ITMI20091547A1 - Ceppo batterico probiotico e suoi usi per via orale e topica - Google Patents

Description

DESCRIZIONE DI INVENZIONE INDUSTRIALE

La presente invenzione si riferisce ad un ceppo batterico probiotico e ai suoi usi per via orale e topica.

La presente invenzione origina e trova applicazione nei settori nutrizionale e dei prodotti medicali e cosmetici.

In particolare, la presente invenzione concerne un selezionato ceppo di Lactobacillus rhamnosus ed i suoi utilizzi nei campi alimentarenutrizionale, cosmetico e/o medicale.

Notoriamente, i batteri probiotici sono batteri appartenenti a generi di lungo uso sicuro nell’essere umano, in grado di fornire un effetto benefico suH'organismo ospite, quando assunti in quantità idonee.

L'utilizzo dei batteri probiotici per la preparazione di integratori alimentari o prodotti dietetici à ̈ ampiamente documentata in letteratura.

Tipici esempi di batteri probiotici di comune utilizzo in ambito nutrizionale e dietetico appartengono al genere Lactobacillus.

Questi Lactobacilli vengono comunemente somministrati per via orale in forma di sospensione o di liofilizzato con il fine di integrare la flora batterica intestinale e di ripristinare le condizioni ottimali per lo sviluppo della comune flora intestinale.

Il mercato dei prodotti probiotici ha avuto una considerevole espansione negli ultimi anni grazie alle proprietà riscontrate per alcuni tipi di microrganismi e per la loro sicurezza di impiego nell’ambito dietetico ed alimentare.

Tuttavia, esiste ancora oggi una costante e crescente domanda per nuovi prodotti o integratori a base di microorganismi probiotici, il cui utilizzo sia privo di controindicazioni e che trovino indicazioni di utilizzo in specifici settori come quello dermatologico e cosmetico.

Uno degli scopi generali della presente invenzione consiste quindi nel fornire un selezionato microorganismo probiotico che presenti proprietà apprezzabili in ambito dermatologico o cosmetico e che si presti ad essere formulato sia per la somministrato orale che topica.

Un altro scopo dell’invenzione consiste nel fornire preparati nutrizionali/dietetici per la somministrazione orale o composizioni per l’applicazione topica contenenti un selezionato ceppo di Lactobacillus che svolgano una apprezzabile attività antinfiammatoria a livello della cute.

Ancora un altro scopo della presente invenzione consiste nel fornire integratori alimentari per l’assunzione orale o composizioni cosmetiche ad uso topico contenenti un selezionato ceppo di Lactobacillus, che svolga un’attività di prevenzione e trattamento delle più comuni affezioni della pelle su base infiammatoria o allergica.

In vista di questi scopi la Richiedente ha selezionato, tra i microorganismi probiotici, un ceppo di Lactobacillus appartenente alla specie rhamnosus che inaspettatamente esercita una marcata azione antiinfiammatoria quando somministrato per via orale o applicato per via topica.

In accordo ad un primo aspetto della presente invenzione, viene quindi fornito uno specifico batterio probiotico appartenente al genere Lactobacillus, specie rhamnosus, depositato dalla Richiedente (Depositor) presso idoneo Centro di deposito di microorganismi ed a cui l'Autorità di Deposito Internazionale (International Depositary Authority) ha dato numero di accesso LMG P-25211.

Specificatamente, questo selezionato ceppo à ̈ stato depositato, a nome della stessa Richiedente, ai fini della procedura di brevettazione, in accordo con le condizioni previste dal Trattato di Budapest, presso il Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM - LMC; presso Università di Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgio, in data 11 febbraio 2009, con numero di Accesso LMG P-25211.

Il riferimento di identificazione del microorganismo fornito dal depositante (depositor, ovvero Giuliani Spa, Milano) al deposito à ̈ Lactobacillus rhamnosus T12.

La Richiedente ha osservato, per questo selezionato ceppo di Lactobacillus rhamnosus, una inaspettata attività antinfiammatoria, non riscontrabile per i microorganismi probiotici noti, incluso i più comuni lactobacilli.

La Richiedente ha riscontrato che il ceppo Lactobacillus rhamnosus LMG P-25211 dell’invenzione sorprendentemente possiede una capacità di aumentare in maniera significativa l'espressione della proteina antinfiammatoria PPARy e, per contro, di ridurre l’espressione delPenzima COX-2, una proteina pro-infiammatoria, in condizioni basali.

Questa attività non à ̈ stata riscontrata per altri lactobacilli noti, anche se appartenenti alla stessa specie rhamnosus.

Secondo un aspetto dell’invenzione viene quindi fornito il ceppo Lactobacillus rhamnosus LMG P-25211 per l’uso nei trattamento o nella prevenzione di una qualsiasi affezione su base infiammatoria e/o allergica, in particolare se localizzata a livello cutaneo.

Secondo un aspetto dell’Invenzione, il ceppo secondo l’invenzione trova quindi applicazione in tutte quelle situazioni in cui à ̈ in atto un processo di flogosi e si vuole attenuare la risposta infiammatoria in particolare qualora presente a livello cutaneo.

Per ottenere la risposta antinfiammatoria il ceppo dell’invenzione può essere veicolato, al sito di azione, utilizzando un idoneo veicolo fisiologicamente accettabile.

Con il termine di veicolo fisiologicamente accettabile si intende una qualsiasi sostanza che à ̈ atta a supportare il ceppo dell’invenzione e che non produce effetti dannosi alla salute quando somministrata ad un essere umano o ad un animale.

Il veicolo fisiologicamente accettabile può essere un qualsiasi alimento, prodotto farmaceutico o cosmetico, idoneo alla somministrazione orale o topica ed in cui il microrganismo dell’invenzione o una sua coltura supernatante può essere incorporato.

A titolo di esempio, nel caso della somministrazione orale del ceppo dell’invenzione possono essere utilizzati uno o più veicoli comunemente utilizzati nell’ambito della formulazione degli integratori alimentari o dei prodotti dietetici o semplicemente uno o più anche alimenti idonei a veicolare i microorganismo quale, ad esempio, il latte e suoi derivati, yogurt, formaggio, latte fermentato, panna, gelato, prodotti a base di cereali fermentati, prodotti a base di latte in polvere, alimenti dietetici per bambini o animali, sospensioni batteriche orali, supplementi alimentari secchi o umidi. Per prodotti cosmetici creme, paste, lozioni, soluzioni, gel, fluidi per il corpo, creme solari, creme dopo sole, creme anti età, unguenti, in cui il microrganismo può essere incluso in forma viva, semiattiva, o in forma deattivata (tindalizzato), per esempio come polvere liofilizzata. Nei prodotti cosmetici possono essere incluse anche culture supematanti del ceppo dell'invenzione, opzionalmente in forma concentrata.

Tipicamente, quando il ceppo dell’invenzione viene somministrato ad un individuo l'attività antinfiammatoria sarà dose dipendente. Ad esempio, si possono includere da 10<5>a 10<12>microrganismi/g di prodotto, in cui il microrganismo può essere vitale o meno.

Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione viene quindi fornito un preparato o integratore alimentare o prodotto dietetico per l’assunzione orale comprendente un quantitativo efficace di Lactobacillus rhamnosus avente numero di accesso LMG P-25211 e/o una sua frazione e/o un suo metabolita, in un veicolo fisiologicamente accettabile.

L’assunzione del preparato secondo questa forma di realizzazione trova indicazione di utilizzo nella prevenzione o nel trattamento di un qualsiasi stato di infiammazione o di allergia dell’organismo target (essere umano o animale) in particolare quando questa forma si manifesta a livello dermatologico.

In accordo ad una forma di realizzazione viene previsto l'uso un preparato o integratore alimentare o prodotto dietetico per l’assunzione orale comprendente un quantitativo efficace di Lactobacillus rhamnosus avente numero di accesso LMG P-25211 e/o una sua frazione e/o un suo metabolita per il trattamento o la prevenzione di una affezione della pelle su base infiammatoria e/o allergica.

In particolare il preparato secondo questa realizzazione può essere somministrato per trattare una affezzioen della pelle quale ad esempio acne, dermatite atopica e o seborroica, eczema e la pelle sensibile in generale.

Ad esempio, il preparato contenente il ceppo dell’invenzione, quando assunto per via orale, consente di ridurre lo stato di infiammazione che tipicamente si accompagna all’acne, determinandone così una considerevole attenuazione della sintomatologia e del prurito accessorio.

Il ceppo di Lactobacillus rhamnosus LMG P-25211, quando supportato da un idoneo veicolo, trova poi utilizzo nell’applicazione topica in una qualsiasi situazione in cui à ̈ richiesto l’apporto a livello locale di una sostanza avente effetto antinfiammatorio e/o antiallergico.

Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione viene quindi fornita una composizione per l’uso topico per il trattamento e/o la prevenzione di una affezione della pelle su base infiammatoria o allergica, comprendente un quantitativo efficace di Lactobacillus rhamnosus LMG P-25211 e/o una sua frazione e/o un suo metabolita, in un veicolo fisiologicamente accettabile.

Nell’ambito di questa forma di realizzazione, la composizione per l’uso topico può essere formulata come cosmetico oppure come medicamento.

Secondo una forma di realizzazione, la composizione dell’invenzione per l’applicazione topica può essere in forma di crema, emulsione, unguento, gel, schiuma, pomata, polvere, soluzione o sospensione acquosa, soluzione o sospensione a base oleosa o soluzione o sospensione bifasica.

A titolo di esempio la composizione per l'uso topico dell’invenzione può essere prodotta in forma solida ad esempio in forma di crema come creme facciali o per il corpo o creme solari stick, patch trans-dermici, makeup (fondotinta, cipria, fard, ombretto, mascara, matita occhi, matita labbra), oppure in forma liquida ad esempio come lozioni idrofile e/o idroalcoliche, latti, oleoliti, shampoo, bagno-schiuma, spray, dispersioni, sospensioni, oppure in forma semi-solida ad esempio come emulsioni olio in acqua o acqua in olio, serum, gel idrofili o lipofili, struccanti idrofili o oleosi.

La composizione dell’invenzione per l’uso topico può comprendere uno o più eccipienti fisiologicamente o cosmeticamente accettabili tipicamente utilizzati nella formulazione di preparati per l'applicazione locale.

A titolo di esempio nella formulazione ad uso topico possono essere incorporati eccipienti, addensanti, vitamine, aggreganti, antimicrobici, prodotti ad azione medicinali o cosmetica.

Ulteriori caratteristiche accessorie dell’invenzione sono evidenziate nella seguente descrizione dettagliata dell’invenzione che include l’illustrazione di alcune prove effettuate per selezionare lo specifico ceppo di e per verificarne le proprietà in campo nutrizionale, cosmetico, dietetico, medicinale.

I. Attività e proprietà di Lactobaciilus rhamnosus LMG P-2521 In particolare, per verificare le attività del ceppo dell’invenzione, si à ̈ ricorso ail'utilizzo di un modello in vitro di cheratinociti umani in coltura. Le prove sono state effettuate utilizzando il ceppo vivo e vitale (Lactobaciilus rhamnosus LMG P-2521, identificato ne seguito anche come T12) come riferimento positivo, al fine di verificare la sovrapponibilità dei dati con quelli precedentemente ottenuti sul vivo.

Preparazione del ceppo batterico tindalizzato

La coltura batterica tindalizzata, da utilizzarsi nel corso di alcune significative prove, à ̈ stata preparata a partire da una coltura fresca del ceppo Lactobacillus rhamnosus LMG P-25211, incubata in MRS per 16 ore a 37°C. Tale coltura à ̈ stata sottoposta a conta decimale al fine di accertare la concentrazione in cellule vive. Tale coltura à ̈ quindi stata centrifugata ed il relativo pellet, risospeso in un egual volume di terreno di coltura per i cheratinoclti, à ̈ stato trattato termicamente a 70°C per 30min, secondo la pratica della tindalizzazione industriale. La coltura à ̈ stata quindi sottoposta, post-trattamento, a conta decimale per stimare la eventuale vitalità cellulare residua. La Tabella 1 riporta i valori di conta ottenuti.

Tabella 1 - Conta decimale (UFC/ml) di CBA-L93 in forma viva e vitale ed in forma tindalizzata

Conta (UFC/ml)

LMG P-25211 vitale 1,5 x 10<a>

LMG P-25211 tindalizzato 8,9 x 10<b>

Messa in coltura e propagazione dei cheratinociti.

Il modello di utilizzazione di una linea di cheratinociti umani in coltura à ̈ stato desunto dalle prove precedentemente realizzate sul ceppo vitale. Il modello à ̈ stato infatti ritenuto, anche in questo caso, pertinente alla comparazione degli effetti immuno-modulatori realizzati dal ceppo parzialmente inattivato al calore e da quello in forma vitale.

Realizzazione delle prove mediante co-incubazione dei cheratinociti con il ceppo tindalizzato da testare

Il ceppo L.rhamnosus LMG P-25211 (T12), coltivato in doppio su terreno selettivo, à ̈ stato prelevato in fase di crescita stazionaria e preparato per le prove mediante lavaggi del pellet cellulare con PBS (phosphate buffered saline, tampone fosfato) per rimuovere il terreno di coltura esausto. Come già precedentemente osservato, la scelta di utilizzare cellule vive in fase stazionaria à ̈ stata motivata dalle osservazioni di alcuni autori, relativamente a patogeni cutanei, secondo i quali si può osservare una minore induzione immunitaria da parte di cellule batteriche in fase di crescita esponenziale rispetto alla fase stazionaria.

I pellets cellulari lavati sono stati quindi risospesi con un ugual volume del terreno di coltura dei cheratinociti. Una delle sospensioni così ottenute à ̈ stata trattata termicamente al fine di ottenere il tindalizzato (killed T12 -kT12).

Entrambi i tipi di sospensione (T12 e kT12) sono state quindi messi a contatto con i cheratinociti umani in coltura (108 cfu/ml, MOl 1:50). Parallelamente i cheratinociti sono stati pre-trattati con lipopolisaccaride (LPS) 10 pg/ml per 30 minuti e quindi incubati con i ceppi batterici, come sopra descritto. Dopo 1 ora di incubazione, le cellule sono state lavate ed il terreno di coltura ripristinato.

La coltura cellulare à ̈ quindi stata protratta per ulteriori 3 ore (per Western blot) o 24 ore (per saggi ELISA).

Al termine dell'incubazione le cellule sono state lisae in RIPA buffer ed il lisato cellulare analizzato mediante Western Blotting per determinare l'espressione di PPARa, PPARb, PPARy e COX2. Il terreno di coltura invece à ̈ stato saggiato mediante ELISA per valutare i livelli delle citochine IL-6, IL-10 e IL-1 β.

Allestimento dei saggi ELISA per la determinazione del rilascio di citochine ML-6. IL-10 ed 1L-1B1

11 terreno di coltura dei cheratinociti à ̈ stato saggiato mediante ELISA al fine di valutare i livelli di citochine IL-6, IL-10 e IL-Ιβ.

Come nei saggi eseguiti in precedenza, la citochina IL-Ιβ à ̈ risultata non dosabile in tutti i campioni testati.

Relativamente ad IL-6, come mostrato in Figura 1, in condizioni basali i ceppi LMG P-25211 (T12), in vivo o tindalizzato, hanno aumentato la produzione e la secrezione di questa citochina da parte dei cheratinociti rispetto al controllo, confermando i dati delle prove precedenti. In seguito a condizioni di infiammazione, come nel caso di stimolazione con LPS, la produzione di IL-6 risulta invece significativamente aumentata.

Nelle figure:

La Figura 1 si riferisce alla determinazione di IL-6, citochina ad azione sistemica pro-infiammatoria.

La Figura 2 fa invece riferimento al rilascio di citochina anti-infiammatoria IL-10 da parte dei cheratinociti.

La figura 3 illustra il Western Biot relativo alla determinazione dell'espressione di PPARa.

La Figura 4 si riferisce ad un Western Blot relativo alla determinazione dell'espressione di PPARy.

La Figura 4b illustra la quantificazione dell'espressione di PPARy da parte dei cheratinociti

La Figura 5illustra un Western Blot relativo alla determinazione dell'espressione di PPARÎ ́

La Figura 6 raffigura Western Blot relativo alla determinazione dell'espressione di COX-2

La Figura 7 illustra l’espressione di pactina

In condizioni basali i ceppi LMG P-25211 (T12) vitale e tindalizzato non modificano significativamente la produzione di ILIO rispetto al controllo mentre in condizioni di flogosi (per stimolazione con LPS) il ceppo LMG P-25211 (T12) vitale à ̈ in grado di aumentare la produzione e secrezione di ILIO, a differenza del tindalizzato.

1.4 Valutazione in vitro dell'induzione del meccanismo PPAR-a, PPAR-Î ́ e PPAR-v e COX-2 mediante Western blotting

Venti Î1⁄4g delle proteine totali ottenute dopo lisi dei cheratinociti stimolati con LPS e/o con i ceppi batterici sono stati frazionati mediante SDS-PAGE (7,5% p/v).

Le proteine sono quindi state trasferite su membrana PVDF.

Con riferimento alle Figure precedentemente menzionate, al fine di valutare l'espressione delle diverse proteine, tale membrana à ̈ stata quindi incubata con anticorpi specifici per il riconoscimento di PPARa (Figura 3), PPARy (Figura 4), PPAR6 (Figura 5), COX-2 (Figura 6). il caricamento delle stesse quantità di proteina per i diversi campioni à ̈ invece stato confermato mediante incubazione della membrana con anticorpo diretto contro la pactina umana, proteina espressa dalle cellule in maniera indipendente rispetto agli stimoli aggiunti (Figura 7).

Il ceppo LMG P-25211 (T12) in forma viva e vitale non sembra modificare l'espressione di PPARa, come da Figura 3, in condizioni basali dopo 4 ore di incubazione. L'espressione di tale proteina non viene modificata neppure dal ceppo LMG P-25211 (T12) sottoposto a tindalizzazione (kT12). Inoltre i livelli di PPARa non subiscono variazioni dopo incubazione con LPS (10 Î1⁄4g/ml) con o senza trattamento con i ceppi batterici, confermando quanto osservato nel corso delle esperienze precedenti.

I dati ottenuti da questi esperimenti confermano l'incremento dell'espressione di PPARy, come fa Fig. 4, a seguito dell'incubazione dei cheratinociti con il ceppo LMG P-25211 (T12), come riportato nei precedenti esperimenti. Al fine di quantificare tali variazioni di espressione, Ã ̈ stata condotta una analisi densitometrica come da Figura 4b.

In una scala arbitraria, il ceppo LMG P-25211 (T12) ha incrementato l'espressione di PPARy di 10 volte rispetto al controllo (cheratinociti non stimolati). Il ceppo LMG P-25211 (T12) tindalizzato ha incrementato invece l'espressione di PPARy di 5 volte rispetto al controllo. Sia il ceppo vitale thà ̈ quello tindalizzato non influiscono in maniera significativa sull'espressione del PPARy in presenza di LPS.

Confermando i dati ottenuti precedentemente, l'incubazione con il ceppo LMG P-25211 (T12) vitale non ha indotto alcuna variazione nell'espressione della proteina PPARb nei cheratinociti in assenza od in presenza di LPS, come risulta dalla Figura 5. Allo stesso modo il ceppo LMG P-25211 (T12) tindalizzato non ha modificato in maniera evidente l'espressione di tale proteina.

I livelli basali di COX-2, proteina coinvolta nella sintesi delle prostaglandine pro-infiammatorie, sono stati significativamente ridotti nei cheratinociti in condizioni basali in seguito ad incubazione con il ceppo LMG P-25211 (T12) vitale. Si veda la Figura 6. L'incubazione con il ceppo tindalizzato non ha invece modificato l'espressione di tale enzima rispetto alle cellule controllo. A seguito di stimolazione con LPS (condizione di flogosi), sia il ceppo LMG P-25211 (T12) vitale sia il tindalizzato hanno mostrato un effetto simile nel ridurre i livelli di COX-2 a valori paragonabili a quelli di cellule controllo.

I livelli di espressione di βactina (Figura 7) sono stati saggiati al fine di evidenziare l’uguale caricamento per ciascuno dei campioni testati ai fini di controllo interno del metodo.

Dai risultati presentati nel corso del presente studio à ̈ emersa una netta attività anti-infiammatoria per il ceppo LMG P-25211 (T12) in forma viva e vitale, come dimostrato dall'abilità di aumentare l'espressione della proteina anti-infiammatoria PPARy e ridurre invece l'espressione dell'enzima COX-2, proteina proinfiammatoria, in condizioni basali. Tale azione inoltre viene mantenuta e confermata anche dopo stimolazione con LPS. In seguito a tindalizzazione, l'azione anti-infiammatoria del ceppo LMG P-25211 (T12) risulta essere meno evidente ma comunque importante nel ridurre i livelli di COX-2, mentre non vengono conservati gli effetti sul PPARy.

Gli esperimenti riportati non hanno evidenziato effetti significativi sul PPARa, dopo 4 ore di incubazione, né con ceppo vitale né tindalizzato.

Per quanto riguarda le citochine à ̈ stato confermato l’effetto sulla IL-6, con effetti sovrapponibili tra ceppo vitale e tindalizzato. Tale dato risulta estremamente interessante in quanto IL6 à ̈ considerata non solo una citochina pro-infiammatoria ma à ̈ anche ritenuta un fattore solubile molto importante per la rigenerazione e proliferazione cellulare. Per quanto riguarda invece IL-10 il ceppo vitale si à ̈ dimostrato più efficace nell'aumentare la produzione della citochina in presenza di LPS rispetto al tindalizzato.

II. Identificazione di Lactobacillus rhamnosus LMG P-2521

Il ceppo batterico dell’invenzione appartiene ad un genere di lungo uso sicuro, ed à ̈ particolarmente idoneo per la preparazione di una forma per l’applicazione topica per il trattamento dei fenomeni infiammatori cutanei localizzati in pelli sensibili.

Per selezionare il ceppo sono state realizzate tre diverse fasi mirate a verificare la natura dell’effetto immunostimolante presente in un gruppo di ceppi batterici su cheratinociti umani mantenuti in coltura per poi passare alla selezione di un singolo ceppo batterico adatto all'applicazione oggetto dello studio nonché la valutazione di parametri tecnologici in grado di influenzare la stabilità batterica nella formulazione commerciale mediante la verifica della sua composizione.

Fase 1: Isolamento di ceppi batterici da destinare alle successive fasi di caratterizzazione

I seguenti ceppi batterici, isolati da feci di bambino ed adulto sani, sono stati identificati dal punto di vista tassonomico, mediante metodi molecolari, e sottoposti alle successive fasi analitiche:

Lactobacillus gasseri T2

Lactobacillus paracasei 6/11

Lactobacillus gallinarum G3

Lactobacillus rhamnosus T12

Lactobacillus crispatus MU5

La scelta di tali isolati batterici à ̈ stata motivata dall'esigenza di testare uno spettro ampio di specie batteriche diverse, nell'ambito di un gruppo batterico (gen. Lactobacillus) con "lunga storia di uso sicuro", che garantissero al contempo buoni livelli di produzione di biomassa.

Fase 2: Valutazione delle potenzialità dei ceppi isolati in termini di attivazione immunitaria, prò- ed anti-infiammatoria, produzione di molecole attive.

1.2.1 Attivazione immunitaria

La concretizzazione di quanto previsto dalla presente attività à ̈ stata ottenuta operando la scelta dei cheratinociti umani in coltura come substrato ideale per le determinazioni preliminari necessarie a valutare l'efficacia di una preparazione cosmetica destinata al trattamento delle irritazioni cutanee mediante batteri lattici vivi. I cheratinociti rappresentano infatti la prima linea di difesa della pelle rispetto allambiente esterno, essendo disseminati nello strato cutaneo esterno (epidermide) e possono indurre la secrezione di citochine e chemochine per veicolare il messaggio di allerta agli strati più profondi della cute, generando la risposta infiammatoria, Nel corso della loro evoluzione subiscono una migrazione dagli strati più profondi a quelli più superficiali, con progressiva deposizione di cheratina, responsabile dell'azione protettiva.

I cheratinociti primari umani possono essere coltivati ex-vivo in laboratorio e destinati alle prove di co-coltura con ceppi batterici al fine di individuare la natura della risposta immunitaria da questi ultimi indotta. La letteratura riporta notizie di tali prove realizzate con patogeni cutanei (es. Propionibacterium acnes) al fine di valutare la natura della risposta immunitaria generata dal patogeno sulla cute umana. Poche informazioni sono invece disponibili relativamente all'azione legata a potenziali "probiotici" cutanei data la novità di tale applicazione.

I ceppi batterici elencati al paragrafo 1.1 sono stati coltivati su terreno selettivo, prelevati in fase di crescita stazionaria e preparati per le prove mediante lavaggi del pellet cellulare con PBS (phosphate buffered saline, tampone fosfato) per rimuovere il terreno di coltura esausto. La scelta di utilizzare cellule vive in fase stazionaria à ̈ stata motivata dalle osservazioni di alcuni autori, relativamente a patogeni cutanei, che hanno osservato una minore induzione immunitaria da parte di cellule batteriche in fase di crescita esponenziale rispetto alla fase stazionaria.

La coltura lavata à ̈ stata quindi risospesa con PBS e messa a contatto, per tempi di 3 ore e 24 ore, con un monolayer di cheratinociti umani in coltura in fase di proliferazione attiva. La quantità di coltura batterica utilizzata a stata dell'ordine di 108 UFC per mi di sospensione cellulare.

Al termine del tempo di contatto il surnatante dei cheratinociti à ̈ stato sottoposto alla determinazione del contenuto in interleuchine 10, 6 ed 1 (IL-IO, IL-6, IL-1) mediante appositi kit Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay). I risultati ottenuti sono sintetizzati in Tab. 1.

Tabella 1 - Produzione di Interleuchine 10, 6 ed 1 da parte dei ceppi batterici in studio

Ceppo IL- 10 IL- 6 (pg/ml) EL-1 Proliferazione 24 hr 24 hr 24 hr 24 hr

MU5 627,9* 604,3* Non dosabile 123%

G3 585,1 640,7* Non dosabile 117%

T2 578,7 576,7 Non dosabile 135%

T12 597,9* 664,3* Non dosabile 116%

LPS Non dosabile 110% Staurosporina 53%

3 hr 3 hr

Controllo 619,4 576,7 Non dosabile

MU5 655,6 1097,8 Non dosabile

G3 664,3 679,2 Non dosabile

T2 636,4 583,1 Non dosabile

T12 698,4 677,1 Non dosabile

Il segno * nella Tab. 1 identifica ì valori significativamente elevati rispetto al controllo.

Come atteso non à ̈ stata rilevata alcuna produzione di IL-1, come già osservato da Graham (2004) secondo cui i cheratinociti umani esprimono livelli molto bassi di tale citochina pro-infiammatoria. Significativi incrementi di IL-1 sono stati infatti osservati per effetto del contatto con P. acnes (Graham 2004) che genera un consistente effetto pro-infiammatorio. Al contrario, il contatto dei lattobacilli con i cheratinociti non ha determinato alcuna variazione significativa nei livelli di IL-1 (Tab. 1).

Alcuni dei ceppi batterici testati hanno invece determinato, a seguito del contatto, un consistente incremento nell’espressione di citochine antiinfiammatorie. In particolare MU5, e T12, hanno rivelato una significativa potenzialità anti-infiammatorìa attraverso l'induzione di 11-10 ed IL-6 soprattutto dopo un prolungato tempo di esposizione. La risposta antiinfiammatoria indotta dal trattamento con alcuni lattobacilli si presenta di potenziale interesse applicativo per l’eventuale controbilanciamento dell’azione proinfiammatoria svolta da certi patogeni cutanei.

Un elemento di potenziale interesse à ̈ inoltre rappresentato dall'induzione, da parte dei lattobacilli testati, del rilascio di TGF-β (transforming growth factor), noto promotore della formazione del tessuto di granulazione neN’ambito del processo di riparazione cutanea delle ferite. Il potenziamento del suo rilascio potrebbe quindi rappresentare un prezioso input per la riepitelizzazione cutanea. La letteratura riporta tuttavia dati controversi circa il coinvolgimento di TGF-β nell’elastosi solare per cui si ritiene che la risposta all’esposizione dei cheratinociti ai lattobacilli, rispetto all’induzione di tale fattore, debba e possa essere meglio indagata in vivo.

1.2.2 Produzione di metaboliti

Alcune specie del genere Lactobacillus spp. sono in grado di produrre acqua ossigenata se esposte al contatto con l’aria. La produzione di acqua ossigenata potrebbe essere perciò espressa da lattobacilli vivi messi a contatto con la superficie cutanea e pertanto esposti all’ossigeno. La capacità di rilasciare H2O2 nell’ambiente à ̈ stata valutata quantitativamente in vitro per i ceppi oggetto del presente studio.

Il metodo di determinazione utilizzato ha fatto riferimento a quanto descritto da Yap et al. (2000). Le colture batteriche sono state incubate per 1-8 ore a 37°C alio scopo di mimare vari tempi di contatto dei microorganismi da testare con la superficie cutanea. Le colture sono state quindi sottoposte a conta decimale delle cellule vive ed alla misurazione del'H202 mediante test colorimetrico, come descritto da Yap et ai. (2000).

TABELLA 2

Incubatimi

time

(hours)

H2O2 released (Ng/10<9>CFU5 )

L.johnsonii L. gasseri L.plantarum L.paracasei L.crispatus L. gasserl L.paracaseiL.galiinarum L rhamnosus

ATCC DSM 20243T ATCC 21028 NODO 151T MU5 T2 6/1 G3

33200T T12

ι 22.10 15,67 0,00 0,00 47,44 14,55 0,00 12,00 0,00

35,33

2 24,50 17,04 0,06 0,03 16,50 0,01 13,65 0,00

4 30,16 22,56 0,06 0,06 8,33 19,23 0,04 17,21 0,03

6 35,22 25,98 0,07 0,06 9,27 21,47 21,47 20,97 0,05 8 37,40 28,55 0,13 0,08 7,98 25,98 25,98 24,76 0,08 I dati illustrati in Tab. 2 mostrano che i ceppi Mu5, T2 e G3 hanno presentato consistenti livelli di rilascio di acqua ossigenata nel surnatante. L'accumulo di acqua ossigenata da parte di specie del gruppo ''acidophilus", quali L. gallinarum, L. crispatus e L. gasseri, risponde alle caratteristiche riscontrate anche in letteratura per queste specie, che producono H2O2 per effetto del metabolismo aerobio ma risultano incapaci di detossificarla, essendo privi di strutture cellulari di degradazione dell' H202.

Le altre specie considerate non hanno invece prodotto livelli detectabili di H202 neppure a seguito di esposizione aerobia.

1.3 Valutazione in vitro dell'induzione del meccanismo PPAR mediante l'impiego di linee cellulari di cheratinociti

Obiettivo di questa fase era la valutazione del livello di espressione, da parte di un monolayer di cheratinociti umani, di alcuni biomarkers a seguito del contatto con colture batteriche in fase stazionaria. Le procedure operative utilizzate sono state di due tipi: a) Cheratinociti umani posti in coltura sono stati incubati con i diversi ceppi di lattobacilli (M01 50) per 1 ora. Le cellule sono state quindi lavate, il terreno di coltura ripristinato e la coltura cellulare protratta per ulteriori 4 ore; b) Cheratinociti umani posti in coltura sono stati pre-trattati con una soluzione contenente lìpopolisaccaridl (LPS 10ug/m1) per 30 minuti e successivamente incubati con i diversi ceppi di lattobacilli (M01 50) per 1 ora. Le cellule sono state quindi lavate, il terreno di coltura ripristinato e la coltura cellulare protratta per ulteriori 4 ore.

In entrambi i casi (a) e b)) al termine delle 4 ore, le cellule sono state raccolte e lisae in RIPA buffer. Venti

delle proteine totali così ottenute sono state frazionate mediante SDS-PAGE (7,5% p/v) e trasferite su membrana PVDF. Al fine di valutare l'espressione delle diverse proteine, tale membrana e stata quindi incubata con anticorpi specifici per il riconoscimento di PPARy, PPARa, PPARÎ ́ e COX-2.

La scelta di valutare il grado di attivazione dei peroxisome proliferatoractivated receptors (PPARs) à ̈ stata legata al fatto che tali fattori di trascrizione sono abitualmente espressi anche a livello cutaneo, oltre che in numerosi altri organi, nell'uomo e negli animali ed intervengono in una molteplicità di processi di fondamentale importanza per il mantenimento della omeostasi cutanea e della corretta differenziazione delle ghiandole sebacee (Di Poi, 2004).

La cyclooxygenase (COX-2) à ̈ una proteina, espressa anche a livello della pelle, a cui viene attribuita la responsabilità, in caso di sovra-espressione, di induzione di fenomeni infiammatori. La COX-2 rappresenta infatti il bersaglio per la maggior parte dei trattamenti con farmaci antiinfiammatori non steroidei. La sovraregolazione della COX-2 ed il relativo aumento della sintesi di prostaglandine à ̈ ritenuta una fattore chiave nella tumorigenesi della pelle (Elmets 2002; Fischer 2004).

1.3.1. Determinazione dell'espressione di PPAR-y

Il livello di espressione di PPAR-y nei cheratinociti esposti ai battei non ha mostrato significative variazioni per nessuno dei ceppi testati rispetto al controllo, nà ̈ in caso di pre-trattamento (B) con LPS nà ̈ in caso di sua assenza (A).

1.3.2. Determinazione dell'espressione di PPÀR-a

Il livello di espressione di PPAR- a nei cheratinocitì esposti ai batteri non ha mostrato significative variazioni per la maggiore parte dei ceppi testati rispetto al controllo, né in caso di pre-trattamento (B) con LPS né in caso di sua assenza (A). Solo il ceppo T2 ha determinato un incremento di espressione dei PPAR-α nei cheratinocitì esposti al batterio senza pretrattamento con LPS.

1.3.3. Determinazione dell'espressione di PPAR-Î ́

Nessun effetto di significativo aumento di espressione del suddetto marcatore à ̈ stato evidenziato.

1.3.4 Determinazione dell'espressione di CO-X-2

I ceppi G3 e T12 hanno ridotto in maniera drastica i livelli basali di questo enzima, mentre T2 sembra agire solo parzialmente. A seguito del trattamento con LPS à ̈ stata riscontrata una induzione della COX2. Tale azione batterica riveste un consistente interesse nel controllo della sovra-regolazione dell’enzima COX-2 associato ai fenomeni infiammatori cutanei.

Le prove descritte ai punti da 1.3.1 a 1.3.4 sono state ripetute, per il ceppo T12 che aveva fornito significative indicazioni nel corso delle prove precedenti, prolungando i tempi di esposizione dei cheratinocitì alle cellule batteriche a 2 ore e 6 ore, rispettivamente, al fine di verificare se la mancata modificazione dei livelli dei recettori PPAR fosse legata al ridotto tempo di induzione utilizzato nel corso delle prove. I risultati ottenuti evidenziano che, mentre i livelli di PPAR-y e PPAR-Î ́ non vengono significativamente modificati dall’azione di induzione batterica, quelli di PPAR-α subiscono una consistente variazione, rispetto al controllo, per tempi di trattamento prolungati. Alla luce di quanto indicato da Di Poi (2004) circa il ruolo del PPAR-α nella formazione della barriera cutanea, l’azione esercitata dal ceppo T12 conferma di rivestire un consistente interesse nella promozione della resistenza epidermica all’azione degli agenti ambientali. Il ruolo chiave del PPAR-α nell’omeostasi cutanea à ̈ anche dimostrato dall’esistenza di brevetti che tutelano l’utilizzazione di farmaci che, agendo come recettori di tale attivatore, vengono utilizzati nel trattamento delle alterazioni cutanee (US patent n. 6060515 del 2000).

Anche il livello di espressione di Î3⁄4-caderina à ̈ stata valutata al fine di evidenziare eventuali variazioni nell’espressione di questa proteina che svolge un’importante funzione di giunzione tra cellule epiteliali. Nessuna significativa variazione à ̈ stata rilevata.

Le variazioni dei livelli di espressione dei recettori PPARs sono state ulteriormente valutate attraverso l’osservazione al microscopio a fluorescenza, che ha confermato la risposta di induzione dell’espressione di PPAR-α a seguito del contatto dei cheratinociti per 1 ora con il ceppo T12 mentre i recettori y e β non hanno rivelato variazioni significative. I cheratinociti sono stati trattati con anticorpi specifici contro i suddetti recettori con successiva rivelazione del segnale fluorescente.

1.4 Valutazione in vitro dell’attività di inibizione dei patogeni cutanei I seguenti batteri patogeni sono stati considerati per l'effettuazione delle prove di inibizione in vitro

Candida aibicans SKF 2270

Staphylococcus aureus ATCC 19636

Staphylococcus epidermidis (isolato clinico)

Streptococcus pyogenes SKF 13400

Enterococcus faecalis (isolato clinico)

Le prove sono state realizzate secondo quanto descritto da Coconnier et al. (1997), mediante inclusione dei patogeni in piastra e verifica della capacità inibente esercitata dai ceppi batterici da testare (sia come coltura lavata sia come surnatante) nei confronti della crescita dei patogeni.

La misura dell'alone di inibizione ha rappresentato il parametro di riferimento per la valutazione dell'attività inibente esercitata dal surnatante.

Il controllo à ̈ stato rappresentato dalla muffa Planobispora rosea che possiede un’attività inibitoria nota. Il controllo negativo à ̈ stato ottenuto con soluzione fisiologica.

I risultati hanno evidenziato una lieve azione inibente per i ceppi MU5 e G3 nei confronti di S. aureus e per i ceppi T12 e G3 nei confronti di S. pyogenes, mentre nessuna attività significativa à ̈ stata riscontrata nei confronti degli altri patogeni testati.

I risultati precedentemente descritti sono stati riassunti nella Tabella 3 con attribuzione di un asterisco a seguito di un risultato positivo conseguito per uno specifico ceppo batterico. La somma degli asterischi attribuiti a ciascun ceppo ha rappresentato la chiave del processo decisionale.

Tabella 3 - Prospetto decisionale

Attivazione H202 PPARs COX-2 Inibizione Punteggio totale immunitaria patogeni

II-6 IL-10 TGF-β a 6 y

X XX

s gasseri T2 X X 2

0

X X X 4

X X X X 5

X X X X 5

I ceppi T12 e MU5 hanno evidenziato caratteristiche di interesse analitico, con particolare riferimento al ceppo T12. Quest’ultimo à ̈ risultato l’unico ceppo in grado di interagire in maniera significativa con i recettori PPAR. Un possibile spiegazione dell’attività anti-infiammatoria evidenziata sembra ricollegabile a questa proprietà in parte riconducibile ad un meccanismo di azione tipico solo per questo ceppo.

1 4 Verifica delle formulazioni idonee,

Si à ̈ proceduto individuando i componenti critici per la stabilità batterica e le possibili strategie per garantire l'adeguata shelf-life del prodotto.

Alcune sostanze, elencate in seguito (Fase 3) sono state testate per la sopravvivenza dei ceppi selezionati. Le potenziali difficoltà tecnologiche associate al ricorso di un lattobacillo vivo per l’ottenimento di uno stabile preparato ad uso topico, sono state by-passate ricorrendo alla verifica dell’efficacia del ceppo selezionato (L.rhmanosus T12) in forma parzialmente inattivata al calore

3.1 Fornitura di liofilizzati batterici per prove preliminari Due liofilizzati batterici sono state predisposte come formulazioni di prova. Le caratteristiche dei liofilizzati sono elencate in seguito:

Lactobacillus rhamnosus 75 g 7,9 x 109 UFC/g

Lactobacillus acidophilus 49 g 3,0 x 1010 UFC/g

Le successive attività, previste per formulazioni di prova, da prepararsi durante l’esecuzione della Fase 1, sono state trasferite a carico della formulazione potenzialmente “definitiva†, basata sull’impiego dei ceppi T12 o MU5. A tale scopo sono state effettuate le attività descritte nei successivi paragrafi.

Prove di stabilità delle colture dei ceppi batterici selezionati in matrici oleose.

I ceppi batterici selezionati sono stati coltivati in terreno sintetico selettivo e le cellule ottenute sono state lavate due volte con fisiologica al fine di rimuovere il terreno colturale esausto.

Le colture così ottenute sono state risospese in acqua fisiologica e sottoposte a conta decimale per determinare la concentrazione in cellule vive.

Le colture sono state quindi miscelate, mediante vigorosa agitazione, alle matrici oleose e le emulsioni così ottenute sono state conservate a temperatura ambiente, al fine di creare condizioni ambientali che mimassero la conservazione del prodotto commerciale e di porre le cellule batteriche nelle peggiori condizioni di idratazione.

I risultati di stabilità ottenuti dopo 7, 14 e 30 gg di conservazione sono

riassunti nella seguente Tabella 4.

II composto CB à ̈ stato escluso dalla prova a causa della sua corrosività nei

confronti del materiale di laboratorio utilizzato per l'effettuazione delle prove.

Tabella 4 - Perdita di vitalità (in Iog10 UFC) dei 3 ceppi batterici testati dopo

7 (A), 14 (B) e 30 gg (C) di conservazione a temperatura ambiente in

condizioni di idratazione in emulsione con matrici oleose

Tempo A

L. rhamnosus T12 L. crispatus MU5 COMPOSTI Derdita in Ioa10 CFUs Derdita in Ioa10 CFUs

OG 6,49 5,56

VB 6,49 5,56

PEH 6,49 5,56

ST 6,49 5,56

CB nd nd

GE 4.01 5,56 5,565,56

N 2.01

DC 4,71

BK 6,49 5,56

Tempo B

L rhamnosus T12 L. crispatus MU5 COMPOSTI perdita in Ioq10 CFUs perdita in Ioq10 CFUs

OG 6,49 6,56

VB 6,49 6,56

PEH 6.49 6.56

ST 6.49 6.56

CB nd nd

GE 4,17 6.56 6,566,56

N 2.49

DC 4,89

BK 6.49 6,56

Tempo C

L. rhamnosus T12 L. crispatus MU5

COMPOSTI perdita in Iog10 CFUs perdita in Iog10 CFUs

OG 6,49 6,56

VB 6,49 6,56

PEH 6.49 6.56

ST 6.49 6.56

CB nd nd

GE 5.49 6.56

N 6.49 6,56

DC 5.49 6,56

BK 6.49 6,56

I composti utilizzati identificati con sigle sono costituiti dalle seguenti matrici oleose:

OG: olio di germe di grano

VB: vaselina bianca

PEH: palmitato d’etile-2-esile

ST: SI TEC DM100 dimeticone

CB:: cetiol β-dibutil adipato

GE: SF1202-GE ciclometicone

N: Nesatol C10-18 trigliceridi

DC: Dow Corning 9041 (dimeticone dimeticone polimero reticolato)

BK: Burro di karité.

Le condizioni estreme applicate alla conservazione dei ceppi selezionati (idratazione, esposizione alia luce e temperatura elevata) hanno determinato un brusco decremento di vitalità, sin dai primi giorni di stoccaggio, per alcune delle matrici utilizzate.

IL ceppo MU5 ha evidenziato una forte instabilità in tutte le sostanze testate, in accordo con le caratteristiche di sensibilità agli stress ambientali della specie di appartenenza. Questo ceppo non à ̈ quindi risultato idoneo per la realizzazione di formulazione topiche.

Il ceppo T12 ha viceversa rivelato una perdita contenuta di vitalità solo nella matrice Nesatol C10-18 triglycerides sino al 14°giorno con successivo significativo calo di cellule vive.

Preparazione di liofilizzati su scala di laboratorio dei ceppi batterici selezionati

In considerazione dei risultati delle precedenti prove di stabilità si à ̈ ritenuto opportuno provvedere alla preparazione di liofilizzati del ceppo batterico T12 mentre il ceppo MU5 à ̈ stato escluso poiché ha rivelato scarsa resistenza nelle condizioni ambientali, al fine di provvedere a valutare la miscibilità delle polveri batteriche ai composti utilizzati nelle formulazioni cosmetiche e la relativa stabilità, espressa come numero di cellule vive.

I liofilizzati ottenuti presentano la seguente carica:

- L. rhamnosus T12 130 g 2,0 x 1011 UFC/g

Le polveri batteriche liofilizzate sono risultate idonee per la miscelazione con altre componenti tipiche per la formulazione di composti topici.

I seguenti esempi sono forniti a mero scopo illustrativo della presente invenzione e non devono essere intesi in senso limitativo dell’ambito di protezione come risulta dalle accluse rivendicazioni.

Esempio 1

DETERGENTE

Componente (nome INCI) . Quantità p/p (%) Sodium lauryl glutamate . 1 ,00-6,00 Sodium lauryl sarcosinate . 1,00-6,00 PEG-120 Methyl glucose dioleate . 1,00-4,00 Glycol distearate . 0,, 20-1, 00 Sodium laureth sulfate . 0,, 20-1 ,00 Myrystyl alcohol . 0,, 20-1 ,00 Cocamydopropyl betaine . 0,50-1,00 Sodium cocoyl glutamate . 1 ,00-6,00 Disodium EDTA . 0,025-0,20 Lactobacillus rhamnosus T12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1<*>10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 PEG-60 Maracuja glycerides . 0,50-1 ,50 Phenoxyethanol . 0,70-0,90 Methylparaben . 0,10-0,20 Propylparaben . 0,01-0,04 Parfum . 0,30-0,40 Aqua . q.b. 100,00 Esempio 2

DEODORANTE ROLL-ON

Componente (nome INCI) Quantità p/p (%) Steareth-2 . 1 ,00-3,00 Steareth-21 . 1 ,00-1 ,50 Glycerin . 1,00-4,00 PPG-15 Stearyl ether . 1 ,00-5,00 Aluminium chloridrate . 10,0-17, 0 Lactobaciilus rhamnosus T12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1 *10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 Phenoxyethanol . 0,70-0,90 Methylparaben . 0, 10-0,20 Propylparaben . 0,01-0,04 Parfum . 0,50-0,60 Aqua . q.b. 100,00 Esempio 3

UNGUENTO

Componente (nome INCI) Quantità p/p (%) Paraffinum liquidum . 1.00-5,00 PEG-8 . 5.00-75,00 PEG-40 . 2,00-30,00 PEG-75 . 1,00-10,00 Hydrogenated polysobutene . 1,00-10,00 PPG-15 Stearyl ether . 1 ,00-3,00 Lactobacillus rhamnosus T 12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1 *10 exp 11 ufo) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 Esempio 4

DETERGENTE LEAVE ON

Componente (nome INCI) . Quantità p/p (%) Propylene glycol . 1 ,00-4,00 Lactobacillus rhamnosus T12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1 *10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 Paraffinum liquidum . 1,00-5,00 PEG-8 Beeswax . 1 ,00-5,00 Xanthan gum . 0,10-0,40 Ceatearyl alcohol . 1,00-4,00 Oryza sativa cera . 0,10-1 ,50 Citric acid . 0,10-0,30 Ammonium giycirrhizate . 0,001-0,01 Sodium hydroximethylglycinate . 0-10-0,50 Phenoxyethanol . 0,70-0,90 Aqua . q.b. 100,00

Esempio 5

CREMA FLUIDA DOPOBARBA

Componente (nome INCI) . Quantità p/p (%) Glycerin . 1 ,00-4,00 Propanediol . 1 ,00-3,00 PEG-100 Stearate . 0,10-0,40 Glyceryi stearate . 0,10-0,40 Xanthan gum . 0,10-0,40 Ceatearyl alcohol . 0,10-0,40 Disodium EDTA . 0,025-0,20 Lactobacillus rhamnosus T 12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1<*>10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01 -0,50 Hydrogenated polydecene . 1 ,00-5,00 Caprilic/capric triglycerides . 1 ,00-5,00 Butyrospermum parkii . 1 ,00-5,00 Meadowfoam (Limnanthes alba) seed oil . 1 ,00-3,00 Dimethicone . 1 ,00-3,00 Sodium hydroximethylglycinate . 0-10-0,20 Phenoxyethanol . 0,70-0,90 Lactic acid . q.b. to pH 5,5 Parfum . 0,30

Delta tocopherol . 0,02-0,25 Sorbityl furfural . 0,10-0,90 Aqua . q.b. 100,00

Esempio 6

LATTE CORPO

Componente (nome INCI) Quantità p/p (%) Glycerin . 1 ,00-6,00 Propylene glycol . 1 ,00-6,00 Cetyl hydroxyethylceilulose . 0,10-0,40 Xanthan gum . 0,10-0,40 Tapioca starch . 1 ,00-2,00 Disodium EDTA . 0,025-0,20 Lactobacillus rhamnosus T12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1 *10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 Sorbitan stearate . 2,00-5,00 Sucrose cocoate . 0,1 0-1 ,00 Ethylexyl palmitate . 1 ,00-5,00 Hydrogenated polydecene . 100-5,00 Caprilic/capric triglycerides . 1 ,00-5,00 Butyrospermum parkii . 1 ,00-5,00 Meadowfoam (Limnanthes alba) seed oil . 1 ,00-3,00 Dimethicone . 1 ,00-3,00 Sodium hydroximethylglycinate . 0-10-0,20 Phenoxyethanol . 0,70-0,90 Lactic acid . .. q.b.

Parfum . 0,30 Delta tocopherol . 0,02-0,25 Sorbityl furfural . 0,10-0,90 Aqua . q.b. 100,00 Esempio 7

CREMA VISO

Componente (nome INCI) . Quantità p/p (%) Glycerin . 2,00-5,00 Methylpropanediol . 0,20-2,00 Acrylates/C 10-30 Alkyl acrylate crosspolymer . 1 ,00-2,00 Cetearyl alcohol . 0,20-2,50 Cetearyl glucoside . 0,20-2,50 PEG-1 00 Stearate . 0,20-1 ,00 Sodium hyaluronate . 0,05-0,5 Disodium EDTA . 0,10-0,50 Lactobacillus rhamnosus T12 lysate (ottenuto dal trattamento di un liofilizzato contenete 1<*>10 exp 11ufc) . 0,001-0,50 Maltodextrin . 0,01-0,50 Cetyl palmitate . 0,50-3,00 Hydrogenated Evening Primrose Oil . 0,50-3,00 Polybutene . 0,50-3,00 Hydrogenated castor oil . 1 ,00-4,00 Dicaprylyl ether . 1 ,00-4,00 Butyrospermum parkii . 1 ,00-5,00 Beta sitosterol . 0,10-0,50 Delta tocoferoi . 0,05-0,20 Dimethicone . 0,50-1 ,50 Dimethicone crosspolymer . 0,10-1 ,50 Sorbityl furfural . 0,5-1 ,00 Sodium hydroximethylglycinate . 0-25-0,50 Parfum . q.b.

Aqua . q.b. 100,00

Esempio 8

PRODOTTO DIETETICO - CAPSULA GELATINA MOLLE

Ogni capsula di gelatina molle (perla) contiene: . q.tà u.m. Lactobacillus rhamnosus T12 . 1<*>10 exp 9 ufc Fibra naturale insolubile . 5-100 mg Vitamina E (di-alpha tocopherol) . 0,5 mg Olio di soia . 250 mg Lecitina di soia . 5 mg Mono e di-gliceridi di acidi grassi . 30 mg Costituenti dell’involucro:

Gelatina . 145 mg Glicerolo . 67 mg

Esempio 9

PRODOTTO DIETETICO - COMPRESSE

Ogni compressa contiene . q.tà u.m. Lactobacillus rhamnosus T12 . 1<*>10 exp 9 ufc Fibra naturale insolubile . 5-100 mg Metionina . 200 mg Cellulosa Microcristallina . 100-250 mg Calcio Fosfato bibasico anidro . 100-200 mg Idrossipropilmeìilcellulosa . 30-100 mg Zinco aminoacido chelato per un quantitativo di Zn . 15 mg Acido ascorbico . 60 mg Vitamina E acetato . 15 mg Mono- e digliceridi degli acidi grassi (E471) . 5,0-10,0 mg Silicio Biossido (silice colloidale) . 5,0-10,0 mg Biotina . 0,23 mg

Esempio 10

PRODOTTO DIETETICO - CAPSULE GELATINA DURA

Ogni capsula di gelatina dura contiene: . q.tà u.m.

Lactobacilius rhamnosus T12 . 1<*>10 exp 9 ufc Nicotinammide (Vit B3) . 18 mg Maltodestrine . 5-50 mg Fibra naturale insolubile . 5-100 mg Magnesio stearato . 1-1 Omg Silicio biossido . 3-6mg Gelatina naturale . involucro esterno Esempio 11

PRODOTTO DIETETICO - GRANULATO OROSOLUBILE

Ogni bustina contiene: . q.tà u.m.

Tindalizzato di Lactobacilius rhamnosus T12 (ottenuto dai trattamento di un liofilizzato contenete 1<*>10 exp 11 ufc) . 100 mg Inulina . 5-100 mg Acido ascorbico . 50-60 mg Fruttosio . 0,5-3, 0 g Maltodestrine . 0,5 -3,0 g Acido malico . 1 -10 mg Aroma . 10,0-50,0 mg Sucralosio . 0,005mg Esempio 12

PRODOTTO DIETETICO - BUSTINE MONODOSE (MISCELA DI POLVERI) DA SCIOGLIERE IN ACQUA

Ogni bustina contiene: . q.tà u.m.

Lactobacillus rhamnosus T12 . 1<*>10 exp 9 ufc Fibra naturale insolubile . 5-100 mg Nicotinammide . 10-18 mg Acido ascorbico . 50-60 mg Metionina . 100-200 mg Estratto da colture cellulari di Ajuga reptans . 2,50 mg Biotina . 0,23mg Zinco aminoacido chelato per un quantitativo di Zn . 15 mg

Lievito al selenio per un quantitativo di Se . 0,03mg Fruttosio . 0-3 g Maltodestrine . 0-3 g

Acido malico . 0,-100 mg Sucralosio . 0,005mg Aroma . 0,25mg

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Ceppo di Lactobacillus rhamnosus avente numero di accesso LMG P-25211.
2. 2. Ceppo di Lactobacillus rhamnosus secondo la rivendicazione 1 per l’uso nel trattamento di una affezione della pelle su base infiammatoria e/o allergica.
3. 3. Composizione o integratore alimentare per l’assunzione orale comprendente un quantitativo efficace di Lactobacillus rhamnosus avente numero di accesso LMG P-25211 e/o una sua frazione e/o un suo metabolita, in un veicolo fisiologicamente accettabile.
4. 4. Uso di una composizione o integratore alimentare secondo la rivendicazione 3 per il trattamento o la prevenzione di una affezione della pelle su base infiammatoria o allergica.
5. 5. Uso di una composizione o integratore alimentare secondo la rivendicazione 4 in cui detta affezione della pelle su base infiammatoria o allergica à ̈ scelta tra acne, dermatite atopica, dermatite seborroica, eczema, pelle sensibile.
6. 6. Composizione per l’uso topico per il trattamento o la prevenzione di una affezione della pelle su base infiammatoria o allergica comprendente un quantitativo efficace di Lactobacillus rhamnosus avente numero di accesso LMG P-25211 e/o una sua frazione e/o un suo metabolita, in un veicolo fisiologicamente accettabile.
7. 7. Composizione secondo la rivendicazione 6 caratterizzata dal fatto di essere una composizione cosmetica o un medicamento.
8. 8. Composizione secondo la rivendicazione 6 o 7 caratterizzata dal fatto di essere in forma di crema, emulsione, unguento, gel, schiuma, pomata, polvere, soluzione o sospensione acquosa, soluzione o sospensione a base oleosa o soluzione o sospensione bifasica e loro miscele.
9. 9. Uso di una composizione secondo la rivendicazione 6 per il trattamento o la prevenzione di una affezione della pelle su base infiammatoria o allergica.
10. 10. Uso di una composizione secondo la rivendicazione 9 in cui detta affezione della pelle su base infiammatoria o allergica à ̈ scelta tra acne, dermatite atopica, dermatite seborroica, eczema, pelle sensibile.