BR112015020182B1 - uso cosmético de queuina ou de um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo, uso de queuina ou um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo, composição cosmética e processo de tratamento cosmético para prevenir e/ou tratar sinais de envelhecimento da pele e/ou anexos cutâneos - Google Patents

Abstract

resumo uso cosmético de queuina ou de um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo, uso de queuina ou um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo, composição cosmética e processo de tratamento cosmético para prevenir e/ou tratar sinais de envelhecimento da pele e/ou anexos cutâneos a presente invenção se refere ao uso cosmético de queuina, em particular, para combater o envelhecimento da pele. também se refere a uma composição cosmética que compreende queuina como ingrediente ativo. 1/1

Description

USO COSMÉTICO DE QUEUINA OU DE UM PRECURSOR OU UM DERIVADO DESSA COMO INGREDIENTE ATIVO, USO DE QUEUINA OU UM PRECURSOR OU UM DERIVADO DESSA COMO INGREDIENTE ATIVO, COMPOSIÇÃO COSMÉTICA E PROCESSO DE TRATAMENTO COSMÉTICO PARA PREVENIR E/OU TRATAR SINAIS DE ENVELHECIMENTO DA PELE E/OU ANEXOS CUTÂNEOS

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção pertence ao campo de cosméticos, em particular, produtos para prevenir ou combater o envelhecimento da pele e anexos cutâneos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Como tecido protetor e limite de troca, a pele é rapidamente renovada ao longo da vida. O passar do tempo resulta inevitavelmente no envelhecimento da pele. O envelhecimento precoce pode ocorrer até mesmo como uma consequência de múltiplos ataques ambientais. Como interface com o ambiente externo, a pele é constantemente submetida a danos resultantes de todos os tipos de ataques físicoquímicos: alteração de temperatura, umidade, luz, poluição, etc. As células da pele envelhecem, se tornam senescentes e morrem após cerca de 80 divisões. Ao longo desse processo, a pele perde sua espessura e elasticidade, causando o início de rugas, porém, também perde sua função protetora, em particular, contra radiação UV durante o dia. Também pode haver pigmentação irregular (manchas de idade).

[003] As causas moleculares do envelhecimento da pele envolvem todos os compartimentos da pele. Como em outros tecidos, algumas proteínas induzidas por estresse têm uma função protetora central, em particular, as proteínas chaperonas que permitem enovelamento adequado de proteínas e

2/29 corrigem os defeitos desse enovelamento e as proteases que degradam proteínas mal enoveladas ou quimicamente deterioradas. O processo de tradução e enovelamento se torna gradualmente menos eficiente à medida que a célula envelhece, resultando, desse modo, na ocorrência de uma sensibilidade intensificada a glicações e modificações oxidantes acidentais. Espécies reativas de oxigênio alteram os aminoácidos (em particular, cisteína, histidina, metionina, tirosina e triptofano) e cadeias principais da proteína. Também causam deterioração a montante de processos que resultam na síntese de novas proteínas.

[004] O acúmulo de agregados de proteína durante o processo de envelhecimento se sobrepõe progressivamente à maquinaria que controla a qualidade de proteínas celulares. Esse envelhecimento da pele implica degradação da matriz extracelular em ambas as camadas dérmica e epidérmica, deixando sinais visíveis de envelhecimento na superfície da pele e modificando as propriedades físicas dessa.

[005] A consequência geral também é uma deterioração de atividade enzimática normal e uma agregação de proteínas totais, resultando em sinais visíveis, como secura irregular, pigmentação irregular, rugas profundas, tez cerácea e/ou apergaminhada, flacidez da pele, etc.

[006] Três processos permitem que as células superem o envelhecimento: neossíntese, reparo e degradação sucedidos por ressíntese. A longo prazo, os dois últimos processos são essenciais, já que permitem o rejuvenescimento celular.

[007]

Portanto, há uma necessidade e uma grande

3/29 demanda de novos produtos para tratamentos cosméticos para combater o envelhecimento da pele.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [008] De modo totalmente surpreendente, os inventores constatam que um fornecimento exógeno de queuina corrige os efeitos prejudiciais de estresse aos quais a pele é inevitavelmente submetida, postergando, desse modo, o aparecimento de sinais de envelhecimento. A queuina contribui muito para a manutenção celular. A queuina tem um efeito protetor contra múltiplos estresses repetidos. Mais particularmente, a presente invenção se concentra na necessidade de otimizar o processo de ressíntese de proteína dotando-se as células de queuina. De fato, essa molécula é necessária para o desempenho ideal da síntese de proteína e o corpo não é capaz de produzir essa molécula. Constatou-se, no contexto da presente invenção, que um fornecimento exógeno de queuina contribui de modo surpreendente para a resistência de células da pele. A presente invenção se refere, portanto, a uma composição cosmética que compreende queuina, um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo. Mais particularmente, a matéria da invenção é uma composição cosmética para aplicação tópica.

[009] A presente invenção também se refere ao uso de queuina, um precursor ou derivado dessa como ingrediente ativo em uma composição cosmética e, mais particularmente, uma composição cosmética para aplicação tópica.

[010] Uma matéria adicional da invenção é o uso cosmético de queuina, precursor ou derivado dessa como ingrediente ativo para reduzir ou prevenir sinais de

4/29 envelhecimento da pele e/ou de anexos cutâneos. Anexos cutâneos se referem, de preferência, a cabelos e unhas.

[011] O uso ou composição da invenção é destinado, mais particularmente, a reduzir ou prevenir rugas e linhas e/ou flacidez da pele e/ou falta de elasticidade e/ou tonicidade da pele e/ou afinamento da pele e/ou tez cerácea e/ou apergaminhada e/ou irregularidades na textura da pele e irregularidades de pigmentação, como manchas de idade.

[012] A invenção também se refere a um método para preparar uma composição cosmética que compreende a adição de queuina, de um precursor ou de derivado dessa a alguns ou todos os componentes da composição cosmética e à recuperação da composição cosmética obtida.

[013] A presente invenção também se refere a um processo de tratamento cosmético para prevenir e/ou tratar sinais de envelhecimento da pele e/ou de anexos cutâneos que compreende a aplicação na pele e/ou em anexos cutâneos de uma composição cosmética de acordo com a invenção.

[014] Em uma modalidade particular, a queuina, o precursor ou o derivado dessa é selecionado a partir do grupo formado por queuina, queuosina, epoxiqueuosina e epoxiqueuina. Entre esses derivados estão os derivados glicosilados de queuina e queuosina, como manosilqueuina, galactosilqueuina e derivados aminoacilados, como glutamilqueuina. A queuina, um precursor ou derivado dessa pode estar em forma purificada ou na forma de um extrato bacteriano ou extrato vegetal ou seiva, sendo que o dito extrato ou a dita seiva são ricos ou enriquecidos com queuina, um precursor ou derivado dessa. Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição cosmética

5/29 compreende queuina.

[015] De preferência, a queuina, o precursor ou o derivado dessa está contido na composição cosmética em uma quantidade de 0,1 pg a 100 pg por ml ou g de composição cosmética, de preferência, 0,5 a 10 pg por ml ou g de composição cosmética, e, mais preferencialmente, 1 a 5 pg por ml ou g de composição cosmética. Para derivados de liberação prolongada, as concentrações são calculadas de modo que a taxa de liberação satisfaça, em todos os momentos, as condições mencionadas anteriormente em conformidade com o processo de liberação físico-químico. Opcionalmente, a composição cosmética pode compreender queuina, o precursor ou derivado dessa em uma quantidade de pelo menos 0,1 pg a 100 pg por ml ou g de composição cosmética, mais preferencialmente, pelo menos 0,5 a 10 pg por ml ou g de composição cosmética e, mais preferencialmente, pelo menos 1 a 5 pg por ml ou g de composição cosmética.

[016] A composição cosmética pode estar na forma de um soro, loção, creme, leite, água ou gel de óleo, hidrogel, microemulsão, nanoemulsão, máscara, bastão, emplastro, óleo, unguento, cera, espuma, tônico, solução para tratamento, bálsamo, base, aspersão, sombra, creme de emagrecimento, batom, pasta, pomada ou xampu ou condicionador, ou em qualquer forma homogênea ou heterogênea adequada que permita o uso de queuina e derivados dessa.

Queuina, precursores e derivados dessa [017] A queuina também é conhecida sob o nome químico a seguir: 2-amino-5-((((1s,4s,5r)-4,5-dihidroxi-2ciclopenten-1-il)amino)metil)-1,7-dihidro-4h-pirrolo(2,3d)pirimidin-4-ona. (Número CAS: 72496-59-4)

6/29 [018] A epoxiqueuina também é conhecida sob o nome químico a seguir: 7-(5-[(3,4-epoxi-2,5dihidroxiciclopent-1-il)amino]metil)-7-deazaguanina-2-amino5-({[(1R,2R,3R,4R,5S)-3,4-dihidroxi-6-oxabiciclo[3.1.0]hex-2il]amino}metil)-3,7-dihidro-4H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ona. (Número CID: 56927905) [019] A queuosina também é conhecida sob o nome químico a seguir: 2-amino-5-[[[(1S,4S,5R)-4,5-dihidroxi-1ciclopent-2-enil]amino]metil]-7-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi5-(hidroximetil)-2-tetrahidrofuranil]-1H-pirrolo[3,2e]pirimidin-4-ona. (Número CAS: 57072-36-3) [020] A epoxiqueuosina também é conhecida sob o nome químico a seguir: 7-(5-[(3,4-epoxi-2,5dihidroxiciclopent-1-il)amino]metil)-7-desazaguanosina-2amino-5-({[(1R,2R,3R,4R,5S)-3,4-dihidroxi-6oxabiciclo[3.1.0]hex-2-il]amino}metil)-7-(beta-Dribofuranosil)-3,7-dihidro-4H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ona (Número CID: 56927875) [021] No contexto do presente pedido, um derivado de queuina se refere a qualquer molécula ou macromolécula que compreenda queuina em uma forma adaptada para uso pela pele ou anexos cutâneos. Em particular, a queuina pode estar em forma livre ou pode ser parte de um complexo covalente ou iônico. Por exemplo, pode ser complexada com uma ribose para formar queuosina, uma galactosil queuosina, uma manosil queuosina ou glutamil queuosina. Também pode ser considerada na forma de tRNAqueuosina ou um oligonucleotídeo que compreende queuosina. Entre esses derivados estão os derivados glicosilados de queuina e queuosina, como manosilqueuina, galactosilqueuina,

7/29 e derivados aminoacilados, como glutamilqueuina.

[022] No contexto do presente pedido, um precursor de queuina se refere, por exemplo, a seu precursor intermediário, epoxiqueuina, em forma livre ou na forma de um complexo covalente com moléculas ou macromoléculas.

[023] Um derivado de queuina também pode ser uma queuina quimicamente modificada que pode ser facilmente metabolizada em queuina por enzimas como aquelas presentes na superfície da pele. Outros derivados de queuina são derivados que liberam queuina quando aplicados à superfície da pele ou anexos cutâneos e submetidos a tratamento físico-químico (por exemplo, luz UV natural ou artificial).

[024] De preferência, a queuina, os precursores e os derivados dessa podem ser preparados através de síntese química. A síntese química de queuina é conhecida. Em particular, dois caminhos de síntese principais foram descritos (Barnett e Grubb, 2000, Tetrahedron 56, 9221 a 9225; Brooks et al, 2010, Tetrahedron Letters 51, 4163 a 4165) e podem ser implementados por uma pessoa versada na técnica.

[025] De modo alternativo, a queuina, os precursores e os derivados dessa podem ser obtidos com o uso de bactérias que sintetizam tais moléculas.

[026] Desse modo, a queuina também pode ser obtida purificando-se extratos de micro-organismos, microorganismos bacterianos em particular.

[027] De modo alternativo, a queuina, os precursores e os derivados dessa estão na forma de extratos bacterianos, possivelmente enriquecidos com queuina, os precursores ou os derivados dessa.

8/29 [028] De preferência, o extrato bacteriano é um extrato de bactérias selecionado a partir de bactérias Firmicutes comestíveis, de preferência, cepas de Bacillus subtilis ou sua vizinha Bacillus amyloliquifaciens, porém, também Bacillus cereus não patogênica, Streptococcus thermophilus produtora de queuina, Staphylococcus epidermidis não patogênica e, em geral, Firmicutes não patogênica, de preferência, usada em alimentos. Entre as Bactérias gramnegativas, os probióticos de proteobactérias gama, como E. coli Nissle 1917, ou proteobactérias usadas em alimentos, como Zymononas mobilis, são preferenciais. Cianobactérias não toxicogênicas também são fontes preferenciais de queuina, em particular, a espécie Arthrospira comestível (Spirulina).

[029] Em outra modalidade, a queuina e os precursores e os derivados dessa podem ser obtidos a partir de plantas que extraíram essas moléculas de seu ambiente, após a verificação de seu teor de queuina ou teor de derivado. Em particular, as plantas que têm nódulos com proteobactérias alfa, particularmente as espécies Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, são uma excelente fonte de queuina. Além disso, a seiva da planta também é uma fonte de queuina de interesse se o crescimento da planta for garantido em um ambiente microbiano rico em bactérias adaptadas à rizosfera ou se tiverem sido colonizadas por micro-organismos epífitos e endófitos que sintetizam queuina, em particular, as famílias Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobactérias (por exemplo, mas sem limitação, Pseudomonas fluorescens ou Serratia marcescens). Os extratos (folhas, raízes, frutos, cascas...) das plantas usados podem ser organismos comumente usados em alimentos, em cosméticos ou na medicina

9/29 tradicional, por exemplo, plantas variadas como: Acalypha indica, Acanthus ebracteatus, Aloe vera, Avena sativa, Cocos nucifera, Coffea arabica, Colocasia esculenta, Curcuma longa, Hippophae rhamnoides, Jasminum sambac, Juglans mandshurica, Matricaria recutita, Mesembryanthemum crystallinum, Opuntia ficus indica, Oryza sativa, Pittocaulon praecox, Plagiochila beddomei, Populus balsamifera, Psidium guajava, Scutellaria baicalensis, Vaccinium spp., Vitis vinifera, em relação a seu teor de queuina que deve ser avaliado. Podem ser selecionadas as plantas usadas tradicionalmente por seu efeito positivo para propósitos de melhoramento, com frequência das famílias Fabaceae, Solanaceae ou Asteraceae, porém, que compreende um número muito grande de plantas reconhecidas por terem um efeito na qualidade e na resistência da pele. Cultivo sem solo sem fornecimento de micróbios ou queuina é usado somente se um fornecimento exógeno da molécula for adicionado. No entanto, plantas raras ou protegidas, como Leontopodium alpinum, cultivadas no laboratório podem ser selecionadas se foram cultivadas na presença de micro-organismos produtores de queuina e após a avaliação de sua habilidade de capturar e concentrar a molécula.

[030] O teor de queuina, de seus precursores e derivados e de extratos vegetais ou bacterianos é, de preferência, garantido. Desse modo, devido à degradação da flora microbiana associada a extratos vegetais obtidos de cultivo intensivo, esses extratos são somente usados, de preferência, nas preparações com um fornecimento exógeno de queuina. Em geral, os extratos vegetais ou bacterianos podem ser enriquecidos com a queuina, os precursores e os derivados dessa.

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Composição cosmética [031] De acordo com a invenção, a queuina, um precursor e/ou um derivado de queuina pode ser usado como ingrediente ativo em uma composição cosmética destinada a prevenir ou tratar sinais cronológicos ou fotoinduzidos de envelhecimento da pele, em particular, sinais de envelhecimento precoce que afetam pessoas de 25 a 30 anos e que se transformam, com frequência, no início de linhas e/ou de uma aparência opaca e/ou heterogênea da tez.

[032] A composição da invenção compreende um meio fisiologicamente aceitável, isto é, compatível com a pele e/ou aos anexos cutâneos. É, de preferência, um meio cosmeticamente aceitável, isto é, de cor, odor e consistência agradáveis e que não gera desconforto, como irritação, vermelhidão ou outro desconforto que provavelmente desencorajariam os consumidores a usá-lo.

[033] De acordo com a invenção, a composição cosmética é um produto de tratamento ou de maquiagem, por exemplo, na forma de um soro, loção, creme, leite, água ou gel de óleo, hidrogel, máscara, bastão, emplastro, óleo, unguento, cera, espuma, tônico, solução para tratamento, bálsamo, base, aspersão, sombra, batom, pasta, pomada, xampu ou condicionador.

[034] A composição cosmética também pode ser usada como composição para emagrecimento que compreende um agente de emagrecimento, além da queuina, um precursor e/ou um derivado da queuina.

[035] Já que a composição é destinada para administração tópica à pele e/ou anexos cutâneos, pode estar na forma de qualquer preparação convencionalmente usada para

11/29 aplicação tópica. Em particular, pode estar, de modo vantajoso, na forma de soluções aquosas, soluções hidroalcoólicas, emulsões de óleo em água (O/A) ou emulsões de água em óleo (A/O) ou múltiplas emulsões (tripla: A/O/A ou O/A/O), ou micro- ou nanoemulsões.

[036] Quando a composição está na forma aquosa, em particular, em uma solução aquosa, de emulsão ou de dispersão, pode compreender uma fase aquosa que contém possivelmente água, água de flor e/ou água mineral.

[037] Tais composições também podem conter diluentes ou veículos cosmeticamente aceitáveis ou farmaceuticamente adequados comuns, em particular, como agente de diluição, agente dispersante, agente gelificante, emoliente sólido, gomas, resinas, solventes, cargas, como amidos polimerizados e modificados, dióxido de titânio ou estearato de metal, agentes conservantes, óleos essenciais, agentes perolizantes, agentes colorantes, absorventes de odor, reguladores de pH ou agentes neutralizantes, agentes espessantes, agentes promotores de absorção e, em particular, etanol e/ou fosfolipídeos, agentes flavorizantes ou perfumantes, pigmentos minerais, como óxidos de ferro, agentes oleosos, como óleos ou gordura de origem vegetal, gorduras de origem animal, óleos sintéticos, óleos de silicone (ciclometicona) óleos que contêm flúor, ésteres de álcool graxo (álcool cetílico), ceras, argilas modificadas, bentonas, sais de metal de ácido graxo, sílica hidrofobizada, polietilenos, mica e/ou outras substâncias usadas em cosméticos.

[038] A composição cosmética da invenção pode compreender, ainda, outras moléculas ativas, como vitaminas,

12/29 protetores solares e filtros, substâncias ativas anti-idade, agentes antirrugas, em particular, peptídeos, antioxidantes, agente clareador, ingrediente de autobronzeamento, acelerador de bronzeamento, ingrediente de lifting, agente de emagrecimento, ingrediente firmador, ingrediente hidratante, ingrediente de peeling, agente de regulação de sebo, agente matificante, etc. De preferência, a composição cosmética pode compreender substâncias ativas anti-idade, agentes antirrugas e/ou antioxidantes, um ingrediente de lifting, um ingrediente firmador e/ou um ingrediente hidratante. Em geral, pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e adaptar as quantidades de moléculas ativas adicionais para que as propriedades da composição da invenção não são deterioradas através da adição dessas.

[039] Em uma modalidade preferencial, a queuina, o precursor ou o derivado dessa estão contidos na composição cosmética com cofatores ou vitaminas, como vitamina C, por exemplo, ou tocoferol.

[040] A invenção será mais bem compreendida mediante a leitura os experimentos e exemplos a seguir e mediante a análise das Figuras anexas. Essas são fornecidas com propósitos ilustrativos e não limitam de forma alguma a invenção.

[041] As Figuras 1, 2 e 3 mostram migração celular em uma cultura de fibroblastos incubados em DMEM, 2,5 % de FCS em 0 hora (Figura 1) e 24 horas (Figura 2), ou em DMEM, 10 % de FCS em 24 horas (Figura 3).

[042] As Figuras 4 e 5 mostram migração celular em uma cultura de fibroblastos incubados com 10 pg/ml de queuina em 2,5 % de FCS em 24 horas (Figura 4) ou 30 pg/ml de

13/29 queuina em 2,5 % de FCS em 24 horas (Figura 5).

[043] As Figuras 6 e 7 mostram migração celular em uma cultura de fibroblastos incubados com 10 pg/mlde metanol em 2,5 % de FCS em 24 horas (Figura 6) ou 30 pg/mlde metanol em 2,5 % de FCS em 24 horas (Figura7).

Experimentos [044] Nesses experimentos, os efeitosde queuina (citotoxicidade, proliferação, migração celular) foram avaliados em fibroblastos dérmicos humanos adultos normais.

Material e métodos [045] Soro fetal bovino FCS, Dutscher, P308100M (lote P130903) foi selecionado para uso com queuina, a qual não contamina o meio.

[046] Metanol foi usado aqui como veículo para a molécula ativa.

[047] A solução de estoque de queuina foi preparada com 15 mg/ml de metanol e as diluições foram obtidas em meio DMEM (Meio Essencial Modificado por Dulbecco) na presença de concentrações variáveis de soro fetal bovino (FCS) (DMEM + 2,5 % de FCS + antibióticos (Penicilina/Estreptomicina) + glutamina): meio esgotado com 2,5 % de FCS para os experimentos de viabilidade, proliferação e migração celular.

Faixas de diluição [048] A faixa de diluição preparada para o ensaio de toxicidade/viabilidade era a seguinte:

Tabela 1: Faixa de diluição para o ensaio de toxicidade/viabilidade

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Concentrações de queuina (pg/ml)	Porcentagem final de metanol (%)
100	0,6
10	0,06
1	0,006
0,1	0,0006

[049] O primeiro ensaio permitiu uma sincronização fina da faixa de concentração aplicada.

[050] A faixa de diluição para o ensaio de cinética de proliferação celular era a seguinte:

Tabela 2: Faixa de diluição para ensaio de cinética de proliferação celular

Concentrações de queuina (pg/ml)	Porcentagem final de metanol (%)
30	0,18
10	0,06
3	0,018
1	0,006
0,3	0,0018

[051] A faixa de diluição preparada para avaliação da migração era idêntica à faixa para avaliação da cinética, com exceção da concentração de 0,3 pg/ml.

Produtos usados:

Tabela 3: Lista de produtos usados

Produto	Fornecedor	Referência
DMEM sem L-glutamina	Dutscher	L0101-500
PBS 1X, sem Ca Mg	PAA	H15-002
Penicilina/estreptomicina	PAA	P11-010
L-Glutamina	PAA	M11-004
Tripsina-EDTA 10X	PAA	L11-003

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FCS	Dutscher	P30-8100M
BrdU	Roche	11647229001
MTT	Calbiochem	475989
Colágeno	Nutacon	NBC 100A
HDFa	TebuBio	106-05a

Protocolos Experimentais

1. Linhagem celular [052] Tipo de célula: HDFa, fibroblastos dérmicos humanos adultos, de uma fêmea com 39 anos, usados entre a passagem 4 e a passagem 6.

[053] Para todos os experimentos conduzidos, os três controles de FCS a seguir foram adicionados sistematicamente:

- DMEM livre de soro;

- meio esgotado de soro (DMEM suplementado com 2,5 % de FCS); e

- meio completo (DMEM suplementado com 10 % de FCS).

2. Avaliação de citotoxicidade e proliferação celular [054] As HDFs adultas usadas foram semeadas a uma proporção de 5x10³ células/cavidade em placas de 96 cavidades (passagem 4) em 200 pl de meio de cultura sem FCS (DMEM suplementado + 0 % de FCS). 24h após a semeadura, o meio de cultura foi alterado e as diferentes diluições do produto ou seu veículo (metanol) foram adicionadas a 200 pl por cavidade, com 3 cavidades por condição de cultura.

controles também foram avaliados (3 cavidades/controle):

DMEM livre de soro;

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- meio esgotado de soro (DMEM suplementado + 2,5 % de FCS); e

- meio completo (DMEM suplementado + 10 % de FCS).

3. Migração celular [055] As HDFs adultas usadas foram semeadas na presença de insertos de cultura previamente esterilizados que permitiram a criação de regiões acelulares calibradas. 100000 HDFa em 600 pl e 30000 células em 150 pl foram adicionadas respectivamente fora e dentro dos insertos, em DMEM + 2,5 % de FCS. Após um período de incubação de 5 horas a 3 7 °C, os insertos foram removidos e as cavidades foram lavadas duas vezes com PBS 1X para eliminar cada célula que não estivesse aderida. A molécula de queuina foi, então, adicionada a 30, 10, 3 ou 1 pg/ml em DMEM com 2,5 % de FCS, e uma faixa equivalente de metanol também foi realizada, duas cavidades por condição. As cavidades foram fotografadas em t=0 hora e as placas foram, então, incubadas por 24 horas. As células foram fixadas com paraformaldeído antes que as fotos fossem tiradas a 24 horas.

Medições e análise de resultados

1. Quantificação de citotoxicidade: ensaio de MTT [056] A proliferação celular foi avaliada com o uso de um ensaio colorimétrico (ensaio de MTT) após um período de cultura de 1, 2 e 3 dias. Esse ensaio é baseado na redução do sal de tetrazólio amarelo (MTT) [3-(4,5-brometo de dimetiltiazol] até um produto de formazan roxo azulado através das NADPH redutases mitocondriais das células, desde que estejam vivas. Os cristais foram, então, dissolvidos em mistura de 100 % de etanol - DMSO (v/v) . A coloração do

17/29 sobrenadante, proporcional ao número de células vivas foi medida através de leitura de densidade óptica (OD) em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 570 nm. O ensaio foi conduzido a D1, D2 e D3 (D0 correspondente ao período de adição das soluções a serem submetidas a ensaio).

[057] Os valores médios de OD das triplicatas são fornecidos em um gráfico para cada momento cinético. Os desvios padrão são indicados.

2. Quantificação de proliferação celular: ensaio de BrdU [058] A proliferação celular foi avaliada com o uso de um ensaio do tipo ELISA (ensaio de BrdU, Bromodeoxiuridina) após 1, 2 e 3 dias de cultura.

[059] O BrdU é um nucleosídeo sintético e um análogo de timidina, o qual pode ser reconhecido por um anticorpo anti-BrdU. É incorporado durante a replicação de DNA das células em proliferação. O anticorpo anti-BrdU é acoplado a uma enzima que, na presença de seu substrato, irá degradar esse. A detecção de BrdU é realizada, desse modo, por ensaio enzimático colorimétrico.

[060] A degradação do substrato de enzima irá manchar o sobrenadante de modo proporcional à quantidade de BrdU incorporado. A medição é, então, realizada através da leitura de densidade óptica (OD) com o uso de um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 450 nm. O ensaio foi conduzido em D1, D2 e D3 (D0 correspondente ao momento de adição das soluções a serem testadas).

[061] Os valores médios de OD, desvios padrão e as Figuras de resposta de dose são detalhados abaixo para cada momento cinético.

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3. Quantificação de migração celular: comparação de imagens de migração em relação a controles [062] As imagens foram analisadas com o uso do software ImageJ para intensificar o contraste dessas. Todos os campos foram examinados e os dois mais representativos de cada condição foram escolhidos para cada indicação de tempo. A análise foi realizada por comparação com o controle.

Resultados

Viabilidade celular

Tabela 4: Viabilidade celular após 24 h de tempo de contato

	queuina 0,1 pg/ml	queuina 1 pg/ml	queuina 10 pg/ml	queuina 100 pg/ml	Metanol 0,0006 g.	Metanol 0,006 %	Metanol 0,06 %	Metanol 0,6 %
Valores médios de OD	0,228	0,250	0,246	0,233	0,242	0,250	0,259	0,248
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,273	0,303	0,187	0,095
Média em branco	0,133	0,155	0,151	0,138	0,146	0,154	0,164	0,153
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,177	0,207	0,091	0,000
Desvio padrão	0,007	0,006	0,011	0,004	0,014	0,023	0,019	0,010
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,019	0,017	0,014	0,005

Tabela 5: Viabilidade celular após 48 h de tempo de contato

queuina 0,1 pg/ml

queuina 1 pg/ml

queuina 10 pg/ml

queuina 100 pg/ml

Metanol 0,0006 g, %

Metanol 0,006 %

Metanol 0,06 %

Metanol 0,6 %

19/29

Valores médios de OD	0,304	0,331	0,328	0,273	0,329	0,315	0,324	0,345
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,250	0,344	0,314	0,085
Média em branco	0,219	0,246	0,243	0,188	0,244	0,231	0,239	0,260
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,165	0,259	0,229	0,000
Desvio padrão	0,001	0,020	0,018	0,005	0,006	0,012	0,019	0,014
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,011	0,011	0,035	0,004

Tabela 6: Viabilidade celular após 72 h de tempo de contato

	queuina 0,1 pg/ml	queuina 1 pg/ml	queuina 10 pg/ml	queuina 100 pg/ml	Metanol 0,0006 o, %	Metanol 0,006 %	Metanol 0,06 %	Metanol 0,6 %
Valores médios de OD	0,341	0,362	0,395	0,272	0,386	0,400	0,362	0,376
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,259	0,429	0,466	0,118
Média - em branco	0,223	0,244	0,277	0,154	0,268	0,282	0,244	0,259
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,141	0,311	0,348	0,000
Desvio padrão	0,035	0,024	0,010	0,010	0,017	0,026	0,011	0,028
					10 % de FCS	5 % de FCS	0 % de FCS	Nenhuma célula
					0,008	0,020	0,015	0,001

Interpretação de resultados [063] Os controles negativo e positivo estavam em conformidade e permitiram a validação do experimento. De

20/29 fato, para o ensaio MTT, o controle de 2,5 de

FCS teve sempre uma maior pontuação do que o controle de 10 de FCS em 24 h.

[064]

O controle de 2,5 de

FCS era equivalente ao controle de 10 % de FCS em h e inferior a esse em 72 h.

[065]

Em relação ao controle de veículo por si só (faixa de metanol de 0,6 a 0,0006 esse exibiu um leve efeito citotóxico, porém, sem nenhum efeito de dose, permaneceu mínimo. Desse modo, sua presença não prejudica a fisiologia celular e não irá prejudicar o restante dos experimentos mesmo em sua concentração mais alta. Além disso, o metanol é conhecido por promover a proliferação celular ao longo dos primeiros dias.

[066]

Em 48

Em relação à molécula de queuina:

h, a concentração de 100 pg/ml exibiu um efeito citotóxico.

As ODs obtidas eram similares àquelas do controle negativo (0 % de FCS) .

As outras concentrações testadas abaixo de

100 pg/ml não mostraram qualquer efeito citotóxico.

Proliferação celular

Tabela 7: Viabilidade celular após 24 h de tempo de contato

	queuina 0,3 μρ/ml	queuina 1 μρ/ml	queuina 3 μρ/ml	queuina 10 μρ/ml	queuina 30 μρ/ml	Metanol 0,0018 o 0	Metanol 0,006 %	Metanol 0,018 %	Metanol 0,06 %	Metanol 0,18 %
Ods médias	1,312	1,328	1,522	1,625	1,634	1,609	1,554	1,489	1,446	1,475
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,158	1,355	1,939	0,131
Média -em branco	1,181	1,197	,1,391	1,494	1,502	1,477	1,423	1,357	1,314	1,344

21/29

							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,027	1,223	1,808	0,000
DP	0,182	0,091	0,145	0,125	0,082	0,190	0,248	0,095	0,125	0,138
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,003	0,042	0,126	0,027

[067] Em 48 h e 72 h, o período de incubação na presença do substrato foi deliberadamente diminuído para que os valores de OD não estivessem além do limite de saturação do espectrofotômetro.

Tabela 8: Viabilidade celular após 48 h de tempo de contato

	queuina 0,3 pg/ml	queuina 1 pg/ml	queuina 3 pg/ml	queuina 10 pg/ml	queuina 30 pg/ml	Metanol 0,0018 %	Metanol 0,006 %	Metanol 0,018 %	Metanol 0,06 %	Metanol 0,18 %
ODs médias	0,800	0,926	0,915	1,066	1,149	0,957	1,026	1,067	1,244	1,189
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,107	0,937	1,517	0,123
Média - em branco	0,677	0,803	0,793	0,943	1,026	0,834	0,903	0,944	1,122	1,066
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							-0,016	0,815	1,394	0,000
Desvio padrão	0,068	0,126	0,129	0,050	0,143	0,083	0,108	0,113	0,068	0,016
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,003	0,074	0,167	0,005

Tabela 9: Viabilidade celular após 72 h de tempo de contato

	queuina 0,3 pg/ml	queuina 1 pg/ml	queuina 3 pg/ml	queuina 10 pg/ml	queuina 30 pg/ml	Metanol 0,0018 %	Metanol 0,006 %	Metanol 0,018 %	Metanol 0,06 %	Metanol 0,18 %
ODs médias	0,586	0,548	0,681	0,708	0,958	0,550	0,544	0,616	0,588	0,696
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula

22/29

							0,133	0,499	1,159	0,170
Média - em branco	0,416	0,378	0,511	0,538	0,787	0,380	0,374	0,446	0,418	0,525
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							-0,037	0,328	0,989	0,000
Desvio padrão	0,033	0,108	0,009	0,041	0,061	0,061	0,075	0,070	0,082	0,019
							0 % de FCS	2,5 % de FCS	10 % de FCS	Nenhuma célula
							0,009	0,059	0,062	0,002

[068] O protocolo usado era baseado em incubação sem alteração de meio, o que resulta em esgotamento do fator de crescimento no meio, particularmente acentuado com o FCS escolhido para o experimento (destinado a garantir que não contenha queuina, o que interferiria no experimento). Como resultado, a OD por volume unitário é inferior quando comparado aos períodos mais curtos.

Interpretação de resultados [069] Os controles positivo e negativo estavam em conformidade e permitiram a validação desse experimento.

[070] De fato, para o ensaio de BrdU, o controle de 2,5 % de FCS teve menos efeito do que o controle de 10 % de FCS independentemente do tempo de análise (24, 48 e 72 horas).

[071] O controle de metanol (conhecido por estimular a proliferação) mostrou um efeito:

- próximo àquele de queuina em 24 e 48 horas;

- menor do que aquele de queuina em 72 horas, em e após 3 pg/ml.

[072] É possível concluir que:

- a queuina mão tem nenhum efeito significante ao longo de curtos períodos de tempo (24 e 48 horas) em

23/29 comparação ao veículo;

- Um efeito proliferativo claro foi mostrado em 72 horas a concentrações de 3 e 10 pg/ml e particularmente acentuado a uma concentração de 30 pg/ml.

Migração celular [073] As HDFs adultas foram semeadas na presença de insertos de cultura previamente esterilizados para criar regiões acelulares calibradas em uma camada celular confluente. As células tendem a preencher o vão criado através de migração das bordas para próximo do vão.

[074] Após 5 h de incubação a 37°C, os insertos foram removidos e as cavidades foram lavadas duas vezes em PBS 1X para eliminar cada célula não aderente.

[075] A queuina foi, então, adicionada a 30,

10, 3 ou 1 pg/ml em DMEM com 2,5 % de FCS e uma faixa

equivalente de metanol também	foi preparada, duas cavidades
por condição.
[076]	Fotos das	cavidades foram obtidas	em
t=0h.
[077]	As células	foram cultivadas por	24 h a	37

°C, antes de serem fixadas em paraformaldeído. As fotos foram obtidas em t=24h.

controles também foram avaliados, 2 cavidades/controle:

- DMEM livre de soro;

- meio esgotado de soro (DMEM suplementado + 2,5 % de FCS)

- Meio completo (DMEM suplementado + 10 % de FCS).

[078] As Figuras 1 e 2 ilustram os efeitos do

DMEM com controle de 2,5 % de FCS (correspondente a 0 pg/ml

24/29 de molécula do controle negativo a ser analisado) nos fibroblastos em 0 hora (Figura 1) e 24 horas (Figura 2), respectivamente.

[079] A Figura 3 ilustra os efeitos do DMEM com controle de 10 % de FCS (correspondente ao controle positivo) em 24 horas nos fibroblastos.

[080] As Figuras 4 e 5 mostram os efeitos de queuina em 2,5 % de FCS em 24 horas nos fibroblastos, a uma concentração de 10 pg/ml (Figura 4) e 30 pg/ml (Figura 5) , respectivamente.

[081] As Figuras 6 e 7 mostram os efeitos de DMEM com 2,5 % de FCS com metanol em 24 horas nos fibroblastos, a uma concentração de 10 pg/ml (Figura 6) e 30 pg/ml (Figura 7), respectivamente.

[082] A linha preta que pode ser observada em todas as Figuras corresponde à marcação aplicada à parte posterior das placas para identificar as regiões a serem fotografadas em 0 h e 24 h.

[083] As fotos foram comparadas umas às outras para avaliar a diferença em migração celular para o vão entre as diferentes condições testadas.

	[084]	Pode-se	observar que, em comparação à
condição	em	0 h,	as células	em 2,5 % de FCS, como com aquelas
em 10 %	de	FCS,	começaram	a colonizar o vão após 24 h. As
células	se	voltaram para	a direção da borda oposta para

migrar nessa direção, enquanto, na camada celular confluente visível, as extensões citoplasmáticas dos fibroblastos não têm nenhuma orientação determinada. Além disso, pode-se observar, nessas imagens, que mais células em 10 % de FCS migraram para o vão e é notável que as células provenientes

25/29 das bordas opostas se encontram no centro do vão.

[085] A observação das fotos para 10 pg/ml e 30 pg/ml de queuina mostra uma melhor migração do que em 2,5 % de FCS. Mais células podem ser vistas no vão, enquanto mantêm a orientação circular na parte frontal da migração em direção à borda oposta, visível em 2,5 % de FCS. Finalmente, a 30 pg/ml, as células das duas bordas se encontram no centro do vão, como pode ser visto na presença de 10 % de FCS.

[086] Os resultados mostram que:

- Os controles de 2,5 % de FCS e 10 % de FCS exibem uma migração proporcional à % de FCS usada;

- A queuina tem um efeito na migração dos fibroblastos tão precoce quanto a concentração de 10 pg/ml, e esse efeito na migração dos fibroblastos é confirmado na concentração de 30 pg/ml;

- A migração na presença de queuina a 10 e 30 pg/ml é equivalente àquela obtida com o controle positivo de 10 % de FCS;

- O metanol mostra um leve efeito na migração, porém, não tão claro quanto o efeito da queuina.

Conclusões gerais [087] As concentrações inferiores a 100 pg/ml de queuina não exibem qualquer efeito citotóxico em HDFs adultas. Além disso, um efeito proliferativo é mostrado com a queuina nas seguintes concentrações 3, 10 e 30 pg/ml após uma incubação de 72 horas. Um efeito proliferato principal é observado com queuina a uma concentração de 30 pg/ml em 72 horas. A queuina tem um efeito na migração de HDFs adultas a uma concentração de 10 pg/ml. Esse efeito é confirmado na concentração de 30 pg/ml. A migração na presença de queuina a

26/29 e 30 pg/ml é equivalente àquela obtida com o controle positivo de 10 % de FCS.

Exemplos de composições

Creme básico [088] Uma mistura de 6 volumes de gel de Aloe Vera (o qual pode ser substituído por infusões vegetais ou minerais ou água destilada), 2,5 volumes de manteiga de karité e óleo de jojoba (pode ser substituído por qualquer outro óleo vegetal ou manteiga) e 1,5 volumes de cera emulsificante são misturados cuidadosamente. Todos os ingredientes são colocados em um banho de água quente para permitir que a cera derreta e, então, foram vigorosamente misturados e colocados em gelo para resfriamento. Os ingredientes ativos são adicionados. Finalmente, o metilparabeno é adicionado a uma concentração final de 0,19 % com propósitos de conservação.

[089] Diversos fabricantes disponibilizam cremes cosméticos básicos neutros no mercado (por exemplo, Neutra base ©) e qualquer base de uma marca importante existente pode ser melhorada pela invenção.

[090] A queuina é adicionada a essa base a uma concentração de 0,1 mg por 100 ml.

[091] Para preparações orgânicas, 100 mg de extrato de tRNA são adicionados a 100 ml de creme básico.

Preparação de extratos de RNA que contêm queuina

Crescimento bacteriano para preparação biológica de extratos que contêm queuina [092] Diversos meios de crescimento são adequados. Por exemplo, para Bacillus subtilis:

Meio ED

27/29 [093] O meio de crescimento ED contém: K2HPO4 8 mM; KH2PO4 4,4 mM; glicose 27 mM; Na3-citrato 0,3 mM; Lglutamina 15 mM; citrato férrico amoniacal 33,5 mM; MgSO4 2 mM. Os elementos-traço são adicionados a essa base a partir de uma solução de estoque concentrada 100 vezes para uma concentração final de: MgCl2 0,61 mM; CaCl2 49,5 mM; FeCl3 49,9 mM; MnCl2 5,05 mM; ZnCl2 12,4 mM; CuCl2 2,52 mM; CoCl2 2,5 mM; Na2MoO4 2,48 mM.

[094] A cepa de tipo selvagem de Bacillus subtilis é pré-cultivada e meio ED líquido a 37° C sob aeração constante. Uma cultura estéril é inoculada em 15 ml de meio ED a uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm (OD600). As células são cultivadas a 37 ° C até uma OD600 de 1 e resfriadas em um volume igual de metanol a 6 0 % em tampão HEPES 70 mM, pH 7,5 a -80 ° C. Todas as etapas a seguir são conduzidas sob condições frias e as soluções destinadas para a preparação de RNA são tratadas com pirocarbonato de dietila e esterilizadas. As células são peletizadas a 4° C, lavadas em água e ressuspensas em 0,5 ml de glicose a 10 %, Tris-HCL 11 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM. As suspensões são transferidas para tubos que contêm 0,1 g de esferas de vidro lavadas com ácido (Sigma-Aldrich, G4649).

[095] Os tubos são colocados em um adaptador CoolPrep de um instrumento FastPrep ® -24 (MP Biomedical) que contém 50 g de gelo seco. As células são fracionadas em três ciclos com o uso dos seguintes parâmetros: 6 metros por segundo durante 45 s. Após cada ciclo, as suspensões são mantidas no gelo por 1 min. Após centrifugar por 2 min a 10000 rpm, o sobrenadante é transferido para um novo tubo Eppendorf. O acetato de sódio, pH 5,2, é adicionado a uma

28/29 concentração final de 0,3 M e o RNA total é isolado sob condições ácidas. Um volume de ácido fenol/clorofórmio e álcool isoamílico (125:24:1) a um pH 4,5 (Amresco, AM9720) é adicionado. Cada amostra é submetida a vórtice por 10 s e incubada por 3 min em um banho de água quente a 65° C. As fases são separadas por 5 min de centrifugação a 14000 rpm, e a fase aquosa é reextraída uma vez após o mesmo procedimento com fenol ácido quente. A fase aquosa é transferida para um novo tubo e concluída com um volume de fenol ácido frio. Após centrifugar por 5 min a 14000 rpm, o RNA é precipitado com

2.5 volumes de etanol absoluto por 1 h a -80° C. O RNA é centrifugado a 14000 rpm por 15 min a 4° C e lavado com etanol a 70 %. O pélete de RNA é dissolvido em Tris 10 mM, EDTA 1 mM, a um pH 7,5. Pode ser usado, então, como a primeira fonte de extrato bacteriano enriquecido com queuina.

Enriquecimento com RNA de transferência [096] A preparação de RNA total descrita anteriormente é misturada com um volume de cloreto de lítio

4.5 M, pH 8, com acetato de sódio, pH 5,2, a uma concentração final de 0,01 mM. Essa solução de RNA é incubada por 2 horas a -80° C. após centrifugar a 14000 rpm por 15 min a 4° C, o tRNA é encontrado no sobrenadante. Para remover a contaminação por sal, o tRNA é precipitado por 1 h a -80 ° C através da adição de acetato de sódio 0,3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol absoluto. O tRNA é, então, levado a sedimentar através de centrifugação a 14000 rpm por 15 min a 4° C e lavado com etanol a 70 %. O pélete de tRNA é dissolvido em Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5. Essa preparação é uma preparação de RNA de transferência rico em queuina. Essa preparação pode ser usada subsequentemente como

29/29 ingrediente ativo para preparar a composição cosmética da presente invenção.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. USO COSMÉTICO DE QUEUINA OU DE UM PRECURSOR OU UM DERIVADO DESSA COMO INGREDIENTE ATIVO para reduzir ou prevenir sinais de envelhecimento da pele e/ou anexos cutâneos, caracterizado pelo precursor ou derivado da queuina ser selecionado a partir do grupo formado por queuosina, epoxiqueuina, epoxiqueuosina, manosilqueuina, galactosilqueuina, glutamilqueuina, galactosilqueuosina, manosilqueuina, glutamilqueuosina e queuosina-tRNA.

2/3 prevenir sinais de envelhecimento da pele e/ou anexos cutâneos.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela queuina ou um precursor ou um derivado dessa ser destinado a reduzir ou prevenir linhas e rugas e/ou flacidez da pele e/ou perda de elasticidade e/ou tonicidade da pele e/ou afinamento da pele e/ou tez amarelada e/ou apergaminhada e/ou irregularidades da textura da pele e irregularidade de pigmentação, como manchas de idade.

3/3 cofatores ou vitaminas, por exemplo, vitamina C ou tocoferol.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela queuina ou o precursor ou o derivado dessa ser selecionado a partir do grupo formado por queuina, queuosina e epoxiqueuina.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela queuina, um precursor ou um derivado dessa estar na forma de um extrato bacteriano ou extrato vegetal ou seiva, sendo que o dito extrato ou a dita seiva é rica em ou enriquecida com queuina, um precursor ou um derivado dessa.

5. USO DE QUEUINA OU UM PRECURSOR OU UM DERIVADO DESSA COMO INGREDIENTE ATIVO, caracterizado por ser para preparar uma composição cosmética que compreende um meio fisiologicamente aceitável e que é destinada a reduzir ou

Petição 870190105718, de 18/10/2019, pág. 6/10

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela queuina, o precursor ou o derivado dessa estar contido na composição em uma quantidade de 0, 1 pg a 100 pg por ml ou g de composição cosmética, de preferência, 1 a 5 pg por ml ou g de composição cosmética.

7. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, que compreende, em um meio fisiologicamente aceitável, queuina ou um precursor ou um derivado dessa como ingrediente ativo, caracterizada por a queuina, o precursor ou um derivado dessa estarem contidos na composição em uma quantidade de 0,1 pg a 100 pg por ml ou g de composição cosmética, de preferência, 1 a 5 pg por ml ou g de composição cosmética e em que o derivado da queuina é selecionado a partir do grupo formado por queuosina, epoxiqueuina, epoxiqueuosina, manosilqueuina, galactosilqueuina, glutamilqueuina, galactosilqueuosina, manosilqueuina, glutamilqueuosina e queuosina-tRNA.

8. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela queuina, o precursor ou o derivado dessa ser selecionado a partir do grupo formado por queuina, queuosina e epoxiqueuina.

9. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender um extrato bacteriano ou extrato vegetal ou seiva, sendo que o dito extrato ou a dita seiva é rica em ou enriquecida com queuina, um precursor ou um derivado dessa.

10. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pela queuina, o precursor ou o derivado dessa estar contido na composição com

Petição 870190105718, de 18/10/2019, pág. 7/10

11. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada por estar na forma de um soro, loção, creme, leite, água ou gel de óleo, hidrogel, máscara, bastão, emplastro, óleo, unguento, cera, espuma, tônico, solução para tratamento, bálsamo, base,

aspersão, sombra, creme de emagrecimento, batom, pasta, pomada ou xampu ou condicionador. 12. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada por ser formulada para aplicação tópica. 13. PROCESSO DE TRATAMENTO COSMÉTICO PARA PREVENIR

E/OU TRATAR SINAIS DE ENVELHECIMENTO DA PELE E/OU ANEXOS CUTÂNEOS caracterizado por compreender a aplicação na pele e/ou nos anexos cutâneos de uma composição cosmética, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 12.