TWI757293B - 含有Ｌ-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母（ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）之菌體、菌體培養物或這些萃取物與其用途及Ｌ-羥脯胺酸的製造方法 - Google Patents

含有Ｌ-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母（ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）之菌體、菌體培養物或這些萃取物與其用途及Ｌ-羥脯胺酸的製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的特徵為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。

Description

含有L-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物與其用途及L-羥脯胺酸的製造方法
本發明係關於含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途，以及L-羥脯胺酸的製造方法。本發明又關於使用於製造L-羥脯胺酸的酵母之使用。本發明又係關於含有酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之飲食品、化妝料、化妝料原料及L-羥脯胺酸補強用組成物等。
L-羥脯胺酸(羥基-L-脯胺酸)為具有於L-脯胺酸的第4位碳原子上鍵結羥基的結構之胺基酸。作為L-羥脯胺酸之效能，可舉出於成纖維細胞中之膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、與膠原同等以上之保濕效果、皮膚之老化防止、比三肽更高的經皮吸收性、皺紋之改善效果、異位性皮膚炎之改善效果等。因L-羥脯胺酸對於人體為安全，故可含於飲食品、化妝料、醫藥品等使用，其有益性非常高。
L-羥脯胺酸雖可藉由有機合成法而製造，但利 用微生物之製造方法亦被檢討。例如專利文獻1中記載將編碼來自宮古木根瘤菌的L-脯胺酸 順-4-羥化酶之核苷酸導入於宿主細胞所得之轉形體於培養基進行培養，於培養物中生成順-4-羥基-L-脯胺酸，使其累積後由該培養物中採取順-4-羥基-L-脯胺酸之順-4-羥基-L-脯胺酸的製造方法已被記載。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 專利第5506668號公報
其中，酵母為在飲食品領域等自古已有嘗試種種工業利用性的微生物，含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可作為期待L-羥脯胺酸之效能的化妝料、飲食品等原料上為有用。然而，於菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的酵母尚未有報告。
本發明係以提供含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途，以及L-羥脯胺酸的製造方法為主要目的。
本發明者們欲解決上述課題進行詳細研究結果，發現將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)進行好氣 培養時，於菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。又，所得之含有L-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計重量含量而言之L-羥脯胺酸的重量含量之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))在特定範圍。本發明者們依據此等見解做進一步研究後完成本發明。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100為特徵。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中，L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。
本發明之其他態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。
本發明之L-羥脯胺酸的製造方法係以含有將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)藉由在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟，上述氮源為包含含 有L-羥脯胺酸之肽的氮源為特徵者。
對於本發明之製造方法，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。上述膠原肽之平均分子量以1000~10000為佳。
對於本發明之製造方法，將上述好氣培養進行10~100小時為佳。
本發明亦包含使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)於製造L-羥脯胺酸的用途。
本發明之使用為，含有藉由將上述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源為佳。
本發明之使用中，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。上述膠原肽的平均分子量以1000~10000為佳。
本發明之使用中，上述好氣培養進行10~100小時為佳。
本發明之組成物係以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。
本發明之飲食品以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。
本發明之化妝料或化妝料原料係以含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。
本發明之化妝料或化妝料原料係以使用於選自由膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚的防老、皮膚鬆弛的預防或改善、皮膚彈性的改善、皺紋的預防或改善及異位性皮膚炎的改善的用途上為佳。
對於一態樣，本發明之化妝料或化妝料原料為化妝料原料，L-羥脯胺酸含量以5~300ppm為佳。
本發明之化妝料或化妝料原料為化妝料，L-羥脯胺酸含量以0.01~20ppm為佳。本說明書中ppm表示重量ppm。
本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物係以含有L-羥脯胺酸之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物者為特徵。
對於本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100為佳。又，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中，L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。
依據本發明可提供含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其用途以及L-羥脯胺酸的製造方法等。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可適合作為飲食品、化妝料等原料等使用。
[圖1] 圖1表示酵母之L-羥脯胺酸(Hyp)累積量的圖表。
[圖2] 圖2表示在各培養基進行培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量的圖表((a)：條件1、(b)：條件2)。
[圖3] 圖3表示在PD培養基或添加0.125%明膠的PD培養基中進行5天培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖表(白：含有0.125%明膠的PD培養基，黑：PD培養基)。
[圖4] 圖4表示在組成相異的YPD培養基進行培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖表((a)：Hyp累積量(μg/mL)、(b)：每細胞之Hyp量(μg/mL/OD600))。
[圖5] 圖5表示在含有蛋白腖或膠原肽的培養基中進行培養的Yarrowia lipolytica的Hyp累積量，每細胞之Hyp量及OD600的圖表((a)：Hyp累積量(μg/mL)、(b)：每細胞之Hyp量(μg/mL/OD600)、(c)：OD600))。
[圖6] 圖6表示進行振盪培養或靜置培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖((a)：培養物樣品(細胞內)的培養基單位換算Hyp量、(b)：培養澄清液中之Hyp量))。
[圖7] 表示進行振盪培養或靜置培養的Yarrowia lipolytica之培養澄清液的乙醇濃度及葡萄糖濃度圖表((a)：乙醇濃度(v/v%)、(b)：葡萄糖濃度(重量%))。
[圖8] 圖8表示分析胺基酸混合標準液H型及含有L-羥脯胺酸的0.1N鹽酸溶液(各胺基酸濃度20μmol/L)之HPLC圖表((a)：在Ch1之激起波長350nm，螢光波長450nm進行檢測，(b)：在Ch2之激起波長266nm，螢光波長305nm進行檢測)。
[實施發明的形態]
以下對於本發明之實施形態做具體說明。然而，本發明並未限定於以下實施形態，在不變更本發明之要旨的範圍下，可適宜變更後適用。
本說明書中，酵母的屬種為在The Yeasts,a Taxonomic Study Fifth Edition(Elsevier發行，2011年)所記載的屬種名。
本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物，上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~ 100。
本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物，L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。
以下將本發明之第一態樣及第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物亦總稱為本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
本發明中之酵母若為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)所屬的酵母即可，可僅使用1種，亦可使用2種以上。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)可藉由種種寄存機構獲得。作為寄存機構，例如獨立行政法人製品評估技術基礎機構(日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)等。又，亦可由自然界分離。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為含有L-羥脯胺酸(Hyp)。本發明中之L-羥脯胺酸為4-羥基-L-脯胺酸。本說明書中，於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含的L-羥脯胺酸係指游離的L-羥脯胺酸。於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中之L-羥脯胺酸含量或累積量係指游離的L-羥脯胺酸量。於該菌體或 菌體培養物中累積游離的L-羥脯胺酸之酵母尚未被報告。
本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物適用於被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料之原料等。將「對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例」(100×Hyp/(Pro+Hyp))在以下亦稱為「(Hyp/(Pro+Hyp))比例」。本說明書中，於上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例中之L-脯胺酸含量係指含於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的游離之L-脯胺酸含量。
對於較佳態樣，本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100。
上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例係以40~100為佳，較佳為50~100，更佳為60~100，更較佳為70~100，進一步較佳為80~100，特佳為90~100。上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例為如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中Hyp之含量比例高，作為被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料之原料等為特佳。
本發明之第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為L-羥脯胺酸之含量在10μg/mL以上。
本發明之第一態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量以10μg/mL以上為佳。L-羥脯胺酸的含量在上述範圍之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可作為被期待L-羥脯胺酸之效能的飲食品或化妝料的原料等為佳。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之L-羥脯胺酸的含量以15μg/mL以上者為較佳，以17μg/mL以上為較佳，以20μg/mL以上為較佳，以30μg/mL以上為更佳，以40μg/mL以上為更佳，以50μg/mL以上為更佳，以70μg/mL以上為更佳，以100μg/mL以上為更佳，以150μg/mL以上為更佳，以200μg/mL以上為特佳，以250μg/mL以上為特佳，以300μg/mL以上為特佳，以400μg/mL以上為特佳，以450μg/mL以上為特佳，以475μg/mL以上為特佳，以500μg/mL以上為最佳。
酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量的上限並無特別限定，雖較佳為佳，通常為6000μg/mL以下，3000μg/mL以下或2000μg/mL以下亦可。
依據本發明可提供來自酵母之菌體或菌體培養物的L-羥脯胺酸之含量為上述範圍的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中之L-脯胺酸的含量(μg/mL)及L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)可藉由高速液體層析法(HPLC)進行測定。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物含於菌體時，藉由加 熱等進行自體溶解或藉由酵素分解處理等破碎菌體，使用溶離菌體內容物者，測定L-脯胺酸及L-羥脯胺酸的含量。L-脯胺酸及L-羥脯胺酸含量的測定方法及HPLC之測定條件等採用實施例所記載的方法及條件等即可。較佳為(1)藉由o-酞醛(OPA)及4-氯-7-硝基苯並呋咱(NBD-C1)依序將胺基酸衍生物化，藉由HPLC進行分析的方法(在激起波長503nm/螢光波長541nm下檢測)或(2)藉由巰基丙酸、OPA將1級胺基進行衍生物化後，藉由氯甲酸-9-芴基甲基(FMOC)使2級胺基酸進行衍生物化，藉由HPLC進行分析的方法(在激起波長266nm，螢光波長305nm下檢測)，較佳為藉由上述(2)之方法，定量L-脯胺酸及L-羥脯胺酸。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在液體培養基中進行好氣培養，視必要進行菌體破碎等所得者。
酵母之菌體培養物中含有酵母之菌體及/或培養澄清液者為佳，亦可含有酵母之菌體內容物。酵母之菌體可為活菌，亦可為死菌。作為含有酵母之菌體及/或培養澄清液的菌體培養物，可舉出含有將上述酵母進行好氣培養所得之酵母之菌體(培養菌體)及培養澄清液的菌體培養液、將由該菌體培養液集合酵母之菌體者(菌體)或由該菌體培養液除去菌體的培養澄清液。將菌體培養液的培養澄清液僅稱為培養澄清液。菌體培養物較佳為含有酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液或培養澄清液。
又，菌體或菌體培養物之萃取物，通常含有菌體內容物，含有菌體內容物及培養澄清液者為佳。作為菌體或菌體培養物之萃取物，於含有菌體或菌體之菌體培養物(較佳為菌體培養液)，進行自體溶解處理或酵素分解處理等菌體破碎處理，將酵母菌體內容物溶離於培養液中等者(菌體破碎物)、由進行菌體破碎處理由菌體或菌體培養物(菌體破碎物)除去菌體殘渣者可舉出，較佳為由進行菌體破碎處理的菌體培養液(菌體破碎物)或該菌體破碎物除去菌體殘渣所得之含有菌體內容物及培養澄清液之萃取物。
如上述，本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在液體培養基中進行好氣培養所得之含有酵母的菌體及培養澄清液的菌體培養液中，視必要可進行集菌、菌體破碎等處理而調製。
於本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中所含的L-羥脯胺酸係以來自由上述的好氣培養所得之酵母的菌體或菌體培養物者為佳。於本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含的L-羥脯胺酸以實質上於上述好氣培養前未存在者為佳。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，例如可使用於作為含有化妝料、酒類之飲食品等原料者為佳。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃 取物為將L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)除以OD600之值(μg/mL/OD600)以0.5以上為佳。將L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)除以OD600之值(μg/mL/OD600)於以下亦稱為Hyp/OD600值。Hyp/OD600值越高，每細胞之L-羥脯胺酸的含量越高故較佳。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的Hyp/OD600值之上限並無特別限定，越多越佳，通常為300以下。Hyp/OD600值以1以上者為佳，例如1~150為佳，Hyp/OD600值以25以上者為較佳，50以上為更佳。
所謂OD為optical density的簡稱，其表示光學密度。OD表示細胞的濃度等。一般測定對於600nm或660nm的波長之可見光的吸光度OD600或OD660(使用生物實驗說明▲7▼的酵母之Two Hybrid，秀潤公司，2003年發行)。
使用於Hyp/OD600值的計算之OD600為，使用於菌體、菌體培養物或這些萃取物的調製之含有菌體及培養澄清液的菌體培養液(含有菌體及培養澄清液之菌體培養物)的600nm之吸光度。
更具體為將上述酵母在液體培養基中進行好氣培養所得之酵母的菌體培養液直接作為菌體培養物時，OD600為該菌體培養液(菌體培養物)的吸光度OD600。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為，將酵母之菌體經破碎後溶離菌體內容物的菌體或菌體培養物之萃取物時，OD600表示使用於該調製的菌體培養液(含有菌體破碎前的酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液)之吸光度OD600。 OD600例如可藉由分光光度計測定。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的乙醇含量以1v/v%以下為佳。乙醇含量若為1v/v%以下時，特別可作為各種飲食品或化妝料等原料使用。乙醇若超過1v/v%時，有時對酵母的增殖等有著壞影響。本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的乙醇含量較佳為0.8v/v%以下，更佳為0.5v/v%以下。乙醇含量可藉由公知方法測定。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的形態雖無特別限定，但例如可舉出糊狀、懸浮狀、提取狀、液狀等。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為可適合使用於如後述的化妝料、飲食品等原料者。可將本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物藉由乾燥等使其粉末化後使用。
本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物係由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，視必要藉由菌體破碎等而可得。更具體為氮源係包含含有L-羥脯胺酸之肽。
藉由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於該酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。 含有藉由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之液體培養基中進行好氣培養，於該酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟之方法作為上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之製造方法或L-羥脯胺酸的製造方法為佳。
本發明之L-羥脯胺酸的製造方法為含有藉由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟(以下亦稱為Hyp累積步驟)。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。
本發明之製造方法可具有依所望的Hyp累積步驟以外之步驟。例如可舉出如後述之前培養步驟、集菌步驟、菌體破碎步驟等1個或2個以上步驟。
對於本發明之L-羥脯胺酸的製造方法，可得到上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
藉由進行上述Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。所得之酵母的菌體或菌體培養物通常上述(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100。又，藉由Hyp累積步驟所得之酵母的菌體或菌體培養物，通常L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。如此酵母之菌體或菌體培養物可作為上述本發明的酵母之菌體或菌體培養物使用。又，於所得之菌體或菌體培養物可紀行依所望進一步進行菌體破碎處理等處理，可調製出含有L-羥脯胺酸的酵 母之菌體或菌體培養物之萃取物。
含有Hyp累積步驟的L-羥脯胺酸的製造方法亦可作為上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之製造方法為佳。欲得到本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物時，Hyp累積步驟及其較佳態樣與於L-羥脯胺酸的製造方法中之Hyp累積步驟及其較佳態樣相同。
對於Hyp累積步驟，對解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之液體培養基的添加方法為，可於含有碳源及氮源的液體培養基中直接接種少量菌體而使其增殖，但欲在短期間提高菌體濃度，接種前培養的菌液者為佳。使用於前培養的培養基並無特別限定，可與在Hyp累積步驟(通常為主要培養)所使用的液體培養基之相同培養基，亦可使用可使用於酵母的公知培養基。前培養的時間，通常為10~72小時，較佳為12~48小時。前培養溫度以15~40℃者為佳。作為接種前培養的菌液之量，通常為在Hyp累積步驟所使用的培養基量之1/100000~1/2，以1/1000~1/10為佳，以1/200~1/10為較佳，以1/200~1/20為更佳。接種量若在上述範圍時，於Hyp累積步驟，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)增殖會加速，可有效率地累積L-羥脯胺酸。
使用在Hyp累積步驟的液體培養基之氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。使用如此氮源進行解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的好氣培養時，於菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。如此氮源可僅使用1種，亦 可使用2種以上。含有L-羥脯胺酸之肽可為1種，亦可為2種以上。
所謂含有L-羥脯胺酸之肽表示將L-羥脯胺酸含於構成胺基酸之肽即可，但較佳為構成胺基酸之10重量%以上為L-羥脯胺酸的肽。對於其中一態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源亦以含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。
包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，例如可藉由水解含有L-羥脯胺酸的蛋白質而得。所謂含有L-羥脯胺酸的蛋白質表示於構成胺基酸含有L-羥脯胺酸的蛋白質即可，但較佳為構成胺基酸的10重量%以上為L-羥脯胺酸之蛋白質。作為上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質，以膠原性蛋白質等為佳。作為膠原性蛋白質，例如可舉出由含有內臟、皮、魚鱗、骨等膠原的組織所調製的蛋白質；可舉出膠原、明膠。膠原性蛋白質的原料來源並無特別限定。例如可使用來自牛、來自豬、來自魚等來自動物的膠原性蛋白質為佳。膠原性蛋白質可使用市售品。含有L-羥脯胺酸的蛋白質之水解可藉由酵素等公知方法進行。
作為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，例如可使用來自動物的蛋白腖為佳。較佳為來自牛、豬或魚的蛋白腖，更佳為來自牛或魚的蛋白腖。對於本發明之一態樣，作為蛋白腖，以獸肉蛋白腖、心肌蛋白腖、明膠蛋白腖亦佳。
作為可使用於本發明的包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之市售品的一例子，例如可舉出製品名Pepton (#211677)(Bacto公司)等。
對於其中一態樣，上述含有L-羥脯胺酸之肽，較佳為膠原肽。所謂膠原肽表示水解膠原，亦可為將天然膠原經熱處理使其變性的明膠或天然膠原經水解後的膠原肽或將此等經化學性、酵素性修飾者中任一皆可。水解可藉由酵素、酸、鹼等進行，較佳為藉由酵素進行。較佳為使用將天然膠原經熱處理使其變性的明膠或天然膠原經水解的膠原肽。膠原肽的原料來源並無別限定。例如使用來自牛、來自豬、來自魚等來自動物的膠原肽為佳。較佳為來自魚的膠原肽。膠原肽可使用市售品。
作為可使用在本發明的膠原肽之市售品的一例子，例如可舉出新田明膠(股)製的「膠原肽Ikuos HDL-50SP」(製品名)(平均分子量5000)、「膠原肽Type S」(製品名)(平均分子量1200)、「超級膠原肽SCP-2000」(製品名)(平均分子量2000)、野洲化學工業(股)製的「膠原肽P-5000」(製品名)(平均分子量5000)、「膠原肽F-5000」(製品名)(平均分子量5000)、日祥(股)製的「Marine collagen oligoCF」(製品名)(平均分子量900~1100)、「Marine collagen oligoMF」(製品名)(平均分子量900~1500)等。其中亦以「膠原肽Type S」(平均分子量1200)、「膠原肽Ikuos HDL-50SP」(平均分子量5000)等為佳。
此等中，例如「膠原肽Ikuos HDL-50SP」、「膠原 肽Type S」、「膠原肽F-5000」、「Marine collagen CF」、「Marine collagen oligoMF」為來自魚者，「膠原肽P-5000」、「超級膠原肽SCP-2000」為來自豬者。
對於本發明之較佳實施態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源，較佳為膠原肽(較佳為來自魚的膠原肽)及/或蛋白腖(較佳為來自動物，更佳為來自牛、豬或魚，特佳為來自牛或魚的蛋白腖)，特佳為膠原肽。使用如此包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源時，酵母之菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。蛋白腖可為獸肉蛋白腖、心肌蛋白腖、明膠蛋白腖。本發明之L-羥脯胺酸的製造方法之較佳實施態樣的一例為，含有將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源以及膠原肽及/或蛋白腖之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟。
對於其中一態樣，包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之平均分子量以10000以下者為佳，例如平均分子量以100~10000為佳。含有L-羥脯胺酸之肽係以平均分子量為10000以下者為佳，例如平均分子量以100~10000為佳。又，含有L-羥脯胺酸之肽的分子量以10000以下者為亦佳。
膠原肽的平均分子量以1000~10000為佳。將平均分子量在上述範圍之膠原肽作為氮源使用時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。
含有L-羥脯胺酸之肽的平均分子量可藉由凝膠過濾等 算出。膠原肽的平均分子量，通常為藉由照片用明膠試驗法(PAGI法)第10版「20-2平均分子量」所記載的方法算出之值。肽之平均分子量表示重量平均分子量。
膠原肽的平均分子量較佳為1000~6000，更佳為1000~5500，特佳為1000~5000。使用如此膠原肽作為氮源時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量可變的更多。又，對於其中一態樣，作為膠原肽之平均分子量，以1000~3000為較佳，以1000~1500為更佳。對於本發明之另一較佳態樣，膠原肽的平均分子量以2000~5500為較佳，以3000~5000為更佳。
上述液體培養基中之包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源的濃度，通常以0.1~10重量%為佳，以0.25~5重量%為較佳，以1~5重量%為更佳。上述氮源的濃度在上述範圍時，菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。因此，例如可得到L-羥脯胺酸含量為10μg/mL以上的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。又，可得到(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100之菌體、菌體培養物或這些萃取物。液體培養基中之上述氮源的濃度以1.5~4.5重量%為更較佳，以2~4重量%為特佳。上述氮源之濃度在培養開始時為上述濃度即可。
對於其中一態樣，上述液體培養基中之膠原肽或蛋白腖的濃度以上述範圍為佳。
上述碳源雖無特別限定，例如可舉出葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、甘 露醇、海藻糖、松三糖、纖維二糖、澱粉、糖蜜、山梨醇、L-山梨糖、甘油、乙醇、山梨醇等糖質或糖醇；乙酸、檸檬酸、或葡萄糖酸等有機酸等。碳源可單獨使用1種，又亦可混合2種以上使用。其中亦以碳源為葡萄糖、果糖、蔗糖等糖為佳，葡萄糖為特佳。
液體培養基中之碳源的濃度，以0.1~20重量%為佳，較佳為0.5~15重量%，更佳為1~10重量%，特佳為1~5重量%，最佳為2~5重量%。液體培養基中之碳源濃度為1重量%以上時，因菌體的增殖速度會變快故較佳。且，碳源濃度在培養開始時為上述濃度者即可。
對於本發明之製造方法，碳源(C)與包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)的重量比(C/N)以0.25~20為佳。C/N的重量比在上述範圍時，因菌體或菌體培養物中的L-羥脯胺酸之累積量會變多故較佳。對於其中一態樣，上述C/N之重量比以0.25~5為佳，以0.3~3為較佳，以0.4~1.5為更佳。C/N的重量比若在上述範圍時，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變的更多。對於其中一態樣，例如於包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)使用膠原肽(較佳平均分子量為1000~5000)或蛋白腖時，上述C/N的重量比以0.25~5為較佳，以0.3~3為更佳，以0.4~1.5為更較佳，以0.5~1.3為特佳。
對於另外較佳態樣，C/N之重量比以0.5~20亦佳。上述C/N的重量比在培養開始時為上述範圍即可。
液體培養基可含有除上述碳源及包含含有L- 羥脯胺酸之肽的氮源以外之成分，例如含有酵母萃取物(Yeast extract)為佳。酵母萃取物通常未含有含有L-羥脯胺酸之肽，於包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源中未含有。酵母萃取物若可使用於酵母之培養者即可，並無特別限定，可使用市售品。例如可使用製品名Bacto yeast Extract(#212750)(Bacto公司)等。
使用酵母萃取物時，酵母萃取物的濃度對於液體培養基以0.1~3重量%為佳，以0.5~3重量%為較佳。酵母萃取物的濃度若於培養開始時為上述濃度即可。
對於其中一態樣，液體培養基之pH以3~9為佳，以4~9為較佳，超過4，9以下為較佳，4.5~8.8為更佳，5~8.7為特佳。液體培養基的pH可適宜調整。pH調整可使用公知酸或鹼劑，例如可舉出鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、谷胺酸、乙酸、丁酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氨水、谷胺酸鈉等。
培養溫度以15~45℃為佳，以20~40℃為較佳，以25~35℃為更佳。培養溫度若在此溫度範圍時，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的增殖會快速，菌體或菌體培養物中之L-羥脯胺酸的累積量會變多。
進行好氣培養的方法並無特限定，將接種解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之液體培養基，例如可進行振盪培養或攪拌培養。振盪或攪拌的速度並無特別限定，較佳為30~600rpm，對於其中一態樣，較佳為50~ 600rpm，更佳為100~600rpm。又對其他較佳態樣，振盪或攪拌的速度較佳為30~500rpm，更佳為50~300rpm。以如此速度進行振盪培養或攪拌培養時，因可使L-羥脯胺酸的累積量變多故較佳。較佳為在上述速度進行振盪培養。又，可依據所望在經滅菌的空氣或氧下進行起泡。又，培養形式可為分批培養、補料分批培養、連續培養中任一種，以分批培養為佳。對於本發明之製造方法，亦可進行靜置培養。
培養時間雖無特別限定，可適宜地設定，例如進行好氣培養10~100小時為佳。培養時間若在上述範圍時，上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。又，通常可得到(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100，酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物、L-羥脯胺酸含量為10μg/mL以上的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。又，得到乙醇含量較少(例如1v/v%以下)酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。若培養時間未達10小時時，L-羥脯胺酸的累積量會有較少之情況，所得的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之(Hyp/(Pro+Hyp))比例有未達35之情況。培養時間若超過100小時時，所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物之乙醇濃度有超過1v/v%之情況。又，變的容易引起污染，或於酵母死滅後因自體溶解而產生著色等情況產生。培養時間較佳為10~80小時，較佳為12~72小時，更佳為20~60小時，更較佳為24~55小時，特佳為24~50小時。
又，對於本發明之製造方法，進行好氣培養至菌體或菌體培養物中的L-羥脯胺酸含量至10μg/mL以上為止為佳。
對於本發明之製造方法，好氣培養通常作為主要培養而進行，亦可為前培養，於前培養及主要培養亦可進行好氣培養。
藉由進行上述好氣培養，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸。菌體培養物可為含有酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液，亦可為酵母之菌體，或菌體培養液之培養澄清液。藉由進行Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸，(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35~100之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體或菌體培養物。又，可得到L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體或菌體培養物。於酵母之菌體或菌體培養物，例如藉由進行菌體破碎處理，可得到酵母之菌體或菌體培養物之萃取物。
對於本發明，調製含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或者菌體培養物或該萃取物時，例如可將含有在Hyp累積步驟所得之酵母之菌體及培養澄清液的菌體培養液直接作為含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體培養物。又，由菌體培養液將酵母之菌體集菌，將所得之菌體可作為酵母之菌體或菌體培養物，亦可將由菌體培養液除去菌體的培養澄清液作為菌體培養物。且，於上述菌體或菌體培養液，視 必要進行破碎菌體的處理，將菌體內容物溶離於培養液中等可調製出菌體或菌體培養物的萃取物。對於菌體或菌體培養物之萃取物的調製，將菌體破碎後，可進行除去菌體殘渣之步驟。又，對於菌體、菌體培養物或這些萃取物，視必要可進行殺菌、加熱等處理。本發明之製造方法可含有如此集菌步驟、菌體破碎步驟、菌體殘渣除去步驟、殺菌步驟等1或2個以上步驟。
由菌體培養液將菌體進行集菌的方法並無特別限定，可採用一般進行的方法，例如可舉出離心分離等。
破碎上述菌體的方法並無特別限定，可採用一般進行的方法，例如可舉出自體溶解法、酵素分解法、鹼萃取法等。其中亦以自體溶解法為佳。對於自體溶解法，例如將菌體或菌體培養物在40~60℃下進行60~180分鐘或在95~100℃進行5~15分鐘加熱即可。
除去菌體殘渣的方法並無特別限定。例如可藉由過濾、離心分離等公知方法除去菌體殘渣即可。
進行殺菌時，可將酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物在75~90℃(較佳為80℃)加熱45~90分鐘(較佳為60分鐘)為佳。進行菌體殘渣除去及殺菌時皆可先進行。
於本發明所得之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及較佳態樣，與如上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。依據本發明之製造方法，例如可製造(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35 ~100，且L-羥脯胺酸含量為10μg/mL的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物中之L-羥脯胺酸，通常來自上述酵母之菌體或菌體培養物者。
於藉由上述方法所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物，可進一步添加來自天然物或經合成的L-羥脯胺酸，對於較佳態樣，於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物所含有的L-羥脯胺酸係由藉由上述Hyp累積步驟所得之來自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體或菌體培養物的L-羥脯胺酸所成。
在本發明所得之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，可作為如後述之飲食品、化妝料等原料等使用。又，對於本發明之L-羥脯胺酸的製造方法，由所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物，可進行純化L-羥脯胺酸的步驟。L-羥脯胺酸之純化，例如可藉由管柱層析法等公知方法進行即可。
本發明亦包含使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)於製造L-羥脯胺酸的用途。
上述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)亦適用於製造含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物者。含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的(Hyp/(Pro+Hyp))比例以35~100為佳。含有 L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣相同。
本發明之使用包含藉由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸者為佳。
上述氮源以包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源為佳。
對於本發明之使用，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。又，上述膠原肽的平均分子量以1000~10000為佳。
對於本發明之使用，上述液體培養基中之包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源之濃度以0.25~5重量%為佳。又，碳源(C)與包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源(N)之重量比(C/N)以0.25~20為佳。對於其中一態樣，上述C/N比以0.5~20為佳。對於本發明之使用，進行上述好氣培養10~100小時為佳。
本發明之使用中的液體培養基、碳源及包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源以及這些較佳態樣與上述L-羥脯胺酸的製造方法中者相同。又，好氣培養之條件及其較佳態樣亦與上述L-羥脯胺酸的製造方法中者相同。本發明之使用亦可含有上述集菌步驟、菌體破碎步驟、菌體除去 步驟、殺菌步驟等1或2個以上步驟。
上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物可添加於化妝料、飲食品、醫藥品等各種組成物。含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的組成物亦包含於本發明。本發明之組成物可含有上述本發明之第一態樣及第二態樣的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物中任一方，亦可含有雙方。含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之組成物為含有來自該酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸。
作為本發明之組成物，例如可舉出化妝料(化妝料組成物)、飲食品(飲食品組成物)、醫藥品(醫藥品組成物)、醫藥部外品(醫藥部外品組成物)等。組成物可為這些原料。對於其中一態樣，組成物以化妝料或飲食品這些原料為佳。
本發明之組成物中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量並無特別限定，可配合該組成物之種類、用途做適宜設定。例如，對於組成物，將上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之固體成分換算的含量設定為0.00001~50重量%者為佳，以0.00005~20重量%為較佳，以0.0001~10重量%為更佳。
本發明之組成物為化妝料或醫藥品時，該劑型並無特別限定，可為溶液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意劑型。
化妝料並無特別限定，例如可為洗面劑、洗顏料、化 妝水、乳液、乳霜、美容液、育毛劑、油、凝膠、洗髮精、潤髮精、護髮素、亮粉、粉底、唇膏、香粉、面膜、香水、蜜粉、古龍水、沐浴乳、肥皂、入浴劑、防曬乳霜等。
含有上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的化妝料或化妝料原料為本發明中較佳態樣之1。化妝料及化妝料原料可含有上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物以外成分。於化妝料及化妝料原料中，可添加於化妝料通常添加的種種成分。例如可適宜地添加油分、香料、界面活性劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、防腐劑、顏料、色素等。這些配合比率適宜選擇即可。本發明之化妝料原料適合使用於製造本發明之化妝料上。
化妝料的用法及用量對應化妝料之種類等可適宜地決定。
本發明之化妝料或化妝料原料因可含有L-羥脯胺酸，例如可使用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚的防老、皮膚鬆弛的預防或改善、皮膚彈性的改善、皺紋的預防或改善及異位性皮膚炎的改善的用途上，故適用於選自皮膚彈性的改善及皺紋的預防或改善的用途上。
化妝料中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料，以固體成分換算下以0.00001~10重量%為佳，以0.0001~10重量%為佳， 0.0001~5重量%為較佳，0.001~5重量%為較佳，0.01~3重量%為更佳，0.05~2重量%為特佳。又，對於其他較佳態樣，化妝料中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料，以固體成分換算下以0.00005~1重量%為較佳，以0.0001~0.5重量%為更佳。
化妝料原料中之上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量對於化妝料原料，例如以固體成分換算下以0.001~20重量%為佳，以0.01~10重量%為較佳，0.05~5重量%為更佳，0.1~2重量%為特佳。化妝料原料中之L-羥脯胺酸含量，例如以5~300ppm為佳，以10~200ppm為較佳，以50~100ppm為更佳。對於其中一態樣，化妝料中之L-羥脯胺酸含量，例如可設定為0.01~20ppm，以0.03~15ppm為佳，以0.05~10ppm為較佳。添加上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，使L-羥脯胺酸含量在上述範圍為佳。
本發明之組成物為飲食品(飲食品組成物)時，飲食品並無特別限定。飲食品的形態可為液狀、半液體狀或固體狀、糊狀中任一種，例如可為一般飲食品、健康食品、功能性食品等中任一種。
一般飲食品並無特別限定，亦含有酒類。所謂健康食品表示健康或對健康良好的食品，含有營養補充食品、自然食品等。所謂營養補充食品表示強化特定營養成分的食品。所謂功能性食品表示欲補給可達到身體調節功能的營養成分之食品，含有特定保健用食品、營養功能食品。
作為營養補充食品，可舉出美容飲料、補充劑等。本發明之飲食品可為膠囊等醫藥製劑形態、飲料劑等。
於飲食品中可添加被許可的可添加於飲食品的種種成分。作為如此成分，例如可舉出結合劑、增黏劑、著色劑、安定劑、乳化劑、分散劑、崩壞劑、懸浮化劑、界面活性劑、防腐劑、甜味料、酸味料等。
上述含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的飲食品為本發明中之較佳態樣之1。
飲食品中的上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量，例如對於飲食品，以固體成分換算下以0.0001~10重量%者為佳，以0.001~5重量%為較佳，以0.01~1重量%為更佳。又，飲食品中之L-羥脯胺酸含量以0.0001~0.01重量%為佳，欲使L-羥脯胺酸含量在上述範圍，添加上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為佳。上述化妝料、化妝料原料、飲食品等組成物中之L-羥脯胺酸含量為游離L-羥脯胺酸含量。L-羥脯胺酸較佳為來自上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
含有本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的化妝料、飲食品、這些原料等組成物為藉由，將這些通常被使用的原料、添加劑等配合該種類選擇後添加，於此添加本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，以公知方法製造。
本發明亦包含將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟(Hyp累積步驟)之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。本發明之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法的較佳態樣為與上述L-羥脯胺酸的製造方法之較佳態樣相同。上述含有L-羥脯胺酸的化妝料原料之製造方法可作為本發明之化妝料原料的製造方法為佳。
藉由進行Hyp累積步驟，可得到含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體或菌體培養物。又，於酵母之菌體或菌體培養物進行上述菌體破碎處理時，得到含有L-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體或菌體培養物的萃取物。如此所得之酵母的菌體、菌體培養物或這些萃取物及較佳態樣為與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。所得之含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物為，依據所望於化妝料添加通常被使用的添加劑等，可作為含有L-羥脯胺酸的化妝料原料使用。又，於由含有L-羥脯胺酸的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物進行純化的L-羥脯胺酸中，添加依據所望的於化妝料通常被使用的添加劑等，可製造出含有L-羥脯胺酸的化妝料原料。藉由本發明所得之含有L-羥脯胺酸的化妝料原料可適用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚保濕、皮膚的防老、皮膚鬆弛的預防或改善、皮膚彈性的改善、皺紋的預防或改善及異位 性皮膚炎的改善之用途的化妝料上。
本發明亦包含，具有含有L-羥脯胺酸之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸補強用組成物。
上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物雖含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))以35~100為佳。上述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸的含量以10μg/mL以上為佳。含有如此酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸補強用組成物，特別可適用於作為欲使化妝品、飲食品等L-羥脯胺酸補強、補充或強化時的添加劑。酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的較佳態樣與上述本發明的酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物及其較佳態樣相同。L-羥脯胺酸補強用組成物作為L-羥脯胺酸補強用之添加劑組成物，可適用於飲食品、化妝料等。L-羥脯胺酸補強用組成物亦可言為L-羥脯胺酸補充用組成物或L-羥脯胺酸強化用組成物。
本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物若具有含有L-羥脯胺酸之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物即可，該菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量可為100重量%，依據所望亦可含有其他成分。例如將L-羥脯胺酸補強用組成物作為食品添加劑使用時，亦含有使用於食品的公知添加劑1種或2種以 上。
本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物，例如亦可作為化妝料添加劑適用。將L-羥脯胺酸補強用組成物作為化妝料添加劑使用時，該組成物中亦可含有解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物，該菌體、菌體培養物或這些萃取物的含量可為100重量%，依據所望，亦可含有使用於化妝料之公知添加劑1種或2種以上。
本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物的製造方法以含有將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟為佳。含有如此步驟的L-羥脯胺酸補強用組成物之製造方法亦包含於本發明。上述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物之製造方法及其較佳態樣與上述L-羥脯胺酸的製造方法及其較佳態樣相同。本發明之L-羥脯胺酸補強用組成物的製造方法，依據所望，亦可含有於酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物添加公知食品添加劑、化妝料添加劑等步驟。
本發明之其他態樣的L-羥脯胺酸之製造方法含有將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養後，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟。
對於本發明之另一態樣的製造方法，上述氮源以包含 含有L-羥脯胺酸的蛋白質或含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。
對於本發明之其他態樣的製造方法，上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質為膠原性蛋白質，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。對於本發明之其他態樣的製造方法，上述膠原性蛋白質及膠原肽之平均分子量以1000~100000為佳。對於本發明之其他態樣的製造方法，上述液體培養基中之氮源的濃度為0.25~5重量%，碳源(C)與氮源(N)的重量比(C/N)以0.5~20為佳。又，上述好氣培養時間較佳為進行10~100小時。
本發明之其他態樣的使用為含有使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)於製造L-羥脯胺酸的用途，將上述酵母藉由在含有碳源及氮源之液體培養基中進行好氣培養，於上述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，上述氮源為具有含有L-羥脯胺酸的蛋白質或含有L-羥脯胺酸之肽者為佳。
對於本發明之其他態樣的使用，上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質為膠原性蛋白質，上述含有L-羥脯胺酸之肽以膠原肽為佳。對於本發明之其他態樣的使用，上述膠原性蛋白質及膠原肽的平均分子量以1000~100000為佳。
對於本發明之其他態樣的使用，上述液體培養基中之氮源的濃度為0.25~5重量%，碳源(C)與氮源(N)的重量比(C/N)以0.5~20為佳。又，上述好氣培養以進行10~100小時為佳。
作為上述含有L-羥脯胺酸的蛋白質，可舉出 上述膠原性蛋白質。膠原性蛋白質等含有L-羥脯胺酸的蛋白質之平均分子量較佳為超過10000，100000以下。蛋白質之平均分子量表示重量平均分子量。膠原性蛋白質等含有L-羥脯胺酸的蛋白質之平均分子量可藉由凝膠過濾等算出。
[實施例]
以下表示更具體說明本發明之試驗例等。且本發明並未僅限定於此等試驗例等。試驗例中若無特別說明，「%」表示「重量%」。
試驗例中，使用於製作標準曲線的L-羥脯胺酸(Hyp)標準溶液之調製中，使用Nakarai Tesque股份有限公司製的L-4-羥脯胺酸。於L-脯胺酸(Pro)標準溶液之調製中，使用Nakarai Tesque股份有限公司製的L-脯胺酸。在試驗例所測定的L-羥脯胺酸及L-脯胺酸皆為游離的L-羥脯胺酸及L-脯胺酸。
在試驗例中所使用的培養基皆為液體培養基。在試驗例中所使用的YPD培養基若無特別說明，Y：P：D為1：2：2(重量比)(Y：酵母萃取物1.0%、P：蛋白腖2.0%、D：葡萄糖2.0%)。
使用於培養基調製的酵母萃取物為Bacto公司製的製品名Yeast Extract(#212750)。蛋白腖為使用Bacto公司製的製品名Pepton(#211677)，牛的細胞經來自豬的胰臟之酵素經分解者。
試驗例中，培養開始前之培養基的pH約6.5~8.5。
<試驗例1> 累積L-羥脯胺酸(以下稱為Hyp)的酵母之篩選
使用表1所示的60株酵母，進行將Hyp累積在培養物中之酵母的篩選。表1表示各菌株之屬種名。
Figure 106115851-A0202-12-0038-1
在以下條件下，在YPD培養基培養酵母後， 以HPLC定量Hyp。
(培養)
於添加0.5%L-脯胺酸(以下稱為Pro)的YPD培養基1mL中，接種各菌株1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)後，在室溫進行4~7天靜置培養後得到酵母之菌體培養液(菌體培養物)。
(樣品調製)
對於酵母之菌體培養液進行以下處理，調製出培養物樣品，測定Hyp含量。
進行上述培養後並集菌，將菌體以1mL的生理食鹽水洗淨。將菌體懸浮於0.2mL的50mM鉀磷酸緩衝液(以下稱為KPB)(pH6.0)並煮沸10分鐘，藉由自體溶解溶離菌體內容物(煮沸法)。由所得之菌體萃取物藉由離心分離(14000rpm、5min、4℃)除去菌體殘渣。藉此，調製出欲測定Hyp累積量之培養物樣品。
將培養物樣品使用Waters公司的(AccQ-Fluor Reagent Kit)，藉由AccQTag法進行衍生物化，並在以下條件下以HPLC定量Hyp。
使用於HPLC分析的裝置及條件如以下所示。
(裝置)
高速液體色譜儀：Prominence((股)島津製作所)
管柱：XBridge C18 5μm(2.1 x 150mm、Waters公司 製)
(測定條件)
溶離液A：乙酸銨(10mM、pH5)
溶離液B：甲醇(0~0.5min.(0%→1%)，0.5~18min.(1%→5%)，18~19min.(5%→9%)，19~29.5min.(9%→17%)，29.5~40min.(17%→60%)，40~43min.(60%))
流速：0.3mL/min
溫度：40℃
檢測：螢光檢測器(激起波長：250nm，檢測波長：395nm)
溶離液B的濃度(%)為v/v%。
結果如圖1所示。
圖1表示酵母的Hyp累積量之圖表。圖1的縱軸(Hyp(μg/mL))為培養物樣品1mL單位的Hyp(μg)。
由上述試驗伐現累積Hyp之酵母。特別以Yarrowia lipolytica的Hyp累積量為多。
<試驗例2>
對於酵母Yarrowia lipolytica，藉由培養基調查Hyp累積量是否變化。使用Yarrowia lipolytica NBRC0717，使用以下液體培養基。Yarrowia lipolytica NBRC0717係由獨立行政法人製品評估技術基礎機構(日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)獲得。
YPD(1%酵母萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖)
YTD(1%酵母萃取物、2%胰蛋白腖、2%葡萄糖)
YM(0.3%酵母萃取物、0.3%麥芽萃取物、0.5%蛋白腖、2%葡萄糖)
PD(0.4%馬鈴薯萃取物、2%葡萄糖)
SD(合成培養基、1%葡萄糖)
(前培養及主要培養) (1)條件1
於添加0.5%Pro的YPD培養基1mL中，將Yarrowia lipolytica NBRC0717接種1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)後得到前培養液。
於添加0.5%Pro的各培養基(上述YPD、YTD、YM、PD或SD)2mL中，接種前培養液0.2mL，在28℃進行36小時振盪培養(300rpm)後得到Yarrowia lipolytica之菌體培養液。
(2)條件2
取代添加0.5%Pro的YPD培養基，使用添加0.5%Pro的SD培養基以外，與條件1相同條件下進行前培養。於添加0.5%Pro的各培養基(上述YPD、YTD、PD或SD)2mL，接種前培養液0.2mL，在28℃進行45小時振盪培養(300rpm)後得到Yarrowia lipolytica之菌體培養液。
(樣品調製)
條件1或2的培養後，於酵母之菌體培養液進行以下處理，調製出培養物樣品，測定Hyp含量。
上述培養後集菌，將菌體以1mL的生理食鹽水洗淨。將菌體懸浮於0.2mL的50mM KPB(pH6.0)，進行10分鐘煮沸，藉由自體溶解溶離菌體內容物(煮沸法)。所得之菌體萃取物藉由離心分離(14000rpm、5min、4℃)除去菌體殘渣。藉此，調製出欲測定Hyp累積量的培養物樣品。
(Hyp定量)
將培養物樣品藉由o-酞醛(OPA)及4-氯-7-硝基苯並呋咱(NBD-C1)進行衍生物化，以HPLC定量Hyp。
(衍生物化方法) 藉由4-Chloro-7-nitrobenzofurazan(NBD-C1)進行衍生物化
注入0.4M硼酸鉀緩衝液(pH9.5)50μL，加入培養物樣品2μL。加入並混合300mM OPA(Wako 167-09263)(溶解於甲醇)2μL，在37℃進行20分鐘反應後，加入並混合2mM NBD-C1(Sigma25455)(溶解於甲醇)50μL，於在37℃進行20分鐘反應的液體中，加入25μL的1N HCl、50%甲醇75μL，以14000rpm進行5分鐘離心的澄清液 作為HPLC測定用之樣品，移至HPLC用之樣品瓶。
使用於HPLC分析的裝置及條件如以下所示。
管柱：XBridge C18 column(5μm；2.1mm×150mm；Waters)
A液：10mM乙酸銨(pH5.0)
B液：甲醇
梯度：
0~0.5分：B.Conc 0v/v%→1v/v%
0.5~18分：B.Conc 1v/v%→5v/v%
18~19分：B.Conc 5v/v%→9v/v%
19~29.5分：B.Conc 9v/v%→17v/v%
29.5~40分：B.Conc 17v/v%→60v/v%
40~43分：B.Conc 60v/v%
流速：0.3mL/分
管柱溫度：40℃
檢測器：螢光檢測器，激起波長503nm/螢光波長541nm
注入量：10μL
標準曲線為調製Hyp之5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、250μmol/L的50mM KPB(pH6.0)溶液而作成。
結果如圖2所示。圖2表示在各培養基進行培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖表((a)：條件1、(b)：條件2)。圖2的縱軸之Hyp(μg/mL)表示培 養物樣品1mL單位的Hyp(μg)。在條件1之培養中，於在YPD及YM培養基進行培養的菌體累積多數羥脯胺酸(含有蛋白腖之培養基)。在條件2之培養中，於在YPD培養基進行培養的菌體累積Hyp。
<試驗例3>
調查藉由培養日數之累積量變動。
將Yarrowia lipolytica的NBRC1551株、NBRC0717株、NBRC0746株及NBRC1195株各在YPD培養基進行1日、2日或3天培養後，自酵母之菌體(細胞)經溶離的Hyp使用HPLC進行定量。以NBRC號碼特定的這些酵母可由獨立行政法人製品評估技術基礎機構(日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)獲得。
(前培養)
於YPD培養基1mL，將各菌株接種1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)得到前培養液。
(主要培養)
於YPD培養基2mL中，接種前培養液0.2mL，在28℃進行1~3天振盪培養(300rpm)得到菌體培養液。
(樣品調製及胺基酸定量)
以與試驗例2相同方法調製出培養物樣品，藉由OPA 及NBD-C1進行衍生物化。
在與試驗例2相同條件下藉由HPLC進行分析，定量Hyp及Pro。Pro的標準曲線係由調製Pro之5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、250μmol/L之50mM KPB(pH6.0)溶液而作成。
將各培養物樣品之Pro及Hyp量表示於表2。又，由Pro及Hyp之測定值，計算初隊於Pro及Hyp之合計含量(μg/mL)的Hyp之含量(μg/mL)的比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))。其結果亦如表2所示。
Figure 106115851-A0202-12-0045-2
Yarrowia lipolytica為藉由培養累積L-羥脯胺酸。所得之菌體培養物為含有L-羥脯胺酸。又，(Hyp/(Pro+Hyp))比例為35以上。
<試驗例4>
檢討Yarrowia lipolytica的明膠資化性。使用Yarrowia lipolytica之NBRC1551株、NBRC0717株及NBRC0746株， 再添加PD培養基或0.125%明膠的PD培養基進行5天培養，自菌體將菌體內容物溶離，將Hyp藉由HPLC進行定量。PD培養基為使用在試驗例2使用的相同培養基。
(前培養)
於PD培養基1mL，接種各菌株1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)後得到前培養液。
(主要培養)
於添加PD培養基或0.125%明膠(和光純藥工業(股)製之製品名明膠)的PD培養基2mL中，接種前培養液0.2mL，在28℃進行5天振盪培養(300rpm)後得到菌體培養液。
(樣品調製及Hyp定量)
培養物樣品之調製及Hyp定量進行與試驗例2之相同方法。結果如圖3所示。
圖3表示在PD培養基或添加0.125%明膠的PD培養基進行5天培養的Yarrowia lipolytica的Hyp累積量圖表(白：含有0.125%明膠之PD培養基(PD+gel)、黑：PD培養基)。縱軸之Hyp(μg/mL)為培養物樣品1mL單位的Hyp(μg)。由圖3得知，若直接添加高分子明膠於培養基時，Hyp的累積與試驗例3相比較為少。
<試驗例5>
使用Yarrowia lipolytica NBRC0717，藉由YPD培養基組成檢討Hyp累積量是否變化。於表3表示#1~#12的各培養基之YPD組成。表3中，Y為酵母萃取物，P為蛋白腖，D為葡萄糖。將酵母萃取物(Y)設定為一定，使蛋白腖(P)及葡萄糖(D)變化(表中之數值為終濃度(重量%))。
Figure 106115851-A0202-12-0047-4
(前培養)
於各YPD培養基1mL接種Yarrowia lipolytica NBRC0717之1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)後得到前培養液。
(主要培養)
於各YPD培養基2mL，接種前培養液0.2mL，在28℃進行4天振盪培養(300rpm)後得到菌體培養液。
(樣品調製及Hyp定量)
培養物樣品之調製及Hyp定量進行與試驗例2之相同方 法。
在上述YPD培養基所培養的酵母Yarrowia lipolytica為累積Hyp。在#1及#7~11的培養基中進行培養時，Hyp累積量為多。在#1及#7~11的培養基進行培養時的結果如圖4所示。
圖4表示在組成相異的YPD培養基進行培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖表((a)：Hyp累積量(μg/mL)、(b)：每細胞之Hyp量(μg/mL/OD600))。圖4之(a)的縱軸為培養物樣品1mL單位的Hyp(μg)。圖4之(b)的縱軸之(Hyp/OD)為每細胞之Hyp量，將培養物樣品1mL中之Hyp量(μg)除以OD600的測定值之值(μg/mL/OD600)。
OD600為使用核酸蛋白質分光光度計(裝置名Bio spec mini，(股)島津製作所)，將使用於培養物樣品的調製之菌體培養液60μL以超純水1150μL稀釋，測定吸光度(600nm)
<試驗例6>
對於在試驗例5所使用的YPD培養基#1及#10，將作為P使用的蛋白腖取代為膠原肽(新田明膠公司製的製品名超級膠原肽SCP-2000，來自豬，平均分子量2000)，調查Hyp之累積量。酵母為使用Yarrowia lipolytica NBRC0717。對於YPD培養基，將蛋白腖之一部分或全部取代為膠原肽的培養基亦稱為YPD改變培養基。
YPD培養基之P的組成
基本：蛋白腖100%
CP50：蛋白腖50% 膠原肽50%
CP100：膠原肽100%
培養基組成
(1)YPD#1-基本(YPD#1)
(2)YPD#1-CP50(對於YPD#1，取代蛋白腖使用CP50)
(3)YPD#1-CP100(對於YPD#1，取代蛋白腖使用CP100)
(4)YPD#10-基本(YPD#10)
(5)YPD#10-CP50(對於YPD#10，取代蛋白腖使用CP50)
(6)YPD#10-CP100(對於YPD#10，取代蛋白腖使用CP100)
(前培養)
於YPD培養基1mL，接種Yarrowia lipolytica NBRC07171接種環量，在28℃進行24小時振盪培養(300rpm)後得到前培養液。
(主要培養)
於上述(1)~(6)之各培養基2mL中，接種前培養液0.1mL，在28℃進行4天振盪培養(300rpm)後得到菌體培養液。
(樣品調製及Hyp定量)
培養物樣品之調製及Hyp定量進行與試驗例2之相同方法。
結果如圖5所示。
圖5表示在含有蛋白腖或膠原肽之培養基中進行培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量、每細胞之Hyp量及OD600之圖表。((a)：Hyp累積量(μg/mL)、(b)：每細胞之Hyp量(μg/mL/OD600)、(c)：OD600)。圖5之(a)~(c)中，N表示P為基本之培養基，50表示P為CP50之培養基，100表示P為CP100之培養基。即使將蛋白腖完全由膠原肽的培養基中，亦可增殖Yarrowia lipolytica，累積Hyp。
<試驗例7>
使用Yarrowia lipolytica NBRC0717，檢討培養時之摻氣的影響。培養基為使用試驗例5之YPD培養基#1及#10。
(前培養)
於YPD培養基1mL，接種Yarrowia lipolytica NBRC0717之1接種環量，在28℃進行24小時振盪培養 (300rpm)後得到前培養液。
(主要培養)
於各YPD培養基(#1或#10)2mL，接種前培養液0.1mL，在28℃進行3天振盪培養(300rpm)或靜置培養後得到菌體培養液。
(樣品調製及Hyp定量)
培養物樣品之調製及Hyp定量進行與試驗例2之相同方法。又，對於培養澄清液亦藉由與培養物樣品之相同方法進行衍生物化，以HPLC定量Hyp。
結果如圖6所示。
圖6表示進行振盪培養或靜置培養的Yarrowia lipolytica之Hyp累積量圖((a)：培養物樣品(細胞內)的培養基單位換算Hyp量、(b)：培養澄清液中之Hyp量)。
Yarrowia lipolytica若進行好氣培養時Hyp累積量較多。
<試驗例8>
將在試驗例7所得之培養澄清液中的乙醇濃度及葡萄糖濃度以HPLC(使用發酵管柱(Bio‧Rudd公司製之製品名Aminex發酵監控器用管柱))進行定量。
結果如圖7所示。
圖7表示進行振盪培養或靜置培養的Yarrowia lipolytica之培養澄清液的乙醇濃度及葡萄糖濃度圖表((a)：乙醇濃度(v/v%)、(b)：葡萄糖濃度(重量%))。
<試驗例9>
對於Yarrowia lipolytica NBRC0717，改變YPD培養基之組成(Y：P：D之比率及P之種類)及培養時間而進行主要培養，測定菌體培養物中之Hyp含量及Pro含量。
(前培養)
於YPD培養基3mL，接種Yarrowia lipolytica NBRC0717之1接種環量，在30℃進行1日靜置培養後得到前培養液。
(主要培養)
將在上述所得之前培養液100μL，接種下述YPD培養基5mL後在30℃進行振盪培養(60rpm)。培養時間為1日或2日後得到菌體培養液(菌體培養物)。
在主要培養，作為YPD培養基之P，使用蛋白腖或膠原肽(CP)。對於膠原肽，使用膠原肽Ikos HDL-50SP(製品名之新田明膠(股)製之平均分子量5000)(以下記載為膠原肽(CP1))或膠原肽Type S(製品名之新田明膠(股)製之平均分子量1200)(以下記載為膠原肽 (CP2))。
又，對於主要培養中之YPD培養基的Y：P：D之比率為(1)Y：P：D=1：2：2(重量比)(Y：酵母萃取物1.0%、P：蛋白腖或膠原肽2.0%、D：葡萄糖2.0%)或(2)Y：P：D=1：4：5(重量比)(Y：酵母萃取物1.0%、P：蛋白腖或膠原肽4.0%、D：葡萄糖5.0%)。表4表示在主要培養所使用的培養條件1~12。
Figure 106115851-A0202-12-0053-5
於在主要培養所得之Yarrowia lipolytica的菌體培養液中，進行以下自體溶解步驟及殺菌步驟後調製出培養物樣品，測定Hyp含量。
(自體溶解步驟)
將Yarrowia lipolytica的菌體培養液在50℃進行2小時恆溫培養，藉由自體溶解將菌體內容物溶離於培養液中。
(殺菌步驟)
將在上述進行自體溶解的培養液在80℃進行1小時恆溫培養。
由所得之萃取物藉由離心分離(3000rpm、5min、1℃)，除去菌體殘渣。藉此，調製出欲測定Hyp累積量之培養物樣品。
(樣品調製)
將所得之培養物樣品以0.1N鹽酸溶液稀釋，調製出HPLC之樣品。由培養時間1日的菌體培養液所調製的培養物樣品稀釋10倍，由培養時間2日的菌體培養液所調製的培養物樣品除條件12以外稀釋40倍，條件12為稀釋20倍。
(HPLC分析)
在HPLC中，以自動取樣器進行1級胺基酸(1級胺基)、2級胺基酸(2級胺基)的螢光標識化，使用藉由逆相之HPLC進行分析的系統。於1級胺基之螢光標識，使用o-酞醛(OPA)，於2級胺基之螢光標識，使用氯甲酸-9-芴基甲基(FMOC)。
將以上述所調製的HPLC之樣品於樣品瓶以0.45μm的濾器進行過濾，設定在自動取樣器。於空樣品瓶放入MPA(巰基丙酸)試藥30μL、OPA試藥15μL、上述樣品5μL，經1分鐘靜置後，加入FMOC試藥5μL，並使其反應2分鐘，將該溶液1μL注入於HPLC。OPA與1級胺基酸經反應，殘留的具有2級胺基的Hyp及Pro與FMOC進行反 應。將各螢光波長在2頻道進行檢測後，可同時檢測所有胺基酸。
使用於HPLC分析的裝置及條件如以下所示。
(裝置) (股)島津製作所製的高速液體色譜儀Nexera X2系統(製品名)
系統控制器：CBM-20A、送液單位：LC-30AD(2台)、脫氣單位：DGU-20A5R、攪拌器：MR180μL II、自動取樣器：SIL-30AC、管柱烤箱：CTO-20AC、螢光檢測器：RF-20AXS、Work station：LabSolutions LC/GC
(測定條件)
管柱：Inertsil ODS-4 100mm×3.0mm
Figure 106115851-A0202-12-0055-25
S-2μm(GL Sciences(股))
保護管柱：UHPLC Fitting(製品名、GL Sciences(股))(Max.Pressure：130MPa)
移動相
A液：15mmol/L KH2PO4及5mmol/L K2HPO4(pH6.5)
B液：15/45/40(v/v/v)=水/乙腈/甲醇
R0(潤髮精液)：水/甲醇=20/80(v/v)
R3(潤髮精液)：水/乙腈=80/20(v/v)
初期B液濃度：10v/v%
流量：0.8mL/min
管柱烤箱溫度：35℃
注入量：1μL
檢測：
Ch1：激起波長350nm、螢光波長450nm
Ch2：激起波長266nm、螢光波長305nm
容器溫度：25℃、Gain：×4、Sensitivity：Midium
梯度程序
0~1.5分：B.Conc 10v/v%
1.5~6分：B.Conc 10v/v%→30v/v%的梯度
6~11分：B.Conc 30v/v%→40v/v%的梯度
11~15分：B.Conc 100v/v%
20~21.5分：B.Conc 100v/v%→10v/v%
25分：控制器停止
標準曲線：對於各Hyp及Pro，調製出6.25μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L之0.1N HCl溶液。將這些各溶液以上述方法與MPA、OPA及FMOC之各試藥進行反應，以HPLC進行分析後畫出標準曲線。
對於胺基酸混合標準液H型溶液及含有L-羥脯胺酸的0.1N鹽酸溶液，亦同樣地與各試藥進行反應並以HPLC分析。所使用的胺基酸混合標準液H型為和光純藥工業(股)製。
圖8表示分析胺基酸混合標準液H型及含有L-羥脯胺酸的0.1N鹽酸溶液(各胺基酸濃度20μmol/L)之HPLC圖表((a)：在Ch1之激起波長350nm、螢光波長 450nm下檢測、(b)：在Ch2之激起波長266nm、螢光波長305nm下檢測)。
培養物樣品的Hyp及Pro之定量結果如表5所示。表中，CP1為上述膠原肽(CP1)(製品名膠原肽Ikos HDL-50SP)，CP2為膠原肽(CP2)(製品名膠原肽Type S)。由Hyp及Pro的定量結果，計算對於各培養物樣品中之Pro及Hyp的合計含量之Hyp的含量比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))。該結果亦表示於表5。表的培養條件為主要培養條件。且，於培養開始前之各培養基中幾乎未含有游離之Hyp。
Figure 106115851-A0202-12-0058-6
<試驗例10> (前培養)
於YPD培養基3mL中接種Yarrowia lipolytical接種環量，在28℃進行1日振盪培養(100rpm)後得到前培養液。
(主要培養)
於培養基使用YPD改變培養基(酵母萃取物1.0%、膠原肽(CP1)2.0%、葡萄糖1.0%)，在28℃進行2天的振盪培養(200~500rpm)以外，以與試驗例9之相同方法進行主要培養。膠原肽(CP1)係與試驗例9相同者。
於在主要培養所得之Yarrowia lipolytica的菌體培養液中，以與試驗例9之相同方法進行自體溶解步驟及殺菌步驟等後調製出培養物樣品。以與試驗例9之相同方法，測定Hyp含量及Pro含量。試驗在n=4進行。結果如表6所示
Figure 106115851-A0202-12-0059-7
<試驗例11>
使用在試驗例1~10使用的Yarrowia lipolytica，以與 試驗例9~10之相同方法進行培養，得到菌體培養液。將此在50℃進行2小時恆溫培養後，藉由自體溶解將菌體內容物溶離於培養液中後，在80℃進行1小時恆溫培養。其後，在1℃進行離心分離(3000rpm、5min)，除去菌體殘渣後得到含有L-羥脯胺酸的菌體培養物之萃取物(含有Hyp的菌體培養物之萃取物)。含有Hyp的菌體培養物之萃取物可適宜稀釋後使用。
以下表示添加在試驗例11所得的各含有Hyp的菌體培養物之萃取物的皮膚外用劑組成物之一製造例。
<製造例1>肥皂
原料的配合量如表7所示。
將肥皂原料混合攪拌，其後將各含有Hyp的菌體培養物之萃取物投入並均勻地混合後成型。
Figure 106115851-A0202-12-0060-8
<製造例2>洗髮精
原料的配合量如表8所示。
於純化水中投入溶解於1,3-丁二醇的防腐劑。經均勻攪拌後，投入月桂基醚硫酸鈉、椰子油脂肪酸單乙醇醯 胺，其後投入色素、香料及殘留的1,3-丁二醇，投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物後，均勻地混合攪拌。
Figure 106115851-A0202-12-0061-9
<製造例3>護髮素
原料的配合量如表9所示。
(1)將氯化硬脂基二甲基苯甲基銨及食鹽投入於純化水中，加熱至80℃而溶解。
(2)加溫鯨蠟硬脂基醇、氫化聚異丁烯及甘油單硬脂酸酯至80℃並溶解。
(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌一邊添加(2)，添加後進行5分鐘預備攪拌。
(4)預備攪拌終了後，一邊攪拌至50℃一邊冷卻，添加各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，在攪拌冷卻至35℃而調製。
Figure 106115851-A0202-12-0062-10
<製造例4>頭髮營養劑(Hair tonic)
原料的配合量如表10所示。
於純化水投入水楊酸、甘油、溶解於乙醇之維他命E、L-薄荷醇，再投入溶解於純化水的一部分的甘草酸二鉀後，投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，均勻地混合後調製。
Figure 106115851-A0202-12-0062-11
<製造例5>噴霧劑
原料的配合量如表11所示。
於純化水中投入檸檬酸及檸檬酸鈉後溶解。其後投入溶解於乙醇的防腐劑及聚山梨酯80。其後投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物並均勻地攪拌並調製。
Figure 106115851-A0202-12-0063-12
<製造例6>化妝水
原料的配合量如表12所示。
於純化水投與檸檬酸及檸檬酸鈉並溶解。其次，依序投與甘油、1,3-丁二醇及乙二胺四乙酸三鈉，進一步投入溶解於乙醇的聚氧乙烯(18)油基醇醚、維他命E及對羥基苯甲酸甲酯並攪拌至均勻。其後投入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物後均勻地攪拌並調製。
Figure 106115851-A0202-12-0064-13
<製造例7>乳液
原料的配合量如表13所示。
(1)將硬脂酸、十六醇、肉荳蔻酸辛基十二烷基及流動石蠟加溫至80℃並溶解。
(2)將三乙醇胺、玻尿酸鈉、甘油、1,3-丁二醇、聚氧乙烯(10)單油酸酯及乙二胺羥基三乙酸鈉投入於純化水中並加溫至80℃。
(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌一邊投入(2)，投入後進行5分鐘預備攪拌。
(4)預備攪拌終了後冷卻至50℃，加入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，進一步冷卻至35℃並調製。
Figure 106115851-A0202-12-0065-14
<製造例8>乳霜
原料的配合量如表14所示。
(1)加溫硬脂酸、單硬脂酸甘油基、半倍硬酯酸山梨糖醇、單硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇、鯨蠟硬脂基醇、角鯊烷、六(羥基硬脂酸/硬脂酸/松香酸)雙季戊四醇、橄欖油、肉荳蔻酸辛基十二烷基及甲基聚矽氧烷至80℃並溶解。
(2)於純化水中投入甘油、1,3-丁二醇、氫氧化鈉及對羥基苯甲酸甲酯，加溫至80℃並溶解。
(3)將(1)以均質混合器一邊攪拌一邊投入(2)，投入後進行5分鐘預備攪拌。
(4)預備攪拌終了後，冷卻至50℃，加入各含有Hyp的菌體培養物之萃取物，在冷卻至35℃後調製。
Figure 106115851-A0202-12-0066-15
[產業上可利用性]
本發明之含有L-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物及這些萃取物作為化妝料、飲食品等原料為有用。

Claims (21)

  1. 一種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為前述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，含有L-羥脯胺酸，對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)之合計含量(μg/mL)而言L-羥脯胺酸之含量(μg/mL)的比例(100×Hyxp/(Pro+Hyp))為35~100，前述萃取物為，對於菌體或菌體培養物進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述前述菌體破碎物除去菌體殘渣者。
  2. 如請求項1之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其中L-羥脯胺酸的含量為10μg/mL以上。
  3. 一種酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之菌體、菌體培養物或這些萃取物，其特徵為L-羥脯胺酸之含量為10μg/mL以上，前述萃取物為，對於菌體或菌體培養物進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述前述菌體破碎物除去菌體殘渣者。
  4. 一種L-羥脯胺酸的製造方法，其特徵為含有藉由將解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在含有碳源及氮源之液 體培養基中進行好氣培養，於前述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸的步驟，前述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。
  5. 如請求項4之製造方法，其中前述含有L-羥脯胺酸之肽為膠原肽。
  6. 如請求項5之製造方法，其中前述膠原肽之平均分子量為1000~10000。
  7. 如請求項4~6中任一項之製造方法，其為進行10~100小時的前述好氣培養。
  8. 一種使用於製造L-羥脯胺酸的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之用途。
  9. 如請求項8之用途，其中含有將前述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)藉由在含有碳源及氮源的液體培養基中進行好氣培養，於前述酵母之菌體或菌體培養物中累積L-羥脯胺酸，前述氮源為包含含有L-羥脯胺酸之肽的氮源。
  10. 如請求項9之用途，其中前述含有L-羥脯胺酸之肽為膠原肽。
  11. 如請求項10之用途，其中前述膠原肽之平均分子量為1000~10000。
  12. 如請求項9~11中任一項之用途，其為進行10~100小時的前述好氣培養。
  13. 一種含有如請求項1~3中任一項之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物之組成物。
  14. 一種飲食品，其特徵為含有如請求項1~3中任一項之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
  15. 一種化妝料或化妝料原料，其特徵為含有如請求項1~3中任一項之酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物。
  16. 如請求項15之化妝料或化妝料原料，其為使用於選自膠原產生促進、表皮細胞之增殖促進、皮膚之保濕、皮膚之老化防止、皮膚鬆弛之預防或改善、皮膚彈性之改善、皺紋之預防或改善及異位性皮膚炎之改善的用途上。
  17. 如請求項15或16之化妝料或化妝料原料，其中前述化妝料或化妝料原料為化妝料原料，L-羥脯胺酸含量為5~300ppm。
  18. 如請求項15或16之化妝料或化妝料原料，其中前述化妝料或化妝料原料為化妝料，L-羥脯胺酸含量為0.01~20ppm。
  19. 一種L-羥脯胺酸補強用組成物，其特徵為包含含有L-羥脯胺酸之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的菌體、菌體培養物或這些萃取物，前述萃取物為，對於菌體或菌體培養物進行菌體破碎處理的菌體破碎物，或自前述前述菌體破碎物除去菌體殘渣者。
  20. 如請求項19之L-羥脯胺酸補強用組成物，其中前述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物對於L-脯胺酸(Pro)及L-羥脯胺酸(Hyp)的合計含量(μg/mL)而言，L-羥脯胺酸的含量(μg/mL)之比例(100×Hyp/(Pro+Hyp))為35~100。
  21. 如請求項19或20之L-羥脯胺酸補強用組成物，其中前述酵母之菌體、菌體培養物或這些萃取物的L-羥脯胺酸之含量為10μg/mL以上。
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