KR20190005160A

KR20190005160A - L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 용도 그리고 l-하이드록시프롤린의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190005160A
Application number: KR1020187032008A
Authority: KR
Inventors: 유키히코 나리타; 유코 후쿠이; 다츠오 마츠오카; 준 오가와; 마코토 히비
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2019-01-15
Also published as: TWI757293B; JP6869972B2; JPWO2017195873A1; CN109072171A; WO2017195873A1; TW201808119A; KR102330633B1

Abstract

본 발명은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린을 함유하고, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물인 것을 특징으로 한다.

Description

L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 용도 그리고 L-하이드록시프롤린의 제조 방법

본 발명은, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 용도, 그리고 L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 효모의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 함유하는 음식품, 화장료, 화장료 원료 및 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물 등에 관한 것이다.

L-하이드록시프롤린 (하이드록시-L-프롤린) 은, L-프롤린의 4 위치의 탄소 원자에 수산기가 결합한 구조를 갖는 아미노산이다. L-하이드록시프롤린의 효능으로서, 선유아세포에 있어서의 콜라겐 산생 촉진, 표피 세포의 증식 촉진, 콜라겐과 동등 이상의 보습 효과, 피부의 노화 방지, 트리펩티드보다 높은 경피 흡수성, 주름 개선 효과, 아토피성 피부염의 개선 효과 등을 들 수 있다. L-하이드록시프롤린은 인체에 대해 안전한 점에서, 음식품, 화장료, 의약품 등에 함유시켜 사용할 수 있어, 그 유익성은 매우 높다.

L-하이드록시프롤린은, 유기 합성법에 의해 제조할 수 있지만, 미생물을 이용하는 제조 방법도 검토되고 있다. 예를 들어 특허문헌 1 에는, 벌노랑이 근립균 유래의 L-프롤린 시스-4-하이드록시라아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 시스-4-하이드록시-L-프롤린을 생성, 축적시키고, 그 배양물 중으로부터 시스-4-하이드록시-L-프롤린을 채취하는 시스-4-하이드록시-L-프롤린의 제조 방법이 기재되어 있다.

일본 특허 제5506668호

그런데, 효모는, 음식품 분야 등에서 예전부터 여러 가지 공업적 이용이 시도되고 있는 미생물이고, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 효능이 기대되는 화장료, 음식품 등의 원료로서 유용하다. 그러나, 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적하는 효모는, 아직 보고되어 있지 않다.

본 발명은, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 용도, 그리고 L-하이드록시프롤린의 제조 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, 효모인 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 호기 배양하면, 그 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적하는 것을 알아냈다. 또, 얻어지는 L-하이드록시프롤린을 함유하는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 중량 함량에 대한 L-하이드록시프롤린의 중량 함량의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이 특정 범위가 될 수 있는 것을 알아냈다. 본 발명자들은, 이들 지견에 근거하여 더욱 연구를 실시하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린을 함유하고, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함하고, 상기 질소원이 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인 것이 바람직하다. 상기 콜라겐펩티드의 평균 분자량은 1000 ∼ 10000 인 것이 바람직하다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용도 포함한다.

본 발명의 사용은, 상기 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 것을 포함하고, 상기 질소원이 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원인 것이 바람직하다.

본 발명의 사용에 있어서는, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인 것이 바람직하다. 상기 콜라겐펩티드의 평균 분자량은 1000 ∼ 10000 인 것이 바람직하다.

본 발명의 사용에 있어서는, 상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은, 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 음식품은, 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 또는 화장료 원료는, 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 또는 화장료 원료는, 콜라겐 산생 촉진, 표피 세포의 증식 촉진, 피부의 보습, 피부의 노화 방지, 피부의 처짐 예방 또는 개선, 피부의 탄력 개선, 주름의 예방 또는 개선 및 아토피성 피부염의 개선에서 선택되는 용도로 사용되는 것이 바람직하다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 화장료 또는 화장료 원료는, 화장료 원료이고, L-하이드록시프롤린 함량이 5 ∼ 300 ppm 인 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 또는 화장료 원료는, 화장료이고, L-하이드록시프롤린 함량이 0.01 ∼ 20 ppm 인 것도 바람직하다. 본 명세서 중 ppm 은, 중량ppm 을 의미한다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물에 있어서는, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인 것이 바람직하다. 또, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 용도, 그리고 L-하이드록시프롤린의 제조 방법 등을 제공할 수 있다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 음식품, 화장료 등의 원료 등으로서 바람직하게 사용된다.

도 1 은, 효모의 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 축적량을 나타내는 그래프이다.
도 2 는, 각 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 ((a) : 조건 1, (b) : 조건 2).
도 3 은, PD 배지 또는 0.125 ％ 젤라틴을 첨가한 PD 배지에서 5 일간 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 (백 : 0.125 ％ 젤라틴을 포함하는 PD 배지, 흑 : PD 배지).
도 4 는, 조성이 상이한 YPD 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 ((a) : Hyp 축적량 (㎍/mL), (b) : 세포당의 Hyp 량 (㎍/mL/OD600)).
도 5 는, 펩톤 또는 콜라겐펩티드를 포함하는 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량, 세포당의 Hyp 량 및 OD600 을 나타내는 그래프이다 ((a) : Hyp 축적량 (㎍/mL), (b) : 세포당의 Hyp 량 (㎍/mL/OD600), (c) : OD600)).
도 6 은, 진탕 배양 또는 정치 (靜置) 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 도면이다 ((a) : 배양물 샘플 (세포 내) 의 배지당 환산 Hyp 량, (b) : 배양 상청 중의 Hyp 량)).
도 7 은 진탕 배양 또는 정치 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 배양 상청의 에탄올 농도 및 글루코오스 농도를 나타내는 그래프이다 ((a) : 에탄올 농도 (v/v％), (b) : 글루코오스 농도 (중량％)).
도 8 은, 아미노산 혼합 표준액 H 형 및 L-하이드록시프롤린을 포함하는 0.1 N 염산 용액 (각 아미노산 농도 20 ㎛ol/L) 을 분석한 HPLC 차트이다 ((a) : Ch1 의 여기 파장 350 nm, 형광 파장 450 nm 로 검출, (b) : Ch2 의 여기 파장 266 nm, 형광 파장 305 nm 로 검출).

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은, 이하의 실시형태로 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 요지를 변경하지 않는 범위에 있어서 적절히 변경하여 적용할 수 있다.

본 명세서 중, 효모의 속종은, The Yeasts, a Taxonomic Study Fifth Edition (Elsevier 발행, 2011년) 에 기재된 속종명으로 기재하였다.

본 발명의 제 1 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린을 함유하고, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 이다.

본 발명의 제 2 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상이다.

이하, 본 발명의 제 1 양태 및 제 2 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을, 통합하여 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물이라고도 한다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물이다.

본 발명에 있어서의 효모는, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 에 속하는 효모이면 되고, 1 종만 사용해도 되고, 2 종 이상을 사용해도 된다.

효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는, 여러 기탁 기관 등으로부터 입수 가능하다. 기탁 기관으로는, 예를 들어 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 등을 들 수 있다. 또, 자연계로부터 분리할 수도 있다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린 (Hyp) 을 함유한다. 본 발명에 있어서의 L-하이드록시프롤린은, 4-하이드록시-L-프롤린이다. 본 명세서 중, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 포함되는 L-하이드록시프롤린은, 유리의 L-하이드록시프롤린을 가리킨다. 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 있어서의 L-하이드록시프롤린 함량 또는 축적량은, 유리의 L-하이드록시프롤린량을 가리킨다. 그 균체 또는 균체 배양물 중에 유리의 L-하이드록시프롤린을 축적하는 효모는 보고되어 있지 않았다.

본 발명의 제 1 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 이다. 이와 같은 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 효능이 기대되는 음식품이나 화장료의 원료 등에 바람직하게 사용된다. 「L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율」(100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 을, 이하에서는 「(Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율」이라고도 한다. 본 명세서 중, 상기 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율에 있어서의 L-프롤린 함량은, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 포함되는 유리의 L-프롤린 함량을 가리킨다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 제 2 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이, 35 ∼ 100 이다.

상기 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율은, 바람직하게는 40 ∼ 100 이고, 보다 바람직하게는 50 ∼ 100 이며, 보다 바람직하게는 60 ∼ 100 이고, 더욱 바람직하게는 70 ∼ 100 이며, 보다 더욱 바람직하게는 80 ∼ 100 이고, 특히 바람직하게는 90 ∼ 100 이다. 상기 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 이와 같은 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, Hyp 의 함량 비율이 높아, L-하이드록시프롤린의 효능이 기대되는 음식품이나 화장료의 원료 등으로서 특히 바람직하다.

본 발명의 제 2 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상이다.

본 발명의 제 1 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것이 바람직하다. L-하이드록시프롤린의 함량이 상기 범위인 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 효능이 기대되는 음식품이나 화장료의 원료 등으로서 바람직하다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 L-하이드록시프롤린의 함량은, 15 ㎍/mL 이상인 것이 보다 바람직하고, 17 ㎍/mL 이상이 보다 바람직하며, 20 ㎍/mL 이상이 보다 바람직하고, 30 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하며, 40 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하고, 50 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하며, 70 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하고, 100 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하며, 150 ㎍/mL 이상이 더욱 바람직하고, 200 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하며, 250 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하고, 300 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하며, 400 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하고, 450 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하며, 475 ㎍/mL 이상이 특히 바람직하고, 500 ㎍/mL 이상이 가장 바람직하다.

효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 L-하이드록시프롤린의 함량의 상한은 특별히 한정되지 않고, 많은 편이 바람직하지만, 통상 6000 ㎍/mL 이하이고, 3000 ㎍/mL 이하 또는 2000 ㎍/mL 이하여도 된다.

본 발명에 의하면, 효모의 균체 또는 균체 배양물에서 유래하는 L-하이드록시프롤린의 함량이, 상기 범위인 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 제공할 수 있다.

효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 중의 L-프롤린의 함량 (㎍/mL) 및 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 은, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 측정할 수 있다. 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물이 균체를 포함하는 경우에는, 가열 등에 의한 자기 소화나 효소 분해 처리 등에 의해 균체를 파쇄하여, 균체 내용물을 용출시킨 것을 사용하여, L-프롤린 및 L-하이드록시프롤린의 함량을 측정한다. L-프롤린 및 L-하이드록시프롤린 함량의 측정 방법 및 HPLC 의 측정 조건 등은, 실시예에 기재된 방법 및 조건 등을 채용하면 된다. 바람직하게는, (1) o-프탈알데하이드 (OPA) 및 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔 (NBD-Cl) 에 의해 순차 아미노산을 유도체화하고, HPLC 에 의해 분석하는 방법 (여기 파장 503 nm/형광 파장 541 nm 로 검출), 또는 (2) 메르캅토프로피온산, OPA 로 1 급 아미노기를 유도체화 후 클로로포름산-9-플루오레닐메틸 (FMOC) 에 의해 2 급 아미노산을 유도체화하고, HPLC 에 의해 분석하는 방법 (여기 파장 266 nm, 형광 파장 305 nm 로 검출) 에 의해, 보다 바람직하게는 상기 (2) 의 방법에 의해, L-프롤린 및 L-하이드록시프롤린을 정량한다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 액체 배지 중에서 호기 배양하고, 필요에 따라 균체 파쇄 등을 실시하여 얻어지는 것이다.

효모의 균체 배양물은, 효모의 균체 및/또는 배양 상청을 포함하는 것이 바람직하고, 효모의 균체 내용물을 포함하고 있어도 된다. 효모의 균체는, 생균이어도 되고, 사균이어도 된다. 효모의 균체 및/또는 배양 상청을 포함하는 균체 배양물로서 상기 효모를 호기 배양하여 얻어지는 효모의 균체 (배양 균체) 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액, 그 균체 배양액으로부터 효모의 균체를 집균한 것 (균체), 또는 그 균체 배양액으로부터 균체를 제거한 배양 상청을 들 수 있다. 균체 배양액의 배양 상청을, 간단히 배양 상청이라고 한다. 균체 배양물은, 바람직하게는 효모의 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액 또는 배양 상청이다.

또, 균체 또는 균체 배양물의 추출물은, 통상 균체 내용물을 포함하고, 균체 내용물 및 배양 상청을 포함하는 것이 바람직하다. 균체 또는 균체 배양물의 추출물로서 균체 또는 균체를 포함하는 균체 배양물 (바람직하게는 균체 배양액) 에, 자기 소화 처리나 효소 분해 처리 등의 균체 파쇄 처리를 실시하여, 효모 균체 내용물을 배양액 중 등에 용출시킨 것 (균체 파쇄물), 균체 파쇄 처리를 실시한 균체 또는 균체 배양물 (균체 파쇄물) 로부터 균체 잔류물을 제거한 것을 들 수 있고, 바람직하게는 균체 파쇄 처리를 실시한 균체 배양액 (균체 파쇄물) 또는 그 균체 파쇄물로부터 균체 잔류물을 제거하여 얻어지는, 균체 내용물 및 배양 상청을 포함하는 추출물이다.

상기와 같이, 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 통상 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 액체 배지 중에서 호기 배양하여 얻어지는 효모의 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액에, 필요에 따라 집균, 균체 파쇄 등의 처리를 실시하여 조제된다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 포함되는 L-하이드록시프롤린은, 상기 호기 배양에 의해 얻어지는 효모의 균체 또는 균체 배양물에서 유래하는 것이 바람직하다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 포함되는 L-하이드록시프롤린은, 상기 호기 배양 전에는 실질적으로 존재하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 예를 들어 화장료, 주류를 포함하는 음식품 등의 원료로서 바람직하게 사용할 수 있는 것이다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 을, OD600 로 나눈 값 (㎍/mL/OD600) 이, 0.5 이상인 것이 바람직하다. L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 을, OD600 로 나눈 값 (㎍/mL/OD600) 을, 이하 Hyp/OD600 값이라고도 한다. Hyp/OD600 값이 높을수록, 세포당의 L-하이드록시프롤린의 함량이 많기 때문에 바람직하다. 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 Hyp/OD600 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 많을수록 바람직하지만, 통상 300 이하이다. Hyp/OD600 값은, 1 이상인 것이 보다 바람직하고, 예를 들어 1 ∼ 150 이 바람직하다. Hyp/OD600 값은, 25 이상이 더욱 바람직하고, 50 이상이 보다 더 바람직하다.

OD 란 optical density 의 약칭으로, 광학 밀도를 가리킨다. OD 는, 세포의 농도 등을 나타낸다. 일반적으로는 600 nm 또는 660 nm 의 파장의 가시광에 대한 흡광도 OD600 또는 OD660 을 측정한다 (바이오 실험 일러스트레이티드 ▲7▼ 사용하자 효모 가능한 Two Hybrid, 수윤사, 2003년 발행).

Hyp/OD600 값의 계산에 사용되는 OD600 은, 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 조제에 사용한, 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액 (균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양물) 의 600 nm 의 흡광도이다.

보다 구체적으로는, 상기 효모를 액체 배지 중에서 호기 배양하여 얻어지는 효모의 균체 배양액을 그대로 균체 배양물로 하는 경우에는, OD600 은, 그 균체 배양액 (균체 배양물) 의 흡광도 OD600 이다. 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물이, 효모의 균체를 파쇄하여 균체 내용물을 용출시킨 균체 또는 균체 배양물의 추출물인 경우에는, OD600 은, 그 조제에 사용한 균체 배양액 (균체 파쇄 전의 효모의 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액) 의 흡광도 OD600 이다. OD600 은, 예를 들어 분광 광도계에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 에탄올 함량이 1 v/v％ 이하인 것이 바람직하다. 에탄올 함량이 1 v/v％ 이하이면, 각종 음식품이나 화장료 등의 원료로서 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 에탄올이 1 v/v％ 를 초과하면, 효모의 증식 등에 나쁜 영향이 있는 경우가 있다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 에탄올 함량은, 보다 바람직하게는 0.8 v/v％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.5 v/v％ 이하이다. 에탄올 함량은, 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 페이스트상, 현탁상, 엑기스상, 액상 등을 들 수 있다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 후술하는 바와 같이 화장료, 음식품 등의 원료로서 바람직하게 사용할 수 있는 것이다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 건조 등에 의해 분말화하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 함유하는 액체 배지 중에서 호기 배양하고, 필요에 따라 균체 파쇄 등 함으로써 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함한다.

효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원, 및 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 그 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린이 축적되어, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 또는 균체 배양물이 얻어진다. 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원, 및 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 그 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함하는 방법은, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 제조 방법, 또는 L-하이드록시프롤린의 제조 방법으로서 바람직하다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정 (이하, Hyp 축적 공정이라고도 한다) 을 포함한다. 상기 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원이다.

본 발명의 제조 방법은, 원하는 바에 따라 Hyp 축적 공정 이외의 공정을 가져도 된다. 예를 들어, 후술하는 전배양 공정, 집균 공정, 균체 파쇄 공정 등의 1 또는 2 이상의 공정을 가지고 있어도 된다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 있어서는, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 얻을 수 있다.

상기 Hyp 축적 공정을 실시함으로써, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 또는 균체 배양물이 얻어진다. 얻어지는 효모의 균체 또는 균체 배양물은, 통상 상기 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 35 ∼ 100 이다. 또, Hyp 축적 공정에 의해 얻어지는 효모의 균체 또는 균체 배양물은, 통상 L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상이다. 이와 같은 효모의 균체 또는 균체 배양물은, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 또는 균체 배양물로서 사용할 수 있다. 또, 얻어진 균체 또는 균체 배양물에, 원하는 바에 따라 추가로 균체 파쇄 처리 등의 처리를 실시하여, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 또는 균체 배양물의 추출물을 조제할 수도 있다.

Hyp 축적 공정을 포함하는 L-하이드록시프롤린의 제조 방법은, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 제조 방법으로서도 바람직하다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 얻는 경우, Hyp 축적 공정 및 그 바람직한 양태는, L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 있어서의 Hyp 축적 공정 및 그 바람직한 양태와 동일하다.

Hyp 축적 공정에 있어서, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 액체 배지에의 첨가 방법은, 탄소원 및 질소원을 함유하는 액체 배지 중에 직접 소량의 균체를 접종함으로써 증식시킬 수 있지만, 단기간에 균체 농도를 상승시키기 위해서는, 전배양한 균액을 접종하는 것이 바람직하다. 전배양에 사용하는 배지는 특별히 한정되지 않고, Hyp 축적 공정 (통상, 본배양) 에서 사용되는 액체 배지와 동일한 배지여도 되고, 효모에 사용할 수 있는 공지된 배지를 사용해도 된다. 전배양의 시간은, 통상 10 ∼ 72 시간이고, 바람직하게는 12 ∼ 48 시간이다. 전배양 온도는, 15 ∼ 40 ℃ 로 하는 것이 바람직하다. 전배양한 균액을 접종하는 양으로는, 통상 Hyp 축적 공정에서 사용하는 배지량의 1/100000 ∼ 1/2 이고, 1/1000 ∼ 1/10 이 바람직하고, 1/200 ∼ 1/10 이 보다 바람직하며, 1/200 ∼ 1/20 이 더욱 바람직하다. 접종량이 상기 범위이면, Hyp 축적 공정에 있어서 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 증식이 빨라, L-하이드록시프롤린을 효율적으로 축적시킬 수 있다.

Hyp 축적 공정에서 사용되는 액체 배지의 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원이다. 이와 같은 질소원을 사용하여 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 호기 배양하면, 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린이 축적된다. 이와 같은 질소원은 1 종만 사용해도 되고, 2 종 이상을 사용해도 된다. L-하이드록시프롤린 함유 펩티드는 1 종이어도 되고, 2 종 이상이어도 된다.

L-하이드록시프롤린 함유 펩티드란, L-하이드록시프롤린을 구성 아미노산에 포함하는 펩티드이면 되지만, 바람직하게는 구성 아미노산의 10 중량％ 이상이 L-하이드록시프롤린인 펩티드이다. 일 양태에 있어서, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드인 것도 바람직하다.

L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원은, 예를 들어 L-하이드록시프롤린 함유 단백질을 가수분해함으로써 얻을 수 있다. L-하이드록시프롤린 함유 단백질이란, 구성 아미노산에 L-하이드록시프롤린을 포함하는 단백질이면 되지만, 바람직하게는 구성 아미노산의 10 중량％ 이상이 L-하이드록시프롤린인 단백질이다. 상기 L-하이드록시프롤린 함유 단백질로서 콜라겐성 단백질 등이 바람직하다. 콜라겐성 단백질로서, 예를 들어 내장, 가죽, 어린, 뼈 등의 콜라겐을 포함하는 조직으로부터 조제되는 단백질 ; 콜라겐, 젤라틴을 들 수 있다. 콜라겐성 단백질의 원료 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 소 유래, 돼지 유래, 물고기 유래 등의 동물 유래의 콜라겐성 단백질을 바람직하게 사용할 수 있다. 콜라겐성 단백질은, 시판품을 사용할 수 있다. L-하이드록시프롤린 함유 단백질의 가수분해는, 효소 등에 의해 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원으로서, 예를 들어 동물 유래의 펩톤을 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게는, 소, 돼지 또는 물고기 유래의 펩톤이며, 보다 바람직하게는 소 또는 물고기 유래의 펩톤이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 펩톤으로서 수육 펩톤, 심근 펩톤, 젤라틴 펩톤도 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원의 시판품의 일례로서, 예를 들어 제품명 Pepton (#211677) (Bacto 사) 등을 들 수 있다.

일 양태에 있어서, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드는, 바람직하게는 콜라겐펩티드이다. 콜라겐펩티드란, 가수분해 콜라겐을 의미하고, 천연 콜라겐을 열처리하여 변성시킨 젤라틴 또는 천연 콜라겐을 가수분해한 콜라겐펩티드, 또는 이들을 화학적, 효소적으로 수식한 것 중 어느 것이어도 된다. 가수분해는, 효소, 산, 알칼리 등에 의해 실시할 수 있고, 바람직하게는 효소에 의해 실시된다. 바람직하게는, 천연 콜라겐을 열처리하여 변성시킨 젤라틴 또는 천연 콜라겐을 가수분해한 콜라겐펩티드를 사용한다. 콜라겐펩티드의 원료 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 소 유래, 돼지 유래, 물고기 유래 등의 동물 유래의 콜라겐펩티드를 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게는, 물고기 유래의 콜라겐펩티드이다. 콜라겐펩티드는, 시판품을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 콜라겐펩티드의 시판품의 일례로서, 예를 들어 닛타 젤라틴 (주) 제조의 「콜라겐펩티드 익오스 HDL-50SP」 (제품명) (평균 분자량 5000), 「콜라겐펩티드 Type S」 (제품명) (평균 분자량 1200), 「슈퍼콜라겐펩티드 SCP-2000」 (제품명) (평균 분자량 2000), 야스 화학 공업 (주) 제조의 「콜라겐펩티드 P-5000」 (제품명) (평균 분자량 5000), 「콜라겐펩티드 F-5000」 (제품명) (평균 분자량 5000), 닛쇼 (주) 제조의 「마린 콜라겐 올리고 CF」 (제품명) (평균 분자량 900 ∼ 1100), 「마린 콜라겐 올리고 MF」 (제품명) (평균 분자량 900 ∼ 1500) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 「콜라겐펩티드 Type S」 (평균 분자량 1200), 「콜라겐펩티드 익오스 HDL-50SP」 (평균 분자량 5000) 등이 바람직하다.

이들 중에서, 예를 들어 「콜라겐펩티드 익오스 HDL-50SP」, 「콜라겐펩티드 Type S」, 「콜라겐펩티드 F-5000」, 「마린 콜라겐 CF」, 「마린 콜라겐 올리고 MF」는 물고기에서 유래하는 것이고, 「콜라겐펩티드 P-5000」, 「슈퍼콜라겐펩티드 SCP-2000」은 돼지에서 유래하는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서는, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원은, 바람직하게는 콜라겐펩티드 (보다 바람직하게는 물고기 유래의 콜라겐펩티드) 및/또는 펩톤 (보다 바람직하게는 소, 돼지 또는 물고기 유래, 더욱 바람직하게는 소 또는 물고기 유래의 펩톤) 이며, 특히 바람직하게는 콜라겐펩티드이다. 이와 같은 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원을 사용하면, 효모의 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 많아진다. 펩톤은, 수육 펩톤, 심근 펩톤, 젤라틴 펩톤이면 된다. 본 발명의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법의 바람직한 실시양태의 일례는, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원, 그리고 콜라겐펩티드 및/또는 펩톤을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함한다.

일 양태에 있어서, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원은, 평균 분자량이 10000 이하인 것이 바람직하고, 예를 들어 평균 분자량이 100 ∼ 10000 이 바람직하다. L-하이드록시프롤린 함유 펩티드는, 평균 분자량이 10000 이하인 것이 바람직하고, 예를 들어 평균 분자량이 100 ∼ 10000 이 바람직하다. 또, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드는, 분자량이 10000 이하인 것도 바람직하다.

콜라겐펩티드는, 평균 분자량이 1000 ∼ 10000 인 것이 바람직하다. 평균 분자량이 상기 범위인 콜라겐펩티드를 질소원에 사용하면, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 많아진다.

L-하이드록시프롤린 함유 펩티드의 평균 분자량은, 겔 여과 등에 의해 산출된다. 콜라겐펩티드의 평균 분자량은, 통상 사진용 젤라틴 시험법 (PAGI 법) 제10판 「20-2 평균 분자량」에 기재되어 있는 방법에 의해 산출되는 값이다. 펩티드의 평균 분자량은, 중량 평균 분자량을 가리킨다.

콜라겐펩티드의 평균 분자량은, 보다 바람직하게는 1000 ∼ 6000 이고, 더욱 바람직하게는 1000 ∼ 5500 이며, 특히 바람직하게는 1000 ∼ 5000 이다. 이와 같은 콜라겐펩티드를 질소원에 사용하면, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 보다 많아진다. 또, 일 양태에 있어서, 콜라겐펩티드의 평균 분자량으로서 1000 ∼ 3000 이 보다 바람직하고, 1000 ∼ 1500 이 더욱 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에 있어서는, 콜라겐펩티드의 평균 분자량은, 2000 ∼ 5500 이 보다 바람직하고, 3000 ∼ 5000 이 더욱 바람직하다.

상기 액체 배지 중의 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원의 농도는, 0.1 ∼ 10 중량％ 가 바람직하고, 0.25 ∼ 5 중량％ 가 보다 바람직하며, 1 ∼ 5 중량％ 인 것이 더욱 바람직하다. 상기 질소원의 농도가 상기 범위이면, 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린이 축적된다. 이 때문에, 예를 들어 L-하이드록시프롤린 함량이 10 ㎍/mL 이상인 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 얻을 수 있다. 또, (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 35 ∼ 100 인 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 얻을 수 있다. 액체 배지 중의 상기 질소원의 농도는, 1.5 ∼ 4.5 중량％ 가 보다 더 바람직하고, 2 ∼ 4 중량％ 가 특히 바람직하다. 상기 질소원의 농도는, 배양 개시 시에 상기 농도이면 된다.

일 양태에 있어서, 상기 액체 배지 중의 콜라겐펩티드 또는 펩톤의 농도가, 상기 범위인 것이 바람직하다.

상기 탄소원은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 라피노오스, 만노오스, 말토오스, 갈락토오스, 만니톨, 트레할로오스, 멜레지토오스, 셀로비오스, 전분, 당밀, 소르비톨, L-소르보오스, 글리세롤, 에탄올, 글루시톨 등의 당질 또는 당알코올 ; 아세트산, 시트르산, 또는 글루콘산 등의 유기산 등을 들 수 있다. 탄소원은, 1 종 단독으로 사용해도 되고, 또 2 종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 그 중에서도, 탄소원은 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 등의 당이 바람직하고, 글루코오스가 특히 바람직하다.

액체 배지 중의 탄소원의 농도는, 바람직하게는 0.1 ∼ 20 중량％ 이고, 바람직하게는 0.5 ∼ 15 중량％ 이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 중량％ 이고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 5 중량％ 이며, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 5 중량％ 이다. 액체 배지 중의 탄소원의 농도가 1 중량％ 이상이면, 균체의 증식 속도가 빠르기 때문에 바람직하다. 또한, 탄소원의 농도는, 배양 개시 시에 상기 농도이면 된다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 탄소원 (C) 과 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원 (N) 의 중량비 (C/N) 가 0.25 ∼ 20 인 것이 바람직하다. C/N 의 중량비가 상기 범위이면, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 많아지기 때문에 바람직하다. 일 양태에 있어서, 상기 C/N 의 중량비는, 0.25 ∼ 5 가 보다 바람직하고, 0.3 ∼ 3 이 보다 바람직하며, 0.4 ∼ 1.5 가 더욱 바람직하다. C/N 의 중량비가 상기 범위이면, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 보다 많아진다. 일 양태에 있어서, 예를 들어 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원 (N) 에 콜라겐펩티드 (바람직하게는 평균 분자량이 1000 ∼ 5000) 또는 펩톤을 사용하는 경우에는, 상기 C/N 의 중량비는 0.25 ∼ 5 가 보다 바람직하고, 0.3 ∼ 3 이 보다 바람직하며, 0.4 ∼ 1.5 가 더욱 바람직하고, 0.5 ∼ 1.3 이 특히 바람직하다.

다른 바람직한 양태에 있어서, 상기 C/N 의 중량비는, 0.5 ∼ 20 도 바람직하다.

상기 C/N 의 중량비는, 배양 개시 시에 상기 범위이면 된다.

액체 배지는, 상기 서술한 탄소원 및 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원 이외의 성분을 포함해도 되고, 예를 들어 효모 추출물 (Yeast extract) 을 포함하는 것이 바람직하다. 효모 추출물은, 통상 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하지 않아, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원에는 포함되지 않는다. 효모 추출물은, 효모의 배양에 사용할 수 있는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않고, 시판품을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제품명 Bacto yeast Extract (#212750) (Bacto 사) 등을 바람직하게 사용할 수 있다.

효모 추출물을 사용하는 경우, 효모 추출물의 농도는, 액체 배지에 대해 0.1 ∼ 3 중량％ 가 바람직하고, 0.5 ∼ 3 중량％ 가 보다 바람직하다. 효모 추출물의 농도는, 배양 개시 시에 상기 농도이면 된다.

일 양태에 있어서, 액체 배지의 pH 는, 3 ∼ 9 가 바람직하고, 4 ∼ 9 가 보다 바람직하며, 4 를 초과하고 9 이하가 더욱 바람직하고, 4.5 ∼ 8.8 이 보다 더 바람직하며, 5 ∼ 8.7 이 특히 바람직하다. 액체 배지의 pH 는, 적절히 조정하면 된다. pH 조정에는, 공지된 산 또는 알칼리제를 사용할 수 있고, 예를 들어 염산, 황산, 인산, 질산, 글루탐산, 아세트산, 부티르산, 락트산, 포름산, 숙신산, 말레산, 말산, 옥살산, 시트르산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 암모니아수, 글루탐산나트륨 등을 들 수 있다.

배양 온도는, 15 ∼ 45 ℃ 가 바람직하고, 20 ∼ 40 ℃ 가 보다 바람직하며, 25 ∼ 35 ℃ 가 더욱 바람직하다. 배양 온도가 이 온도 범위이면, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 증식이 빨라, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린의 축적량이 많아진다.

호기 배양을 실시하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 접종한 액체 배지를, 예를 들어 진탕 배양 또는 교반 배양하면 된다. 진탕 또는 교반의 속도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 30 ∼ 600 rpm 이고, 일 양태에 있어서, 보다 바람직하게는 50 ∼ 600 rpm 이며, 더욱 바람직하게는 100 ∼ 600 rpm 이다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서 진탕 또는 교반의 속도는, 보다 바람직하게는 30 ∼ 500 rpm 이고, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 300 rpm 이다. 이와 같은 속도로 진탕 배양 또는 교반 배양하면, L-하이드록시프롤린의 축적량이 많아지기 때문에 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 속도로 진탕 배양한다. 또, 원하는 바에 따라 멸균된 공기 또는 산소로 버블링을 실시해도 된다. 또, 배양 형식은, 회분 배양, 유가 배양, 연속 배양 중 어느 것이어도 되지만, 회분 배양이 바람직하다. 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 정치 배양을 실시해도 된다.

배양 시간은 특별히 한정되지 않고, 적절히 설정하면 되지만, 예를 들어 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다. 배양 시간이 상기 범위이면, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린이 축적된다. 또, 통상 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 35 ∼ 100 인, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물, L-하이드록시프롤린 함량이 10 ㎍/mL 이상인 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 얻을 수 있다. 또, 에탄올 함량이 적은 (예를 들어, 1 v/v％ 이하) 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물이 얻어진다. 배양 시간이 10 시간 미만이면, L-하이드록시프롤린의 축적량이 적은 경우나, 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 35 미만이 되는 경우가 있다. 배양 시간이 100 시간을 초과하면, 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 에탄올 농도가 1 v/v％ 를 초과하는 경우가 있다. 또, 콘테미네이션이 일어나기 쉬워지거나, 효모의 사멸 후에 자기 소화에 의한 착색 등이 발생하거나 하는 경우가 있다. 배양 시간은, 보다 바람직하게는 10 ∼ 80 시간이고, 더 바람직하게는 12 ∼ 72 시간이며, 보다 더 바람직하게는 20 ∼ 60 시간이고, 보다 더욱 바람직하게는 24 ∼ 55 시간이며, 특히 바람직하게는 24 ∼ 50 시간이다. 또, 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 균체 또는 균체 배양물 중의 L-하이드록시프롤린 함량이 10 ㎍/mL 이상이 될 때까지, 호기 배양을 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 호기 배양은, 통상 본배양으로서 실시되지만, 전배양이어도 되고, 전배양 및 본배양에 있어서 호기 배양을 실시해도 된다.

상기 호기 배양을 실시함으로써, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린이 축적된다. 균체 배양물은, 효모의 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액이어도 되고, 효모의 균체여도 되며, 또는 균체 배양액의 배양 상청이어도 된다. Hyp 축적 공정을 실시함으로써, L-하이드록시프롤린을 함유하고, (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이, 35 ∼ 100 인 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 또는 균체 배양물을 얻을 수 있다. 또, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 효모 야로위아 리폴리티카 (Ycarrowia lipolytia) 의 균체 또는 균체 배양물을 얻을 수 있다. 효모의 균체 또는 균체 배양물에, 예를 들어 균체 파쇄 처리를 실시함으로써, 효모의 균체 또는 균체 배양물의 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서 L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 그 추출물을 조제하는 경우에는, 예를 들어 Hyp 축적 공정에서 얻어지는 효모의 균체 및 배양 상청을 포함하는 균체 배양액을 그대로 L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 배양물로 할 수 있다. 또, 균체 배양액으로부터 효모의 균체를 집균하고, 얻어진 균체를 효모의 균체 또는 균체 배양물로 해도 되고, 균체 배양액으로부터 균체를 제거한 배양 상청을 균체 배양물로 할 수도 있다. 또한, 상기 균체 또는 균체 배양액에, 필요에 따라 균체를 파쇄하는 처리를 실시하여, 균체 내용물을 배양액 중 등에 용출시켜 균체 또는 균체 배양물의 추출물을 조제할 수도 있다. 균체 또는 균체 배양물의 추출물의 조제에 있어서는, 균체를 파쇄한 후, 균체 잔류물을 제거하는 공정을 실시해도 된다. 또, 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에는, 필요에 따라 살균, 가열 등의 처리를 실시해도 된다. 본 발명의 제조 방법은, 이와 같은 집균 공정, 균체 파쇄 공정, 균체 잔류물 제거 공정, 살균 공정 등의 1 또는 2 이상의 공정을 포함해도 된다.

균체 배양액으로부터 균체를 집균하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 통상 실시되고 있는 방법을 채용할 수 있고, 예를 들어 원심분리 등을 들 수 있다.

상기 균체를 파쇄하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 통상 실시되고 있는 방법을 채용할 수 있으며, 예를 들어 자기 소화법, 효소 분해법, 알칼리 추출법 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 자기 소화법이 바람직하다. 자기 소화법에 있어서는, 예를 들어 균체 또는 균체 배양물을 40 ∼ 60 ℃ 에서 60 ∼ 180 분간, 또는 95 ∼ 100 ℃ 에서 5 ∼ 15 분간 가열하면 된다.

균체 잔류물을 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 여과, 원심분리 등의 공지된 방법에 의해 균체 잔류물을 제거하면 된다.

살균을 실시하는 경우에는, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 75 ∼ 90 ℃ (보다 바람직하게는 80 ℃), 45 ∼ 90 분 (보다 바람직하게는 60 분) 가열하는 것이 바람직하다. 균체 잔류물 제거 및 살균을 실시하는 경우, 어느 것을 먼저 실시해도 된다.

본 발명에 있어서 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물, 및 그 바람직한 양태는, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물, 및 그 바람직한 양태와 동일하다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 예를 들어 (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이, 35 ∼ 100 이고, 또한 L-하이드록시프롤린 함량이 10 ㎍/mL 인 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 제조할 수 있다. 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 중의 L-하이드록시프롤린은, 통상 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물에서 유래하는 것이다.

상기 방법에 의해 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에, 추가로 천연물 유래 또는 합성된 L-하이드록시프롤린을 첨가해도 되지만, 바람직한 양태에 있어서는, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 포함되는 L-하이드록시프롤린은, 상기 Hyp 축적 공정에 의해 얻어지는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 또는 균체 배양물에서 유래하는 L-하이드록시프롤린으로 이루어진다.

본 발명에서 얻어지는 L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 후술하는 음식품, 화장료 등의 원료 등으로서 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 있어서는, 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로부터, L-하이드록시프롤린을 정제하는 공정을 실시해도 된다. L-하이드록시프롤린의 정제는, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 의해 실시하면 된다.

상기 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 제조하기 위해서도 바람직하게 사용된다. L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이, 35 ∼ 100 인 것이 바람직하다. L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것도 바람직하다. L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 바람직한 양태는, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 바람직한 양태와 동일하다.

본 발명의 사용은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원인 것이 바람직하다.

본 발명의 사용에 있어서는, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인 것이 바람직하다. 또, 상기 콜라겐펩티드의 평균 분자량은 1000 ∼ 10000 인 것이 바람직하다.

본 발명의 사용에 있어서는, 상기 액체 배지 중의 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원의 농도가 0.25 ∼ 5 중량％ 인 것이 바람직하다. 또, 탄소원 (C) 과 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원 (N) 의 중량비 (C/N) 가 0.25 ∼ 20 인 것이 바람직하다. 일 양태에 있어서, 상기 C/N 비는 0.5 ∼ 20 인 것도 바람직하다. 본 발명의 사용에 있어서는, 상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 사용에 있어서의 액체 배지, 탄소원 및 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원 그리고 이들의 바람직한 양태는, 상기 서술한 L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 있어서의 것과 동일하다. 또, 호기 배양의 조건 및 그 바람직한 양태도, 상기 서술한 L-하이드록시프롤린의 제조 방법에 있어서의 것과 동일하다. 본 발명의 사용은, 상기 서술한 집균 공정, 균체 파쇄 공정, 균체 제거 공정, 살균 공정 등의 1 또는 2 이상의 공정을 포함해도 된다.

상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 화장료, 음식품, 의약품 등의 각종 조성물에 배합할 수 있다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 조성물도, 본 발명에 포함된다. 본 발명의 조성물은, 상기 서술한 본 발명의 제 1 양태 및 제 2 양태의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 중 어느 것을 포함하면 되고, 양방을 포함해도 된다. 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 조성물은, 그 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에서 유래하는 L-하이드록시프롤린을 포함한다.

본 발명의 조성물로서, 예를 들어 화장료 (화장료 조성물), 음식품 (음식품 조성물), 의약품 (의약품 조성물), 의약 부외품 (의약 부외품 조성물) 등을 들 수 있다. 조성물은, 이들의 원료여도 된다. 일 양태에 있어서, 조성물은, 화장료 또는 음식품, 이들의 원료인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물 중의 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량은 특별히 한정되지 않고, 그 조성물의 종류, 용도에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 조성물에 대해, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 고형분 환산의 함량을 0.00001 ∼ 50 중량％ 로 하는 것이 바람직하고, 0.00005 ∼ 20 중량％ 가 보다 바람직하며, 0.0001 ∼ 10 중량％ 가 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물이 화장료 또는 의약품인 경우, 그 제형은 특별히 한정되지 않고, 용액상, 페이스트상, 겔상, 고체상, 분말상 등 임의의 제형을 취할 수 있다.

화장료는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 클렌징제, 세안료, 화장수, 유액, 크림, 미용액, 육모제, 오일, 겔, 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 에나멜, 파운데이션, 립스틱, 분, 팩, 향수, 파우더, 오데 코롱, 보디 소프, 비누, 입욕제, 자외선 차단 크림 등으로 할 수 있다.

상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 화장료 또는 화장료 원료는, 본 발명에 있어서의 바람직한 양태의 하나이다. 화장료 및 화장료 원료는, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 이외의 성분을 포함하고 있어도 된다. 화장료 및 화장료 원료에는, 화장료에 통상 배합되는 여러 가지 성분을 배합할 수 있다. 예를 들어, 유분, 향료, 계면 활성제, 보습제, 산화 방지제, 자외선 흡수제, 방부제, 안료, 색소 등을 적절히 배합할 수 있다. 이들의 배합 비율은 적절히 선택하면 된다. 본 발명의 화장료 원료는, 본 발명의 화장료를 제조하기 위해서 바람직하게 사용된다.

화장료의 용법 및 용량은, 화장료의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

본 발명의 화장료 또는 화장료 원료는, L-하이드록시프롤린을 함유하는 점에서, 예를 들어 콜라겐 산생 촉진, 표피 세포의 증식 촉진, 피부의 보습, 피부의 노화 방지, 피부의 처짐 예방 또는 개선, 피부의 탄력 개선, 주름의 예방 또는 개선 및 아토피성 피부염의 개선에서 선택되는 용도로 바람직하게 사용되고, 피부의 탄력 개선, 및 주름의 예방 또는 개선에서 선택되는 용도로 보다 바람직하게 사용된다.

화장료 중의 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량은, 화장료에 대해 고형분 환산으로 0.00001 ∼ 10 중량％ 가 바람직하고, 0.0001 ∼ 10 중량％ 로 하는 것이 바람직하며, 0.0001 ∼ 5 중량％ 가 보다 바람직하고, 0.001 ∼ 5 중량％ 가 보다 바람직하며, 0.01 ∼ 3 중량％ 가 더욱 바람직하고, 0.05 ∼ 2 중량％ 가 특히 바람직하다. 또, 다른 바람직한 양태에 있어서, 화장료 중의 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량은, 화장료에 대해 고형분 환산으로 0.00005 ∼ 1 중량％ 가 보다 바람직하고, 0.0001 ∼ 0.5 중량％ 가 더욱 바람직하다.

화장료 원료 중의 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량은, 화장료 원료에 대해 예를 들어 고형분 환산으로 0.001 ∼ 20 중량％ 가 바람직하고, 0.01 ∼ 10 중량％ 가 보다 바람직하며, 0.05 ∼ 5 중량％ 가 더욱 바람직하고, 0.1 ∼ 2 중량％ 가 특히 바람직하다. 화장료 원료 중의 L-하이드록시프롤린 함량은, 예를 들어 5 ∼ 300 ppm 이 바람직하고, 10 ∼ 200 ppm 이 보다 바람직하며, 50 ∼ 100 ppm 이 더욱 바람직하다. 일 양태에 있어서, 화장료 중의 L-하이드록시프롤린 함량은, 예를 들어 0.01 ∼ 20 ppm 으로 할 수 있고, 0.03 ∼ 15 ppm 이 바람직하고, 0.05 ∼ 10 ppm 이 보다 바람직하다. L-하이드록시프롤린 함량이 상기 범위가 되도록, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 배합하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물이 음식품 (음식품 조성물) 인 경우, 음식품은 특별히 한정되지 않는다. 음식품의 형태는, 액상, 반액체상 또는 고체상, 페이스트상 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어 일반적인 음식품, 건강 식품, 기능성 식품 등 중 어느 것이어도 된다.

일반적인 음식품은 특별히 한정되지 않고, 주류도 포함된다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 여겨지는 식품을 말하고, 영양 보조 식품, 자연 식품 등을 포함한다. 영양 보조 식품이란, 특정 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 기능성 식품이란, 신체의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하고, 특정 보건용 식품, 영양 기능 식품을 포함한다.

영양 보조 식품으로서 미용 드링크, 서플리먼트 등을 들 수 있다. 본 발명의 음식품은, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 드링크제 등이어도 된다.

음식품에는, 음식품에 배합하는 것이 인정되고 있는 여러 가지 성분을 배합할 수 있다. 이와 같은 성분으로는, 예를 들어 결합제, 증점제, 착색제, 안정제, 유화제, 분산제, 붕괴제, 현탁화제, 계면 활성제, 방부제, 감미료, 산미료 등을 들 수 있다.

상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 음식품은, 본 발명에 있어서의 바람직한 양태의 하나이다.

음식품 중의 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량은, 예를 들어 음식품에 대해 고형분 환산으로 0.0001 ∼ 10 중량％ 로 하는 것이 바람직하고, 0.001 ∼ 5 중량％ 가 보다 바람직하며, 0.01 ∼ 1 중량％ 가 더욱 바람직하다. 또, 음식품 중의 L-하이드록시프롤린 함량은, 0.0001 ∼ 0.01 중량％ 가 바람직하고, L-하이드록시프롤린 함량이 상기 범위가 되도록, 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 배합하는 것이 바람직하다. 상기 화장료, 화장료 원료, 음식품 등의 조성물 중의 L-하이드록시프롤린 함량은, 유리의 L-하이드록시프롤린 함량이다. L-하이드록시프롤린은, 바람직하게는 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에서 유래한다.

본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 함유하는 화장료, 음식품, 이들의 원료 등의 조성물은, 이들에 통상 사용되고 있는 원료, 첨가제 등을 그 종류에 따라 선택하여 배합하고, 이것에 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 배합하고, 공지된 수법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정 (Hyp 축적 공정) 을 포함하는, L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료의 제조 방법도 포함한다. 상기 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원이다. 본 발명의 L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료의 제조 방법의 바람직한 양태는, 상기 서술한 L-하이드록시프롤린의 제조 방법의 바람직한 양태와 동일하다. 상기 L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료의 제조 방법은, 본 발명의 화장료 원료의 제조 방법으로서 바람직하다.

Hyp 축적 공정을 실시함으로써, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 또는 균체 배양물이 얻어진다. 또, 효모의 균체 또는 균체 배양물에 상기 서술한 균체 파쇄 처리를 실시함으로써, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 또는 균체 배양물의 추출물이 얻어진다. 이와 같이 하여 얻어지는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물, 및 그 바람직한 양태는, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물, 및 그 바람직한 양태와 동일하다. 얻어지는 L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, 원하는 바에 따라 화장료에 통상 사용되는 첨가제 등을 배합하여, L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료로서 사용할 수 있다. 또, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로부터 정제한 L-하이드록시프롤린에, 원하는 바에 따라 화장료에 통상 사용되는 첨가제 등을 배합하여, L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료를 제조할 수도 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 L-하이드록시프롤린 함유 화장료 원료는, 콜라겐 산생 촉진, 표피 세포의 증식 촉진, 피부의 보습, 피부의 노화 방지, 피부의 처짐 예방 또는 개선, 피부의 탄력 개선, 주름의 예방 또는 개선 및 아토피성 피부염의 개선에서 선택되는 용도의 화장료에 바람직하게 사용된다.

본 발명은, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는, L-하이드록시프롤린 보강용 조성물도 포함한다.

상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린을 함유하지만, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인 것이 바람직하다. 상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상이 바람직하다. 이와 같은 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, 화장품, 음식품 등의 L-하이드록시프롤린을 보강, 보충 또는 강화하기 위한 첨가제로서 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 바람직한 양태는, 상기 서술한 본 발명의 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물 및 그 바람직한 양태와 동일하다. L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, L-하이드록시프롤린 보강용의 첨가제 조성물로서 음식품, 화장료 등에 바람직하게 사용할 수 있다. L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, L-하이드록시프롤린 보충용 조성물 또는 L-하이드록시프롤린 강화용 조성물이라고 바꿔 말할 수도 있다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하고 있으면 되고, 그 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량이 100 중량％ 여도 되지만, 원하는 바에 따라 다른 성분을 포함하고 있어도 된다. 예를 들어 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물을 식품 첨가제로서 사용하는 경우에는, 식품에 사용되는 공지된 첨가제 1 종 또는 2 종 이상을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물은, 예를 들어 화장료 첨가제로서도 바람직하게 사용된다. L-하이드록시프롤린 보강용 조성물을 화장료 첨가제로서 사용하는 경우에는, 그 조성물 중, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하고 있으면 되고, 그 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물의 함량이 100 중량％ 여도 되지만, 원하는 바에 따라 화장료에 사용되는 공지된 첨가제 1 종 또는 2 종 이상을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물의 제조 방법은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같은 공정을 포함하는 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물의 제조 방법도 본 발명에 포함된다. 상기 질소원은, L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원이다. 본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물의 제조 방법 및 그 바람직한 양태는, 상기 서술한 L-하이드록시프롤린의 제조 방법 및 그 바람직한 양태와 동일하다. 본 발명의 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물의 제조 방법은, 원하는 바에 따라 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물에 공지된 식품 첨가제, 화장료 첨가제 등을 첨가하는 공정을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 다른 양태의 L-하이드록시프롤린의 제조 방법은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함한다.

본 발명의 다른 양태의 제조 방법에 있어서는, 상기 질소원이, L-하이드록시프롤린 함유 단백질 또는 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 제조 방법에 있어서는, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 단백질이 콜라겐성 단백질이고, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태의 제조 방법에 있어서는, 상기 콜라겐성 단백질 및 콜라겐펩티드의 평균 분자량이 1000 ∼ 100000 인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 제조 방법에 있어서는, 상기 액체 배지 중의 질소원의 농도가 0.25 ∼ 5 중량％ 이고, 탄소원 (C) 과 질소원 (N) 의 중량비 (C/N) 가 0.5 ∼ 20 인 것이 바람직하다. 또, 상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 사용은, 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용으로서, 상기 효모를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 것을 포함하고, 상기 질소원이 L-하이드록시프롤린 함유 단백질 또는 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 사용에 있어서는, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 단백질이 콜라겐성 단백질이고, 상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태의 사용에 있어서는, 상기 콜라겐성 단백질 및 콜라겐펩티드의 평균 분자량이 1000 ∼ 100000 인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태의 사용에 있어서는, 상기 액체 배지 중의 질소원의 농도가 0.25 ∼ 5 중량％ 이고, 탄소원 (C) 과 질소원 (N) 의 중량비 (C/N) 가 0.5 ∼ 20 인 것이 바람직하다. 또, 상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는 것이 바람직하다.

상기 L-하이드록시프롤린 함유 단백질로는, 예를 들어 상기 서술한 콜라겐성 단백질을 들 수 있다. 콜라겐성 단백질 등의 L-하이드록시프롤린 함유 단백질의 평균 분자량은, 바람직하게는 10000 을 초과하고 100000 이하이다. 단백질의 평균 분자량은, 중량 평균 분자량을 가리킨다. 콜라겐성 단백질 등의 L-하이드록시프롤린 함유 단백질의 평균 분자량은, 겔 여과 등에 의해 산출된다.

실시예

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 시험예 등을 나타낸다. 또한, 본 발명은 이들 시험예 등으로만 한정되는 것은 아니다. 시험예 중, 특별히 기재하지 않는 경우에는 「％」는 「중량％」를 의미한다.

시험예 중, 검량선의 작성에 사용하는 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 표준 용액 등의 조제에는, 나카라이테스크 (주) 제조의 L-4-하이드록시프롤린을 사용하였다. L-프롤린 (Pro) 표준 용액 등의 조제 등에는, 나카라이테스크 (주) 제조의 L-프롤린을 사용하였다. 시험예에서 측정한 L-하이드록시프롤린 및 L-프롤린은, 모두 유리의 L-하이드록시프롤린 및 L-프롤린이다.

시험예 중에서 사용한 배지는, 모두 액체 배지이다. 시험예 중에서 사용한 YPD 배지는, 특별히 기재하지 않는 경우에는, Y : P : D 가 1 : 2 : 2 (중량비) (Y : 효모 추출물 1.0 ％, P : 펩톤 2.0 ％, D : 글루코오스 2.0 ％) 로 하였다.

배지 조제에 사용한 효모 추출물은, Bacto 사 제조의 제품명 Yeast Extract (#212750) 이다. 펩톤은, Bacto 사 제조의 제품명 Pepton (#211677), 소의 세포를 돼지의 췌장 유래의 효소로 분해한 것을 사용하였다.

시험예에 있어서, 배양 개시 전의 배지의 pH 는, 약 6.5 ∼ 8.5 였다.

＜시험예 1＞

L-하이드록시프롤린 (이하, Hyp) 을 축적하는 효모의 스크리닝

표 1 에 나타내는 60 주의 효모를 사용하여, Hyp 를 배양물 중에 축적하는 효모의 스크리닝을 실시하였다. 표 1 에 각 균주의 속종명을 나타낸다.

이하의 조건으로, YPD 배지에서 효모를 배양한 후, HPLC 로 Hyp 를 정량하였다.

(배양)

0.5 ％ L-프롤린 (이하, Pro) 을 첨가한 YPD 배지 1 mL 에, 각 균주를 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 한 후, 실온에서 4 ∼ 7 일간 정치 배양하여 효모의 균체 배양액 (균체 배양물) 을 얻었다.

(샘플 조제)

효모의 균체 배양액에 이하의 처리를 실시하여 배양물 샘플을 조제하고, Hyp 함량을 측정하였다.

상기 배양 후, 집균하고, 균체를 1 mL 의 생리 식염수로 세정하였다. 균체를 0.2 mL 의 50 mM 칼륨인산 완충액 (이하, KPB) (pH 6.0) 에 현탁하고, 10 분간 자비하여, 자기 소화에 의해 균체 내용물을 용출시켰다 (자비법). 얻어진 균체 추출물로부터 원심분리 (14000 rpm, 5 분, 4 ℃) 에 의해 균체 잔류물을 제거하였다. 이로써, Hyp 축적량을 측정하기 위한 배양물 샘플을 조제하였다.

배양물 샘플을 워터즈사의 (AccQ-Fluor Reagent Kit) 를 사용하여, AccQTag 법에 의해 유도체화하고, 이하의 조건으로 HPLC 로 Hyp 를 정량하였다.

HPLC 분석에 사용한 장치 및 조건을 이하에 나타낸다.

(장치)

고속 액체 크로마토그래프 : Prominence ((주) 시마즈 제작소)

칼럼 : XBridge C18 5㎛ (2.1 x 150 mm, 워터즈사 제조)

(측정 조건)

용리액 A : 아세트산암모늄 (10 mM, pH 5)

용리액 B : 메탄올 (0 ∼ 0.5 분. (0 ％ → 1 ％), 0.5 ∼ 18 분. (1 ％ → 5 ％), 18 ∼ 19 분. (5 ％ → 9 ％), 19 ∼ 29.5 분. (9 ％ → 17 ％), 29.5 ∼ 40 분. (17 ％ → 60 ％), 40 ∼ 43 분. (60 ％))

유속 : 0.3 mL/분

온도 : 40 ℃

검출 : 형광 검출기 (여기 파장 : 250 nm, 검출 파장 : 395 nm)

용리액 B 의 농도 (％) 는, v/v％ 이다.

결과를 도 1 에 나타낸다.

도 1 은, 효모의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다. 도 1 의 세로축 (Hyp (㎍/mL)) 은, 배양물 샘플 1 mL 당의 Hyp (㎍) 를 나타낸다.

상기 시험으로부터, Hyp 를 축적하는 효모가 발견되었다. 특히 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 가, Hyp 축적량이 많았다.

＜시험예 2＞

효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 에 대해, 배지에 의해 Hyp 축적량이 변화하는지를 조사하였다. 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 사용하고, 이하의 액체 배지를 사용하였다. 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 은, 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 로부터 입수하였다.

YPD (1 ％ 효모 추출물, 2 ％ 펩톤, 2 ％ 글루코오스)

YTD (1 ％ 효모 추출물, 2 ％ 트립톤, 2 ％ 글루코오스)

YM (0.3 ％ 효모 추출물, 0.3 ％ 맥아 엑기스, 0.5 ％ 펩톤, 2 ％ 글루코오스)

PD (0.4 ％ 포테이토 추출물, 2 ％ 글루코오스)

SD (합성 배지, 1 ％ 글루코오스)

(전배양 및 본배양)

(1) 조건 1

0.5 ％ Pro 를 첨가한 YPD 배지 1 mL 에, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

0.5 ％ Pro 를 첨가한 각 배지 (상기 YPD, YTD, YM, PD 또는 SD) 2 mL 에, 전배양액 0.2 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 36 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 배양액을 얻었다.

(2) 조건 2

0.5 ％ Pro 를 첨가한 YPD 배지 대신에, 0.5 ％ Pro 를 첨가한 SD 배지를 사용한 것 이외에는, 조건 1 과 동일한 조건으로 전배양을 실시하였다. 0.5 ％ Pro 를 첨가한 각 배지 (상기 YPD, YTD, PD 또는 SD) 2 mL 에, 전배양액 0.2 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 45 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제)

조건 1 또는 2 의 배양 후, 효모의 균체 배양액에 이하의 처리를 실시하여 배양물 샘플을 조제하고, Hyp 함량을 측정하였다.

상기 배양 후, 집균하고, 균체를 1 mL 의 생리 식염수로 세정하였다. 균체를 0.2 mL 의 50 mM KPB (pH 6.0) 에 현탁하고, 10 분간 자비하여, 자기 소화에 의해 균체 내용물을 용출시켰다 (자비법). 얻어진 균체 추출물로부터 원심분리 (14000 rpm, 5 분, 4 ℃) 에 의해 균체 잔류물을 제거하였다. 이로써, Hyp 축적량을 측정하기 위한 배양물 샘플을 조제하였다.

(Hyp 정량)

배양물 샘플을 o-프탈알데하이드 (OPA) 및 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔 (NBD-Cl) 에 의해 유도체화하고, HPLC 로 Hyp 를 정량하였다.

(유도체화 방법)

4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔 (4-Chloro-7-nitrobenzofurazan, NBD-Cl) 에 의한 유도체화

0.4 M 붕산칼륨 완충액 (pH 9.5) 을 50 μL 분주하고, 배양물 샘플을 2 μL 첨가하였다. 300 mM OPA (Wako 167-09263) (메탄올에 용해) 를 2 μL 첨가하여 혼합하고, 37 ℃ 에서 20 분간 반응 후, 2 mM NBD-Cl (Sigma25455) (메탄올에 용해) 을 50 μL 첨가하여 혼합하고, 37 ℃ 에서 20 분간 반응시킨 액에, 1 N HCl 을 25 μL, 50 ％ 메탄올을 75 μL 첨가하고, 14000 rpm 으로 5 분간 원심한 상청을 HPLC 측정용 샘플로 하고, HPLC 용의 바이알에 옮겼다.

HPLC 분석에 사용한 장치 및 조건을 이하에 나타낸다.

칼럼 : XBridge C18 column (5 ㎛ ; 2.1 mm × 150 mm ; Waters)

A 액 : 10 mM 아세트산암모늄 (pH 5.0)

B 액 : 메탄올

그레이디언트 :

0 ∼ 0.5 분 : B. Conc 0 v/v％ → 1 v/v％

0.5 ∼ 18 분 : B. Conc 1 v/v％ → 5 v/v％

18 ∼ 19 분 : B. Conc 5 v/v％ → 9 v/v％

19 ∼ 29.5 분 : B. Conc 9 v/v％ → 17 v/v％

29.5 ∼ 40 분 : B. Conc 17 v/v％ → 60 v/v％

40 ∼ 43 분 : B. Conc 60 v/v％

유속 : 0.3 mL/분

칼럼 온도 : 40 ℃

검출기 : 형광 검출기, 여기 파장 503 nm/형광 파장 541 nm

주입량 : 10 μL

검량선은, Hyp 의, 5 ㎛ol/L, 10 ㎛ol/L, 20 ㎛ol/L, 50 ㎛ol/L, 100 ㎛ol/L, 250 ㎛ol/L 의 50 mM KPB (pH 6.0) 용액을 조제하여 작성하였다.

결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 는, 각 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 ((a) : 조건 1, (b) : 조건 2). 도 2 의 세로축의 Hyp (㎍/mL) 는, 배양물 샘플 1 mL 당의 Hyp (㎍) 이다. 조건 1 의 배양에서는, YPD 및 YM 배지에서 배양한 균체에 하이드록시프롤린이 많이 축적되었다 (펩톤을 포함하는 배지). 조건 2 의 배양에서는, YPD 배지에서 배양한 균체에 Hyp 가 축적되었다.

＜시험예 3＞

배양일수에 의한 축적량의 변동을 조사하였다.

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 NBRC1551 주, NBRC0717 주, NBRC0746 주 및 NBRC1195 주를 각각 YPD 배지에서 1 일, 2 일 또는 3 일간 배양하고, 효모의 균체 (세포) 로부터 용출시킨 Hyp 를 HPLC 를 사용하여 정량하였다. NBRC 번호로 특정되는 이들 효모는, 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 (일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8) 로부터 입수하였다.

(전배양)

YPD 배지 1 mL 에, 각 균주를 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

YPD 배지 2 mL 에, 전배양액 0.2 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 1 ∼ 3 일간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제 및 아미노산 정량)

시험예 2 와 동일한 방법으로 배양물 샘플을 조제하고, OPA 및 NBD-Cl 에 의해 유도체화하였다.

시험예 2 와 동일한 조건으로 HPLC 에 의한 분석을 실시하고, Hyp 및 Pro 를 정량하였다. Pro 의 검량선은, Pro 의 5 ㎛ol/L, 10 ㎛ol/L, 20 ㎛ol/L, 50 ㎛ol/L, 100 ㎛ol/L, 250 ㎛ol/L 의 50 mM KPB (pH 6.0) 용액을 조제하여 작성하였다.

각 배양물 샘플의 Pro 및 Hyp 량을 표 2 에 나타낸다. 또, Pro 및 Hyp 의 측정값으로부터, Pro 및 Hyp 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 Hyp 의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 을 계산하였다. 그 결과도 표 2 에 나타낸다.

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는, 배양에 의해 L-하이드록시프롤린을 축적하였다. 얻어진 균체 배양물은, L-하이드록시프롤린을 함유하였다. 또, (Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 비율이 35 이상이었다.

＜시험예 4＞

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 젤라틴 자화성을 검토하였다. 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 NBRC1551 주, NBRC0717 주 및 NBRC0746 주를 사용하여, PD 배지 또는 0.125 ％ 젤라틴을 첨가한 PD 배지에서 5 일간 배양하고, 균체로부터 균체 내용물을 용출시켜 Hyp 를 HPLC 에 의해 정량하였다. PD 배지는, 시험예 2 에서 사용한 것과 동일한 배지를 사용하였다.

(전배양)

PD 배지 1 mL 에, 각 균주를 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

PD 배지 또는 0.125 ％ 젤라틴 (와코 준야쿠 공업 (주) 제조, 제품명 젤라틴) 을 첨가한 PD 배지 2 mL 에, 전배양액 0.2 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 5 일간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제 및 Hyp 정량)

배양물 샘플의 조제 및 Hyp 정량은, 시험예 2 와 동일한 방법으로 실시하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

도 3 은, PD 배지 또는 0.125 ％ 젤라틴을 첨가한 PD 배지에서 5 일간 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 (백 : 0.125 ％ 젤라틴을 포함하는 PD 배지 (PD ＋ gel), 흑 : PD 배지). 세로축의 Hyp (㎍/mL) 는, 배양물 샘플 1 mL 당의 Hyp (㎍) 이다. 도 3 으로부터, 고분자 젤라틴 그대로 배지에 첨가하면, Hyp 의 축적은 시험예 3 과 비교해 적었다.

＜시험예 5＞

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 사용하여, YPD 배지 조성에 의해 Hyp 축적량이 변화하는지 검토하였다. 표 3 에 ＃1 ∼ ＃12 의 각 배지의 YPD 조성을 나타낸다. 표 3 중, Y 는, 효모 추출물, P 는 펩톤, D 는 글루코오스이다. 효모 추출물 (Y) 을 일정하게 하고, 펩톤 (P) 및 글루코오스 (D) 를 변화시켰다 (표 중의 수치는 종농도 (중량％)).

(전배양)

각 YPD 배지 1 mL 에, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

각 YPD 배지 2 mL 에, 전배양액 0.2 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 4 일간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제 및 Hyp 정량)

배양물 샘플의 조제 및 Hyp 정량은, 시험예 2 와 동일한 방법으로 실시하였다.

상기 YPD 배지에서 배양한 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는, Hyp 를 축적하였다. ＃1 및 ＃7 ∼ 11 의 배지에서 배양한 경우에 Hyp 축적량이 많았다. ＃1 및 ＃7 ∼ 11 의 배지에서 배양한 경우의 결과를 도 4 에 나타낸다.

도 4 는, 조성이 상이한 YPD 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 그래프이다 ((a) : Hyp 축적량 (㎍/mL), (b) : 세포당의 Hyp 량 (㎍/mL/OD600)). 도 4 의 (a) 의 세로축은, 배양물 샘플 1 mL 당의 Hyp (㎍) 이다. 도 4 의 (b) 의 세로축의 (Hyp/OD) 는, 세포당의 Hyp 량이고, 배양물 샘플 1 mL 중의 Hyp 량 (㎍) 을 OD600 의 측정값으로 나눈 값 (㎍/mL/OD600) 이다.

OD600 은, 핵산 단백질 분광 광도계 (장치명 Bio spec mini, (주) 시마즈 제작소) 를 사용하여, 배양물 샘플의 조제에 사용한 균체 배양액 60 μL 를 초순수 1150 μL 로 희석하고, 흡광도 (600 nm) 를 측정하였다.

＜시험예 6＞

시험예 5 에서 사용한 YPD 배지 ＃1 및 ＃10 에 있어서, P 로서 사용한 펩톤을 콜라겐펩티드 (닛타 젤라틴사 제조의 제품명 슈퍼콜라겐펩티드 SCP-2000, 돼지 유래, 평균 분자량 2000) 로 치환하여, Hyp 의 축적량을 조사하였다. 효모는, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 사용하였다. YPD 배지에 있어서, 펩톤의 일부 또는 전부를 콜라겐펩티드로 치환한 배지는, YPD 개변 배지라고도 할 수 있다.

YPD 배지의 P 의 조성

노멀 : 펩톤 100 ％

CP50 : 펩톤 50 ％ 콜라겐펩티드 50 ％

CP100 : 콜라겐펩티드 100 ％

배지 조성

(1) YPD ＃1-노멀 (YPD＃1)

(2) YPD ＃1-CP50 (YPD ＃1 에 있어서, 펩톤 대신에 CP50 을 사용)

(3) YPD ＃1-CP100 (YPD ＃1 에 있어서, 펩톤 대신에 CP100 을 사용)

(4) YPD ＃10-노멀 (YPD ＃10)

(5) YPD ＃10-CP50 (YPD ＃10 에 있어서, 펩톤 대신에 CP50 을 사용)

(6) YPD ＃10-CP100 (YPD ＃10 에 있어서, 펩톤 대신에 CP100 을 사용)

(전배양)

YPD 배지 1 mL 에, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 24 시간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

상기 (1) ∼ (6) 의 각 배지 2 mL 에, 전배양액 0.1 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 4 일간 진탕 배양 (300 rpm) 하여 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제 및 Hyp 정량)

결과를 도 5 에 나타낸다.

도 5 는, 펩톤 또는 콜라겐펩티드를 포함하는 배지에서 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량, 세포당의 Hyp 량 및 OD600 을 나타내는 그래프이다. ((a) : Hyp 축적량 (㎍/mL), (b) : 세포당의 Hyp 량 (㎍/mL/OD600), (c) : OD600). 도 5 의 (a) ∼ (c) 중, N 은, P 가 노멀인 배지, 50 은, P 가 CP50 인 배지, 100 은 P 가 CP100 인 배지인 것을 의미한다. 펩톤을 완전히 콜라겐펩티드로 치환한 배지에서도 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는 증식할 수 있고, Hyp 를 축적하였다.

＜시험예 7＞

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 사용하여, 배양 시의 에어레이션의 영향을 검토하였다. 배지는, 시험예 5 의 YPD 배지 ＃1 및 ＃10 을 사용하였다.

(전배양)

(본배양)

각 YPD 배지 (＃1 또는 ＃10) 2 mL 에, 전배양액 0.1 mL 를 접종하고, 28 ℃ 에서 3 일간 진탕 배양 (300 rpm) 또는 정치 배양하여 균체 배양액을 얻었다.

(샘플 조제 및 Hyp 정량)

배양물 샘플의 조제 및 Hyp 정량은, 시험예 2 와 동일한 방법으로 실시하였다. 또, 배양 상청에 대해서도, 배양물 샘플과 동일한 방법으로 유도체화하고, HPLC 로 Hyp 를 정량하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다.

도 6 은, 진탕 배양 또는 정치 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 Hyp 축적량을 나타내는 도면이다 ((a) : 배양물 샘플 (세포 내) 의 배지당 환산 Hyp 량, (b) : 배양 상청 중의 Hyp 량).

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 는, 호기 배양하면 Hyp 축적량이 많았다.

＜시험예 8＞

시험예 7 에서 얻어진 배양 상청 중의 에탄올 농도 및 글루코오스 농도를 HPLC (발효 칼럼 (바이오 라드사 제조, 제품명 Aminex 발효 모니터용 칼럼) 을 사용) 로 정량하였다.

결과를 도 7 에 나타낸다.

도 7 은, 진탕 배양 또는 정치 배양한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 배양 상청의 에탄올 농도 및 글루코오스 농도를 나타내는 그래프이다 ((a) : 에탄올 농도 (v/v％), (b) : 글루코오스 농도 (중량％)).

＜시험예 9＞

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 에 대해, YPD 배지의 조성 (Y : P : D 의 비율 및 P 의 종류) 및 배양 시간을 변화시켜 본배양을 실시하고, 균체 배양물 중의 Hyp 함량 및 Pro 함량을 측정하였다.

(전배양)

YPD 배지 3 mL 에, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) NBRC0717 을 1 백금이 접종하고, 30 ℃ 에서 1 일 정치 배양하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

상기에서 얻어진 전배양액 100 μL 를, 하기 YPD 배지 5 mL 에 접종하여 30 ℃ 에서 진탕 배양 (60 rpm) 하였다. 배양 시간은, 1 일 또는 2 일로 하여 균체 배양액 (균체 배양물) 을 얻었다.

본배양에서는, YPD 배지의 P 로서, 펩톤 또는 콜라겐펩티드 (CP) 를 사용하였다. 콜라겐펩티드로는, 콜라겐펩티드 익오스 HDL-50SP (제품명, 닛타 젤라틴 (주) 제조, 평균 분자량 5000) (이하, 콜라겐펩티드 (CP1) 이라고 기재한다) 또는 콜라겐펩티드 Type S (제품명, 닛타 젤라틴 (주) 제조, 평균 분자량 1200) (이하, 콜라겐펩티드 (CP2) 라고 기재한다) 를 사용하였다.

또, 본배양에 있어서의 YPD 배지의 Y : P : D 의 비율은, (1) Y : P : D = 1 : 2 : 2 (중량비) (Y : 효모 추출물 1.0 ％, P : 펩톤 또는 콜라겐펩티드 2.0 ％, D : 글루코오스 2.0 ％), 또는 (2) Y : P : D = 1 : 4 : 5 (중량비) (Y : 효모 추출물 1.0 ％, P : 펩톤 또는 콜라겐펩티드 4.0 ％, D : 글루코오스 5.0 ％) 로 하였다. 표 4 에, 본배양에서 사용한 배양 조건 1 ∼ 12 를 나타낸다.

본배양에서 얻어진 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 배양액에, 이하의 자기 소화 공정 및 살균 공정을 실시하여 배양물 샘플을 조제하고, Hyp 함량을 측정하였다.

(자기 소화 공정)

야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 배양액을 50 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하여, 자기 소화에 의해 균체 내용물을 배양액 중에 용출하였다.

(살균 공정)

상기에서 자기 소화한 배양액을 80 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다.

얻어진 추출물로부터 원심분리 (3000 rpm, 5 분, 1 ℃) 에 의해 균체 잔류물을 제거하였다. 이로써, Hyp 축적량을 측정하기 위한 배양물 샘플을 조제하였다.

(샘플 조제)

얻어진 배양물 샘플을 0.1 N 염산 용액으로 희석하여, HPLC 의 샘플을 조제하였다. 배양 시간 1 일의 균체 배양액으로 조제한 배양물 샘플은, 10 배 희석, 배양 시간 2 일의 균체 배양액으로 조제한 배양물 샘플은, 조건 12 이외에는 40 배 희석하고, 조건 12 는 20 배 희석하였다.

(HPLC 분석)

HPLC 로는, 오토샘플러로 1 급 아미노산 (1 급 아미노기), 2 급 아미노산 (2 급 아미노기) 의 형광 표지화를 실시하고, 역상의 HPLC 로 분석을 실시하는 시스템을 이용하였다. 1 급 아미노기의 형광 표지에는, o-프탈알데하이드 (OPA) 를, 2 급 아미노기의 형광 표지에는, 클로로포름산-9-플루오레닐메틸 (FMOC) 을, 각각 사용하였다.

상기에서 조제한 HPLC 의 샘플을, 샘플 바이알에 0.45 ㎛ 의 필터로 여과하여 오토샘플러에 세트하였다. 빈 바이알에 MPA (메르캅토프로피온산) 시약 30 μL, OPA 시약 15 μL, 상기 샘플 5 μL 를 넣어 1 분 정치 후, FMOC 시약을 5 μL 첨가하고 2 분간 반응한 용액 1 μL 를 HPLC 에 주입하였다. OPA 와 1 급 아미노산이 반응하고, 남은 2 급 아미노기를 가지는 Hyp 및 Pro 가 FMOC 와 반응한다. 각각의 형광 파장을 2 채널로 검출함으로써, 모든 아미노산을 동시에 검출하는 것이 가능하다.

HPLC 분석에 사용한 장치 및 조건을 이하에 나타낸다.

(장치)

(주) 시마즈 제작소 제조의 고속 액체 크로마토그래프 Nexera X2 시스템 (제품명)

시스템 컨트롤러 : CBM-20A, 송액 유닛 : LC-30AD (2 대), 탈기 유닛 : DGU-20A5R, 믹서 : MR180μL II, 오토샘플러 : SIL-30AC, 칼럼 오븐 : CTO-20AC, 형광 검출기 : RF-20AXS, 워크 스테이션 : LabSolutions LC/GC

(측정 조건)

칼럼 : Inertsil ODS-4 100 mm × 3.0 mmφ S-2 ㎛ (지엘 사이언스 (주))

가드 칼럼 : UHPLC Fitting (제품명, 지엘 사이언스 (주))(Max. Pressure : 130 MPa)

이동상

A 액 : 15 mmol/L KH₂PO₄ 및 5 mmol/L K₂HPO₄(pH 6.5)

B 액 : 15/45/40 (v/v/v) = 물/아세토니트릴/메탄올

R0 (린스액) : 물/메탄올 = 20/80 (v/v)

R3 (린스액) : 물/아세토니트릴 = 80/20 (v/v)

초기 B 액 농도 : 10 v/v％

유량 : 0.8 mL/분

칼럼 오븐 온도 : 35 ℃

주입량 : 1 μL

검출 :

Ch1 : 여기 파장 350 nm, 형광 파장 450 nm

Ch2 : 여기 파장 266 nm, 형광 파장 305 nm

셀 온도: 25 ℃, Gain : ×4, 감도 (Sensitivity) : Midium

그레이디언트 프로그램

0 ∼ 1.5 분 : B. Conc 10 v/v％

1.5 ∼ 6 분 : B. Conc 10 v/v％ → 30 v/v％ 의 그레이디언트

6 ∼ 11 분 : B. Conc 30 v/v％ → 40 v/v％ 의 그레이디언트

11 ∼ 15 분 : B. Conc 100 v/v％

20 ∼ 21.5 분 : B. Conc 100 v/v％ → 10 v/v％

25 분 : 컨트롤러 정지

검량선 : Hyp 및 Pro 각각에 대해, 6.25 ㎛ol/L, 25 ㎛ol/L, 50 ㎛ol/L, 100 ㎛ol/L 의 0.1 N HCl 용액을 조제하였다. 이들 각 용액을, 상기 방법으로 MPA, OPA 및 FMOC 의 각 시약과 반응시키고, HPLC 로 분석하여 검량선을 그었다.

아미노산 혼합 표준액 H 형 용액 및 L-하이드록시프롤린을 포함하는 0.1 N 염산 용액에 대해서도, 동일하게 각 시약과 반응시키고 HPLC 로 분석하였다. 사용한 아미노산 혼합 표준액 H 형은, 와코 준야쿠 공업 (주) 제조이다.

도 8 은, 아미노산 혼합 표준액 H 형 및 L-하이드록시프롤린을 포함하는 0.1 N 염산 용액 (각 아미노산 농도 20 ㎛ol/L) 을 분석한 HPLC 차트이다 ((a) : Ch1 의 여기 파장 350 nm, 형광 파장 450 nm 로 검출, (b) : Ch2 의 여기 파장 266 nm, 형광 파장 305 nm 로 검출).

배양물 샘플의 Hyp 및 Pro 의 정량 결과를 표 5 에 나타낸다. 표 중, CP1 은, 상기 콜라겐펩티드 (CP1) (제품명 콜라겐펩티드 익오스 HDL-50SP) 이고, CP2 는, 콜라겐펩티드 (CP2) (제품명 콜라겐펩티드 Type S) 이다. Hyp 및 Pro 의 정량 결과로부터, 각 배양물 샘플 중의 Pro 및 Hyp 의 합계 함량에 대한 Hyp 의 함량의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 을 계산하였다. 그 결과도 표 5 에 나타낸다. 표의 배양 조건은, 본배양의 조건이다. 또한, 배양 개시 전의 각 배지에는, 유리의 Hyp 는 거의 포함되지 않았다.

＜시험예 10＞

(전배양)

YPD 배지 3 mL 에, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 1 백금이 접종하고, 28 ℃ 에서 1 일 진탕 배양 (100 rpm) 하여 전배양액을 얻었다.

(본배양)

배지에 YPD 개변 배지 (효모 추출물 1.0 ％, 콜라겐펩티드 (CP1) 2.0 ％, 글루코오스 1.0 ％) 를 사용하고, 28 ℃ 에서 2 일간, 진탕 배양 (200 ∼ 500 rpm) 한 것 이외에는, 시험예 9 와 동일한 방법으로 본배양을 실시하였다. 콜라겐펩티드 (CP1) 은, 시험예 9 와 동일한 것이다.

본배양에서 얻어진 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 배양액에, 시험예 9 와 동일한 방법으로 자기 소화 공정 및 살균 공정 등을 실시하여 배양물 샘플을 조제하였다. 시험예 9 와 동일한 방법으로, Hyp 함량 및 Pro 함량을 측정하였다. 시험은 n = 4 로 실시하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.

＜시험예 11＞

시험예 1 ∼ 10 에서 사용한 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를 사용하여, 시험예 9 ∼ 10 과 동일한 방법으로 배양하여, 균체 배양액을 얻었다. 이것을 50 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트함으로써, 자기 소화에 의해 균체 내용물을 배양액 중에 용출시킨 후, 80 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다. 그 후, 1 ℃ 에서 원심분리 (3000 rpm, 5 분) 하여, 균체 잔류물을 제거한 L-하이드록시프롤린 함유 균체 배양물의 추출물 (Hyp 함유 균체 배양물의 추출물) 을 얻었다. Hyp 함유 균체 배양물의 추출물은, 적절히 희석하여 사용할 수도 있다.

이하, 시험예 11 에서 얻은 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 배합한 피부 외용제 조성물의 제조예의 일례를 나타낸다.

＜제조예 1＞ 비누

원료의 배합량을 표 7 에 나타낸다.

비누 소지를 혼합 교반하고, 그 후 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 투입하여 균일하게 혼합 후, 성형하였다.

＜제조예 2＞ 샴푸

원료의 배합량을 표 8 에 나타낸다.

정제수에 1,3-부틸렌글리콜에 용해한 방부제를 투입하였다. 균일하게 교반 후, 라우레스황산나트륨, 야자유 지방산 모노에탄올아미드를 투입하고, 그 후 색소, 향료 및 나머지 1,3-부틸렌글리콜을 투입하고, 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 투입 후, 균일하게 혼합 교반하였다.

＜제조예 3＞ 컨디셔너

원료의 배합량을 표 9 에 나타낸다.

(1) 염화스테아릴디메틸벤질암모늄 및 식염을 정제수에 투입하고, 80 ℃ 까지 가온하여 용해하였다.

(2) 세토스테아릴알코올, 수소 첨가 폴리이소부텐 및 글리세린모노스테아레이트를 80 ℃ 까지 가온하여 용해하였다.

(3) (1) 을 호모믹서로 교반하면서 (2) 를 첨가하고, 첨가 후 5 분간 예비 교반을 실시하였다.

(4) 예비 교반 종료 후, 50 ℃ 까지 교반하면서 냉각하고, 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 첨가하고 또한 35 ℃ 까지 교반 냉각하여 조제하였다.

＜제조예 4＞ 헤어토닉

원료의 배합량을 표 10 에 나타낸다.

정제수에 살리실산, 글리세린, 에탄올에 용해한 비타민 E, L-멘톨을 투입하고, 추가로 정제수의 일부에 용해한 글리시리진산디칼륨을 투입하고, 그 후 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 투입하고, 균일하게 혼합하여 조제하였다.

＜제조예 5＞ 미스트

원료의 배합량을 표 11 에 나타낸다.

정제수에 시트르산 및 시트르산나트륨을 투입하여 용해하였다. 그 후 에탄올에 용해한 방부제 및 폴리소르베이트 80 을 투입하였다. 그 후 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 투입하여 균일하게 교반해 조제하였다.

＜제조예 6＞ 화장수

원료의 배합량을 표 12 에 나타낸다.

정제수에 시트르산 및 시트르산나트륨을 투입하여 용해하였다. 다음으로 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜 및 에틸렌디아민4아세트산3나트륨을 순차 투입하고, 추가로 에탄올에 용해한 폴리옥시에틸렌(18)올레일알코올에테르, 비타민 E 및 메틸파라벤을 투입하여 균일하게 될 때까지 교반하였다. 그 후 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 투입하여 균일하게 교반해 조제하였다.

＜제조예 7＞ 유액

원료의 배합량을 표 13 에 나타낸다.

(1) 스테아르산, 세틸알코올, 미리스트산옥틸도데실 및 유동 파라핀을 80 ℃ 까지 가온하여 용해하였다.

(2) 트리에탄올아민, 히알루론산나트륨, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌(10)모노올레산에스테르 및 에틸렌디아민하이드록시3아세트산나트륨을 정제수에 투입하고 80 ℃ 까지 가온하였다.

(3) (1) 을 호모믹서로 교반하면서 (2) 를 투입하고, 투입 후 5 분간 예비 교반하였다.

(4) 예비 교반 종료 후, 50 ℃ 까지 냉각하고, 각 Hyp 함유 균체 배양물의 추출물을 첨가하고, 또한 35 ℃ 까지 냉각하여 조제하였다.

＜제조예 8＞ 크림

원료의 배합량을 표 14 에 나타낸다.

(1) 스테아르산, 모노스테아르산글리세릴, 세스퀴스테아르산소르비탄, 모노스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄, 세토스테아릴알코올, 스쿠알란, 헥사(하이드록시스테아르산/스테아르산/로진산)디펜타에리트리톨, 올리브유, 미리스트산옥틸도데실 및 메틸폴리실록산을 80 ℃ 까지 가온하여 용해하였다.

(2) 정제수에 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 수산화나트륨 및 메틸파라벤을 투입하고, 80 ℃ 까지 가온하여 용해하였다.

산업상 이용가능성

본 발명의 L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체, 균체 배양물 및 이들의 추출물은, 화장료, 음식 품 등의 원료로서 유용하다.

Claims

효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서,
상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린을 함유하고, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인 것을 특징으로 하는 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물.
제 1 항에 있어서,
L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물.
효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물로서, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인 것을 특징으로 하는, 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물.
효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 공정을 포함하고, 상기 질소원이 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원인 것을 특징으로 하는 L-하이드록시프롤린의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인, L-하이드록시프롤린의 제조 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 콜라겐펩티드의 평균 분자량이 1000 ∼ 10000 인, L-하이드록시프롤린의 제조 방법.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는, L-하이드록시프롤린의 제조 방법.
효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용.
제 8 항에 있어서,
상기 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 를, 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지 중에서 호기 배양함으로써, 상기 효모의 균체 또는 균체 배양물 중에 L-하이드록시프롤린을 축적시키는 것을 포함하고, 상기 질소원이 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드를 포함하는 질소원인, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용.
제 9 항에 있어서,
상기 L-하이드록시프롤린 함유 펩티드가 콜라겐펩티드인, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용.
제 10 항에 있어서,
상기 콜라겐펩티드의 평균 분자량이 1000 ∼ 10000 인, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 호기 배양을 10 ∼ 100 시간 실시하는, L-하이드록시프롤린을 제조하기 위한 사용.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 음식품.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 또는 화장료 원료.
제 15 항에 있어서,
콜라겐 산생 촉진, 표피 세포의 증식 촉진, 피부의 보습, 피부의 노화 방지, 피부의 처짐 예방 또는 개선, 피부의 탄력 개선, 주름의 예방 또는 개선 및 아토피성 피부염의 개선에서 선택되는 용도로 사용되는, 화장료 또는 화장료 원료.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 화장료 또는 화장료 원료는, 화장료 원료이고, L-하이드록시프롤린 함량이 5 ∼ 300 ppm 인, 화장료 또는 화장료 원료.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
상기 화장료 또는 화장료 원료는, 화장료이고, L-하이드록시프롤린 함량이 0.01 ∼ 20 ppm 인, 화장료 또는 화장료 원료.
L-하이드록시프롤린을 함유하는 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 L-하이드록시프롤린 보강용 조성물.
제 19 항에 있어서,
상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-프롤린 (Pro) 및 L-하이드록시프롤린 (Hyp) 의 합계 함량 (㎍/mL) 에 대한 L-하이드록시프롤린의 함량 (㎍/mL) 의 비율 (100 × Hyp/(Pro ＋ Hyp)) 이, 35 ∼ 100 인, L-하이드록시프롤린 보강용 조성물.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
상기 효모의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물은, L-하이드록시프롤린의 함량이 10 ㎍/mL 이상인, L-하이드록시프롤린 보강용 조성물.