외한 전 처리군에 멜라닌 생합성을 유도하기 위해 0.1 mM의 IBMX를 함께 처리하였다. 미백효과를 갖는 물질인 알부틴(arbutin)을 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 0.1 mg/mL의 농도로 처리하였다. 48시간 뒤, 각 well의 세포를 차가운 PBS로 2회 세척 후, 세포를 회수한 뒤, 20 mmol/L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5)를 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)을 30분간 실시하여 멜라닌을 추출하였다. 이를 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, pellet에 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 1 N NaOH를 150 ㎕ 첨가하여 80℃에서 30분간 가열하였다. 반응시킨 혼합물을 96 wells plate에 100 ㎕씩 분주하여 마이크로플레이트리더기(micro plate reader)를 이용하여 415 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였고, 결과값은 [계산식 2]에 따라 계산하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[계산식2]
멜라닌 함량 (%) = (시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(control)의 멜라닌 함량을 100%로 비교하였을 때, IBMX만 처리한 대조군(IBMX control)의 멜라닌 함량은 약 188%로, 대조군에 비해 생성량이 약 88% 증가하였고, 양성대조군인 알부틴(arbutin) 처리군의 멜라닌 함량은 약 112%로, IBMX 대조군에 비해 생성량이 약 76% 감소하였다. 율피 열수 추출물 및 발효물의 경우, 상기 언급한 순(A-H)으로 각각 약 202%, 188%, 182%, 197%, 191%, 164%, 194% 및 166%의 멜라닌 함량(melanin contents)를 나타내었다. 율피 열수 추출물과 분해액의 경우 멜라닌 저해 활성이 거의 없었고, 율피 분해액의 발효물 처리군(C-H)에서만 IBMX만 처리한 대조군과 비교하여 멜라닌 저해 효과가 있음을 확인 하였다. 발효물 처리군 중에서, 특히 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물 처리군(F)이 약 24%의 멜라닌 생성 저해를 보여 가장 높은 멜라닌 생성 억제효과를 나타냄을 확인하였으므로, 이를 이용하여 추가적인 미백 활성 실험을 실시하였다.
실험예 3. L. casei 이용한 율피 효소 분해액 발효물의 티로시나아제 저해 활성 측정
L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물을 대상으로 미백활성을 시험관 수준에서 검토하기 위해 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다. 이는 티로시나아제 작용의 결과로 생성되는 도파크롬(DOPA-chrome)을 비색법에 의해 측정하는 것으로, 버섯 유래의 티로시나아제(mushroom tyrosinase, 150 unit, Sigma, USA)를 사용하였고, 10 mM의 디페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine, Sigma, USA)을 기질로 사용하였다. 시료의 농도는 각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/mL 씩 처리하였으며, 양성 대조군(positive control)인 알부틴(arbutin)은 0.1 mg/mL로 처리하였다. 증류수 550 ㎕, 1 M 칼륨 인산 완충액(potassium phosphate buffer, KPB, pH 6.8) 50 ㎕, 시료 100 ㎕를 혼합한 반응혼합물에 150 U 티로시나아제(tyrosinase) 100 ㎕을 첨가하여 37 ℃에서 2분 pre-incubation하였다. 공시험(Blank)은 tyrosinase 대신 50 mM의 KPB buffer(효소 희석액)를 첨가하였다. 이 혼합액에 10 mM의 DOPA solution 200 ㎕을 첨가하여 37 ℃에서 10분 반응시켰다. 반응시킨 혼합물을 아이스 배스(ice bath)에서 효소 반응을 정지 시킨 뒤, 생성된 도파크롬(DOPA-chrome)의 양을 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 475 nm에서 측정하였다. 티로시나아제의 활성은 [계산식 3]에 따라 계산하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[계산식3]
mushroom tyrosinase activity (%)={(Sample O.D - Blank O.D)/(Control O.D - Blank O.D)} × 100
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(control)의 효소 활성을 100%로 하였을 때, 양성대조군(positive control)인 알부틴(arbutin)의 tyrosinase 활성은 약 84%로, 약 16%의 티로시나아제(tyrosinase) 억제 활성을 나타내었다. L. casei를 이용한 율피 효소 분해액 발효물의 효소 활성은 상기 언급한 농도 순으로 각각 약 101%, 96%, 89%, 85% 및 72%의 활성으로, 발효물의 농도에 의존적으로 저해 활성이 높아지는 결과를 나타내었다. 상기 결과를 통해서 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액 발효물 농도 1.0 mg/mL 처리군에서 티로시나아제에 대해 약 28%의 억제 활성을 확인하였다.
실시예 4. L. casei 이용한 율피 효소 분해액 발효물의 멜라닌 생성 저해 효과 검토
L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물을 대상으로 멜라닌 생성 저해효과를 검토하기 위해 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하여 멜라닌 생성을 유도시킨 B16/F10 세포에서 멜라닌 함량을 측정하였다. B16/F10 cell을 10% Fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1x10cells/well의 농도로 6 well-plate에 접종하여 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 원 배지를 제거하고, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지와 함께 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액의 발효물을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL 농도로 처리하여 37℃, CO2 항온기(incubator)에서 48시간 배양하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군(control)을 제외한 전 처리군에 멜라닌 생합성을 유도하기 위해 0.1 mM의 IBMX를 함께 처리하였다. 미백효과를 갖는 물질인 알부틴(arbutin)을 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 0.1 mg/mL의 농도로 처리하였다. 48시간 뒤, 각 well의 세포를 차가운 PBS로 2회 세척 후, 세포를 회수한 뒤, 20 mmol/L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5)를 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)을 30분간 실시하여 멜라닌을 추출하였다. 이를 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, pellet에 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 1 N NaOH를 150 ㎕ 첨가하여 80℃에서 30분간 가열하였다. 반응시킨 혼합물을 96 wells plate에 100 ㎕씩 분주하여 마이크로플레이트리더기(micro plate reader)를 이용하여 415 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였고, 결과값은 [계산식 4]에 따라 계산하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
[계산식4]
멜라닌 함량 (%) = (시료 처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(control)의 멜라닌 함량을 100%로 비교하였을 때, IBMX만 처리한 대조군(IBMX control)의 멜라닌 함량은 약 204%로, 대조군에 비해 생성량이 약 104% 증가하였고, 양성대조군인 알부틴(arbutin) 처리군의 멜라닌 함량은 약 110%로, IBMX 대조군에 비해 생성량이 약 94% 감소하였다. L. casei를 이용한 율피 효소 분해액 발효물의 경우 상기 언급한 농도 순으로 각각 약 206%, 194%, 174%, 170% 및 143%의 멜라닌 함량(melanin contents을 나타내어 농도 의존적인 효과가 증가한다는 결과를 확인하였다. 상기 결과를 통해서 L. casei를 이용한 율피 효소 분해액 발효물을 농도 1.0 mg/mL로 처리군에서 약 61%의 우수한 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (15)

  1. 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 피부 미백용인 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 율피 효소 분해물은 율피를 당분해효소, 단백질분해효소, 섬유소분해효소, 펙틴분해효소, 셀루라아제 및 크실라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소에 의해 분해하여 얻은 것인 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    율피 효소 분해물의 발효물은 율피 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모를 접종하여 발효시킨 것인 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    율피 효소 분해물의 발효물은 율피 효소 분해액에 유산균을 접종하여 발효시킨 것인 화장료 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이고, 유산균은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidphilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 페디오코코스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 효모는 사카로마이세스 세레비세(Saccharomyces cerevisiae)인 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택된 제형을 갖는 화장료 조성물.
  8. 제 1항 내지 제6항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장수류, 에센스류, 스킨류, 로션류, 크림류, 팩류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 화장품.
  9. 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 율피 효소 분해액은 율피를 당분해효소, 단백질분해효소, 섬유소분해효소, 펙틴분해효소, 셀루라아제 및 크실라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소에 의해 분해하여 얻은 것인 피부 미백용 식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    율피 효소 분해물의 발효물은 율피 효소 분해액에 바실러스, 유산균 또는 효모를 접종하여 발효시킨 것인 피부 미백용 식품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이고, 유산균은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidphilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 페디오코코스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 효모는 사카로마이세스 세레비세(Saccharomyces cerevisiae)인 피부 미백용 식품 조성물.
  13. 제8항 또는 제12항에 따른 식품 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품.
  14. 율피 효소 분해물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cynic melisma), 약물 사용 후의 과다 색소 침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 피부 색소 증식증 및 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소침착으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 약학 조성물.
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