JP6430408B2 - ケウインの化粧料使用 - Google Patents

Description

本発明は、化粧料の分野、特に皮膚及び皮膚付属器官の老化を予防又はこれに対抗する製品に関する。

背景技術
皮膚は、保護組織及び交換境界部として、生涯にわたり速やかに再生される。時間の経過に伴い、皮膚の老化が必然的に引き起こされる。環境からの複数の攻撃の結果、早期老化も起こり得る。外的環境との境界面として、皮膚は絶えず、温度変化、湿度、光、汚染などといったあらゆる種類の物理化学的攻撃に起因した損傷を受ける。皮膚細胞は年を重ね、老化し、約８０回分裂した後に死に至る。このプロセス全体にわたり、皮膚はその厚さ及び弾力性を失ってしわの発生を招くが、特に日中の紫外線照射に対する、その保護の役割もまた失ってしまう。さらに、むらのある色素沈着（年齢によるしみ）も現れる可能性がある。

皮膚の老化の分子的な原因には、皮膚のコンパートメントすべてが関わっている。他の組織におけると同様、ストレスによって誘導されるいくつかのタンパク質、特に、タンパク質の好適な折り畳みを可能とし、かつこの折り畳みの欠陥を正すシャペロンタンパク質、及び化学的に劣化したタンパク質又は折り畳みに誤りのあるタンパク質を分解するプロテアーゼが、中心的な保護の役割を果たす。翻訳及び折り畳みのプロセスは、細胞が年を重ねるにつれ徐々にその効率が低下してしまい、これにより、偶発的な酸化的修飾及び糖化への感応性の惹起及び増大という結果を招く。活性酸素種は、アミノ酸（特にシステイン、ヒスチジン、メチオニン、チロシン及びトリプトファン）及びタンパク質骨格を変化させる。それらはまた、新しいタンパク質の合成へと導くプロセスを上流で損なわさせる事態も引き起こす。

老化プロセスの間のタンパク質凝集体の蓄積は、細胞タンパク質の質を制御している機構を次第に埋没させてしまう。皮膚のこのような老化は、上皮及び真皮の両層での細胞外基質の分解を伴い、目に見える老化の徴候を皮膚の表面上に残し、またその物理的特性を変えてしまう。

総括的な結果として、全タンパク質の凝集、及び正常な酵素活性の低下もたらされ、むらのある乾燥、むらのある色素沈着、深いしわ、蝋様及び／又は羊皮紙的な顔貌、皮膚のたるみ、などの目に見える徴候に至ることになる。

三つのプロセス、すなわち、新合成、修復及び分解とそれに続く再合成で、細胞は老化を克服することが可能になる。より長期間にわたると、後の二つのプロセスで細胞の若返りが可能になるので、これらが必須である。

したがって、皮膚の老化に対抗する新規な化粧ケア製品に対する必要性及び要望が現存している。

発明の概要
非常に意外なことに、ストレスで皮膚が不可避的に受ける有害な効果が、ケウインを外的に供給すると収拾され、これにより老化の徴候の開始が遅延することを、本発明者らは発見している。ケウインは、細胞維持に著しく寄与する。ケウインは、繰り返される複数のストレスに対する保護効果を有している。より具体的には、本発明は、細胞にケウインを供給することによって、タンパク質再合成のプロセスを至適化することの必要性に焦点を当てている。実際に、この分子はタンパク質合成の至適な遂行に必要であり、そして身体はこの分子を生成することができない。本発明の背景において、ケウインの外的な供給は驚くべきことに、皮膚細胞の耐性に寄与することが見出されている。本発明はしたがって、ケウイン、その前駆体又は誘導体を有効成分として含む化粧料組成物に関する。より具体的には、本発明の主題は局所適用のための化粧料組成物である。

本発明はまた、化粧料組成物の有効成分としてのケウイン、その前駆体又は誘導体の使用、そして最も詳細には局所適用のための化粧料組成物に関する。

本発明のさらなる主題は、皮膚及び／又は皮膚付属器官の老化の徴候を低減又は予防する有効成分としての、ケウイン、又はその前駆体若しくは誘導体の化粧料使用である。皮膚付属器官とは、好ましくは毛髪及び爪を意味する。

本発明の使用又は組成物は、最も詳細には、皮膚のしわ及びすじ及び／又はたるみ、並びに／或いは皮膚の弾力性及び／又は緊張度の不足、並びに／或いは皮膚の薄化、並びに／或いは蝋様並びに／又は羊皮紙様の顔貌、並びに／或いは皮膚の肌理のむら及び年齢によるしみなどの色素沈着のむらを、低減又は予防することが意図されている。

本発明はまた、化粧料組成物のいくつか又はすべての成分に、ケウイン、その前駆体又は誘導体を加えることと、得られた化粧料組成物を回収することとを含む、化粧料組成物を調製する方法にも関する。

本発明はまた、本発明に係る化粧料組成物を皮膚及び／又は皮膚付属器官に適用することを含む、皮膚及び／又は皮膚付属器官の老化の徴候を予防及び／又は治療する、化粧的処置方法にも関する。

一つの具体的な実施形態において、前記ケウイン、その前駆体又は誘導体は、ケウイン、ケウオシン、エポキシケウオシン及びエポキシケウインからなる群より選択される。これらの誘導体として、マンノシルケウイン、ガラクトシルケウインなどの、ケウイン及びケウオシンのグリコシル化誘導体、並びにグルタミルケウインなどのアミノアシル化誘導体が挙げられる。ケウイン、その前駆体又は誘導体は、精製された形態であっても、又は細菌エキス若しくは植物エキス又は樹液の形態であってもよく、前記エキス又は前記樹液は、ケウイン、その前駆体若しくは誘導体に富んでいるか、又は富化されている。一つの特に好ましい実施形態において、化粧料組成物はケウインを含む。

好ましくは、ケウイン、その前駆体又は誘導体は、化粧料組成物１ml又は１ｇあたり０．１μg〜１００μg、好ましくは化粧料組成物 １ml又は１ｇあたり０．５〜１０μg、さらに好ましくは化粧料組成物 １ml又は１ｇあたり１〜５μgの量で化粧料組成物に含まれる。徐放性の誘導体の場合、遊離の割合が常に物理化学的遊離プロセスに即した上述の条件に適合するように、その濃度が算出される。化粧料組成物は任意に、ケウイン、その前駆体又は誘導体を化粧料組成物 １ml又は１ｇあたり少なくとも０．１μg〜１００μg、より好ましくは化粧料組成物 １ml又は１ｇあたり少なくとも０．５〜１０μg、さらに好ましくは化粧料組成物 １ml又は１ｇあたり少なくとも１〜５μgの量で含んでもよい。

化粧料組成物は、セラム（serum）、ローション剤、クリーム、ミルク、水若しくはオイルゲル、ヒドロゲル、マイクロエマルション、ナノエマルション、マスク、スティック、パッチ、オイル、軟膏、ワックス、フォーム剤、トナー、ケア液剤、香膏、ファンデーション、スプレー、アイシャドウ、痩身用クリーム、口紅、ペースト、軟膏剤又はシャンプー若しくはコンディショナーの形態で、又はケウイン及びその誘導体の使用を可能とするいかなる好適な均一若しくは不均一な形態であってもよい。

ケウイン、前駆体及びその誘導体
ケウインは、以下の化合物名：２−アミノ−５−（（（（１ｓ，４ｓ，５ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−イル）アミノ）メチル）−１，７−ジヒドロ−４ｈ−ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−４−オンでも知られている。（ＣＡＳ番号：７２４９６−５９−４）

エポキシケウインは、以下の化合物名：７−（５−［（３，４−エポキシ−２，５−ジヒドロキシシクロペント−１−イル）アミノ］メチル）−７−デアザグアニン
２−アミノ−５−（｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−６−オキサビシクロ［３．１．０］ヘキシ−２−イル］アミノ｝メチル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンでも知られている。（ＣＩＤ番号：５６９２７９０５）

ケウオシンは、以下の化合物名：２−アミノ−５−［［［（１Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−１−シクロペント−２−エニル］アミノ］メチル］−７−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−２−テトラヒドロフラニル］−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｅ］ピリミジン−４−オンでも知られている。（ＣＡＳ番号：５７０７２−３６−３）

エポキシケウオシンは、以下の化合物名：７−（５−［（３，４−エポキシ−２，５−ジヒドロキシシクロペント−１−イル）アミノ］メチル）−７−デアザグアノシン２−アミノ−５−（｛［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−６−オキサビシクロ［３．１．０］ヘキシ−２−イル］アミノ｝メチル）−７−（β−Ｄ−リボフラノシル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オンでも知られている。（ＣＩＤ番号：５６９２７８７５）

本願の文脈で、ケウインの誘導体とは、皮膚又は皮膚付属器官による使用に適合させた形態のケウインを含むあらゆる分子又は高分子をいう。特に、ケウインは遊離形態であってもよいし、又は共有結合型若しくはイオン結合型複合体の一部であってもよい。例えば、ケウインはリボースと複合してケウオシン、ガラクトシルケウオシン、マンノシルケウオシン又はグルタミルケウオシンを形成することができる。ｔＲＮＡ−ケウオシン又はケウオシンを含むオリゴヌクレオチドの形態も考えられる。これらの誘導体として、マンノシルケウイン、ガラクトシルケウインなどの、ケウイン及びケウオシンのグリコシル化誘導体、並びにグルタミルケウインなどのアミノアシル化誘導体が挙げられる。

本願の文脈で、ケウインの前駆体とは、例えばその中間部前駆体、エポキシケウインをいい、遊離の形態か、又は分子若しくは高分子との共有結合型複合体の形態にある。

ケウインの誘導体は、皮膚の表面に存在するものなどの酵素によって容易にケウインへと代謝されることのできる、化学的に修飾されたケウインであってもよい。ケウインの他の誘導体は、皮膚又は皮膚付属器官の表面に適用されて物理化学的処理（例えば天然又は人工的なＵＶ光）に付されると、ケウインを遊離する誘導体である。

好ましくは、ケウイン、その前駆体及び誘導体は、化学合成によって調製され得る。ケウインの化学合成は公知である。特に、二つの主な合成経路が報告されており（Barnett and Grubb, 2000, Tetrahedron 56, 9221-9225；Brooks et al, 2010, Tetrahedron Letters 51, 4163-4165）、当業者により実施され得る。

あるいは、ケウイン、並びにその前駆体及び誘導体は、このような分子を合成する細菌を使用して得ることができる。

したがって、ケウインは微生物、特に細菌性微生物のエキスの精製によって得ることができる。

あるいは、ケウイン、その前駆体及び誘導体は、できる限りケウイン、その前駆体又は誘導体が富化されている、細菌エキスの形態にある。

好ましくは、細菌エキスは、可食フィルミクテス（Firmicutes）細菌、好ましくはバチルス スブチリス（Bacillus subtilis）の菌株又はその近縁のバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquifaciens）、のみならず非病原性のバチルス セレウス（Bacillus cereus）、ケウイン生成ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、非病原性のスタフィロコッカス エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）及び一般に非病原性のフィルミクテスで、好ましくは食品に用いられるものの中から選択される細菌エキスである。グラム陰性細菌のうち、大腸菌（E. coli）Nissle 1917などのガンマ−プロテオバクテリア プロバイオティクス（Proteobacteria probiotics）、又はザイモモナス モビリス（Zymononas mobilis）などの食品に用いられるプロテオバクテリアが好ましい。非毒素性シアノバクテリア（cyanobacteria）、特に可食種アルスロスピラ（Arthrospira）（スピルリナ（Spirulina））もまた、好ましいケウインの供給源である。

別の実施形態では、ケウイン並びにその前駆体及び誘導体は、これら分子をそれらを取り巻く環境から抽出してきた植物より、かかる植物のケウイン含有量又は誘導体含有量を検証した後に得ることができる。特に、α−プロテオバクテリアを伴う根粒を有する植物、特にリゾビウム（Rhizobium）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）及びシノリゾビウム（Sinorhizobium）種が、ケウインの優れた供給源である。加えて、根圏に適合した細菌に富む微生物環境で植物の生育が確実になっている場合、又はケウインを合成する着生植物及び内生植物微生物、特にバクテロイデス（Bacteroidetes）、フィルミクテス及びプロテオバクテリア科（例えば、シュードモナス ルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）又はセラチア マルセッセンス（Serratia marcescens）を含むがこれらに限定されない）により定着されている場合には、その植物樹液もまた、対象となるケウインの供給源である。使用される植物（葉、根、実、樹皮等）のエキスは、食物に、化粧料に、又は従来の医薬において日常的に用いられている生物体であることができ、例えば、評価されるべきそれらのケウイン含有量との関連で、アカリファ インディカ（Acalypha indica）、アカンサス エブラクテタス（Acanthus ebracteatus）、アロエ ベラ（Aloe vera）、アベナ サティバ（Avena sativa）、ココ ヌキフェラ（Cocos nucifera）、コヒア アラビカ（Coffea arabica）、コロカシア エスクレンタ（Colocasia esculenta）、クルクマ ロンガ（Curcuma longa）、ヒッポファエ ラムノイデス（Hippophae rhamnoides）、ジャスミン サンバック（Jasminum sambac）、ジャグランス マンシュリカ（Juglans mandshurica）、マトリカリア レクティタ（Matricaria recutita）、メセンブリアンセマム クリスタリナム（Mesembryanthemum crystallinum）、オプンティア フィカス インディカ（Opuntia ficus indica）、オリザ サティバ（Oryza sativa）、ピットカウロン プラエコクス（Pittocaulon praecox）、プラギオキラ ベッドメイ（Plagiochila beddomei）、ポプラ バルサミフェラ（Populus balsamifera）、シジュウム グァバ（Psidium guajava）、スクテラリア バイカレンシス（Scutellaria baicalensis）、ウァッキニウム（Vaccinium）属、ヴィティス ヴィニフェラ（Vitis vinifera）と、実に多様な植物が挙げられる。多くの場合マメ（Fabaceae）科、ナス（Solanaceae）科又はキク（Asteraceae）科から育種目的としたそれらの正の効果のために従来使用されるが、皮膚の質及び耐性に対する効果を有することが認められる非常に多数の植物を含む植物を選択することができる。ケウインの分子の外的な供給が追加されるのであれば、微生物又はケウイン供給のない無土壌栽培だけでも使用される。しかしながら、レオントポンディウム アルピナム（Leontopodium alpinum）などの稀少又は被保護植物であって、実験室で生育されている植物を、ケウイン生成微生物の存在下で生育した場合には、その分子を捕獲及び富化するそれらの能力について評価した後に選択することができる。

ケウインの含有量、その前駆体及び誘導体の含有量、並びに細菌エキス又は植物エキスの含有量は、保証されていることが好ましい。この点に関し、集約栽培から得られた植物エキスに関わる微生物細菌叢の分解に起因して、これらのエキスはケウインを外的に供給した製剤でのみ用いるのが好ましい。一般に、細菌又は植物エキスでは、ケウイン、その前駆体及び誘導体が富化され得る。

化粧料組成物
本発明によれば、ケウイン、ケウインの前駆体及び／又は誘導体は、経時的な、及び／又は光で誘発される、皮膚の老化の徴候、特に２５〜３０歳の年齢の人々に現れ、最も多くの場合すじ並びに／又は顔貌のくすんだ及び／若しくは不均一な外見の始まりとして見て取られる早期老化の徴候の、予防又は治療を意図する化粧料組成物の有効成分として使用することができる。

本発明の組成物は、生理的に許容し得る媒質、すなわち皮膚及び／又は皮膚付属器官に適合する媒質を含む。媒質は、好ましくは化粧料的に許容し得る媒質、すなわち良好な色、香り及び粘稠度を有し、かつ穿痛、潮紅などの不快事象、又はその使用から消費者を遠ざけてしまいがちな他の不快事象をもたらさないものである。

本発明によれば、化粧料組成物は、ケア又はメーキャップ用製品であり、例えばセラム、ローション剤、クリーム、ミルク、水若しくはオイルゲル、ヒドロゲル、マスク、スティック、パッチ、オイル、軟膏、ワックス、フォーム剤、トナー、ケア液剤、香膏、ファンデーション、スプレー、アイシャドウ、口紅、ペースト、軟膏剤、シャンプー又はコンディショナーの形態にある。

化粧料組成物は、ケウイン、ケウインの前駆体及び／又は誘導体に加えて痩身用薬剤を含む、痩身用組成物としても使用することができる。

組成物では、皮膚及び／又は皮膚付属器官への局所の投与が意図されているので、局所適用に従来より用いられるいかなる製剤の形態としてもよい。特に、水溶液、水性アルコール溶液、水中油型エマルション（Ｏ／Ｗ）若しくは油中水型エマルション（Ｗ／Ｏ）又は多相エマルション（三相：Ｗ／Ｏ／Ｗ又はＯ／Ｗ／Ｏ）、又はミクロエマルション若しくはナノエマルションの形態とするのが有利であり得る。

組成物が水性形態であれば、特に分散液、エマルション又は水溶液であれば、場合により水を含有する水相、フラワーウォーター及び／又はミネラルウォーターを含んでもよい。

このような組成物は、通常の好適な、薬学的に又は化粧料的に許容し得る担体又は賦形剤、特に希釈剤、分散剤、ゲル化剤、固形皮膚軟化薬、ガム、樹脂、溶媒、修飾及び重合デンプン、二酸化チタン若しくは金属ステアリン酸塩などの充填剤、保存剤、精油、パール化剤、着色剤、臭気吸収剤、ｐＨ調整剤又は中和剤、増粘剤、吸収促進剤、特にエタノール及び／若しくはリン脂質、着香剤若しくは芳香剤、酸化鉄などの鉱物顔料、植物由来の油脂などの油剤、動物由来の脂肪、合成油、シリコーン油（シクロメチコン）、フッ素含有油、脂肪アルコールエステル（セチルアルコール）、ワックス、改質粘度、ベントン（bentones）、脂肪酸金属塩、疎水化シリカ、ポリエチレン、マイカ、並びに／又は化粧料で用いられる他の物質も含有してよい。

本発明の化粧料組成物は、ビタミン、日焼け止め及びフィルターなどの他の活性分子、老化防止活性物質、しわ防止剤、特にペプチド、抗酸化剤、美白剤、自己日焼け（self-tanning）成分、日焼け促進剤、リフティング成分、痩身用剤、引き締め成分、水和成分、ピーリング成分、皮脂調整剤、マット化剤などをさらに含んでもよい。化粧料組成物は、好ましくは老化防止活性物質、しわ防止及び／又は抗酸化薬剤、リフティング成分、引き締め成分及び／又は水和成分を含んでもよい。一般に、当業者は本発明の組成物の特性が追加の活性分子の添加によって損なわれないように、その活性分子の量を選択及び適合させることができる。

一つの好ましい実施形態で、ケウイン、その前駆体又は誘導体は、共同因子又は例えばビタミンＣ若しくはトコフェロールなどのビタミンと共に化粧料組成物に含有される。

本発明は、以下の実験及び実施例を読み、添付の図面を精査すればその理解が深まるはずである。これらは例示目的で提示され、決して本発明を限定するものではない。

図１、２及び３は、ＤＭＥＭ ２．５％ＦＣＳにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて０時間（図１）及び２４時間（図２）での細胞遊走、又はＤＭＥＭ １０％ＦＣＳにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間（図３）での細胞遊走を示す。

図４及び５は、２．５％ＦＣＳ中１０μg/mlケウインにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間（図４）での細胞遊走、又は２．５％ＦＣＳ中３０μg/mlケウインにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間（図５）での細胞遊走を示す。

図６及び７は、２．５％ＦＣＳ中１０μg/mlメタノールにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間（図６）での細胞遊走、又は２．５％ＦＣＳ中３０μg/mlメタノールにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間（図７）での細胞遊走を示す。

実験
これらの実験で、ケウインの効果（細胞毒性、増殖、細胞遊走）は、正常な成人ヒト真皮の線維芽細胞において評価した。

材料及び方法
ウシ胎児血清ＦＣＳ、Dutscher、P30-8100M（バッチ：P130903）は、ケウインとの使用のために選択したものであり、媒質に混入するものではない。

ここでメタノールを、活性分子用の担体として使用した。

ケウインの原液は、１５mg/mlメタノールで調製し、その希釈液は、可変濃度のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下に、ＤＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Essential Media）中で得られた。（ＤＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ＋抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）＋グルタミン）：生存率、増殖及び細胞遊走実験用の、２．５％ＦＣＳを含む欠乏培地。

希釈範囲
毒性／生存率アッセイのために準備した希釈範囲は、以下のとおりである。

この第１アッセイによって、適用される濃度範囲の微調整が可能となった。

細胞増殖動態のアッセイのための希釈範囲は以下のとおりであった。

遊走を評価するために準備した希釈範囲は、０．３μg/ml濃度を除いて、動態を評価するための範囲と同様であった。

使用した製品

実験プロトコル
１．細胞系
細胞型：ＨＤＦａ、成人ヒト真皮線維芽細胞、３９歳女性、第４継代と第６継代との間を使用。

行った実験すべてに対し、以下の３種のＦＣＳ対照を体系的に加えた。
− 無血清ＤＭＥＭ；
− 血清欠乏培地（２．５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）；及び
− 完全培地（１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）。

２．細胞毒性及び細胞増殖の評価
使用した成人ＨＤＦを５×１０^３細胞／ウェルの割合になるよう、２００μlＦＣＳ不含培地（添加ＤＭＥＭ＋０％ＦＣＳ）の入った９６穴プレート（第４継代）に播種した。播種後２４時間で培地を交換し、そして異なる希釈率の前記製品又はその担体（メタノール）を、１つの培養条件に対して３つのウェルで、１ウェルあたり２００μl添加した。

三種の対照も評価した（３ウェル／対照）：
− 無血清ＤＭＥＭ；
− 血清欠乏培地（添加ＤＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ）；及び
− 完全培地（添加ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）。

３．細胞遊走
上記使用した成人ＨＤＦを、較正された無細胞の領域を創出させる、予め滅菌しておいたカルチャーインサートの存在下に播種した。ＤＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ ６００μl中１０００００のＨＤＦａと、１５０μl中３００００細胞とを、それぞれインサートの外側と内部とに加えた。３７℃で５時間のインキュベーション時間後に、インサートを取り除いてウェルをＰＢＳ １Ｘで２回洗浄し、接着しなかった細胞をすべて除去した。次いでケウイン分子を、２．５％ＦＣＳのＤＭＥＭ中、３０、１０、３又は１μg/mlで添加し、また同等の範囲のメタノールについても１つの条件に対して２ウェルで実施した。ウェルの写真をｔ＝０時間で撮って、そのプレートを次いで２４時間インキュベーションした。２４時間で写真を撮る前に、細胞をパラホルムアルデヒドで固定した。

測定、及び結果の解析
１．細胞毒性の定量：ＭＴＴアッセイ
比色分析（ＭＴＴアッセイ）を用いて、１、２及び３日の培養時間後に細胞増殖を評価した。このアッセイは、細胞が生存しているのであればそれらのミトコンドリアのＮＡＤＰＨレダクターゼによって、黄色のテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）［３−（４、５−ジメチルチアゾールブロミド］が、青色−紫色のホルマザン産物へと還元されることに基づくものである。結晶はその後、１００％エタノール−ＤＭＳＯ混合物（v/v）に溶解させた。生存細胞の数に比例する上清の着色を、５７０nmの波長における分光光度計での光学密度（ＯＤ）読み取りによって測定した。本アッセイは、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３で行った（Ｄ０はアッセイすべき溶液の添加した時間に対応している）。

三重試験の平均ＯＤ値をグラフに、各々の速度論的時間に対して示す。標準偏差を示す。

２．細胞増殖の定量：ＢｒｄＵアッセイ
１、２及び３日間培養した後に、ＥＬＩＳＡ型のアッセイ（ＢｒｄＵアッセイ、ブロモデオキシウリジン）を用いて細胞増殖を評価した。

ＢｒｄＵは合成ヌクレオシドであり、チミジンの類似体であって、抗ＢｒｄＵ抗体によって認識され得る。ＢｒｄＵは増殖している細胞のＤＮＡ複製の際に取り込まれる。抗ＢｒｄＵ抗体は、酵素にカップリングされ、これはその基質の存在下で、当該基質を分解することになる。ＢｒｄＵの検出はそれゆえ、酵素による比色アッセイによって行なわれる。

取り込まれたＢｒｄＵの量に比例して、酵素基質の分解により上清が染色されることになる。次いで、４５０nmの波長で分光光度計を用い、光学密度（ＯＤ）の読み取りによって測定を実施する。本アッセイは、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３で行った（Ｄ０はアッセイすべき溶液の添加した時間に対応している）。

平均ＯＤ値、標準偏差及び用量反応図を、各々の速度論的時間に対して以下に詳説する。

３．細胞遊走の定量：対照に対する遊走の画像の比較
画像は、そのコントラストを向上するＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて解析した。全視野を調べ、各々の時間表示に対して各条件の最も代表的な二つを選んだ。対照との比較によって解析を実施した。

結果
細胞生存率

結果の解釈
陰性及び陽性対照は整合しており、実験の妥当性が確認できた。実際に、ＭＴＴアッセイでは、２４時間で２．５％ＦＣＳ対照は常に、１０％ＦＣＳ対照よりもスコアが高かった。

４８時間では、２．５％ＦＣＳ対照は１０％ＦＣＳ対照と同等であり、７２時間では２．５％ＦＣＳ対照は１０％ＦＣＳ対照よりもスコアが低かった。

担体対照単独（メタノール範囲０．６％〜０．０００６％）については、わずかに細胞傷害効果が呈されたものの、用量による効果はなく、最低限に抑えられていた。したがって、その存在は細胞生理を妨げるものではなく、また最高濃度であったとしても実験の余の部分を妨げることはないはずである。加えて、メタノールは開始から数日にわたり細胞増殖を促進することがわかっている。

ケウイン分子に関して、
− ４８時間で、１００μg/mlの濃度にて細胞傷害効果が呈された。得られたＯＤは陰性対照（０％ＦＣＳ）の場合に類似していた。
− １００μg/mlを下回る、他のアッセイ濃度では細胞傷害効果は示されなかった。

細胞増殖

４８時間及び７２時間では、ＯＤ値が分光光度計の飽和閾値を超えないように、基質の存在下でのインキュベーション時間を故意に短くした。

用いたプロトコルは、培地を交換しないインキュベーションに基づいていており、これは培地における成長因子の枯渇をもたらし、実験に選択されたＦＣＳで特に顕著である（実験を妨げるかもしれないケウインを含有しないことの裏付けが意図される）。結果的に、単位容量あたりのＯＤは最短時間の場合と比べて低くなる。

結果の解釈
陰性及び陽性対照は整合しており、実験の妥当性が確認できた。

実際に、ＢｒｄＵアッセイでは、２．５％ＦＣＳ対照は分析時間に関わらず（２４、４８及び７２時間）１０％ＦＣＳ対照よりも効果が低かった。

「メタノール」対照（増殖を刺激することが知られている）は、以下の効果を示す。
− ２４及び４８時間でケウインの場合に近似する；
− ７２時間でケウインの場合を、３μg/ml以降にて下回る。
以下のように結論付けることができる。
− 担体での場合に比べ、ケウインは短時間（２４及び４８時間）では有意な効果がない；
− 明確な増殖効果は７２時間で３及び１０μg/mlの濃度にて証明され、３０μg/mlの濃度で特に顕著であった。

細胞遊走
成人ＨＤＦを、予め滅菌しておいたカルチャーインサートの存在下に播種して、集密単層培養において較正された無細胞の領域を創出させた。細胞は、創出されたギャップの近くの端部から遊走することによって当該ギャップを埋める傾向がある。

３７℃で５時間インキュベーションした後、インサートを取り除いてウェルをＰＢＳ １Ｘで２回洗浄し、非接着細胞をすべて除去した。

次いでケウインを、２．５％ＦＣＳのＤＭＥＭ中、３０、１０、３又は１μg/mlで添加し、また同等の範囲のメタノールについても一つの条件に対して２ウェルで準備した。

ウェルの写真をｔ＝０時間で撮った。

細胞は、パラホルムアルデヒドにて固定する前に３７℃で２４時間培養した。ｔ＝２４時間で写真を撮った。

三種の対照も評価した（２ウェル／対照）：
− 無血清ＤＭＥＭ；
− 血清欠乏培地（添加ＤＭＥＭ＋２．５％ＦＣＳ）；及び
− 完全培地（添加ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）。

図１及び２は、ＤＭＥＭ２．５％ＦＣＳ対照（０μg/mlのアッセイすべき分子：陰性対照に対応する）の、線維芽細胞に対する０時間（図１）及び２４時間（図２）での効果をそれぞれ示す。

図３は、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ対照（陽性対照に対応する）の、線維芽細胞に対する２４時間での効果を示す。

図４及び５は、１０μg/ml（図４）及び３０μg/ml（図５）の濃度での、２．５％ＦＣＳ中のケウインの線維芽細胞に対する２４時間での効果をそれぞれ示す。

図６及び７は、１０μg/ml（図６）及び３０μg/ml（図７）の濃度での、メタノール ＤＭＥＭ ２．５％ＦＣＳの線維芽細胞に対する２４時間での効果をそれぞれ示す。

すべての図で見ることのできる黒線は、０時間及び２４時間で写真を撮るべき領域を識別するよう、ディッシュの背部に付けたマークに対応する。

写真を互いに比較して、異なるアッセイ条件間での、ギャップへの細胞遊走の差を評定した。

０時間条件と比較して、２．５％ＦＣＳにおける細胞は１０％ＦＣＳでの場合と同様、２４時間後にギャップに定着しはじめることが観察できる。細胞は、反対側の端部の方向に転換してこの方向に遊走するが、可視の集密単層培養では、線維芽細胞の細胞質内伸展には所定の方向性が認められない。加えて、これらの画像では、１０％ＦＣＳにおいてより多くの細胞がギャップに定着していることを観察でき、また、二つの対向する端部から到達する細胞がギャップの中心に集まることは注目すべきである。

１０μg/ml及び３０μg/ml ケウインについての写真の観察で、２．５％ＦＣＳにおいてより良好に遊走することが示される。より多くの細胞をギャップ内に認めることができる一方、遊走前方で、対向する端部に向かう往復方向を維持していることが２．５％ＦＣＳで視認できる。最後に、３０μg/mlでは、１０％ＦＣＳの存在下で認めることができたと同様に、二つの端部の細胞がギャップの中心に集まる。

上記結果から、以下のことが示される：
− ２．５％ＦＣＳ及び１０％ＦＣＳ対照は、用いた％ＦＣＳに比例した遊走を示す；
− ケウインは、１０μg/mlの濃度でさえも、線維芽細胞の遊走に対して効果を示し、線維芽細胞の遊走に対するこの効果は、３０μg/mlの濃度で確実になる；
− １０及び３０μg/mlのケウインの存在下での遊走は、１０％ＦＣＳ陽性対照で得られるのと同等である；並びに
− メタノールは、遊走に対してわずかな効果を示すが、ケウインの効果ほど明瞭ではない。

一般的な結論
１００μg/mlよりも低いケウインの濃度では、成人ＨＤＦに対して細胞傷害効果は何ら示されない。加えて、３、１０及び３０μg/mlという濃度のケウインで、７２時間のインキュベーション後に増殖効果が立証されている。より優れた増殖効果は、３０μg/mlの濃度のケウインにて、７２時間で観察される。ケウインは１０μg/mlの濃度で、成人ＨＤＦの遊走に対して効果を有する。この効果は、３０μg/mlの濃度で確実になる。１０及び３０μg/mlのケウインの存在下での遊走は、１０％ＦＣＳ陽性対照で得られるのと同等である。

組成物の例
ベースクリーム
アロエベラゲル（植物若しくは鉱物浸剤又は蒸留水で置き換え可能である）６容量、シアバターとホホバ油の混合物（他の植物油、又はバターで置き換えできる）２．５容量、及び乳化ろう １．５容量を注意深く混合する。すべての成分を湯浴上に置いてろうを溶かし、その後激しく混合して、冷却のために氷上に置く。有効成分を添加する。最後に、最終濃度０．１９％のメチルパラベンを保存目的で添加する。

多数の製造業者が中性のベース化粧クリームを市場に出しており（例えば、Neutra base（著作権））、既存の主要ブランドのいずれのベースも本発明によって改良することができる。

ケウインは、このベース１００mlあたり０．１mgの濃度で添加される。

「オーガニック」調製品の場合、ｔＲＮＡエキス １００mgがベースクリーム １００mLに添加される。

ケウインを含有するＲＮＡエキスの調製
ケウイン含有エキスの生物学的調製のための細菌生育
多数の成長培地が好適である。例えばバチルス スブチリスには、ＥＤ培地が挙げられる。

ＥＤ成長培地は、８mM Ｋ_２ＨＰＯ_４；４．４mM ＫＨ_２ＰＯ_４；２７mM グルコース；０．３mM Ｎａ_３−クエン酸塩；１５mM Ｌ−グルタミン；３３．５μM クエン酸第二鉄アンモニウム；２mM ＭｇＳＯ_４を含有する。１００倍濃縮原液から、微量元素をこのベースに、０．６１μM ＭｇＣｌ_２；４９．５μM ＣａＣｌ_２；４９．９μM ＦｅＣｌ_３；５．０５μM ＭｎＣｌ_２；１２．４μM ＺｎＣｌ_２；２．５２μM ＣｕＣｌ_２；２．５μM ＣｏＣｌ_２；２．４８μM Ｎａ_２ＭｏＯ_４の最終濃度となるように加える。

バチルス スブチリスの野生型株を、液体ＥＤ培地中、３７℃で定常的に空気混和しながら前培養する。新鮮な一晩の培養物を、ＥＤ培地１５mL中に６００nmの光学密度（ＯＤ６００）０．１で接種する。細胞は３７℃でＯＤ６００が１になるまで培養して、等容量の７０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液中６０％メタノール、ｐＨ７．５にて−８０℃で冷却する。後の工程はすべて冷条件下に行い、ＲＮＡの調製用であることが意図される溶液はピロ炭酸ジエチルで処理して滅菌する。細胞を４℃でペレット化し、水で洗浄して、１０％グルコース、１１mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ７．５、１０mM ＥＤＴＡ ０．５mlに再懸濁させる。酸で洗浄したガラスビーズ（Sigma−Aldrich、G4649）０．１ｇを含有するチューブに、懸濁液を移す。

ドライアイス ５０ｇを含有するFastPrep（登録商標）-24装置（MP Biomedical）のCoolPrepアダプターの中にチューブを入れる。細胞は、以下のパラメータ：毎秒６メートル４５秒間、を用いて３サイクルにて分画される。各サイクルの後、懸濁液は氷上で１分間保持される。１００００rpmで２分遠心した後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２を、最終濃度 ０．３Mとなるように添加して、全ＲＮＡを酸条件下に単離する。１容量のフェノール酸／クロロホルム及びイソアミルアルコール（１２５：２４：１）をｐＨ４．５で（Amresco、AM9720）添加する。各試料を１０秒ボルテックスにかけて、６５℃の湯浴上で３分間インキュベーションする。複数相を１４０００rpmで５分遠心することによって分離し、その水相を同じ熱酸フェノール手順に付し、その後一度再抽出する。水相を新しいチューブに移し、１容量の冷酸フェノールで満たす。１４０００rpmで５分遠心した後、ＲＮＡを−８０℃で２．５容量の無水エタノールを用いて１時間沈殿させる。ＲＮＡを４℃で、１４０００rpmにて１５分遠心し、７０％エタノールで洗浄する。そのＲＮＡペレットを１０mM Ｔｒｉｓ、１mM ＥＤＴＡ ｐＨ７．５に溶解させる。これはケウインが富化されている細菌エキスの第一の供給源として使用できる。

転移ＲＮＡの富化
上記の全ＲＮＡの調製品を、４．５M 塩化リチウム（ｐＨ８） １容量と、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と共に混合して最終濃度０．０１mMとする。このＲＮＡ溶液を、−８０℃で２時間インキュベーションする。４℃で１４０００rpmにて１５分間遠心した後、tＲＮＡは上清に認められる。塩の夾雑物を除去するために、０．３M 酢酸ナトリウム ｐＨ５．２及び無水エタノール ２．５容量を添加して−８０℃で１時間、tＲＮＡを沈殿させる。tＲＮＡは次いで、４℃で１４０００rpmにて１５分間遠心することにより沈降させ、７０％エタノールで洗浄する。そのtＲＮＡペレットを、１０mM Ｔｒｉｓ、１mM ＥＤＴＡ ｐＨ７．５に溶解させる。この調製品は、ケウインに富む転移ＲＮＡの調製品である。引き続き、この調製品を有効成分として使用して、本発明の化粧料組成物を調製できる。

ＤＭＥＭ ２．５％ＦＣＳにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて０時間での細胞遊走を示す図である。 ＤＭＥＭ ２．５％ＦＣＳにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。 ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。 ２．５％ＦＣＳ中１０μg/mlケウインにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。 ２．５％ＦＣＳ中３０μg/mlケウインにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。 ２．５％ＦＣＳ中１０μg/mlメタノールにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。 ２．５％ＦＣＳ中３０μg/mlメタノールにおいてインキュベーションした線維芽細胞培養にて２４時間での細胞遊走を示す図である。

Claims (13)

1. ケウイン、ケウオシン、エポキシケウイン、エポキシケウオシン、マンノシルケウイン、ガラクトシルケウイン、グルタミルケウイン、マンノシルケウオシン、ガラクトシルケウオシン、グルタミルケウオシン、及びｔＲＮＡ−ケウオシンからなる群より選択される化合物を有効成分として含む、皮膚及び／又は皮膚付属器官の老化の徴候を低減又は予防するための化粧料組成物。
2. 前記化合物が、皮膚のすじ及びしわ及び／又はたるみ、並びに／或いは皮膚の弾力性及び／又は皮膚の緊張度の不足、並びに／或いは皮膚の薄化、並びに／或いは土気色の及び／又は羊皮紙様の顔貌、並びに／或いは皮膚の肌理のむら及び年齢によるしみなどの色素沈着のむらを、低減又は予防することが意図されている、請求項１記載の化粧料組成物。
3. 前記化合物が、ケウイン、ケウオシン及びエポキシケウインからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の化粧料組成物。
4. 前記化合物が、細菌エキス若しくは植物エキス又は樹液の形態であり、該エキス又は該樹液は、前記化合物が富むか又は富化されていることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか一項記載の化粧料組成物。
5. 生理的に許容し得る媒質を含み、皮膚及び／又は皮膚付属器官の老化の徴候を低減又は予防することが意図される化粧料組成物を調製するための有効成分としての、ケウイン、ケウオシン、エポキシケウイン、エポキシケウオシン、マンノシルケウイン、ガラクトシルケウイン、グルタミルケウイン、マンノシルケウオシン、ガラクトシルケウオシン、グルタミルケウオシン、及びｔＲＮＡ−ケウオシンからなる群より選択される化合物の使用。
6. 前記化合物が、化粧料組成物１ｍｌ又は１ｇあたり０．１μｇ〜１００μｇ、好ましくは化粧料組成物１ｍｌ又は１ｇあたり１〜５μｇの量で組成物中に含有されることを特徴とする、請求項５記載の使用。
7. 生理的に許容し得る媒質に、ケウイン、ケウオシン、エポキシケウイン、エポキシケウオシン、マンノシルケウイン、ガラクトシルケウイン、グルタミルケウイン、マンノシルケウオシン、ガラクトシルケウオシン、グルタミルケウオシン、及びｔＲＮＡ−ケウオシンからなる群より選択される化合物を有効成分として含む化粧料組成物。
8. 前記化合物が、ケウイン、ケウオシン及びエポキシケウインからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７記載の化粧料組成物。
9. 前記化粧料組成物が細菌エキス若しくは植物エキス又は樹液を含み、該エキス又は該樹液は、前記化合物が富むか又は富化されていることを特徴とする、請求項７記載の化粧料組成物。
10. 前記化合物が、化粧料組成物１ｍｌ又は１ｇあたり０．１μｇ〜１００μｇ、好ましくは化粧料組成物１ｍｌ又は１ｇあたり１〜５μｇの量で組成物に含有されることを特徴とする、請求項７から請求項９のいずれか一項記載の化粧料組成物。
11. 前記化合物が、共同因子又はビタミン、例えばビタミンＣ若しくはトコフェロールと共に組成物中に含有されることを特徴とする、請求項７から請求項１０のいずれか一項記載の化粧料組成物。
12. セラム、ローション剤、クリーム、ミルク、水若しくはオイルゲル、ヒドロゲル、マスク、スティック、パッチ、オイル、軟膏、ワックス、フォーム剤、トナー、ケア液剤、香膏、ファンデーション、スプレー、アイシャドウ、痩身用クリーム、口紅、ペースト、軟膏剤又はシャンプー若しくはコンディショナーの形態にあることを特徴とする、請求項７から請求項１１のいずれか一項記載の化粧料組成物。
13. 局所適用のために製剤化されていることを特徴とする、請求項７から請求項１２のいずれか一項記載の化粧料組成物。

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