CN112972601A - 一种中药发酵产物及其在皮肤外用剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精提取得到的中药提取物。本发明还涉及采用姬松茸与植物乳杆菌作为混合菌进行发酵后得到的中药发酵产物。本发明还涉及包含所述中药提取物和/或所述中药发酵产物的皮肤外用剂。

Description

一种中药发酵产物及其在皮肤外用剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有中药发酵产物、其制备方法及其在皮肤外用剂中的应用。
背景技术
中医药是中华民族的瑰宝，数千年来为中华民族的繁荣昌盛作出了不可磨灭的贡献，并越来越受到世界人民的关注和重视。但由于传统中医药理论与现代科学理论脱节以及中药研究手段相对落后，很长一段时间，使中药资源的开发受到较大的影响和限制。中草药的开发利用目前主要聚焦在从现有中药中寻找有效成分，并与现在科技结合开发各种提取的手段如超声波提取、超临界萃取、膜萃取技术等。而以现有中药资源为基础，将传统中药的优势与现代生物技术相结合提升中药的开发潜力，目前尚未引起人们的广泛重视。
生物发酵技术是现代生物科学研究的重点领域。自古以来，人类就开始使用微生物作用对天然的产物进行加工，比如，希腊的酸奶、日本的纳豆、法国的红酒、中国的红茶等。现代的生物发酵技术，主要是通过对微生物的改造或者酶的作用使物质得到充分分解、转化，得到生物工程所需要的特定的化合物，如抗生素类、胰岛素、疫苗、氨基酸等。同时，在微生物的代谢过程中，会产生许多原本天然物中不含有的物质。生物技术的应用已经涉及到人们日常生产、生活的方方面面。在化妆品中，韩国、日本的护肤品界十分流行发酵护肤品，其中最出名的就是日本的SK-II，但是它还是停留在较传统的发酵阶段。
中医理论体系与分子生物学虽然属于两种不同的思想体系，但研究生命活动的物质基础是一致的，是人类关于生命与健康在不同程度上的认识和探索的产物。按中医药组方理论，将一些具有类似或协同作用的名贵中草药材组方按照君、臣、佐、使配伍体系，并与现代生物技术相结合，利用微生物强大的分解、代谢、转化能力，不仅可对培养基中中药的纤维、糖类和蛋白等物质加以利用，而且在代谢过程中可以对中药中的一些成分进行转化，从而提高中药活性成分在复合制剂中的比例及效价。因而产生具有多方功效相生相长、同时降低单一药物不良作用和风险成分的复合体系。虽然有些已知物质的功效已经得到了验证，但是在内服和外用的差异性还是需要进一步研究。同时，在提取时的纯度、原料与原料之间的匹配性和配伍性、成分添加的浓度都影响着中草药在化妆品中的功效。将中草药与现代生物发酵技术完美匹配，这必将是我国的化妆品行业的优势之一，发挥1+1＞2的作用，同时也是本发明的主要方向。利用该手段，从分子水平研究中医理论及中医药，提供一种中草药混菌发酵的方法，并将中医理论及现代中医药的新成果应用到现代生物学技术中去，对推动中医药在化妆品领域的发展和应用具有重要的意义。
麦角硫因(简写EGT)是一种含有硫醇基团的组氨酸衍生物，于1909年首次被法国科学家Charles Tanret从黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)中分离出来。这种天然稀有的氨基酸，在自然界中主要由真菌和细菌合成，通过食物链进入动物和人类体内。目前尚未发现动物或人体内能自身合成此类氨基酸。麦角硫因的水溶性好，但不能通过自由扩散进入动物细胞，只能选择性地通过表达有OCT1(有机阳离子转运蛋白)的细胞膜运输至细胞内。大量体内和体外实验已证明，麦角硫因具有其他生物分子不能比拟的抗氧化作用，抵抗细胞体内生成的活性氧自由基、抗炎症、延长细胞生存周期或抗细胞衰老活性，改善神经细胞生成等多种生理功效。同时在多种疾病模型包括阿尔茨海默病、糖尿病等的并发症中，具有较好的保护细胞和抗击损伤的功效。与已经广泛使用的生物抗氧化剂谷胱甘肽相比，麦角硫因的化学性更加稳定，抗氧化能力更加显著，具有非常广阔的生物医药应用前景。
目前工业生产麦角硫因主要通过化学合成、天然产物提取和生物发酵来实现。化学合成方法得到的麦角硫产率和纯度较低，杂质难以去除，并且存在一定的生物毒性。天然产物提取的方法主要是通过对真菌成品进行化学萃取的方式来获取，该方法成本高，产率低，且化学萃取剂残留较多。因此，生物发酵生产麦角硫因是本领域推崇的工业化推广方式。
本发明首次以中药提取物为发酵基础培养基，通过混合发酵植物乳杆菌和姬松茸，获得具有抗氧化、抗衰老等功效的发酵产物。该发酵产物包含高含量、高纯度的麦角硫因，而没有化学合成或有机溶剂萃取导致的杂质和毒性问题。
发明概述
一方面，本发明提供了一种中药发酵产物，所述发酵产物通过以下方法制备得到：
a)按照重量份数取人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花、黄精并混合；
b)溶剂煮沸提取；
c)过滤；
d)收集滤液得到中药提取物；
e)将中药提取物与发酵菌一起培养进行发酵，其中，所述发酵菌是姬松茸(Agaricus blazei)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的混合菌；
其中，所述步骤a)中人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精的重量比为12:10.5-12:6:3-6:1.8-2.4:1.8-3。
在优选的实施方式中，所述步骤a)中人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精的重量比为6：6：3：3：1：1。
在优选的实施方式中，所述步骤e)中姬松茸与植物乳杆菌的体积比为1:2至2:1。
在优选的实施方式中，所述步骤e)的发酵过程包括以下两个阶段：
(i)发酵温度25℃，发酵时间0-36小时；和
(ii)发酵温度30℃，发酵时间36-72小时。
在优选的实施方式中，所述步骤b)的提取过程还采用消泡剂。在优选的实施方式中，消泡剂是聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
在优选的实施方式中，所述步骤e)的发酵过程采用大米粉、脱脂奶粉和葡萄糖。
另一方面，本发明还涉及中药发酵产物在制备具有抗氧化和/或抗衰老功效的皮肤外用剂中的应用。
又一方面，本发明还涉及一种皮肤外用剂，该制剂包含通过本发明所述方法制备得到的中药发酵产物。在优选的实施方式中，所述中药发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-20％，优选的重量百分比为0.01-20％，更优选的重量百分比为0.01-10％，最优选的重量百分比为0.1-5％。
发明内容
本发明基于中药提取物的发酵制备发酵产物，该发酵产物包含高纯度、高含量的麦角硫因，具有抗衰老、抗氧化作用。本发明利用微生物发酵技术，发酵产物无潜在的致病因子，因此产品的质量安全性得以保证。本发明得到的发酵产物可直接用于皮肤，也可作为功效添加剂加入到化妆品配方中使用，大幅提升化妆品应用的功效和安全性。
本发明的一个方面，提供了一种中药发酵产物的制备方法，所述发酵方法以中草药为原料，利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和姬松茸(Agaricus blazei)混合菌种进行发酵。
本发明采用的中草药原料包括人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花和黄精。
人参(Radix panacis ginseng)属于五加科人参属，性温、味甘、微苦，为多年生的草本植物，人参具有多种人体所必需的营养成分和生物活性物质，如人参皂甙、人参多糖、黄酮等，具有较高的药用价值。
熟地黄(Rehmannia radix praeparata)是玄参科地黄属植物，以新鲜或干燥块根入药，是经生地黄经酒蒸煮炮制后获得。熟地黄微温、味甘，含有环烯醚萜类、多糖类、黄酮类等120余种化学成分，具有滋阴补血、益精填髓的功效。
灵芝(Glossy ganoderma)为灵芝科灵芝属药用真菌，始载于汉代《神农本草经》，被列为上品。灵芝含有多种化学成分，如三萜类化合物、灵芝多糖、生物碱、核苷等有效成分，具有多种生理活性。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科植物，味甘甜、性微寒，含有多糖、酚酸类等成分。具有调节免疫力、抗氧化、止泻等多种活性。
桂花(Osmanthus Fragrantis)属于木犀科植物，含有黄酮甙类、紫檀烷类等活性物质，具有优异的抗氧化能力。
黄精(Rhizoma polygonati)为黄精属植物，含有丰富的黄精多糖，具有增强免疫力与抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗衰老等作用。
迄今为止尚未发现采用这六味中药材进行提取、然后发酵制备包含麦角硫因的发酵产物的相关报道。因此，本发明首次将这六种中药材进行复配，提取得到的中药提取物进一步发酵后能够制备得到包含麦角硫因的发酵产物。
本发明所述中药提取物的制备过程如下：
按比例称取人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精，以适宜溶媒和方法进行提取。
本发明适宜的提取溶媒包括：水(包括蒸馏水、去离子水等)，不同浓度的乙醇溶液，不同浓度的多元醇溶液以及其他极性相似的溶剂。提取方法可以是浸提、煎煮、回流提取、渗漉等方法。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝20:20:10:5:3:3进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝6:6:3:3:1:1进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，本发明的中药提取物采用人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精＝40:35:20:20:8:10进行提取。例如，将上述原料混合后高速粉碎，然后加入溶剂，煮沸提取。然后，收集滤液，过滤，收集滤液浓缩后得到所需的中药提取物。
在一些优选的实施方式中，本发明中药提取物的制备过程中还采用消泡剂。例如，消泡剂可以是聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
在一些优选的实施方式中，本发明中药提取物的煮沸提取过程长达1小时。
在一些优选的实施方式中，提取过程中中药原料与提取溶剂的体积比为1:10。
在一些优选的实施方式中，还包括将提取得到的中药提取物的pH调节至中性。例如，可以使用2M氢氧化钠将中药提取物的pH调节至7.0。
本发明所述发酵产物的制备过程如下：
将本发明制备得到的中药提取物与发酵菌一起培养进行发酵，得到发酵产物。
在优选的实施方式中，发酵菌是姬松茸和植物乳杆菌的混合菌。在一个具体的实施方式中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号为CICC 21790；姬松茸(Agaricus blazei)从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，编号为CGMCC 5.485。
在优选的实施方式中，姬松茸:植物乳杆菌的体积比为2:1至1:2。在一个具体的实施方式中，初始接种姬松茸:植物乳杆菌体积比为2:1的发酵菌。
在优选的实施方式中，本发明的发酵过程包括两个阶段。第一阶段的发酵温度约为25℃，发酵时间从0小时至36小时。第二阶段的发酵温度约为30℃，发酵时间从36小时至72小时。在优选的实施方式中，第一阶段的发酵溶氧控制在60％以上。在优选的实施方式中，第二阶段的发酵溶氧控制约为20％。
在优选的实施方式中，除了本发明所述中药提取物作为基础培养基之外，发酵过程还采用其它碳源和/或氮源。例如，在一个具体的实施方式中，本发明的发酵过程还采用大米粉、脱脂奶粉和葡萄糖。在一个具体的实施方式中，采用的大米粉:脱脂奶粉:葡萄糖的重量比为1:1:2。
另一方面，本发明还涉及本发明所述中药提取物和/或本发明所述发酵产物在抗氧化、抗衰老方面的应用。
本发明的中药提取物和/或发酵产物可以作为功效添加剂加入到化妆品中使用，用于皮肤抗氧化、抗衰老目的。因此，本发明提供了一种包含本发明所述中药提取物和/或本发明所述发酵产物的皮肤外用剂。
在本发明的另一方面，提供了一种具有抗氧化、抗衰老作用的皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含按照本发明方法制备得到的中药提取物和/或发酵产物以及皮肤外用剂领域可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种皮肤外用剂，该皮肤外用剂含有本发明所述中药提取物和/或发酵产物。在一个优选的实施方式中，所述中药提取物和/或发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.01％-20％。更优选的重量百分比为0.01％-10％(w/w)。最优选的重量百分比为0.1％-5％(w/w)。
所述皮肤外用剂组合物是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。
所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。
所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。
当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。
所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。
本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。
通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的C4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有C12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。
本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。
本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。
颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。
珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。
填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。
本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有C16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。
可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
以下实施例中采用的六种中草药药材均购自“李同丰药业公司”，具体的批号为人参(Lot#20190901)：熟地黄(Lot#20190701)：灵芝(Lot#20190401)：铁皮石斛(Lot#20190303)：桂花(Lot#20190703)：黄精(Lot#20181201)。
以下实施例中采用的培养基均为江南大学发酵重点实验室自制，单独配方组分具体来源为：
固体培养基MRS：国药集团(分析纯)、安琪酵母(酵母粉LOT#2019032902A1、蛋白胨LOT#2019020308B9)
LB液体培养基：国药集团(分析纯)、安琪酵母(酵母粉LOT#2019032902A1、蛋白胨LOT#2019020308B9)
大米粉：齐齐哈尔老屯食品有限责任公司，批号：20190520
脱脂奶粉：杜尔伯特伊利乳业有限责任公司(B)，批号：747CI1905
无水葡萄糖：西王药业有限公司，批号：20190407
实施例1：中药提取物的制备
按重量比例称取人参：熟地黄：灵芝：铁皮石斛：桂花：黄精＝20：20：10：5：3：3，混合后经高速万能粉碎机粉碎得细粉100g，加1.0L去离子水，并滴加4～5滴聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚作为消泡剂，于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1h，使用200目滤网过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5L，冷却。将滤液用2M氢氧化钠调节pH为7.0，121℃灭菌20分钟(min)，作为培养基备用。
实施例2：中药提取物的制备
按重量比例称取人参：熟地黄：灵芝：铁皮石斛：桂花：黄精＝6：6：3：3：1：1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得细粉100g，加1.0L去离子水，并滴加4～5滴聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚作为消泡剂，于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1h，使用200目滤网过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5L，冷却。将滤液用2M氢氧化钠调节pH为7.0，121℃灭菌20min，作为培养基备用。
实施例3：中药提取物的制备
按重量比例称取人参：熟地黄：灵芝：铁皮石斛：桂花：黄精＝40：35：20：20：8：10，混合后经高速万能粉碎机粉碎得细粉100g，加1.0L去离子水，并滴加4～5滴聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚作为消泡剂，于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1h，使用200目滤网过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5L，冷却。将滤液用2M氢氧化钠调节pH为7.0，121℃灭菌20min，作为培养基备用。
实施例4：中药提取物的制备
按重量比例称取人参：熟地黄：灵芝：桂花：黄精＝6：6：3：1：1，混合后经高速万能粉碎机粉碎得细粉100g，加1.0L去离子水，并滴加4～5滴聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚作为消泡剂，于提取浓缩罐中煮沸，保持微沸1h，使用200目滤网过滤，滤渣复提一次，再过滤，合并两次滤液，浓缩至1.5L，冷却。将滤液用2M氢氧化钠调节pH为7.0，121℃灭菌20min，作为培养基备用。
实施例5：发酵反应
取出保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和姬松茸菌(Agaricusblazei)菌种冻管，经两步活化，即液体培养基中活化和液体培养基种子扩培。
具体地，植物乳杆菌为从-80℃冻管中吸取200ul菌液涂布于乳酸菌专用固体培养基MRS(蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，葡萄糖20g/L，吐温801mL，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，琼脂18g/L)上，置于30℃恒温培养箱中培养48h后，用无菌接种环挑取单菌落一环接种至灭菌LB(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L)液体培养基，培养基装液量为25ml/250ml三角摇瓶，置于30℃恒温培养箱中培养12h，OD600＝1.5；再将此菌种培养液按照10％接种量转接至装有100mL LB液体培养基的500mL三角摇瓶中，置于30℃恒温培养箱中培养至OD600＝4.0(大概时间为16～20h)作为发酵罐发酵菌种备用。
具体地，姬松茸菌为从-80℃冻管中吸取200ul菌液涂布于装有PDA固体斜面培养基(200g/L马铃薯提取液1L，葡萄糖20g，琼脂20g/L)的茄形瓶上，置于25℃恒温培养箱中培养72h后，长出菌丝体，用无菌接种环挑取菌丝体一环接种至装有100ml灭菌大米粉液体培养基(大米粉20g/L，无水葡萄糖10g/L，脱脂奶粉2g/L)的250ml带档板三角摇瓶中，置于菌种孵育摇床，25℃，220rpm培养72h，作为发酵罐菌种备用。
取实施例1的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照2:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例6：发酵反应
取实施例2的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照2:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例7：发酵反应
取实施例3的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照2:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。α同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例8发酵反应
取实施例1的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:2比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例9：发酵反应
取实施例2的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:2比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例10：发酵反应
取实施例3的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:2比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例11：发酵反应
取实施例1的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例12：发酵反应
取实施例2的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例13：发酵反应
取实施例3的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例14：发酵反应
取实施例4的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照2:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例15：发酵反应
取实施例4的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:1比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例16：发酵反应
取实施例4的中药提取液1.5L，加入3L发酵罐，投入7.5g大米粉，7.5g脱脂奶粉，15.0g葡萄糖，搅拌混匀后，用2M NaOH调节pH至7.0，再经过121℃灭菌20min后，待温度降低至25℃后，与培养好的姬松茸、植物乳杆菌种子液按照1:2比例(体积比)混合后，按照发酵罐体积的10％的量将种子液投入到3L发酵罐中。同时开启搅拌200rpm/min，打开通气1vvm，初始发酵温度25℃，溶氧控制在60％以上，pH控制在6.5；发酵至36h，将温度调节为30℃，转速调节为100rpm/min，通气0.1vvm，溶氧控制在20％，pH控制在6.5左右。发酵至72h，样品放罐，发酵结束后将发酵液在12000rpm离心10min，上清4℃保存待测。
实施例17：发酵液成分测定
酚含量的测定：在碱性条件下利用多酚的还原性,多酚可以将福林酚中的磷钨钼酸还原成蓝色,蓝色深浅与多酚含量城正相关,可以用分光广度计进行测定。以水为溶剂，分别配制400、200、100、50、25、12.5mg/L的没食子酸溶液，向5mL反应管中，加入100μL待测样品+Folin-酚(液体)1.0mL+10％Na2CO3 1.0mL(注：添加顺序不可调整)，常温反应90min。在760nm处读取吸光值，以没食子酸标准溶液为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程，计算出样品中总酚的含量，每个样品平行测定2次，取平均值。结果如表1所示。
麦角硫因含量的测定：配制10g/L麦角硫因标样，分别稀释成浓度为5mg/L、10mg/L、2 0mg/L、40mg/L、80mg/L的标样，1mL过膜待测。分别在发酵6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h时取1mL发酵液测定麦角硫因含量，样品在转速10000rpm下离心2分钟，固液分离。上清沸水浴10分钟后，14000rpm下离心10分钟，上清过膜待测。用高效液相色谱法检测麦角硫因含量，首先以标样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作出标准曲线，再根据标准曲线计算得出麦角硫因含量。结果如表1所示。
表1：发酵液中成分含量
Figure BDA0002317436670000171
Figure BDA0002317436670000181
结果显示，经过植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和姬松茸菌(Agaricusblazei)混菌发酵后，实施例5-16发酵液中意外地获得了强抗氧化物质——麦角硫因，其含量与混菌的比例、中草药配比、发酵时间具有较大的关系，其中实施例6在经过2天的发酵后，麦角硫因的浓度达到了20mg/L，随后的浓度有一定的下降，说明了较优的发酵时间为2天；总酚的含量在实施例5-16的发酵液中均有不同程度的提高。在实施例6中总酚含量较发酵前的提取物(实施例2)提高了13倍。
实施例18：发酵液DPPH自由基清除能力
自由基是一类性质活泼、具有极强氧化能力的化学物质。皮肤中产生的大量自由基，对机体造成损伤，加速衰老。DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH光吸收减弱，DPPH乙醇溶液退色程度与其接受的电子数呈定量关系，借此可评价物质清除自由基的能力。
样品配制与测定：使用无水乙醇为溶剂配置摩尔浓度为4x10-3M的DPPH(二苯代苦味酰基自由基)母液，在4℃下避光保存。使用时用无水乙醇进行十倍稀释，得到4x10-4M的DPPH溶液。分别取0.5mL待测样品于两个1.5mL EP管中，一管加入0.5mL DPPH溶液，一管加入0.5mL无水乙醇，混匀后避光静置30min，1000rpm常温离心5min，取上清在517nm处测吸光值，前者记为AS,后者记为AB。取0.5mL DPPH和0.5mL无水乙醇重复上述操作，测得吸光值记为AC。根据DPPH清除率公式CD＝(1-(AS-AB)/AC)x100％计算得不同发酵液DPPH清除率。
表2：不同实施例的中药提取液和发酵液的自由基清除率数据
Figure BDA0002317436670000191
Figure BDA0002317436670000201
对比相同浓度下的中药提取液和发酵液，抗氧化DPPH能力的差异。其中实施例5和实施例6发酵液的抗氧化能力较实施例1和实施例2的中药提取物具有较好的提升。其中实施例5相较于实施例1的中药提取物的抗氧化DPPH能力提升达到了48％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
取实施例1-16的提取液或发酵液，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述实施例1-16的提取液或发酵液，在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001％-20％(w/w)。优选的重量百分比为0.001％-10％(w/w)。更优选的重量百分比为0.001％-5％(w/w)。最优选的重量百分比为0.01％-5％(w/w)。
以下是实施例1-16的提取物或发酵液，在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中“-”表示无添加。
实施例19：面霜的制备
Figure BDA0002317436670000211
实施例20：乳液的制备
Figure BDA0002317436670000212
Figure BDA0002317436670000221
实施例21：啫喱的制备
Figure BDA0002317436670000222
实施例22：化妆水的制备
Figure BDA0002317436670000231
实施例23：精华液的制备
Figure BDA0002317436670000232
Figure BDA0002317436670000241
实施例24：面膜的制备
Figure BDA0002317436670000242
实施例25：眼霜的制备
Figure BDA0002317436670000251
实施例26：气雾(清洁泡)的制备
Figure BDA0002317436670000252
Figure BDA0002317436670000261
实施例27：喷雾的制备
Figure BDA0002317436670000262
实施例28：沐浴露的制备
Figure BDA0002317436670000263
Figure BDA0002317436670000271
实施例29：洗面奶的制备
Figure BDA0002317436670000272
Figure BDA0002317436670000281
实施例30精华水的制备
Figure BDA0002317436670000291
以上所有皮肤外用剂中的具体应用的实施例中，实施例1-4的中药提取物，实施例5-16的发酵液均可部分或者全部取代去离子水直接应用于配方中。

Claims (10)

1.一种中药发酵产物，所述发酵产物通过以下方法制备得到：
a)按照重量份数取人参、熟地黄、灵芝、铁皮石斛、桂花、黄精并混合；
b)溶剂煮沸提取；
c)过滤；
d)收集滤液得到中药提取物；
e)将中药提取物与发酵菌一起培养进行发酵，其中，所述发酵菌是姬松茸(Agaricusblazei)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的混合菌；
其中，所述步骤a)中人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精的重量比为12:10.5-12:6:3-6:1.8-2.4:1.8-3。
2.如权利要求1所述的中药发酵产物，其特征在于，所述步骤a)中人参:熟地黄:灵芝:铁皮石斛:桂花:黄精的重量比为6：6：3：3：1：1。
3.如权利要求1所述的中药发酵产物，其特征在于，所述步骤e)中姬松茸与植物乳杆菌的体积比为1:2至2:1。
4.如权利要求1所述的中药发酵产物，其特征在于，所述步骤e)的发酵过程包括以下两个阶段：
(i)发酵温度25℃，发酵时间0-36小时；和
(ii)发酵温度30℃，发酵时间36-72小时。
5.如权利要求1所述的中药发酵产物，其特征在于，所述步骤b)的提取过程还采用消泡剂。
6.如权利要求5所述的中药发酵产物，其特征在于，所述消泡剂是聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
7.如权利要求1所述的中药发酵产物，其特征在于，所述步骤e)的发酵过程采用大米粉、脱脂奶粉和葡萄糖。
8.如权利要求1所述的中药发酵产物在制备具有抗氧化和/或抗衰老功效的皮肤外用剂中的应用。
9.一种皮肤外用剂，其包含如权利要求1所述的中药发酵产物。
10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述中药发酵产物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.001-20％，优选的重量百分比为0.01-20％，更优选的重量百分比为0.01-10％，最优选的重量百分比为0.1-5％。
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