TWI837076B

TWI837076B - 含有l-羥脯胺酸的酵母菌之菌體、菌體培養物或這些萃取物與其用途及l-羥脯胺酸的製造方法

Info

Publication number: TWI837076B
Application number: TW106115849A
Authority: TW
Inventors: 成田幸彦; 福井祐子; 松岡龍雄
Original assignee: 日商三得利控股股份有限公司
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2024-04-01

Abstract

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物係選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Mctschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之特徵為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。

Description

含有L-羥脯胺酸的酵母菌之菌體、菌體培養物或這些萃取物與其用途及L-羥脯胺酸的製造方法

本發明係關於含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途，以及L-羥脯胺酸的製造方法。本發明又關於使用於製造L-羥脯胺酸的酵母之使用。本發明又係關於含有酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之飲食品、化妝料、化妝料原料及L-羥脯胺酸補強用組成物等。

L-羥脯胺酸(羥基-L-脯胺酸)為具有於L-脯胺酸的第4位碳原子上鍵結羥基的結構之胺基酸。作為L-羥脯胺酸之效能，可舉出於成纖維細胞中之膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、與膠原同等以上之保濕效果、皮膚之老化防止、比三肽更高的經皮吸收性、皺紋之改善效果、異位性皮膚炎之改善效果等。因L-羥脯胺酸對於人體為安全，故可含於飲食品、化妝料、醫藥品等使用，其有益性非常高。

L-羥脯胺酸雖可藉由有機合成法而製造，但利用微生物之製造方法亦被檢討。例如專利文獻1中記載將編碼來自宮古木根瘤菌的L-脯胺酸順-4-羥化酶之核苷酸導入於宿主細胞所得之轉形體於培養基進行培養，於培養物中生成順-4-羥基-L-脯胺酸，使其累積後由該培養物中採取順-4-羥基-L-脯胺酸之順-4-羥基-L-脯胺酸的製造方法已被記載。

〔先前技術文獻] 〔專利文獻〕

〔專利文獻1〕專利第5506668號公報

其中，酵母為在飲食品領域等自古已有嘗試種種工業利用性的微生物，含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可作為期待L-羥脯胺酸之效能的化妝料、飲食品等原料上為有用。然而，於菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的酵母尚未有報告。

本發明係以提供含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途，以及L-羥脯胺酸的製造方法為主要目的。

本發明者們欲解決上述課題進行詳細研究結果，發現將奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)等某種酵母進行好氣培養時，於該菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。又，所得之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計重量含量之L-羥脯胺酸的重量含量之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))在特定範圍。本發明者們依據此等見解做進一步研究後完成本發明。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100者為特徵。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量以10μg/mL以上為佳。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量(μg/mL)除以OD660之值(μg/mL/OD660)以20以上為佳。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的另一態樣為選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。

本發明之L-羥脯胺酸的製造方法為含有藉由將選自奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟，上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源者為特徵。

對於本發明之製造方法，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。上述膠原肽的平均分子量以1000~10000為佳。

對於本發明之製造方法，進行上述好氣培養10~100小時者為佳。

13]本發明係包含使用選自奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之製造L-羥脯胺酸時的用途。

本發明之使用(用途)係包含藉由將上述酵母在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，上述氮源為以包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源為佳。

對於本發明之使用(用途)，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。又，上述膠原肽的平均分子量以1000~ 10000為佳。對於本發明之使用，上述好氣培養進行10~100小時者為佳。

本發明之組成物以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。

本發明之飲食品以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。

本發明之化妝料或化妝料原料以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。

本發明之化妝料或化妝料原料以使用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚之老化防止、皮膚鬆弛之預防或改善、皮膚彈性之改善、皺紋之預防或改善及異位性皮膚炎之改善的用途者為佳。

對於一態樣，本發明之化妝料或化妝料原料為化妝料原料，L-羥脯胺酸含量以5~300ppm為佳。

本發明之化妝料或化妝料原料為化妝料，L-羥脯胺酸含量以0.01~20ppm為佳。本說明書中ppm表示重量ppm。

本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物為含有L-羥脯胺酸的選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。

對於本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物對於L-脯胺酸 (Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100為佳。又，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中，L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。

依據本發明可提供含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途以及L-羥脯胺酸的製造方法等。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可適合作為飲食品、化妝料等原料等使用。

〔圖1〕圖1表示藉由HPLC的培養物樣品之L-羥脯胺酸含量的測定結果圖。

〔圖2〕圖2表示分析含有胺基酸混合標準液H型及L-羥脯胺酸之0.1N鹽酸溶液(各胺基酸濃度20μmol/L)的HPLC圖表((a)：在Ch1的激起波長350nm、螢光波長450nm下檢測、(b)：在Ch2的激起波長266nm、螢光波長305nm下檢測)。

〔實施發明的形態〕

以下對於本發明之實施形態做具體說明。然而，本發明並未限定於以下實施形態，在不變更本發明之要旨的範圍下，可適宜變更後適用。

本說明書中，酵母的屬種為在The Yeasts,a Taxonomic Study Fifth Edition(Elsevier發行，2011年)所記載的屬種名。

本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。

本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。

以下將本發明之第一態樣及第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物總稱為本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

本發明中之酵母若為上述中任一屬種的酵母即可。酵母可僅使用1種亦可使用2種以上。

上述酵母可由種種寄存機構獲得。作為寄存機構，例如獨立行政法人製品評估技術基礎機構(日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)等。又，亦可由自然界分離。

其中亦以本發明中之酵母，由L-羥脯胺酸含量多的觀點來看，以奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)為佳。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳者為奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸(Hyp)。本發明中之L-羥脯胺酸為4-羥基-L-脯胺酸。本說明書中，於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含的L-羥脯胺酸係指游離的L-羥脯胺酸。於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中之L-羥脯胺酸含量或累積量係指游離的L-羥脯胺酸量。於該菌體或菌體培養物中累積游離的L-羥脯胺酸之酵母尚未被報告。

本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸 (Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物適用於被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料之原料等。將「對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例」(100×Hyp/(Pro+Hyp))在以下亦稱為「(Hyp/(Pro+Hyp))比例」。本說明書中，於上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例中之L-脯胺酸含量係指含於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的游離之L-脯胺酸含量。

對於較佳態樣，本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100。

上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例係以40~100為佳，較佳為50~100，更佳為60~100，更較佳為70~100，進一步較佳為80~100，特佳為90~100。上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例為如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中Hyp之含量比例高，作為被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料之原料等為特佳。

本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為L-羥脯胺酸之含量在10μg/mL以上。本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量以10μg/mL以上為佳。L-羥脯胺酸的含量在上述範圍之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可作為被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料的原料等為佳。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之L-羥脯胺酸的含量以15μg/mL以上者為較佳，17μg/mL以上為較佳，20μg/mL以上為較佳，30μg/mL以上為更佳，40μg/mL以上為更佳，50μg/mL以上為更佳，100μg/mL以上為更佳，150μg/mL以上為更佳，200μg/mL以上為特佳，250μg/mL以上為特佳，300μg/mL以上為特佳。

酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量的上限並無特別限定，雖較佳為佳，通常為6000μg/mL以下，3000μg/mL以下或2000μg/mL以下亦可。

依據本發明可提供來自酵母之菌體或菌體培養物的L-羥脯胺酸之含量為上述範圍的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中之L-脯胺酸的含量(μg/mL)及L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)可藉由高速液體層析法(HPLC)進行測定。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有菌體時，可藉由加熱等自體溶解或藉由酵素分解處理等使菌體破碎，使用溶離菌體內容物者，測定L-脯胺酸及L-羥脯胺酸之含量。例如以巰基丙酸、o-酞醛(OPA)將1級胺基經衍生物化後藉由氯甲酸-9-芴基甲基(FMOC)使2級胺基酸衍生物化，藉由HPLC進行分析的方法(在激起波長266nm、螢光波長305nm下檢測)，可定量L-脯胺酸及L-羥脯胺酸。L-脯胺酸及L-羥脯胺酸含量之測定方法及HPLC之測定條件等採用實施例所記載的方法及條件等即可。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為將上述酵母在液體培養基中進行好氣培養，視必要進行菌體破碎等後所得者。

酵母之菌體培養物中含有酵母之菌體及/或培養澄清液者為佳，亦可含有酵母之菌體內容物。酵母之菌體可為活菌，亦可為死菌。作為含有酵母之菌體及/或培養澄清液的菌體培養物，可舉出含有將上述酵母進行好氣培養所得之酵母之菌體(培養菌體)及培養澄清液的菌體培養液、將由該菌體培養液集合酵母之菌體者(菌體)或由該菌體培養液除去菌體的培養澄清液。將菌體培養液的培養澄清液僅稱為培養澄清液。菌體培養物較佳為含有酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液或培養澄清液。

又，菌體或菌體培養物之萃取物，通常含有菌體內容物，含有菌體內容物及培養澄清液者為佳。作為菌體或菌體培養物之萃取物，於菌體或含有菌體之菌體培養物(較佳為菌體培養液)，進行自體溶解處理或酵素分解處理等菌體破碎處理，將酵母菌體內容物溶離於培養液中等者(菌體破碎物)、由進行菌體破碎處理由菌體或菌體培養物(菌體破碎物)除去菌體殘渣者可舉出，較佳為由進行菌體破碎處理的菌體培養液(菌體破碎物)或該菌體破碎物除去菌體殘渣所得之含有菌體內容物及培養澄清液之萃取物。

如上述，本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，通常於含有將上述酵母在液體培養基中進行好氣培養所得的酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液中，視必要進行集菌、菌體破碎等處理而調製。

於本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中所含的L-羥脯胺酸係以來自由上述的好氣培養所得之酵母的菌體或菌體培養物者為佳。於本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含的L-羥脯胺酸以實質上於上述好氣培養前未存在者為佳。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，例如可使用於作為含有化妝料、酒類之飲食品等原料者為佳。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為將L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)除以OD660之值(μg/mL/OD660)以20以上為佳。將L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)除以OD660之值(μg/mL/OD660)於以下亦稱為Hyp/OD660值。Hyp/OD660值越高，每細胞之L-羥脯胺酸的含量越高故較佳。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的Hyp/OD660值之上限並無特別限定，越多越佳，通常為300以下。Hyp/OD660值以25以上者為較佳，30以上為更佳，40以上為更較佳，50以上為特佳，60以上為特佳，80以上為最佳。

所謂OD為optical density的簡稱，其表示光學密度。OD表示細胞的濃度等。一般測定對於600nm或 660nm的波長之可見光的吸光度OD600或OD660(使用生物實驗說明▲7▼的酵母之Two Hybrid，秀潤公司，2003年發行)。

使用於Hyp/OD660值的計算之OD660為，使用於菌體、菌體培養物或這些萃取物的調製之含有菌體及培養澄清液的菌體培養液(含有菌體及培養澄清液之菌體培養物)的660nm之吸光度。

更具體為將上述酵母在液體培養基中進行好氣培養所得之酵母的菌體培養液直接作為菌體培養物時，OD660為該菌體培養液(菌體培養物)的吸光度OD660。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為，將酵母之菌體經破碎後溶離菌體內容物的菌體或菌體培養物之萃取物時，OD660表示使用於該調製的菌體培養液(含有菌體破碎前的酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液)之吸光度OD660。OD660例如可藉由分光光度計測定。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的乙醇含量以1v/v%以下為佳。乙醇含量若為1v/v%以下時，特別可作為各種飲食品或化妝料等原料使用。乙醇若超過1v/v%時，有時對酵母的增殖等有著壞影響。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的乙醇含量較佳為0.8v/v%以下，更佳為0.5v/v%以下。乙醇含量可藉由公知方法測定。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的形態雖無特別限定，但例如可舉出糊狀、懸浮狀、提取狀、液狀等。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為可適合使用於如後述的化妝料、飲食品等原料者。可將本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物藉由乾燥等使其粉末化後使用。

本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物係可由將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，視必要藉由菌體破碎等而得。更具體為氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽。

將上述酵母藉由在含有碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之液體培養基中進行好氣培養，於該酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。含有將上述酵母藉由在含有碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之液體培養基中進行好氣培養，於該酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟之方法為，可作為上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之製造方法或L-羥脯胺酸的製造方法為佳。

本發明之L-羥脯胺酸的製造方法為含有將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii 及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母，藉由在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟(以下亦稱為Hyp累積步驟)。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。

本發明之製造方法可具有依所望的Hyp累積步驟以外之步驟。例如可舉出如後述之前培養步驟、集菌步驟、菌體破碎步驟等1個或2個以上步驟。

對於本發明之L-羥脯胺酸的製造方法，可得到上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

藉由進行上述Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。所得之酵母的菌體或菌體培養物通常上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100。又，藉由Hyp累積步驟所得之酵母的菌體或菌體培養物，通常L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。如此酵母之菌體或菌體培養物可作為上述本發明的酵母之菌體或菌體培養物使用。又，於所得之菌體或菌體培養物可紀行依所望進一步進行菌體破碎處理等處理，可調製出含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物之萃取物。

含有Hyp累積步驟的L-羥脯胺酸的製造方法亦可作為上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之製造方法為佳。欲得到本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物時，Hyp累積步驟及其較佳態樣與於L-羥脯胺酸的製造方法中之Hyp累積步驟及其較佳態樣相同。

對於Hyp累積步驟，對酵母之液體培養基的添加方法為，可於含有碳源及氮源的液體培養基中直接接種少量菌體而使其增殖，但欲在短期間提高菌體濃度，接種前培養的菌液者為佳。使用於前培養的培養基並無特別限定，可與在Hyp累積步驟(通常為主要培養)所使用的液體培養基之相同培養基，亦可使用可使用於酵母的公知培養基。前培養的時間，通常為10~72小時，較佳為12~48小時。前培養溫度以15~40℃者為佳。作為接種前培養的菌液之量，通常為在Hyp累積步驟所使用的培養基量之1/100000~1/2，以1/1000~1/10為佳，以1/200~1/10為較佳，以1/200~1/20為更佳。接種量若在上述範圍時，於Hyp累積步驟，酵母增殖會加速，可有效率地累積L-羥脯胺酸。

使用在Hyp累積步驟的液體培養基之氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。使用如此氮源進行上述酵母的好氣培養時，於菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。如此氮源可僅使用1種，亦可使用2種以上。含有L-羥脯胺酸之肽可為1種，亦可為2種以上。

所謂含有L-羥脯胺酸之肽表示將L-羥脯胺酸含於構成胺基酸之肽即可，但較佳為構成胺基酸之10重量%以上為L-羥脯胺酸的肽。對於其中一態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源亦以含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。

包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，例如可藉由水解含有L-羥脯胺酸的蛋白質而得。所謂含有L-羥脯胺酸的蛋白質表示於構成胺基酸含有L-羥脯胺酸的蛋白質即可，但較佳為構成胺基酸的10重量%以上為L-羥脯胺酸之蛋白質。作為上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質，以膠原性蛋白質等為佳。作為膠原性蛋白質，例如可舉出由含有內臟、皮、魚鱗、骨等膠原的組織所調製的蛋白質；可舉出膠原、明膠。膠原性蛋白質的原料來源並無特別限定。例如可使用來自牛、來自豬、來自魚等來自動物的膠原性蛋白質為佳。膠原性蛋白質可使用市售品。含有L-羥脯胺酸的蛋白質之水解可藉由酵素等公知方法進行。

作為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，例如可使用來自動物的蛋白腖為佳。較佳為來自牛、豬或魚的蛋白腖，更佳為來自牛或魚的蛋白腖。對於本發明之一態樣，作為蛋白腖，以獸肉蛋白腖、心肌蛋白腖、明膠蛋白腖亦佳。

作為可使用於本發明的包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之市售品的一例子，例如可舉出製品名Pepton(#211677)(Bacto公司)等。

對於其中一態樣，上述含有L-羥脯胺酸之肽，較佳為膠原肽。所謂膠原肽表示水解膠原，亦可為將天然膠原經熱處理使其變性的明膠或天然膠原經水解後的膠原肽或將此等經化學性、酵素性修飾者中任一皆可。水解可藉由酵素、酸、鹼等進行，較佳為藉由酵素進行。較佳為使用將天然膠原經熱處理使其變性的明膠或天然膠原經水解的膠原肽。膠原肽的原料來源並無別限定。例如使用來自牛、來自豬、來自魚等來自動物的膠原肽為佳。較佳為來自魚的膠原肽。膠原肽可使用市售品。

作為可使用在本發明的膠原肽之市售品的一例子，例如可舉出新田明膠(股)製的「膠原肽Ikuos HDL-50SP」(製品名)(平均分子量5000)、「膠原肽Type S」(製品名)(平均分子量1200)、「超級膠原肽SCP-2000」(製品名)(平均分子量2000)、野洲化學工業(股)製的「膠原肽P-5000」(製品名)(平均分子量5000)、「膠原肽F-5000」(製品名)(平均分子量5000)、日祥(股)製的「Marine collagen oligoCF」(製品名)(平均分子量900~1100)、「Marine collagen oligoMF」(製品名)(平均分子量900~1500)等。其中亦以「膠原肽Type S」(平均分子量1200)、「膠原肽Ikuos HDL-50SP」(平均分子量5000)等為佳。

此等中，例如「膠原肽Ikuos HDL-50SP」、「膠原肽Type S」、「膠原肽F-5000」、「Marine collagen CF」、「Marine collagen oligoMF」為來自魚者，「膠原肽P-5000」、「超級膠原肽SCP-2000」為來自豬者。

對於本發明之較佳實施態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，較佳為膠原肽(較佳為來自魚的膠原肽)及/或蛋白腖(較佳為來自動物，更佳為來自牛、豬或魚，特佳為來自牛或魚的蛋白腖)，特佳為膠原肽。使用如此包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源時，酵母之菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。蛋白腖可為獸肉蛋白腖、心肌蛋白腖、明膠蛋白腖。

本發明之L-羥脯胺酸的製造方法之較佳實施態樣的一例為，含有將上述酵母在含有碳源以及膠原肽及/或蛋白腖之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟。

對於其中一態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之平均分子量以10000以下者為佳，例如平均分子量以100~10000為佳。含有L-羥脯胺酸之肽係以平均分子量為10000以下者為佳，例如平均分子量以100~10000為佳。又，含有L-羥脯胺酸之肽的分子量以10000以下者為亦佳。

膠原肽的平均分子量以1000~10000為佳。將平均分子量在上述範圍之膠原肽作為氮源使用時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。

含有L-羥脯胺酸之肽的平均分子量可藉由凝膠過濾等算出。膠原肽的平均分子量，通常為藉由照片用明膠試驗法(PAGI法)第10版「20-2平均分子量」所記載的方法算出之值。肽之平均分子量表示重量平均分子量。

膠原肽的平均分子量較佳為1000~6000，更佳為1000~5500，特佳為1000~5000。使用如此膠原肽作為氮源時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量可變的更多。又，對於其中一態樣，作為膠原肽之平均分子量，以1000~3000為較佳，以1000~1500為更佳。對於本發明之另一較佳態樣，膠原肽的平均分子量以2000~5500為較佳，以3000~5000為更佳。

上述液體培養基中之包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源的濃度，通常以0.1~10重量%為佳，以0.25~5重量%為較佳，以1~5重量%為更佳。上述氮源的濃度在上述範圍時，菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。因此，例如可得到L-羥脯胺酸含量為10μg/mL以上的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。又，可得到(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100之菌體、菌體培養物或這些萃取物。液體培養基中之上述氮源的濃度以1.5~4.5重量%為更較佳，以2~4重量%為特佳。上述氮源之濃度在培養開始時為上述濃度即可。對於其中一態樣，上述液體培養基中之膠原肽或蛋白腖的濃度以上述範圍為佳。

上述碳源雖無特別限定，例如可舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、松三糖、纖維二糖、澱粉、糖蜜、山梨醇、L-山梨糖、甘油、乙醇、山梨醇等糖質或糖醇；乙酸、檸檬酸、或葡萄糖酸等有機酸等。碳源可單獨使用1種，又亦可混合2種以上使用。其中亦以碳源為葡萄糖、果糖、蔗糖等糖為佳，葡萄糖為特佳。

液體培養基中之碳源的濃度，以0.1~20重量%為佳，較佳為0.5~15重量%，更佳為1~10重量%，特佳為1~5重量%，最佳為2~5重量%。液體培養基中之碳源濃度為1重量%以上時，因菌體的增殖速度會變快故較佳。且，碳源濃度在培養開始時為上述濃度者即可。

對於本發明之製造方法，碳源(C)與包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)的重量比(C/N)以0.25~20為佳。C/N的重量比在上述範圍時，因菌體或菌體培養物中的L-羥脯胺酸之累積量會變多故較佳。上述C/N之重量比以0.25~5為佳，以0.3~3為較佳，以0.4~1.5為更佳。C/N的重量比若在上述範圍時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變的更多。對於其中一態樣，例如於包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)使用膠原肽(較佳平均分子量為1000~5000)或蛋白腖時，上述C/N的重量比以0.25~5為較佳，以0.3~3為更佳，以0.4~1.5為更較佳，以0.5~1.3為特佳。對於另外較佳態樣，C/N之重量比以0.5~20亦佳。上述C/N的重量比在培養開始時為上述範圍即可。

液體培養基可含有除上述碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源以外之成分，例如含有酵母萃取物(Yeast extract)為佳。酵母萃取物通常未含有含有L-羥脯胺酸之肽，於包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源中未含有。酵母萃取物若可使用於酵母之培養者即可，並無特別限定，可使用市售品。例如可使用製品名Bacto yeast Extract(#212750)(Bacto公司)等。

使用酵母萃取物時，酵母萃取物的濃度對於液體培養基以0.1~3重量%為佳，以0.5~3重量%為較佳。酵母萃取物的濃度若於培養開始時為上述濃度即可。

對於其中一態樣，液體培養基之pH以3~9為佳，以4~9為較佳，超過4,9以下為較佳，4.5~8.8為更佳，5~8.7為特佳。液體培養基的pH可適宜調整。pH調整可使用公知酸或鹼劑，例如可舉出鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、谷胺酸、乙酸、丁酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氨水、谷胺酸鈉等。

培養溫度以15~45℃為佳，以20~40℃為較佳，以25~35℃為更佳。培養溫度若在此溫度範圍時，酵母的增殖會快速，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。

進行好氣培養的方法並無特別限定，將接種菌的液體培養基，例如進行振盪培養或攪拌培養即可。振盪或攪拌的速度並無特別限定，較佳為30~600rpm，對於其中一態樣，較佳為30~500rpm，更佳為50~500rpm，特佳為50~300rpm，特佳為50~100rpm。對於另一較佳態樣，振盪或攪拌的速度以50~600rpm為佳，以100~600rpm為較佳。在如此速度下進行振盪培養或攪拌培養時，因L-羥脯胺酸的累積量會變多故較佳。較佳為在上述速度下進行振盪培養。又，可依據所望在經滅菌的空氣或氧下進行起泡。又，培養形式可為分批培養、補料分批培養、連續培養中任一種，以分批培養為佳。對於本發明之製造方法，亦可進行靜置培養。

培養時間雖無特別限定，可適宜地設定，例如進行好氣培養10~100小時為佳。培養時間若在上述範圍時，上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。又，通常可得到(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100，酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物、L-羥脯胺酸含量為10μg/mL以上的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。又，得到乙醇含量較少(例如1v/v%以下)酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。若培養時間未達10小時時，L-羥脯胺酸的累積量會有較少之情況，所得的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之(Hyp/(Pro+Hyp))比例有未達35之情況。培養時間若超過100小時時，所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物之乙醇濃度有超過1v/v%之情況。又，變的容易引起污染，或於酵母死滅後因自體溶解而產生著色等情況產生。培養時間較佳為10~80小時，較佳為12~72小時，更佳為20~60小時，更較佳為24~55小時，特佳為24~50小時。

又，對於本發明之製造方法，進行好氣培養至菌體或菌體培養物中的L-羥脯胺酸含量至10μg/mL以上為止為佳。

對於本發明之製造方法，好氣培養通常作為主要培養而進行，亦可為前培養，於前培養及主要培養亦可進行好氣培養。

藉由進行上述好氣培養，上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。菌體培養物可為含有酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液，亦可為酵母之菌體，或菌體培養液之培養澄清液。藉由進行Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸，(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100之酵母的菌體或菌體培養物。又，可得到L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上之酵母之菌體或菌體培養物。於酵母之菌體或菌體培養物，例如藉由進行菌體破碎處理，可得到酵母之菌體或菌體培養物之萃取物。

對於本發明，調製含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或者菌體培養物或該萃取物時，例如可將含有在Hyp累積步驟所得之酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液直接作為含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體培養物。又，由菌體培養液將酵母之菌體集菌，將所得之菌體可作為酵母之菌體或菌體培養物，亦可將由菌體培養液除去菌體的培養澄清液作為菌體培養物。且，於上述菌體或菌體培養液，視必要進行破碎菌體的處理，將菌體內容物溶離於培養液中等可調製出菌體或菌體培養物的萃取物。對於菌體或菌體培養物之萃取物的調製，將菌體破碎後，可進行除去菌體殘渣之步驟。又，對於菌體、菌體培養物或這些萃取物，視必要可進行殺菌、加熱等處理。本發明之製造方法可含有如此集菌步驟、菌體破碎步驟、菌體殘渣除去步驟、殺菌步驟等1或2個以上步驟。

由菌體培養液將菌體進行集菌的方法並無特別限定，可採用一般進行的方法，例如可舉出離心分離等。

破碎上述菌體的方法並無特別限定，可採用一般進行的方法，例如可舉出自體溶解法、酵素分解法、鹼萃取法等。其中亦以自體溶解法為佳。對於自體溶解法，例如將菌體或菌體培養物在60~180分鐘，40~60℃下進行加熱即可。對於自體溶解法，例如亦在95~100℃進行5~15分鐘加熱。

除去菌體殘渣的方法並無特別限定。例如可藉由過濾、離心分離等公知方法除去菌體殘渣即可。

進行殺菌時，可將酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物在75~90℃(較佳為80℃)加熱45~90分鐘(較佳為60分鐘)為佳。進行菌體殘渣除去及殺菌時皆可先進行。

於本發明所得之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及較佳態樣，與如上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。依據本發明之製造方法，例如可製造(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100，且L-羥脯胺酸含量為10μg/Ml的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

於藉由上述方法所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物，可進一步添加來自天然物或經合成的L-羥脯胺酸，對於較佳態樣，於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含有的L-羥脯胺酸係由藉由上述Hyp累積步驟所得之來自酵母的菌體或菌體培養物的L-羥脯胺酸所成。

在本發明所得之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，可作為如後述之飲食品、化妝料等原料等使用。又，對於本發明之L-羥脯胺酸的製造方法，由所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物，可進行純化L-羥脯胺酸的步驟。L-羥脯胺酸之純化，例如可藉由管柱層析法等公知方法進行即可。

本發明亦包含使用選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母於製造L-羥脯胺酸的用途。

上述酵母亦適用於製造含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物上。含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的(Hyp/(Pro+Hyp))比例以35~100為佳。含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上亦佳。又，含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的上述Hyp/OD660值以20以上為佳。含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣相同。

本發明之使用為含有將上述酵母在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸者為佳。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源為佳。

對於本發明之使用，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。又，上述膠原肽之平均分子量以1000~ 10000為佳。

對於本發明之使用，上述液體培養基中之包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之濃度以1~5重量%為佳。又，碳源(C)與包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)之重量比(C/N)以0.25~20為佳。對於其中一態樣，上述C/N比以0.5~20為佳。對於本發明之使用，進行上述好氣培養10~100小時為佳，進行10~80小時為較佳。

本發明之使用中的液體培養基、碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源以及這些較佳態樣與上述L-羥脯胺酸的製造方法中者相同。又，好氣培養之條件及其較佳態樣亦與上述L-羥脯胺酸的製造方法中者相同。本發明之使用亦可含有上述集菌步驟、菌體破碎步驟、菌體除去步驟、殺菌步驟等1或2個以上步驟。

上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可添加於化妝料、飲食品、醫藥品等各種組成物。含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的組成物亦包含於本發明。

本發明之組成物可含有上述本發明之第一態樣及第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中任一方，亦可含有雙方。含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之組成物為含有來自該酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸。作為本發明之組成物，例如可舉出化妝料(化妝料組成物)、飲食品(飲食品組成物)、醫藥品(醫藥品組成物)、醫藥部外品(醫藥部外品組成物)等。組成物可為這些原料。對於其中一態樣，組成物以化妝料或飲食品這些原料為佳。

本發明之組成物中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量並無特別限定，可配合該組成物之種類、用途做適宜設定。例如，對於組成物，將上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之固體成分換算的含量設定為0.00001~50重量%者為佳，以0.00005~20重量%為較佳，以0.0001~10重量%為更佳。

本發明之組成物為化妝料或醫藥品時，該劑型並無特別限定，可為溶液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意劑型。

化妝料並無特別限定，例如可為洗面劑、洗顏料、化妝水、乳液、乳霜、美容液、育毛劑、油、凝膠、洗髮精、潤髮精、護髮素、亮粉、粉底、唇膏、香粉、面膜、香水、蜜粉、古龍水、沐浴乳、肥皂、入浴劑、防曬乳霜等。

含有上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的化妝料或化妝料原料為本發明中較佳態樣之1。化妝料及化妝料原料可含有上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物以外成分。於化妝料及化妝料原料中，可添加於化妝料通常添加的種種成分。例如可適宜地添加油分、香料、界面活性劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、防腐劑、顏料、色素等。這些配合比率適宜選擇即可。本發明之化妝料原料適合使用於製造本發明之化妝料上。

化妝料的用法及用量對應化妝料之種類等可適宜地決定。

本發明之化妝料或化妝料原料因可含有L-羥脯胺酸，例如可使用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚的防老、皮膚鬆弛的預防或改善、皮膚彈性的改善、皺紋的預防或改善及異位性皮膚炎的改善的用途上，故適用於選自皮膚彈性的改善及皺紋的預防或改善的用途上。

化妝料中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料，以固體成分換算下以0.00001~10重量%為佳，以0.0001~10重量%為佳，0.0001~5重量%為較佳，0.001~5重量%為較佳，0.01~3重量%為更佳，0.05~2重量%為特佳。又，對於其他較佳態樣，化妝料中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料，以固體成分換算下以0.00005~1重量%為較佳，以0.0001~0.5重量%為更佳。

化妝料原料中之上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料原料，例如以固體成分換算下以0.001~20重量%為佳，以0.01~10重量%為較佳，0.05~5重量%為更佳，0.1~2重量%為特佳。化妝料原料中之L-羥脯胺酸含量，例如以5~300ppm為佳，以10~200ppm為較佳，以50~100ppm為更佳。對於其中一態樣，化妝料中之L-羥脯胺酸含量，例如可設定為0.01~20ppm，以 0.03~15ppm為佳，以0.05~10ppm為較佳。添加上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，使L-羥脯胺酸含量在上述範圍為佳。

本發明之組成物為飲食品(飲食品組成物)時，飲食品並無特別限定。飲食品的形態可為液狀、半液體狀或固體狀、糊狀中任一種，例如可為一般飲食品、健康食品、功能性食品等中任一種。

一般飲食品並無特別限定，亦含有酒類。所謂健康食品表示健康或對健康良好的食品，含有營養補充食品、自然食品等。所謂營養補充食品表示強化特定營養成分的食品。所謂功能性食品表示欲補給可達到身體調節功能的營養成分之食品，含有特定保健用食品、營養功能食品。

作為營養補充食品，可舉出美容飲料、補充劑等。本發明之飲食品可為膠囊等醫藥製劑形態、飲料劑等。

於飲食品中可添加被許可的可添加於飲食品的種種成分。作為如此成分，例如可舉出結合劑、增黏劑、著色劑、安定劑、乳化劑、分散劑、崩壞劑、懸浮化劑、界面活性劑、防腐劑、甜味料、酸味料等。

上述含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的飲食品為本發明中之較佳態樣之1。

飲食品中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量，例如對於飲食品，以固體成分換算下以0.0001~10重量%者為佳，以0.001~5重量%為較佳，以 0.01~1重量%為更佳。又，飲食品中之L-羥脯胺酸含量以0.0001~0.01重量%為佳，欲使L-羥脯胺酸含量在上述範圍，添加上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為佳。

上述化妝料、化妝料原料、飲食品等組成物中之L-羥脯胺酸含量為游離L-羥脯胺酸含量。L-羥脯胺酸較佳為來自上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的化妝料、飲食品、這些原料等組成物為藉由，將這些通常被使用的原料、添加劑等配合該種類選擇後添加，於此添加本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，以公知方法製造。

本發明亦包含含有選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之化妝料或化妝料原料。

上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物較佳無上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

本發明亦包含將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟(Hyp累積步驟)之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。本發明之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法的較佳態樣為與上述L-羥脯胺酸的製造方法之較佳態樣相同。上述含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法可作為本發明之化妝料原料的製造方法為佳。

藉由進行Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。又，於酵母之菌體或菌體培養物進行上述菌體破碎處理時，得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物的萃取物。如此所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物及較佳態樣為與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。所得之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為，依據所望於化妝料添加通常被使用的添加劑等，可作為含有L-羥脯胺酸的化妝料原料使用。又，於由含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物進行純化的L-羥脯胺酸中，添加依據所望的於化妝料通常被使用的添加劑等，可製造出含有L-羥脯胺酸的化妝料原料。藉由本發明所得之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料可適用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚的防老、皮膚鬆弛的預防或改善、皮膚彈性的改善、皺紋的預防或改善及異位性皮膚炎的改善之用途的化妝料上。

本發明亦包含，具有含有L-羥脯胺酸之選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸補強用組成物。

上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物雖含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))以35~100為佳。上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。含有如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸補強用組成物，特別可適用於作為欲使化妝品、飲食品等L-羥脯胺酸補強、補充或強化時的添加劑。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。L-羥脯胺酸補強用組成物作為L-羥脯胺酸補強用之添加劑組成物，可適用於飲食品、化妝料等。L-羥脯胺酸補強用組成物亦可言為L-羥脯胺酸補充用組成物或L-羥脯胺酸強化用組成物。

本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物若具有含有L-羥脯胺酸之上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物即可，該菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量可為100重量%，依據所望亦可含有其他成分。例如將L-羥脯胺酸補強用組成物作為食品添加劑使用時，亦含有使用於食品的公知添加劑1種或2種以上。

本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物，例如亦可作為化妝料添加劑適用。將L-羥脯胺酸補強用組成物作為化妝料添加劑使用時，該組成物中亦可含有上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，該菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量可為100重量%，依據所望，亦可含有使用於化妝料之公知添加劑1種或2種以上。

本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物的製造方法以含有將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟為佳。含有如此步驟的L-羥脯胺酸補強用組成物之製造方法亦包含於本發明。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物之製造方法及其較佳態樣與上述L-羥脯胺酸的製造方法及其較佳態樣相同。本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物的製造方法，依據所望，亦可含有於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物添加公知食品添加劑、化妝料添加劑等步驟。

本發明之其他態樣的L-羥脯胺酸之製造方法含有將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟。

對於本發明之另一態樣的製造方法，上述氮源以包含含有L-羥脯胺酸的蛋白質或含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。對於本發明之其他態樣的製造方法，上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質為膠原性蛋白質，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。對於本發明之其他態樣的製造方法，上述膠原性蛋白質及膠原肽之平均分子量以1000~100000為佳。對於本發明之其他態樣的製造方法，上述液體培養基中之氮源的濃度為1~5重量%，碳源(C)與氮源(N)的重量比(C/N)以0.5~20為佳。又，上述好氣培養時間較佳為進行10~100小時，更佳為進行10~80小時。

本發明之其他態樣的使用為含有使用選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母於製造L-羥脯胺酸的用途，將上述酵母藉由在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，上述氮源為具有含有L-羥脯胺酸的蛋白質或含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。

對於本發明之其他態樣的使用，上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質為膠原性蛋白質，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。對於本發明之其他態樣的使用，上述膠原性蛋白質及膠原肽的平均分子量以1000~100000為佳。對於本發明之其他態樣的使用，上述液體培養基中之氮源的濃度為1~5重量%，碳源(C)與氮源(N)的重量比(C/N)以0.5~20為佳。又，上述好氣培養以進行10~100小時為佳，較佳為進行10~80小時。

作為上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質，可舉出上述膠原性蛋白質。膠原性蛋白質等含有L-羥脯胺酸的蛋白質之平均分子量較佳為超過10000，100000以下。蛋白質之平均分子量表示重量平均分子量。膠原性蛋白質等含有L-羥脯胺酸的蛋白質之平均分子量可藉由凝膠過濾等算出。

〔實施例〕

以下表示更具體說明本發明之試驗例等。且，本發明並未僅限定於此等試驗例等。

試驗例中，使用於製作標準曲線的L-羥脯胺酸(Hyp)標準溶液之調製中，使用Nakarai Tesque股份有限公司製的L-4-羥脯胺酸。於L-脯胺酸(Pro)標準溶液之調製中，使用Nakarai Tesque股份有限公司製的L-脯胺酸。在試驗例所測定的L-羥脯胺酸及L-脯胺酸皆為游離的L-羥脯胺酸及L-脯胺酸。

<試驗例1> 累積L-羥脯胺酸(以下稱為Hyp)的菌之篩選

與篩選將Hyp累積於菌體培養液中的屬種，以以下挑選條件進行1~3次挑選試驗。

1次挑選試驗：挑選條件：乙醇生產量、增殖速度

2次挑選試驗：挑選條件：Hyp累積量(比色法)

3次挑選試驗：挑選條件：Hyp累積量(HPLC)

再現性：Hyp累積量(HPLC)

將表1~3所示相異屬種的菌株提供於試驗。

在1~3次挑選試驗，以以下條件進行前培養及主要培養。在前培養及主要培養所使用的YPD液體培養基中，Y：P：D為1：2：2(重量比)(Y：酵母萃取物(Bacto公司製的製品名Yeast Extract(#212750))1.0重量%、P：蛋白腖(Bacto公司製的製品名Pepton(#211677)、將牛的細胞以來自豬的胰臟之酵素進行分解者)2.0重量%、D：葡萄糖2.0重量%)。

(前培養)

於YPD液體培養基3mL，接種各菌株1接種環量，在30℃靜置培養1天，得到前培養液。

(主要培養)

於YPD液體培養基5mL，接種前培養液100μL，在30℃進行1日振盪培養(60rpm)後得到酵母之菌體培養液(菌體培養物)。

在2次挑選試驗及3次挑選試驗中，使用於Hyp含量測定之培養物樣品，其由在主要培養所得的酵母之菌體培養液進行以下自體溶解步驟及殺菌步驟等而調製。

(自體溶解步驟)

將酵母之菌體培養液在50℃進行2小時恆溫培養，藉由自體溶解將菌體內容物溶離於培養液中。

(殺菌步驟)

將在上述經自體溶解的培養液在80℃進行1小時恆溫培養。

由所得的萃取物藉由離心分離(3000rpm、5min、1℃)除去菌體殘渣。藉此調製出測定Hyp累積量之培養物樣品。

1. 1次挑選試驗 (1)乙醇生產量

對於表1~3所示酵母116株，測定在主要培養(30℃下進行1日之振盪培養)所得之菌體培養液的澄清液中之乙醇濃度。乙醇的測定使用生物傳感器BF5(王子計測機器公司)。

使用於試驗的酵母之培養液澄清液的乙醇濃度如表1~3所示。

對於使用於試驗的所有酵母(116株)，菌體培養液澄清液之乙醇濃度為1v/v%以下。

(2)增殖速度

其次，測定上述酵母的增殖曲線。測定為使用TVS 062CA(ADVANTEC公司)，測定菌體培養液之吸光度(660nm)。

此等中，將增殖速度快速的100菌株(以下記載的16株以外之菌株)使用於2次挑選試驗及3次挑選試驗。

(未使用於2次挑選試驗及3次挑選試驗的菌株)

Zygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces pseudorouxii、Zygosaccharomyces siamensis、Candida etchellsii、Starmerella bombicola、Starmerella sp、Candida holmii、Rahnella aquatilis、Candida railenensis、Candida ernobii、Debaryomyces nepalensis、Candida sake、Peterozyma toletana、Trigonopsis cantarellii、Brettanomyces bruxellensis、Candida oleophila

2. 2次挑選試驗

使用在1次挑選試驗所選出的100株，藉由以下所記載的比色法，比較Hyp累積量。

於2mLEppen試管中加入0.5M硼酸緩衝液0.2mL及培養物樣品(或Hyp標準液)0.4mL並仔細攪拌，在室溫靜置5分鐘後，於冰浴中(0℃)靜置5分鐘。其次，加入0.2M氯胺T溶液(Chloramine T solution)0.2mL，一邊時時攪拌下，一邊放置於冰浴中(0℃)120分鐘(氧化反應)。於氧化反應後溶液中，加入3.6M硫代硫酸鈉水溶液0.4mL，並密栓後，在沸騰水浴中進行30分鐘加熱(脫碳酸反應)。將脫氧化反應後的溶液以自來水冷卻至室溫後，加入乙酸乙酯0.6mL，以振盪器進行20分鐘激烈振盪。脫碳酸及乙酸乙酯萃取時欲防止開封故蓋上蓋子。

將所得之溶液經離心分離(1500rpm、5分)後，於1.5mLEppen試管取出乙酸乙酯層(上層：無色)0.4mL，於此加入埃里希試藥(黃)0.16mL，在室溫放置30分鐘，作為樣品(呈色反應：若含有Hyp則變成紅色)。空白試驗為於乙酸乙酯0.4mL加入埃里希試藥0.16mL並在室溫下靜置30分鐘而調製。

於玻璃製盤(96孔之透明平底)上注入樣品200μL，以平板讀數儀(Tecan公司製；infinite M200 Pro)將650nm的基準線調整為0後，測定560nm之吸光度(欲防止揮發及因酸使機器的腐蝕，於盤上貼上薄膜)。

以Hyp標準液(Hyp濃度2.5~0.25μg/mL)做成標準曲線，求得培養物樣品之Hyp濃度。在提供於試驗的菌株中，藉由比色法挑選出培養物樣品之Hyp含量高的22株。

3. 3次挑選試驗

使用與在2次挑選試驗的相同菌株之培養物樣品，藉由比比色法精度更高的HPLC法測定Hyp累積量。

在HPLC中，以自動取樣器進行1級胺基酸(1級胺基)、2級胺基酸(2級胺基)之螢光標識化，使用以逆相HPLC進行分析的系統。於1級胺基之螢光標識中使用O-酞醛(OPA)，於2級胺基的螢光標識中使用氯甲酸-9-芴基甲基(FMOC)。

將培養物樣品以0.1N HCl進行稀釋成為樣品。將該樣品於樣品瓶以0.45μm的濾器進行過濾後設定自動取樣器。於空樣品瓶中放入MPA(巰基丙酸)試藥30μL、OPA試藥15μL、上述樣品5μL後靜置1分鐘後，將FMOC試藥加入5μL後反應2分鐘的溶液1μL注入於HPLC。OPA與1級胺基酸進行反應，剩下的具有2級胺基的Hyp及Pro與FMOC進行反應。將各螢光波長以2頻道進行檢測後，可同時檢測出所有胺基酸。

使用於HPLC分析的裝置及條件如以下所示。

(裝置)

(股)島津製作所製的高速液體色譜儀Nexera X2系統(製品名)

系統控制器：CBM-20A、送液單位：LC-30AD(2台)、脫氣單位：DGU-20A5R、攪拌器：MR180μL II、自動取樣器：SIL-30AC、管柱烤箱：CTO-20AC、螢光檢測器：RF-20AXS、Work station：LabSolutions LC/GC

(測定條件)

管柱：Inertsil ODS-4 100mm×3.0mm

S-2μm(GL Sciences(股))

保護管柱：UHPLC Fitting(製品名、GL Sciences(股))(Max.Pressure：130MPa)

移動相

A液：15mmol/L KH₂PO₄及5mmol/L K₂HPO₄(pH6.5)

B液：15/45/40(v/v/v)=水/乙腈/甲醇

R0(潤髮精液)：水/甲醇=20/80(v/v)

R3(潤髮精液)：水/乙腈=80/20(v/v)

初期B液濃度：10%(v/v)

流量：0.8mL/min

管柱烤箱溫度：35℃

注入量：1μL

檢測：Ch1：激起波長350nm、螢光波長450nm

Ch2：激起波長266nm、螢光波長305nm

容器溫度：25℃、Gain：×4、Sensitivity：Midium

梯度程序(B液濃度(%)為v/v%)

0~1.5分：B.Conc 10%

1.5~6分：B.Conc 10%→30%的梯度

6~11分：B.Conc 30%→40%的梯度

11~15分：B.Conc 100%

20~21.5分：B.Conc 100%→10%

25分：控制器停止

標準曲線：調製出各胺基酸之6.25μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的0.1N HCl溶液。將這些各溶液以上述方法與MPA、OPA及FMOC之各試藥進行反應，以HPL分析後畫出標準曲線。

對於胺基酸混合標準液H型溶液及含有L-羥脯胺酸之0.1N鹽酸溶液，亦與上述同樣下與各試藥進行反應，以上述裝置及測定條件下藉由HPLC進行分析。

圖2表示分析胺基酸混合標準液H型及含有L-羥脯胺酸的0.1N鹽酸溶液(各胺基酸濃度20μmol/L)之HPLC圖表((a)：在Ch1之激起波長350nm、螢光波長450nm下檢測，(b)：在Ch2的激起波長266nm、螢光波長305nm下檢測)。所使用的胺基酸混合標準液H型為和光純藥工業(股)。

即使藉由HPLC進行測定，對於在2次挑選試驗確認多量Hyp累積量的22株菌體培養物，卻任期Hyp含量為多。由這些22株菌體培養物所調製的培養物樣品之藉由HPLC的Hyp含量之測定結果如圖1所示。且，於培養開始前之各液體培養基中並未檢測出游離的Hyp。

圖1表示藉由HPLC的培養物樣品之Hyp含量測定結果圖。

在此等中，對於藉由HPLC所測定的Hyp含量為90μg/mL以上的以下11種菌株，確認其再現性。

Meyerozyma caribbica(2種)、Candida chrysomelidarum、Candida saopaulonensis、Candida blattae、Clavispora lusitaniae、Metschnikowia reukaufii(2種)、Meyerozyma guilliermondii、Candida morakotiae、Kodamaea ohmeri

4. 再現性之確認

對於上述11株，確認再現性。

以與3次挑選試驗之同樣方法進行各菌株的前培養及主要培養，使用在主要培養所得之菌體培養液，進行酵母之自體溶解後調製出培養物樣品。對於培養物樣品，藉由與3次挑選試驗之HPLC法相同方法，測定Hyp含量。其結果，對於所有11株，得到與3次挑選試驗之同樣結果，確認到再現性。

<試驗例2>

由試驗例1之結果得知，由Hyp累積量或使用於食品、化妝料等時的安全性等觀點來看，對於含有Hyp之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物之調製上有望之屬種Meyerozyma caribbica(2種)、Clavispora lusitaniae、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma guilliermondii及Kodamaea ohmeri6種進行進一步實驗。

對於上述6種菌，改變YPD培養基之組成(Y：P：D之比率及P之種類)及培養時間進行主要培養，測定菌體培養物中之Hyp含量及Pro含量。

(前培養)

使用Y：P：D為1：2：2(重量比)(Y：酵母萃取物1.0重量%、P：蛋白腖2.0重量%、D：葡萄糖2.0重量%)的YPD液體培養基。酵母萃取物及蛋白腖與在試驗例1所使用者相同。

前培養在與試驗例1之1次挑選試驗的相同條件下進行。

(主要培養)

將在上述所得之前培養液100μL，接種於下述YPD液體培養基5mL並在30℃進行振盪培養(60rpm)。培養時間為1日或2日後得到菌體培養液(菌體培養物)。

在主要培養中，作為YPD液體培養基之P，使用蛋白腖或膠原肽(CP)。於膠原肽中使用膠原肽Ikos HDL-50SP(製品名，新田明膠(股)製之平均分子量5000) (以下記載為膠原肽(CP1))或膠原肽Type S(製品名之新田明膠(股)製的平均分子量1200)(以下記載膠原肽(CP2))。對於YPD培養基，取代蛋白腖使用膠原肽的培養基亦稱為YPD改變培養基。

又，於主要培養中之YPD液體培養基的Y：P：D之比率為(1)Y：P：D=1：2：2(重量比)(Y：酵母萃取物1.0重量%、P：蛋白腖或膠原肽2.0重量%、D：葡萄糖2.0重量%)或(2)Y：P：D=1：4：5(重量比)(Y：酵母萃取物1.0重量%、P：蛋白腖或膠原肽4.0重量%、D：葡萄糖5.0重量%)。於表4表示在主要培養使用的培養條件1~12。

欲測定Hyp含量的培養物樣品為，將在主要培養所得之酵母的菌體培養液，與試驗例1相同方法下進行自體溶解，經殺菌，除去菌體殘渣後而調製。將所得之培養物樣品以0.1N鹽酸溶液進行稀釋，調製出HPLC的樣品。由培養時間1日之菌體培養液所調製的樣品為，由將培養物樣品稀釋10倍稀釋，培養時間2日之菌體培養液所調製的樣品為稀釋40倍。將這些樣品與試驗例1之相同方法與MPA、OPA及FMOC之各試藥進行反應並以HPLC分析。

在HPLC所使用的裝置及測定條件與3次挑選試驗相同。

標準曲線各對Hyp及Pro調製出5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、250μmol/L之0.1N HCl溶液，將這些溶液以與試驗例1之相同方法，與MPA、OPA及FMOC之各試藥進行反應，以HPLC分析並作成。

培養物樣品之Hyp的定量結果如表5所示。表中，CP1為上述膠原肽(CP1)(製品名膠原肽Ikos HDL-50SP)，CP2為膠原肽(CP2)(製品名膠原肽Type S)。培養物樣品之Pro的定量結果如表6所示。表中之培養條件為主要培養之條件。且，於培養開始前的各液體培養基中幾乎未含有游離Hyp。

由表5及表6所示結果計算出對於各培養物樣品中之Pro及Hyp的合計含量(μg/mL)的Hyp的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))。其結果如表7所示。

提供於試驗之6種酵母皆為藉由好氣培養於培養物中累積L-羥脯胺酸。所得之菌體培養物的(Hyp/(Pro+Hyp))比例皆為35以上。

<試驗例3>

使用如表8所示Meyerozyma caribbica、Clavispora lusitaniae、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma guilliermondii及Kodamaea ohmeri。以表8所示NBRC號碼所特定的酵母可由獨立行政法人製品評估技術基礎機構(日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)獲得。

(前培養)

使用表8所示酵母以外，以與試驗例2相同條件下進行。

(主要培養)

將在上述所得之前培養液100μL，接種於下述YPD液體培養基5mL，並進行30℃的振盪培養(60rpm)。培養時間為1日或2日後得到菌體培養液。

主要培養的條件為試驗例2之培養條件11或12。具體為作為YPD液體培養基的P，使用膠原肽Type S(製品名之新田明膠(股)製的平均分子量1200)(試驗例2之膠原肽(CP2))。YPD液體培養基的Y：P：D之比率為Y：P：D=1：4：5(重量比)(Y：酵母萃取物1.0重量%、P：膠原肽Type S 4.0重量%、D：葡萄糖5.0重量%)。

由菌體培養液藉由與試驗例2之相同方法調製出培養物樣品。將所得之培養物樣品以0.1N鹽酸溶液稀釋，調製出HPLC之樣品。由培養時間1日的菌體培養液所調製的樣品為，將培養物樣品稀釋20倍，由培養時間2日的菌體培養液所調製的樣品為，將培養物樣品稀釋50倍。將這些樣品以與試驗例2相同的方法與MPA、OPA及FMOC之各試藥進行反應。

以與試驗例2相同條件下，以HPLC進行分析，測定培養物樣品中之胺基酸含量。結果如表9所示。表9亦表示加入Hyp含量及Pro含量的全胺基酸量(TotalAA)。提供於試驗的酵母，皆為藉由氣培養在培養物中累積L-羥脯胺酸。又，將菌體培養液(培養時間1日)的660nm之吸光度(OD660)表示於表9。吸光度係由TVS 062CA(ADVANTEC公司)所測定。

如表9所示結果，計算對於各培養物樣品中之Pro及Hyp的合計含量(μg/mL)之Hyp的含量(μg/mL)的比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))。將該結果表示於表10。又，將1日培養物之Hyp含量(μg/mL)除以菌體培養液之吸光度OD660的值(μg/mL/OD660)(Hyp/OD660值)表示於表10。

<試驗例4>

使用在試驗例2及3使用的酵母，以與試驗例2及3相同方法進行培養，得到菌體培養液。將此在50℃進行2小時恆溫培養，藉由自體溶解將菌體內容物溶離於培養液中後，在80℃進行1小時恆溫培養。其後，在1℃進行離心分離(3000rpm,5min)，除去菌體殘渣，得到含有L-羥脯胺酸的菌體培養物之萃取物(含有Hyp的菌體培養物之萃取物)。含有Hyp的菌體培養物之萃取物亦可適宜地稀釋後再使用。

以下表示在試驗例4所得之添加各含有Hyp的菌體培養物之萃取物的皮膚外用劑組成物之製造例的一例子。

<製造例1>肥皂

原料的配合量如表11所示。

將肥皂原料經混合攪拌後，投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，均勻地混合後使其成型。

<製造例2>洗髮精

原料的配合量如表12所示。

於純化水中投入溶解於1,3-丁二醇的防腐劑。均勻地攪拌後投入月桂基醚硫酸鈉、椰子油脂肪酸單乙醇醯胺後，投入色素、香料及殘留的1,3-丁二醇，投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物後，經均勻地混合攪拌。

<製造例3>護髮素

原料的配合量如表13所示。

(1)將氯化硬脂基二甲基苯甲基銨及食鹽投入於純化水中，加溫溶解至80℃。

(2)加溫鯨蠟硬脂基醇、氫化聚異丁烯及甘油單硬脂酸酯至80℃並使其溶解。

(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌一邊添加(2)，添加後進行5分鐘預備攪拌。

(4)預備攪拌終了後，攪拌至50℃下冷卻，添加各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，進一步攪拌冷卻至35℃而調製。

<製造例4>頭髮營養劑(Hair tonic)

原料的配合量如表14所示。

投與溶解於純化水的水楊酸、甘油、乙醇之維他命E、L-薄荷醇，進一步投入溶解於純化水的一部分之甘草酸二鉀後，投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，均勻地混合後調製。

<製造例5>噴霧劑

原料的配合量如表15所示。

於純化水中投入檸檬酸及檸檬酸鈉並溶解。其後投入溶解於乙醇的防腐劑及聚山梨酯80。其後投與各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，並均勻地攪拌後調製。

<製造例6>化妝水

原料的配合量如表16所示。

於純化水投入檸檬酸及檸檬酸鈉並溶解。其次依序投入甘油、1,3-丁二醇及乙二胺四乙酸三鈉，再投入溶解於乙醇的聚氧乙烯(18)油基醇醚、維他命E及對羥基苯甲酸甲酯並攪拌至均勻。其後投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物並均勻地攪拌而調製。

<製造例7>乳液

原料的配合量如表17所。

(1)加溫硬脂酸、十六醇、肉荳蔻酸辛基十二烷基及流動石蠟至80℃並溶解。

(2)將三乙醇胺、玻尿酸鈉、甘油、1,3-丁二醇、聚氧乙烯(10)單油酸酯及乙二胺羥基三乙酸鈉投入於純化水中並加溫至80℃。

(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌下一邊投入(2)，投入後進行5分鐘預備攪拌。

(4)預備攪拌終了後冷卻至50℃，加入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，再冷卻至35℃並冷卻後調製。

<製造例8>乳霜

原料的配合量如表18所示。

(1)加溫硬脂酸、單硬脂酸甘油基、半倍硬酯酸山梨糖醇、單硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇、鯨蠟硬脂基醇、角鯊烷、六(羥基硬脂酸/硬脂酸/松香酸)雙季戊四醇、橄欖油、肉荳蔻酸辛基十二烷基及甲基聚矽氧烷至80℃而溶解。

(2)於純化水中投入甘油、1,3-丁二醇、氫氧化鈉及對羥基苯甲酸甲酯，加溫至80℃並溶解。

(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌一邊投入(2)，投入後進行5分鐘預備攪拌。

(4)預備攪拌終了後，冷卻至50℃，加入各含有Hyp之菌體培養物的萃取物，再冷卻至35℃後調製。

〔產業上可利用性〕

本發明之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物作為化妝料、飲食品等原料為有用。

Claims

一種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其係選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae(但，除Clavispora lusitaniae CCTCC No.M205116及Clavispora lusitaniae CGMCC No.6414以外)所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為前述酵母之菌體為酵母之培養菌體，前述萃取物為，含有對於菌體或含有菌體的菌體培養物，進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述菌體破碎物除去菌體殘渣而得之菌體內容物者；前述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)之合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。
如請求項1之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其中L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。
如請求項1或2之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其中將L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)除以OD660的值(μg/mL/OD660)為20以上。
一種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其係選自由選自奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae(但，除Clavispora lusitaniae CCTCC No.M205116及Clavispora lusitaniae CGMCC No.6414以外)所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為前述酵母之菌體為酵母之培養菌體，前述萃取物為，含有對於菌體或含有菌體的菌體培養物，進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述菌體破碎物除去菌體殘渣而得之菌體內容物者，其中L-羥脯胺酸之含量為10μg/mL以上。
一種L-羥脯胺酸的製造方法，其特徵為含有將選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母，在含有碳源及氮源之液體培養基中，藉由好氣培養，於前述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟，前述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。
如請求項5之製造方法，其中前述含有L-羥脯胺酸之肽為膠原肽。
如請求項6之製造方法，其中前述膠原肽之平均分子量為1000~10000。
如請求項5~7中任一項之製造方法，其中進行10~100小時的前述好氣培養。
一種使用於製造L-羥脯胺酸的選自由奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae所成群的至少1種酵母之用途。
如請求項9之用途，其中含有將前述酵母藉由在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養，於前述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，前述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽。
如請求項10之用途，其中前述含有L-羥脯胺酸之肽為膠原肽。
如請求項11之用途，其中前述膠原肽之平均分子量為1000~10000。
如請求項10~12中任一項之用途，其為將前述好氣培養進行10~100小時。
一種組成物，其特徵為含有如請求項1~4中任一項之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物。
一種飲食品，其特徵含有如請求項1~4中任一項之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物。
一種化妝料或化妝料原料，其特徵為含有如請求項1~4中任一項之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物。
如請求項16之化妝料或化妝料原料，其為使用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚之保濕、皮膚之老化防止、皮膚鬆弛之預防或改善、皮膚彈性之改善、皺紋之預防或改善及異位性皮膚炎之改善的用途上。
如請求項16或17之化妝料或化妝料原料，其中前述化妝料或化妝料原料為化妝料原料，L-羥脯胺酸含量為5~300ppm。
如請求項16或17之化妝料或化妝料原料，其中前述化妝料或化妝料原料為化妝料，L-羥脯胺酸含量為0.01~20ppm。
一種L-羥脯胺酸補強用組成物，其特徵為含有選自由含有L-羥脯胺酸之奧默柯達菌(Kodamaea ohmeri)、 Metschnikowia reukaufii、Meyerozyma caribbica、Meyerozyma guilliermondii及Clavispora lusitaniae(但，除Clavispora lusitaniae CCTCC No.M205116及Clavispora lusitaniae CGMCC No.6414以外)所成群的至少1種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，前述酵母之菌體為酵母之培養菌體，前述萃取物為含有對於菌體或含有菌體的菌體培養物，進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述菌體破碎物除去菌體殘渣而得之菌體內容物者，其中前述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為，含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)之合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100及/或L-羥脯胺酸之含量為10μg/mL以上。