SA92120509B1 - تآزر وتضافر (tnf) مع il-4 - Google Patents

Abstract

الملخص: تم الكشف عن تركيب المادة الذييشمل عامل نخر الورم السرطاني Tumor necrosis factor ، وفترلوكين -٤ 4-interleukin ( 4-IL ) . ويمنع هذا النزكيب الخلايا السرطانية في صدر الإنسان human breast cancer cells ، وخلايا سرطان الفرج vulgar carcinoma cell لهان والخلايا الليمفاوية النسيجية للانعان human histolytic lymphoid cells وذلك بطريقة الاعتماد على الجرعة dose-dependent manner . إن خصائص نمو الخلايا السرطانية في صدر الانسان نتناقص عند تعرضها د TNF أو [ 4-f IL . كل لمفرده ، ونجد على أي حال أن اتحاد كل من ذتك السيتوكينات cytokines ٠ع بعض يمنع نمو تلك الخلايا في هلريقة الاعتماد على الجرعة dose-dependent ] [ manner.^ أنه بالاضافة إلى ذلك فإن interferons IFN-g يؤدي إلى تعزيز التأثيوات المضادة للتكاثر الخلوي لمركبات بقوة أكش [ 4-لم1 TNF and ].

Description

¥ ‎,5U‏ وتضافر ‎(TNF)‏ مع ‎IL-4‏ ‏الوصف الكامل مجاز ( ‎pi AY)‏ | 2 : يتعلق هذا الاختراع باللمفاكينات ‎Lymphokines‏ وعلى وجه الخصسوص المرتبطة بالتأثيرات التازرية ‎synergistic effects‏ عامل نخر الورم السرطاني ‎TNF‏ مع انتركولين-؛ ‎interleukin IL-4‏ لمنع نمو الخلية الورمية وتسمم الخلية ‎.cytotoxicity °‏ خلفية الاختراع: السيتوكاين ‎cytokine‏ هو أي جزيء ينتج بواسطة خلية واحدة ويؤثر فيها أو في خلايا أخرى . ويوجد تتوع واسع من السيتوكينات ‎cytokines‏ والتي تمارس - كمجموعة - تأثيرات مختلفة على الخلايا الطبيعية وغير الطبيعية. ‎٠١‏ ويعتمد ‎il‏ سيتوكين ‎cytokine‏ معين على خلية محددة على نوع المسيتوكين ‎cytokine‏ ونوع خليته الهدف ‎Target cell‏ ويعتبر ‎TNF‏ نوع من السيتوكينات ‎cytokines‏ وهو أصلاً منتج من الخلايا الأحادية النشطة ‎Activated monocytes‏ . وذات التعدد الجيني النمطي العالي ‎highly pleiotropic‏ ( أي أن جين واحد في الخلية مسؤول عن تأثيرات متميزة لا ‎Ve‏ تربطها علاقات ظاهرة ( في الطبيعة كما يتضح ذلك في المراجع العلمية التالية: ‎(Ayier, et al. ( 1988 ) Tumor Necrosis Factors, CRC Handbook on‏ ‎Cytolytic Lymphocytes and Complement: Effectors of thelmmune System (E.R.‏ ‎podack. ed), CRC Press inc., Boca Raton, Fla., p. 105; Goeddel, et al. ( 1987)‏ ‎Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities.

In Cold Spring‏ ‎Harbor Symposia on Quantitative Biology, L1:597 ) > It inhibits the growth ofa ٠‏ ‎wide variety of tumor cells in culture nd stimulates the growth of fibroblasts, B-‏ ات v cells and thymocytes. The cytotoxic effects of TNF against tumor cells are potentiated by interferons ( Lee, et al., (1984 ) J. Immunol. 133:1003; Sugarman, et al. (1985) Science 230:943; Aggarwal, et al. ( 1985) Nature 318: 665; Vilcek, et al. (1986) Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferon’s, in The

Bilolgy of the Interferon System. Edited by H. Schellekenes and W.E. Stewart. °

Elsevier Science Publishers, Amsterdam., ‏.م‎ 249; Fransen, et al. ( 1986) Eru. J.

Cancer Clin. Oncol. 22:419-426; Campbell, et al. ( 1988 ) J. Immunol. 141:2325- 2329: Schiller; et al. (1987) Cancer Res. 47:2809-2813 The enhancement of the anti-proliferative effects of TNF by interferon’s accompanies the up regulation of

TNF receptors (Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; Fransen, etal. (1986) ٠

Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22:419-426. The up regulation of TNF receptors by interferon’s, however, is nota primary mechanism for their synergistic cytotxic response ( Tsujimoto, et al. ) 1986 J. Immunol. 137:2272-2276; Aggarwal and

Eesssalu (1987) J. Biol. Chem. (262:10007). ‏على تنظيم النمو الورمىي‎ TNF Interferon-g ‏إن التأثير ات التازرية ل‎ Vo cytokine IL-4 ‏موضح في براءة الاختراع الأمريكية رقم 4,189,714 ¢ إن السيتوكين‎ ‏النشطة.‎ T-lymphocytes ‏هو مُعَدل مناعي تتتجه الخلايا اللمفاوية التائية‎ ‏الجهاز المنا عي قد وصئت على أنهما‎ CYA 2s ‏ونجد أن و احدة من‎ ‏تكانفر الخلية اللمفاويمة‎ aa ‏وذلك لقدرتها على‎ B-cell ‏عامل النمو‎ (Howard, et al. J. EXP). ‏كما وضح ذلك :- المرجع‎ (B-lymphocyte) 5 ٠ ‏تشمل‎ A ‏ويؤثر 11-4 في نطاق واسع على الخلايا‎ Med. 155:914 (1982) ‏وخلايا‎ « macrophages , (Mast cells) ‏البدينة‎ LAN ‏؛‎ T-cells : ‏الخلايا النائية‎ ‏كما وضح ذلك المرجع:‎ hematopoietic progenitor cells ax ll ‏تكوين‎ ‎| (paul, et. Al/) (1987) Ann. Rev. Immunol 5:439; Yokota, et al. (1988) Immunol.

Rev. 102:137; crabstein et al. ) 1986 ( J. EXP. Med 163:1405). ٠

T-cell ‏وتعزر 11-4 نمو أنواع عديدة من الخلايا تشمل الخلايا التائية‎ ‏كما وضحت ذلك المراجع التالية:‎ mast cells ‏والخلايا البدينة‎

EAY

¢ ( Fernandez — Botran, et al. ( 1986).

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83; 9689; Spits, et al. ( 1987) J. Immunol. 139:11 42; zlotlik; et al. ( 1987 ) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3856; Mosmann, et al. ( 1986) proc Natl. Acad. SCI. USA. 83:5654.

B-cells ‏على الخلايا الباثية‎ Class II Antigen—=MHC ‏كما ويستحث التعبير عن‎ ‏كما وضحت المراجع:‎ monocytes ‏والخلايا الأحادية‎

Tevelde, etal. ) 1988( J. Immunol 140:1548

T-cells ‏من الخلايا السمية التخصصية‎ (Antigen ( ‏ويكثر المستضد‎ ‏المراجع:‎ « Macrophages ‏ويعزز من السمية الخلوية الوسيطة للبلعميات‎ ( Spits, etal. ) 1988( . J. Immunol 141:29: Wiamer; et al. (1987). J. EXP. Med. ٠١ 166:1447; Crawford, et al. (1987) J. Immunol 139:135 ). ‏إنتاج عديد من‎ downregulates a Jai ‏يقوم 4 بخفض‎ aig « [TNF-a] a ‏التي تشمل: عامل نخر الورم السرطاتي‎ Cytokines ‏السيتوكينات‎ ‏؛ والأنترلوكين ؛‎ ) 11-5 ( b= ‏؛ والأنترلوكين‎ (IFN-g) ‏والأنترفيرون = ع ؛‎

B-cells ‏البائثية‎ Lal ‏فإنه يقوم أيضاً برفع تنظيم إنتاج 1-6 بواسطة‎ (IL-la) yo ‏كما وضحث المراجع:‎

Essner el al. ( 1989 )J. Immunol. 142:3857; Lee et al. (1990). J. of Laukocyte

Biol. 47:475-479; pelman et al. ( 1989 ) J. EXP. Med. 170:1751 ). ‏كما يقوم بخفض‎ LAK ‏و‎ NK ‏يحث الأنتركولين 11-2 نشاط الخلايا‎ -: ‏وذلك كما وصح‎ IL-4 ‏التعديل بواسطة‎ 7 ( Brooks , et al. (1988) Clin. EXP. Immunol . 2 Nagler, etal. (1988). 7].

Immunol. 141:2349. ‏ونجد أنه بالإضافة إلى التأثيرات التكاثرية ل 11-4 فقد تبين حديثاً‎ ee ‏مخبرياً وليس من خلال التجارب على الكائن الحي 107100 أنه‎ sald) ‏للإنسان وخلايا البلازما وخلايا الأورام‎ Lymphoid ‏نمو الخلايا الليمفاوية‎ vo (Taylor, etal. ) 1990 ( Blood 75:5 ( plasma cells neoplasm’s ( ‏في البلازما‎ ‏اقل‎

° الوصف العام للاختراع: يرتبط الاختراع الحالي بالآشار التأزرية ‎Synergistic‏ ل ‎IL-4‏ على النشاط المضاد للتكاشثر ل ‎TNF‏ . ويحفز 11-4 التأثيرات السمية الخلوية ل ‎TNF‏ المضاد للعديد من الخلايا الورمية ؛ بما في ذلك - وليس مقتصراً على م - خلايا سرطان ض الصدر ؛ خلايا الأورام السرطانية + الخلايا اللمفاوية. وتعتمد تلك التأثيرات التأازرية ‎synergistic‏ على جرعة 11 و ‎IL-4‏ ‏ويقارن تحسين السمية الخلوية ل ‎TNF‏ بواسطة 11.4 بما نتشر من قبل ‎Las‏ ‏يتعلق ب انترفيرون = جاما ( الأنترفيرون المناعي البشري ) ( ‎-(Interferon gamma‏ ويرتبط الاختراع الحالي بالتأثيرات التازرية ‎Synergistic‏ للخلايا ‎٠‏ التائية ‎AE al (Tocells)‏ من سيتوكين ‎cytokine‏ + و 1-4[ على التأثيرات ‎Ca‏ ‏الخلوية ل ‎TNF‏ في الخلايا السرطانية. ويجسد الاختراع الحالي استخدام تركيب خال من الخلايا مكون من 11-4 و ‎TNF‏ بمقدار فعال بنسب من ‎٠:0,‏ وتمتد إلى ‎١:00‏ لصنع دواء لمعالجة الخلايا السرطائية . كذلك يُبرز الاختراع استخدام تركيب خال من ‎٠‏ الخلايا مكون من 11.4 وليمفوتوكسين ‎lymphotoxin‏ بمقدار فعال بنسب : تتراوح من ‎٠0,١‏ إلى تمتد إلى 7050 : ‎١‏ لتصنيع دواء لمعالجة الخلايا السرطانية . ووفقاً لما هو أفضل فإن تركيباً خال من الخلايا يشضمل 11-4 وليمفوتوكسين ‎lymphotoxin‏ بالإضافة إلى ‎ad gal‏ على أتترفيرون جاما ‎[interferon gamma‏ وتحفز التأثيرات المضادة للتكاثر ل ‎TNF‏ ضد عدد مختلف من الخلايا ‎٠‏ الخطية ( نسل خلوي ) ) ‎(cell lines‏ بواسطة 11-4 . حيث نجد أن 4-.]1 لوحده ليس له التأثيرات مائعة للتكاثر ضد هذا النسل الخلوي ‎cell lines‏ أو له في بعض الحالات حافز ضعيف للنمو. م

:

وقد فُورنت كمياً درجة تعزيز التأثيرات السمية ل ‎TNF‏ بواسطة ‎IL-4‏ ‏مع انترفيرون - ‎interferon gamma IFN-g Lala‏ . وعلى كل حال فإن الآلية التي بواسطتها يتم ثقوية الآشار المضادة للتكائر ل 11-4 و ‎IFN-g‏ أو تقوية الآثار السمية الخلوية ل 11077 واللمفوتوكسين ‎lymphotoxin‏ تكون مختلفة في كلتي الحالتين.

يفضل أن يكون عامل النخر الورمي ‎TNF‏ هو 1107 للإنسان وعامل النخر الورمي يمكن الحصول عليه من أي مصدر . وتعرف تلك المصادر لدى العلماء المختصين إلا أنه يفضل عامل التخر الورمي المنتج بالطرق التوليفية المتبعة في تقنيات الهندسة الوراثية ؛ كما يفضل أن يكون 11-4 هو 4 للإنسان وعامل 11-4 يمكن الحصول عليه من أي مصدر . ويمكن الحصول

‎٠‏ على 11.4 من أي مصدر . وتعرف تلك المصادر للعلماء المختصين . إلا أنه يفضل 11-4 المنتج بالطرق التوليفية المتبعة في تقنيات الهندسة الوراثية. شرح مختصر ‎iba ome Jl‏

‏يوضح ‎(V) JS‏ تأثير تركيزات مختلفة من ‎ng / ml ) IL-4 5 TNF‏ 100 ) على قابلية نمو النسل الخلوي لسرطان الصدر البشري لخط الخلايا 330 - ‎"MDA - MB‏

‎IL-4 ‏و‎ TNF ‏تأثير التركيزات المختلفة من‎ )2 B) )2 A) ‏ويوضح شكل‎ Ve ‏على قابلية نمو النسل الخلوي لسرطان الأنسجة الطلائية‎ (100 ng/ml) ‏البشري.‎ epithelial carcinoma

‎lymphoma cell ‏والنسل الخلوي اللمقلوي‎ » {A-431; Upper panel ‏؟‎ A ‏(الشكل‎ ‎{ 1-937: lower panel ١ B ‏لأنسجة الإنسان } الشكل‎

‎Y.‏ ويوضح شدكل 38 و 38 تأثير التركيزات المختلفة ل 11-4 على السمية الخلوية المعتمدة ل ‎A-431 2a TNF-dependent cytotoxicity TNF‏ ( الشكل ‎(3A‏ ‏والنسل الخلوي ‎MDA-MB-330‏ ( الشكل 38 ).

‏ويوضح شكل (؛) مقارنة تأثير كل من ‎IL-4‏ , 1710-8 على : السمية الخلوية المعتمدة ل ‎TNF-dependent cytotoxicity TNF‏ ضد خلايا ‎MPA-MB-330‏ ¢ v ‏ويوضح شكل )0( مقارنة تأثير 11-4 على السمية الخلوية المعتمدة ل‎

MDA-MB-330 ‏ضد خلايا‎ Lt, TNF ‏الوصف التفصيلي للاختراع:‎ ‏إليه من قبل‎ Ja gill ‏يعتمد هذا الاختراع على الاكتشاف الذي تم‎ ‏على‎ TNF ‏في إمكانية تعزيز النشاط المضاد للتكاثقر ل‎ J Sadly ‏المخترعين‎ ٠

INF ‏الخلايا الورمية وذلك بإعطاء 11-4 للخلايا الورمية تزامنياً مع‎ ‏ضد عديد من الخلايا‎ TNF ‏ويحفز 4م11 التأثير السمي الخلوي ل‎ ‏و‎ MDA-MB-330 ‏الورمية بما ذلك - ودون الاقتصار على الخلايا الورمية الصدرية‎ 17-937 ‏النسيجية‎ lymphoma ‏خلايا سرطان الفرج ( 8-432 ) والخلايا الليمفاوية‎ ‏كما نجد أن 4.]آ آله‎ . TNF ‏ويعتمد التأثير التازري على جرعة كل من 11.4و‎ ٠ ‏تأثيرات محدودة على الأنسال الخلوية عندما يتم تعاطيه منفرداً لوحده وكما وجد‎ ‏في بعض الأنسال الخلوية أن 11-4 يظهر نشاط تكاشقري واضح عندما يتم تعاطيه‎ ‏بواسطة 11-4 يمكن مقارنته‎ TNF ‏لوحده أيضاً . ونجد أن تعزيز السمية الخلوية ل‎ .(IFN-g) interferon gamma ‏انترفيرون‎ - Lela ‏يما سبق توضيحه آنفاً بالنسبة إلى‎ cyctokine ‏سيتوكين‎ Jai ‏ويمدنا الاختراع الحالي بتركيب تآزري‎ ‏ونجد أن هذا التركيب له تير‎ . TNF ‏مشتق من خلية تائية و 11.4 و‎ ‏عند تعاطيه لوحده.‎ TNF ‏سمي أكبر على الخلايا الورمية مقارنة بال‎ ‏ومما يتضمنه هذا الاختراع تركيب مادة تستخدم لتصنيع دواء لعلاج الخلايا‎ cyctokines ‏؛ و 11-4 . وهذان السيتوكينان‎ ite TNF ‏ل السرطانية يتكون أساساً من‎ ‏لأن كل منهما هو عبارة عن سيتوكين ) من الممكن اشتقاقهم من أي مصدر ؛ سواء‎ ( YS ‏منتجة توليفياً . كما أنه من الممكن أيضاً أن‎ proteins ‏أكان طبيعياً أو من بروتينات‎ - ‏منقى مع 11-4 بالإضافة إلى جاما‎ TNF ‏نحصل على هذا التركيب أساساً من‎ .(IFN-g) interferon gamma ‏أنترفيرون‎ ‏وتعني كلمة " فرد " أي حيوان وخاصمة الحيوان الثقدي ويفضل‎ 0 : ‏القوارض والقطة والكلب والبقرة والإنسان.‎ vo

A

‏كما هو مستخدم في مذه البراءة إلى عديد ببتيد‎ TNF ‏ويشير مصطلح‎ ‏والذي له نشاط سمي خلوي‎ » lymphotoxin ‏غير الليمفوتوكسين‎ polypeptide ‏وله منطقة تناظر أو تشابه تركيبسي‎ preferential cytotoxic activity ‏مميز‎ ‎) ‏مع تسلسل ( أو تحاقب‎ amino acid ‏للحمض الأميني‎ functional homology ‏وظيفي‎ ‎Barn ‏لعامل نخسر الورم الناضسج أو‎ amino acid ‏حمض أميني‎ sequence o ‘peptide ‏منه أو مشتق من مثل هذا الببتيد‎ fragment ‏لد أوضحت براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,190,174 وصسف‎ ‏في استخدام هذا الاختراع الحالي.‎ TNF ‏تفصيلي لفائدة‎ ‏أنه التدمير‎ cytotoxicity ‏ويعرف النشاط السمي الخلوي المميز‎ ‏المفضل أو مانع نمو الخلايا الورمية عند مقارنتها بالخلايا العادية تحت‎ oy. ‏نفس الظروف.‎ ‏وذلك‎ cytotoxicity ‏ويمكن الكشف عن النشاط السمي الخلوي المميز‎ ‏على الخلايا الورمية مخبرياً أو على الكاتن‎ polypeptide ‏بتأثير عديد الببتيد‎ ‏الحي نفسه ومقارنة هذا التأثير بالخلايا أو الأنسجة العادية . وبشكل عام فإن‎ ‏هو الدلالة التشخيصية في المختبر 107200 ( وليس على‎ cell lysis ‏الخلية‎ J las yo ‏الكائن الحي ) في حين أن النخر الورمي يقدر ويحدد في تجارب تجسري‎ .112 171170 ‏على الكائن الحي‎ ‏وبصسورة عامة فإن النشاط السمي الخلوي يظهر في صورة ركود‎ ‏خلوي أو على شكل منع تكاشر خلوي . وهناك أنظمة للقياس في هذا المجال‎ ‏الخلية تستخدم لتحديد‎ Plat ‏جلي . وعلى سسبيل المثال فإن تجارب‎ US sy, LL ‏بالمرجع:‎ (B) ‏الموضح أدناه كما هو موضح في تجارب‎ TNF ‏النشاط التخصصي ل‎

Aggarwal, et al in “Thymic Hormones and Lymphokines,” 1983, ed. A.

Goldstein, spring symposium on Health Sciences, George. Washington University.

EAY q ‏المشار إليه في المراجع يمكن الحصسول‎ (A549) ‏والنسل الخلوي‎ (ATCC as CCL 185) ‏عليه من‎ ‏يعبر عنه بتحلل الخلية الهدف‎ TNF ‏ونجد أن النشاط التخصصي ل‎ .cytostasis ‏بخلاف الركود الخلوي‎ Target cell lysis ‏كالآتي :- هي الكمية المطلوبة لأحداث‎ TNF ‏من‎ unit ‏وتعرف الوحدة‎ ° ٠ lysis of target cells ‏من الخاديا المستهدفة‎ 58 ٠ ‏تحلل‎

Jie ‏وهذا لا يعني استبعاد التجارب الأخرى لقياس النشاط التخصصي‎ ‏الطبيعي من‎ TNF ‏الطرق المبنية على معدل نمو الخلية الهدف . ونجد أن‎ ‏مقدراً بطريقة التفريد‎ ١700٠0 ‏مصادر إحيائية عادية له وزن جزيء محسوب حوالي‎ sodium dodecyl sulfate, polyacrylamide gel ‏لس‎ gel electrophoresis ‏الكهربائي‎ ٠ 5,7 ‏عند حوالي‎ isoelictric point ‏وتكون نقطة التماثل الكهربي‎ (SDS-PAGE) ‏الطبيعكي‎ TNF ‏عند مواقع عديدة . ويُثقى‎ trypsin ‏وقابلية تميؤ التربسين‎

HPLC ‏بالطور العكسي ل‎ ‏المعرف على أنه يحتوي‎ polypeptide ‏وبصورة عامة فإن عديد الببتيد‎ ‏الموصوف في براءة‎ TNF protein ‏م على مناطق متماظة جوهرياً من بروتين‎ ‏تمر‎ TNF protein ‏الاختراع الأمريكية رقم 4,150,174 أو أجزاء من بروتين‎ ‏من رواسب‎ ٠٠١ = 5١ ‏تتراوح ما بين‎ continuous block ‏فوق كمية مستمرة‎ ‏على وجه الخصوص ؛ الكميات المشمولة ببقايا الأحماض‎ «amine acid ‏حمض أميني‎

ATY - ١٠١ ‏15و‎ = Yo amino acid ‏الأمينية‎ ‎{ polypeptide ‏ونجد هناك عامل مهم في التعرف على } عديد الببتيد‎ Y. ‏التي تكون قادرة على إبطال‎ antiserum ‏وهو قدرة المصول الضدية‎ TNF ‏ك‎ ‏يكون‎ Lind ‏الناضج كما‎ TNF ‏ل‎ cytolytic ‏أو تحييد أساس نشاط التحلل الخلوي‎ polypeptide ‏لعديد الببتيد‎ cytolytic ‏أساسياً في إيطال نشاط التحلل الخلوي‎ ‏الذي نحن بصدده.‎

EAY

ب" ونجد على أي حال كما هو معروف أن تعريف المناعة وتعريف القسمم الخلوي غير ضروري كتساو في السلسلة . ونجد أن جسم مضاد ‎antibody‏ مبطل ل ‎TNF‏ لا يعوق الحصسول على البروتين ‎wo Wal protein‏ لأن الجسم المضاد ‎antibody‏ المبطل لا يوجه مباشرة ليعوق مكان ‎TNF‏ الذي م يكون حرجاً للتشاط السمي الخلوي ‎cytotoxic‏ ‏ونجد أن الجسم المضاد ‎antibody‏ بد ل من ذلك يعوق منطقة حميدة ويمارس تأثيرها المبطل وذلك بالإعاقة التزاحمية ‎steric hindrance‏ . ونجد أن البروتين ‎protein‏ المطلوب والمتحول في تلك المنطقة الحميدة لا يعوق بعد الآن تحييد الجسم المضاد ولكنه يكون عامل نخر ورمي ‎INF‏ ‏- بلغة ‎blll‏ الأساسي ‎substantial homology‏ والنشاط ‎biological activity Albay!‏ « ومن المهم أن نلاحظ أن الخصائشص مثل الوزن الجزيء ونقطة التمافل الكهربي وما شابه ذلك بالنسبة ل ‎TNF‏ الفطري ) ‎Native‏ ( للإنسان أو ‎TNE‏ ‏الخلقي ‎wild‏ للإنسان الذي يحصل عليهما من الخلايا الليمفاوية المحيطلة ؛ 0 من نسل خلوي ‎cell line‏ ويكون ذلك وصفي فقط للأنواع الخلقية من ‎TNF‏ ‎١5‏ ونجد أن ‎TNF‏ كما هو موضح في التعريف السابق يتضمن أنواعاً عديدة ولااتظهر كل خصائص ‎TNF‏ الفطري ‎Native‏ بينما نجد أن ‎TNF‏ كما عرف أنه يحتوي على ‎TNF‏ الفطري ؛ ويسقط من التعريف ما يتلق ب عديد الببتيد ‎polypeptide‏ ذو الخاصية السمية الخلوية ‎cytotoxicity polypeptides‏ ونجد على سبيل المشال أن مشتقات ‎Jie TNF‏ طفرات الإقحام ‎insertion mutants‏ أو ‎x.‏ طفرات الإلغاء ‎deletion mutants‏ أو ‎lad‏ البروتينات ‎fusion proteins‏ سسوف تجلب ‎TNF‏ ذو وزن ‎(ja‏ مختلف مكونة ‎TNF‏ فطري للإنسان ونذنلك بإدماج البروتينات ‎fusion proteins‏ مع ‎TNF‏ الناضج أو ‎ads pre TNF‏ إدخال 0 الطفرات يؤدي إلى ‎TNF‏ ذي وزن جزيئي أكبر من ‎TNF‏ الفطري والناضج بينما طفرات الإلغاء من ‎TNF‏ الفطري والناضج يؤدي إلى خفض في ‎vo‏ وزنه الجزيء . ونجد بطريقة مشابهة أن ‎TNF‏ يمكن تحويره هندسياً ل

١

Trypsin ‏من أجل خفض أو إزالة القابلية للتميؤٌ بالتربسين‎ engineered ‏هندسياً‎ ‎proteases ) ‏أي غيرها من أنزيمات البروتياز ( أنزيمات تحليل البروتين‎ (pre TNF) — post translation ‏ونجد أخيراً أن عملية (الترجمة) التقل القادمة‎ ) ‏البشضري في النسل الخلوي المشتقة من ثدييات لا أولية قد تنتج تغاير ( اختلاف‎ amino ‏في المنطقة الطرفية الأمينية‎ ) Micro heterogene ( laa ‏م جيني ضئيل‎ ‏بعد ذلك الحمض الأميني‎ (valine) amino acid ‏بحيث لا يكون الحمض الأميني‎ ‏الطرفي.‎ amino acid ‏السمي الخلوي أو النخر الورمي‎ lal ‏ونجد أن تعريف " قادر " في‎ ‏يحتوي‎ TNF ‏في نسيج الكائن الحي تعني أن مصطلح عامل النخر الورمي‎ ally ‏التي يمكن أن تتحول وذلك‎ polypeptides ‏على عديد الببتيدات‎ ٠ ‏الأتزيمي من حالة موازنة / تشابه وظيفي دون تشابه في التركيب الكيميائي‎ ‏غير نشط أيضاً ثم إلى شدفة صسغيرة‎ zymogen ‏غير نشطة إلى طليع أنزيمي‎ . ‏الإحيائي المرغوب أحداثه‎ lal ‏و الذي يظهر‎ polypeptide ‏من عديد الببتيد‎ proteins ‏غير النضشطة تصبح بروتينات‎ precursors ‏ونجد أن البادئات‎ ‏عند مجموعة‎ peptide bond ‏الناضج برابطة ببتيد‎ TNF ‏يرتبط‎ Cam ‏مندمجة‎ yo ‏بشري أو إلى جزء منه.‎ protein ‏الطرفية إلى بروتين‎ carboxyl ‏الكربوكسيل‎ ‏لتكون عرضة لتميؤ‎ ES peptide bond ‏ونجد أن تعاقب رابطة الببتيد‎ ‏إما في نسيج الكائن الحي أو خارج‎ TNF ‏لإطلاق‎ proteolytic ‏أنزيمي بروتيني‎ ‏الكائن الحي أشاء إجراء تصنيعي وهذا ال 1105 الذي لم يتولد سيظهر‎ ‏النشاط السمي الخلوي التخصصي المطلوب.‎ © ‏من مصادر منل‎ TNF ‏بشري ؛ فإن‎ TNF ‏عادة‎ TNF ‏بينما يعني‎ ‏طالما أنه‎ TNF ‏والخنازير والفرس والثيران تكون مشمولة بتعريف‎ of al ‏يحقق المعايير الموصوفة من قبل حول المناطق المتناظرة تركيبياً وحول‎ ‏النشاط السمي الخلوي.‎ ‏ول‎

YY

‏البشري يمارس نشاطاً‎ TNF ‏نوعاً متخصصاً بمعنى أن‎ TNF ‏ولا يُكون‎ ‏من نوع معين لعلاج نوع‎ TNF ‏ولهذا فإنه يمكن استخدام‎ all ‏على أورام‎

Sle ‏وتعتبر‎ Multimenic ‏أشكالاً متعددة الوحدات‎ TNF ‏آخر . يشمل ال‎

INF cella adi ‏مشمولة ضمن‎ TNF ‏ونجد أن مناطق جزيء التخر الورمي ضمن الرواسب ما بين 35 - 11 أو‎ . ‏أو أكثر تظهر تناظراً تركيبياً حقيقياً )700( مع‎ ١3 - ١١١ ‏مابين‎ ‎carboxy ‏ومن الممكن المحافظة على المجموعة الكربوكسيلية‎ . lymphotoxin ‏الذي‎ INF ‏للجزيئين من ( رواسب‎ el all ‏الطرفية غير الذائبة بالماء أو الكارهة‎ .) ١٠١7 - 1٠١ ‏يتراوح جزيئها ما بين‎ ‏تظهر نشاطاً سميا‎ proteins ‏من البروتينات‎ (EY) ‏وحيث أن كلا من‎ Ve ‏أو تخراً ورمياً في الأنسجة الحية ؛ فقد أصسبح معتقداً أن تلك‎ Lyla ‏المناطق هامة في النشاط المشترك ولعامل التخر الورمي 1107 . لذلك وبناء‎ ‏اللمفوتوكسين‎ Pla) ‏عليه فعند ممارسة هذا الاختراع الحالي فإنه يمكن‎

INF ‏من‎ Va ‏في تركيب الاختراع الحالي‎ lymphotoxin ‏كما هو مستخدم‎ Minterleukin-4" (IL-4) ‏إن المصطلح انترلوكين = ؛ أو‎ vo ‏الموصوف أساساً كعامل مُنتج‎ polypeptide ‏هنا يشير إلى عديد الببتيد‎ ‏بعد تتشيطها‎ )4 thymoma cell ) EL-4 ‏خلايا الورم التوتي‎ a lg ‏المنشط لمولد البلازمين ) ؛ والذي يحث على تكاثر‎ ( TPA ‏بواسطة العامل‎ ‏إ الخلايا البائية [[©-3 للفثران ؛ والمنشطة بواسطة جرعات من مضاد‎ ‏دون مستوى تحريض بدء الاتقسام الخلوي.‎ anti-Ig ‏الجلوبيولينات المناعية‎ ‘ ‏؛ وعامل‎ BCGF ‏كما أصسطلح على 11.4 كعامل تكاشر الخلية البائية‎ 1001-11 1١ - ‏؛ وعامل تكاشر الخلية التائية‎ BSF-1 ‏مُحفّز الخلية البائية‎

MCGF-11 ١١ = ‏وعامل تكاثر الخلية البدينة‎ : ‏المرجع‎

‎VY |‏ ‎Moward, et al. ( 1982 ) J.

Exp.

Med. 155:914 — 923; Yokota, et al. (1988)‏ ( ‎Immunol.

Rev 102 : 137.‏ إن 11-4 تنتج بواسطة أعداد متنوعة من الخلايا الليمفاوية ‎Lymphocyte‏ ‏والخلايا التائية ‎Tocell‏ ويمكن الكشضف عنها بتجارب المناعة ) ‎ELISAS‏ ) هه وبتحليل : ‎paliard, et al. 1988 ) Northern blot analysis‏ ). وإلى حد نموذجي نجد أن نشاط 11.4 يمكن أن يقدر بالتجسارب الحيوية لزيادة نشاط نمو الخلية التائية كما بين ذلك المرجع: ‎Spits, et al. ( 1987 ( J.

Immunol 139. 1142 — 1147.‏ من ناحية ثانية فقد عرف المختصون في هذا المجال طرقاً أخرى ‎٠‏ المعرفة وتحديد نشاط 11-4 . ونجد على سبل المثال أنه قد تم إجراء تجارب حيوية مكتملة وذلك بتنشضيط الخلايا الأحادية النواة المحيطة بالدم مع ‎PHA‏ لمدة ‎VY‏ ساعة عند درجة حرارة ١م‏ تغسل خلايا الأرومة ‎PHA blasts‏ وتوضع في شريحة بمعدل 95000 خلية في كل ‎١‏ ‏ميليلتر في الحجيرة الواحدة ‎well)‏ / لد« 0.1 / ‎cells‏ 5000) . في شريحة ذات ‎AT‏ ‎١٠5‏ حجيرة . أن عينات الاختبار 11-4 تخفف تسلسلياً وتوضع في حاضنة مع الخلايا لمدة ‎VY‏ ساعة عند درجة حرارة ١م‏ . ويضاف إلى الخلايا ثاميدين ‎al we‏ بالتريقيوم ‎Tritiated thymidine‏ ويمكن تحديد نشاط 4 بقياس المُعلم المندمج في الخلايا. وتخرف الوحدة من 11.4 بأنها كمية السيتوكين ‎cytokine‏ التي تعططسي نصف الحد الأقصى للتكاثر. ويحدث التنقيسة بصورة طبيعية ل ‎IL-4‏ من المصل ‎Serum‏ المحتوى على الطبقة العائمة أو الطافية الوسط الحاوي ‎supernatants‏ كما وضح ذلك:- ‎Le, etal. ( 1988 J.

Biol.

Chem. 263:10817-10823.‏ وباختصار نجد أنه بعد التحليل الكروماتوجرافي بالتبادل الكاتيوني ‎vo‏ على ‎(s—sepharose)‏ ؛ يخرج جزئيات محتوية على 11-4 مع تدر ‎NaCl z‏ من : ا

V¢ ‏ويصبح عرضه للترشضسيح الهلامسي‎ ] 0-0.5 Min 50 m M HEPES, PH 7.0 ‏وذلك بالطور‎ IL-4 ‏وتنقى بعد ذلك جزيئات‎ (sephadex 6 - 100) ‏على‎ gel ‏بالجيل‎ ‎acetonitrite (V/V) ‏حجم / حجم‎ 770 = Yo ‏باستخدام تدرج من‎ [HPLC] ‏العكسي‎ ‎‘Trifluoroacetic acid aaa / ‏حجم‎ 70.١ ‏في‎ ‏مرة‎ Yorn ‏وتؤدي تلك الإجراءات إلى استخلاص حوالي 760و‎ . (2.6x10" U/mg) : specific activity ‏تتقية ) نشاط تخصصي نوعي‎ ‏خال من طافيات الوسط‎ (serum) ‏ونجد أن تنقية 11-4 من مصل‎

CM-Sepharose ‏يتطلب خطوة تحليل كروماتوجرافي واحدة فقط على‎ ‏مرة تتقية نشاط تخصصي نوعي‎ ٠٠١ ‏ويؤدي إلى استعادة 746 ؛ و‎ ‏وله‎ IL-4 ‏فيه نشاط‎ polypeptide ‏ونجد أن أي عديد ببتيد‎ . ]3»10 U/mg] ٠ ‏مع تعاقب لحمض‎ amino acid ‏منطقة تبدي تناظر وظيفي حمض أميني‎ ‏الناضج ومشتقات أو جزيئات من ذلك العديد من‎ 11-4 amino acid ‏الأميني‎ ‏ستكون مفيدة في تطبيق هذا الاختراع.‎ polypeptide ‏الببتيد‎ ‎tl ‏الخلية ؛‎ SS ‏ونجد أن النشاط النوعي 11-4 يعبر عنه‎ ‏ولايعخحي‎ TNF ‏م« من استخدامه في هذا الاختراع لتتشيط السمية الخلوية ل‎ ‏ذلك استبعاد تجارب أخرى لقياس النشاط النوعي ؛ مثل الطرق المبتية‎ ‏إن الخواص‎ . Target cell ‏على التأثيرات الإحيائية أو أخرى على خلايا الهدف‎ ‏الفيزيائية الكيميائية ل 11.4 قد وصفت بواسطة:‎

Yokota, et al. (1988 ( Immunol. Rev 102:137 and Le et al. ( 1988( J. Biol. Chem 263:10817-10823. Y. ‏وزن جزيء‎ Ad ‏أن 11-4 الفطري الناتج من مصادر إحيائية طبيعية‎ ‏دالتون كما تم تقديره بطريقة الترشيح‎ YY, eee - ٠0,0080 ‏تقريبي ما بين‎ ‏عندما تزال‎ LY ‏؛ وعند نقطة تماثل كهربي حوالي‎ gel filtration ‏الهلامي‎ ‏مع مجموعات السكر وتكون عرضة لتميؤ‎ ٠١87 ‏مجموعات السكر ؛‎

IL-4 protein ‏إن تعاقب بروتين‎ . ] chymo trypsin] ‏والتميو بإنزيم‎ Trypsin ‏باتزيم‎ vo ‏ادل‎

\o ‏جزيفاً نظرياً‎ Lg ‏يعطى‎ amine acid ‏حمض أميني‎ ٠١"9 ‏والمكون من‎ ‏دالقون . وهذا الوزن الجزيئي قريب من الأوزان الجزئية‎ ١5,00٠0 ‏مقداره‎ ‏ويعزى‎ .2 140068 NA oY ‏وهي‎ [SDS-PAGE] ‏المقدرة بطريقة‎ ¢ Gel filtration ‏الاختلاف بين هذه الأوزان الجزيئية المقدرة بالترشيح الهلامي‎ ‏إلى الشطر الكربوهيدراتي.‎ SDS-PAGE ‏م و‎ ‏دالتون مقدراً بواسطة‎ A ‏ونجد أن 11-4 المؤلف له وزن جزيئي حوالي‎ ‏كما‎ [SDS ~ PAGE] ‏مقدرة بواسطة‎ ١5,00٠0 ‏وحوالي‎ (gel) ‏الترشضيح الهلامي‎ ‏وقابلية للتميؤ بإنزميبي‎ ٠*7 ‏أن له نقطة تمائل كهربي حوالي‎ -trypsin and chymotrypsin hydrolysis ‏التربسين والكيمى تريسبين‎ ‏شهور عند درجة حرارة لام‎ F ‏وهذا المركب ثابت لأكثر من‎ ١ ْ ٠١ ‏ولأككر من شهر واحد عند درجة حرارة الغرفة ؛ كما أنه ثابت لمدة‎ ‏أم . ونجد أن 11-4 مستقر عند مجال‎ #١ ‏دقائق تقريباً عند درجة حرارة‎

IL-4 ‏ولا يعتبر‎ . [PH2= 10] pH ‏واسع من تركيزات أيون الهيدروجين ما بين‎ ‏نوع مخصص للتعامل مع الإنسان ؛ لهذا فإن 11-4 البشري تعمل على خايا‎ ‏الفأري له أنواع متخصصة.‎ IL-4 ‏الفأريات . غير أن‎ yo ‏الذي‎ amino acid ‏إن درجة التناظر التركيبي لتسلسل الحمض الأميني‎

IL-4 ‏ضمن مجال التعريف بالنسبة ل‎ polypeptide ‏يعطى عديد ببتيد‎

IL-4 ‏المطلوب ؛ و‎ protein ‏على حسب التناظر التركيبي بين البروتين‎ aban ‏الواقع داخل أو خارج مناطق 11-4 المسؤولة عن النشاط السمي الخلوي‎ .cytotoicity Y. ‏لخصائصها الجينية والتي تكون‎ Domains ‏ونجد أن المركبات السائدة‎

Bll ‏حرجة بالنسبة للنشاط السمي الخلوي تظهر درجة عالية من‎ ‏التركيبي حتى تقع في نطاق التعريف ؛ بينما التعاقب ليس لهدور في‎ ‏المحافظة على الهيئة التركيبية الفراغية ل 11-4 أو في التأثير على عملية‎ ‏الربط بالمستقبل ؛ يظهر بالمقارنة تناظراً تركيبياً منخفضاً ملحوظا.‎ ve ‏نقد‎

ونجد بالإضافة إلى ذلك أن السائدات الحرجة ‎Critical Domains‏ قد تظهر نشاطاً ‎Laas‏ خلوياً ‎cytotoicity‏ ولكن تبقى متتاظرة تركيبياً كما وصف في هذا الموضوع ؛ إذا كانت الرواسب المحتوية على سلاسل جانبية وظيفياً متشابهة من حمض الأميني ‎amino acid‏ التي تستبدل ‎aa jis‏ التشسابه ‎٠‏ وظيفياً إلى الخصائص السائدة للسلاسل الجانبية كأن تكون قاعدية أو متعادلة أو حامضية ‎acid‏ وأخيراً وجود أو غياب ‎ABS‏ تجسمية ‎steric bulk‏ . وإن العالمل الأكثر أهمية في تحديد هوية عديد الببتيد ‎polypeptide‏ ؛ مل 4 هو القدرة على تضاد مصل الدم ‎antiserum‏ التي تمكنها من إيطال تأثير النشاط الإحيائي ل 11-4 أساساً ؛ وأيضاً إيطال للنشاط الإحيائي ‎١‏ الأساسي لعديد الببتيد ‎polypeptide‏ المذكور. وعلى أي حال وإنه من الظاهر أن الخاصية المناعية والسمية الخلوية ليستا بالضرورة متماديتان ‎.coextensive Lore‏ ونجد أن الجسم المضاد المتعادل ‎neutralizing antibody‏ ل ‎IL-4‏ لا يعوق البروتين ‎protein‏ المطلوب لأن الجسم المضاد المتعادل لا ‎am‏ ‎yo‏ مباشرة لإعاقة تخصصية لموقع 11-4 الذي يكون حرجاً لنشاطه الإحيائي. ونجد بد ل من ذلك أن الجسم المضاد يمكن أن يعوق منطقة حميدة ‎innocuous region‏ ويمارس تأثيره المتعادل أو المبطل بالإعاقة التجسمية ‎steric hindrance‏ كما أن البروتين ‎protein‏ المطلوب المتغير في تلك المنطقة ل الحميدة قد لا يعوق بعد ذلك تعادل الجسم المضاد ولكنه يكون 11-4 في ‎vy.‏ صورة تناظر تركيبي أساسي ‎substantial homology‏ ونشاط أحيائي. ومن المهم أن نلاحظ أن الخصائص مثل الوزن الجزيء ‎molecular weight‏ ونقطة التمائل الكهربي والمشابه ل 11-4 الناضج الفطري أو الطبيعي ‎native or wild‏ الناتج من الخلايا الليمفاوية المحيطة أو المكون من مزارع نسلية خلوية ‎cell line‏ تكون وصفية بالنسبة للأنواع الفطرية من 11.4 . وسيتضمن ‎IL-4‏ ‏»كما هو مبين في التعريف السابق أنواعا أخرى لا تظهر كل ‎alas‏

لا ‎IL-4‏ الفطري ¢ ‎ain‏ يقع في ضمن هذا التعريف ل ‎IL-4‏ الفطري وعديد الببتيهيدات ‎polypeptide‏ المتعلقة بذلك. ‎lad‏ سبيل المثال فأن مشتقات ‎IL-4‏ مثل إدخال الطفرات ‎mutants insertion‏ أو إلغاء الطفرات أو إدماج البروتيتات ‎ary Cas fusion proteins‏ 114 ‎٠‏ خارج نطاق الوزن الجزيئي المثبت ل 1-4 الفطري كما أن إدماج البروتينات ‎fusion proteins‏ مع ‎IL-4‏ الناضج وأيضاً إدخال الطفرات ‎Mutants insertion‏ سسيكون له وزن جزيئي أكبر من 11-4 الفطري الناضج. بينما إلغاء الطفرات ‎Mutants‏ ل 11-4 الفطري سيكون له وزن جزيء أقل. وبنفس الطريقة نجد أن ‎IL-4‏ يمكن هندسته من أجل تخفيض أو نزع قابليته للتميؤ بواسطة أنزيمات ‎trypsin‏ أو أنزيمات تحلل البروتينات ‎proteins‏ الأخرى ‎proteases‏ ‏أن التركيب المستخدم في الاختراع الحالي يمكن أن يُعطى مع أي من عديدات الببتيدات ‎polypeptides‏ حالة غير نشطة والتي يمكن أن تتحول بالصَيؤ الإنتزميي من حالة متشابهة ‎Lida‏ غير نشطة ‎inactive state analogous‏ إلى ‎Vo‏ طبع أتزيمي غير نشط ‎zymogen‏ ثم إلى جزئ عديد ‎polypeptide +l‏ والذي يظهر ‎Lal‏ | لإحيائي المطلوب . ونجد أن البادثات أو ‎precursors aA all‏ غير التشضطة مسستكون بروتينات ‎proteins‏ مندمجة حيث ترتبط واحدة أو أكثر من 4ت رار ‎TNF‏ ‏و/أو ‎IFNg‏ برابطة ببتيدية ‎peptide bond‏ عند الطرف النهائي الكربوكسيلي ‎carboxyl ve‏ إلى بروتين ‎protein‏ بشري أو جزء منةه ‎Fragment‏ أو إما بطريقة مباشرة أو غير مباشرة إلى عديد ببتيد ‎polypeptide‏ أخر مفيد في التطبيق لهذا الاختراع. وينتقي تسلسل تلك الرابطة البيتيدية ‎peptide bond‏ أو ما قاربها للتعرض للتميؤ البروتيسني ‎[proteolytic]‏ ليطلللسق ‎[FN-g 5s TNF IL-4‏ ‎EAY‏

YA aa ‏إما في التجارب المخبرية ؛ أو‎ Interferon gamma ‏انترفيرون جاما‎ ‏الأنسجة الحية على الكاتن نفسه ؛ كجزء من طريقة التصنيع ؛ مخبرياً.‎ cytotoxicity ‏والتركيب الذي يتولد سيقوم بإظهار النشاط السمي الخلوي‎ ‏المطلوب حسب التعريف.‎ ° وعادة ما يعني أن 11-4 البشري ؛ كما أن 11-4 الناتجة مسن مصسادر أخرى مثل الفئران والخنازير والفرس والثيران تتطوي تحت نطاق تعريف 11-4 طالما أنها تحقق المعايير القياسية الموضحة من قبل للمناطلق المتناظطظطرة تركيبياً ‎homologous regions‏ ¢ والنشاط السمي الخلوي ‎cytotoxic‏ . كذا_ك تستخدم متعددات الوحدات ‎Multimeric‏ ل ‎IL-4‏ كتطببق وممارسة ‎٠‏ للاختراع الحالي. ‎“er = . Wg‏ ات ‎IL-4‏ في ود - يف 11-4 . ‎oP)‏ . . )ل » © ات طفرات تعاقب حمض ‎١‏ لأميني ‎amino acid sequence mutants‏ ¢ والمتغيرات الناجمسة عن تكوين البروتينات السكرية ‎«glycosylation variants‏ والروابط التساهمية والتجمعية ‎covalent or aggregative conjugates‏ مع أجزاء كيماوية أخرى . ‎١ Oo‏ وتحضر المتتقات الشساهمية بتر ابط المجمو عات ‎A esl‏ (المتخصصات) بالنسبة للمجوعات التي توجد في السلاسل الجانبية للحمض الأميني ‎IL-4 amino acid‏ ؛ أو عند الطرف النتروجيني النهائي ‎N-terminal‏ أو الطرف الكربوني النهائي ‎C-terminal‏ ‏كما هو معروف لدى المتخصصين في هذا المجال العلمي. ‏وكما شو الحال مع ‎TNF‏ + نجد طفر ات ‎IL-4 Cle Ga‏ تتضصمن ‎IL-4 ‏وطفرات في‎ ¢ site specific ‏والمقصود هنا موقع تخصصض‎ By ua ‏المحددة‎ Y. ‏أو جزء منها تساهم في تطبيق هذا الاختراع. ‏ويعرف طفرة هذه 11-4 على عديد الببتيد ‎polypeptide‏ أي يقع داخل تعريف التناظر التركيبي لمجموعة ‎IL-4‏ ولكن له تعاقب حمض أميني ‎amine acid‏ مختلف عن 11-4 نتيجة الإزالة ‎deletion‏ أو الاستيدال ‎substitution‏ أو الإدخال ‎0 . Insertion Yo

V4 ‏عند‎ substitution mutation ‏ونجد أن الطرق الفنية لإحداث طفرات استبدالية‎ ‏لها تسلسل معروف هي تقنيات معروفة‎ (DNA) ‏مواقع سابقة التحديد في‎

M13 ‏أو بادي أو مشهد توليد الطفرات‎ M 13 primer mutagenesis : ‏جيداً مثل‎

TNF ‏أو‎ substantially homogeneous ‏ونجد أن 11-4 المتجانس الأساسي‎ proteins ‏من البروتيتات‎ a ‏الذي يكون أساسياً‎ TNF ‏أو‎ IL-4 ‏يعني‎ © protein ‏الأمسلية الأخرى بالنسبة للمصدر الذي يتم منه عزل البروتين‎ ‏يجب أن يكونوا بالضرورة‎ TNF ‏الأصلي . وهذا يعني أن 11-4 المتجانس أو‎ ‏الدم مثل مولد الليغفين ( مولد‎ plasma proteins Le Pb ‏خاليين من بروتينات‎ ¢ a-globulins ‏جلوبيولين - ألفا‎ ¢ albumin ‏البيومين‎ » Fibrinogen ) ‏الفيبرين‎ ‏ء عديدة الببتيد السمي الخلوي غير‎ Serine proteases ‏وأنزيم سيرين بروتييز‎ Ve [ non-tumor necrosis Factor cytotoxic polypeptide [ يمرولا ‏عامل التخر‎

Interferons ‏أو الأنترفيرونات‎ ( lymphotoxin ‏ليمفوتوكسين‎ ) Lymphotoxin, ‏مثل‎ ‏الخلية أو الكائن الحي الذي يعمل كمنشئ‎ proteins ‏أو غيرها من بروتينات‎ ‏بما في نلك الخلايا بأكملها‎ polypeptide ‏صناعي ( مخلق ) بالنسبة ل‎ cla dll ‏ونجد على أي حال بصفة هامة أن عديد‎ . [celldebris] ‏وخاصة‎ ١ ] stablizers [ ‏النقية تتضمن مثل تلك المواد مثل المواد المثبتة‎ polypeptide ‏الموضحة فيما بعد.‎ [excipients ] ‏والمواد السائغة‎ ‏سابقة الإعداد من الخلية‎ polypeptide ‏وكما أن كميات من البروتينات‎ ‏أخرى من‎ polypeptide ‏أو العضو الذي يخدم كمصدر تخليقي ؛ وبروتينات‎ cl ws) ‏الأصسسلية أو‎ [polypeptides ] ‏مصادر أخرى غير مصادر خليته‎ - ٠ ‏ونجد أن‎ . poly-L-lysine ‏التخليقيسة مثل‎ polypeptide ‏الحية وعديد الببتيدات‎ (Ake ( ‏والذي يعبر عنه أنواع متباينة الجينات‎ Recombinant ‏المؤلف‎ 11-4 ‏طبعاً سوف يعبر عنه‎ ¢ host cell ‏مثل البكتيريا ؛ والخلية المغذية‎ allogeneic ‏ذات المصدر الجيني . ويفضل تصنيع‎ proteins ‏بصفة خالية تماماً من البروتينات‎ ‏المستخدمان في تطبيق هذا الاختراع من مزرعة من الكائنات الحية‎ TNF (IL-4, ¢AY ‏ض‎

١ ‏بالطرق المعروفة للعلماء في هذا‎ Recombinant organisms ‏المولفة جينياً‎ ‏المجال.‎ ‏مع‎ TNF ‏يحضر التركيب الذي يتم التعاطي به في هذا الاختراع بمزج‎ ‏المتقى بالدرجة المطلوبة مع حاملات مقبولة فسيولوجياً‎ 4 ‏أي الحاملات التي ليس لها تأثير سمي على‎ physiologically acceptable carriers © ‏عند الجرعات والتركيزات المستخدمة.‎ recipients ‏المُستقبلات‎ ‏لهذا الاختراع مع‎ TNF ‏وعادة ما يستلزم ذلك اتحاد .4-11 وتركيب‎ « ascorbic acid Jie antioxidants ‏؛ ومواد مضادة للأكسدة‎ Buffer ‏محاليل منظمة‎ ‏من عديد‎ ) residues ‏رواسب‎ ٠١ ‏وزن جزيء متنخفض ) أقل تقريباً من‎ amine acids ‏وأحماض أمينية‎ » proteins ‏وبروتينات‎ « polypeptides ‏الببتيدات‎ ٠ dextrins s glucose ‏متضمنة جلنلوكوز‎ carbohydrates ‏ومواد كربو هيدراتية‎ ‏أخرى ومواد‎ stabilizers ‏مثبتات‎ EDTA ‏مثل‎ Chelating agents ‏وعوامل تكليب‎ ‏لتثبيت هذا التركيب.‎ carriers ‏ويجب أن تصاغ الحاملات‎ excipients ‏مضوغة‎ ‏ويجب أن يكون التركيب المستخدم في العلاج معقماً.‎ ‏تنفيذ ذلك بسهولة بالترشيح خلال أغضية ترشيح معقمة‎ Sa vo

J ‏وبالإضافة‎ Iyophilized ‏جاف متجمد‎ JS 5 ‏ويحفظ عادة التركيب في‎

IL- 4 ‏مع‎ synergistically ‏تعمل تازرياً‎ Interferons ‏ذلك حيث أن الأنترفيرونات‎ ‏فمن المفضل أن تتحد انترفيرونات ألفاوبيتا وجاما مع تركيبات‎ TNF ‏و‎ ‎lymphotoxin ‏مع تركيبات محتوية على‎ IL-4 / TNF ‏أو‎ TNF [IL-4 ‏جرام والتنفاط‎ oii / ‏وحدة‎ ٠٠١ ‏إن 1147 له نشاط نوعي حوالي‎ ْ Y. / ‏وحدة‎ ٠١ ‏حوالي‎ (IFN-g) ‏؛ وانترفيرون جاما‎ IL-4 ‏النوعي لكل من‎ ‏وتضم المكونات المثالية على 1124 و/أن 1777 و/أو‎ . (10u/ng) ‏نانو جرام‎ يفو١-7‎ 7٠١ ‏إلى‎ ١ : ٠,١ ‏بنسسب في وحدة النشاط تتراوح من‎ 0 ‏بد ل عن‎ lymphtoxin ‏كما قد تحتوي على‎ ١ - ٠١ ‏العادة تكون النسبة من‎ ‏ندر‎

ض ف جزء من أو كل أو ‎TNF‏ . وتكون تلك الأجزاء عرضة للتعديل المطلوب طبقاً للتجارب العلاجية. وتعطى تركيبات من ‎TNF/IL-4‏ لحيوانات حاملة الورم.

وطرق التداوي تتم بأساليب معروفة وهي: داخل الوريد ‎intravenous‏ » أو داخل ‎ial‏ ( البريقون ) ض ‎intraperitoneal‏ » أو في العضل ‎«intramuscular‏ أو داخل وريد الأفة ‎intralesional‏ أو حقن محاليل معقمة من 11.4 / ‎TNF‏ أو بأنظمة إطلاق مبرمج زمنياً ‎time released systems‏ كما هو موضح ‎Lad‏ بعد. ويمكن إعطاء ‎TNF‏ 11-4 بالحقن المباشضر في الأورام الصلبة وفي ‎٠‏ حالة الأورام المنتشرة مثل سرطان الدم ‎Jab Leukemia‏ الإعطاء بطريقة الحقن الوريدي ‎Intravenous‏ أو في الجهاز الليمفاوي ‎lymphatic system‏ أما بالنسبة لأورام الأعضاء الباطنية مثل سرطان المبيض ‎Ovarian cancer‏ فتفضل طريقة الحقن داخل الصفاق أو ( البريتون ) بأسلوب الإنفاذ الغخنائي الصفاقي ) ‎Lal‏ 3 3 الصفاقية ‎Peritoneal dialysis‏ ( بأجهزتها ومحاليلها المناسبة مد ‎-Intraperitonea infusion by peritoneal dialysis hardware‏ ونجد عادة أنه يتم إعطاء ‎TNF‏ / 11-4 بالطريقة المستمرة غير المتقطعة بالتشرب كما أن الحقن بالجرعات ‎bolus injection‏ أيضاً يعتبر مقبولا. ‎(Say‏ إعطاء ‎TNF‏ / 11-4 من خلال فصسله مفروزة لإعطاء نظام - إطلاق مبرمج ‎Lie}‏ ومحدد ‎implantable timed - release article‏ . ونجسد .؟ ‎ALAS‏ على أنظمة مناسبة للبروتينات ‎proteins‏ التي لها الوزن الجزيئي ل ‎TNF dimers or Trimers [‏ ] وتتضمن بوليمرات مشاركة ‎copolymers‏ من :- ‎glutamic, acid and gamma ethyl - L — glutamate‏ -آ كما وضح ذلك المرجع:- ‎(U. sidman, et al. 1983, “ Biopolymers “ 22 (1):547-556 ), poly ( 2-hydroxy‏ ‎ethyl-methacrylate )‏ ‎EAY‏

A

‏المرجع:-‎ ‎(R. Langer et al. 1981 1. Biomed. Matter. Res * 15:167-277 and R. Langer, 1982, * Chem. Tech ©“ 12 98 — 105) ‏وهذه‎ OR ethylene vinyl acetate sl ( R. Langer , etal. Id) ‏المرجع:-‎ ‏غرزها عند مواضع جراحية حيث تم فيها استتصسال.‎ a article ‏ه الفصلة‎ ‏1-4اضمن كبسولات‎ / TNF ‏الأورام . وهناك بديل آخر يتم فيه وضع تركيب‎ ‏شبه نافذ « أو وضع‎ Semipermeable micro capsules ‏دقيقة جداً ذات غشاء‎ liposomes ‏التركيب المشار إليه ضمن جسيمات دهنية من الليببوسومات‎ ‏وذلك لطرح وحقن الدواء وهذه في الورم نفسه . وبهذه الطريقة في العلاج‎ ‏مفيدة خاصة الأورام القابلة للإزالة بالجراحة وبخاصة أورام المخ.‎ ٠ ‏إلى الأفراد‎ 11.4 / TNF ‏إن طريقة علاج الخلايا الوزمية بإعطاء‎ ‏لإعطاء عديد الببتيدات‎ aan al ‏بالورم يجب التأمل بها‎ Gn Lad) ‏بالطريقتين‎ a ‏بالتزامن وكذلك بالتعاقب أو التتابع‎ polypeptides ‏ومن المعروف لدى المختصسين أن‎ concurrent and ‏لمانو‎ administration ‏من العديد الببتيدات‎ Uf ‏تأثير لإعطاء بالتزامن يجب أن تقلد تعاطي‎ ve ‏للأشخاص وتكون متبوعة بالتعاطي المتعاق ب لعديد الببتيسد‎ polypeptides ‏الثاني ؛ وتوقيت التعاطي المتعاقب يجب أن يكون جلياً للمختصين‎ polypeptides ‏في هذا المجال ؛ كما أنه يعتمد فقط على معدل تفكك التعاطي الأول لعديد‎ ‏مخبرياً أي بالتجارب المخبرية.‎ polypeptide ‏الببتيد‎ ‏التي تعطى على طريقة‎ 11-4 / TNF ‏وتعتمد كمية تركيب‎ Y. ‏التداوي بها ونوع الورم وحالة المريض.‎ run ‏أقل من المطللوب‎ Intralesional ‏ويتطلب الحقن داخل الورم‎ ‏المعمول بها عند تعاطي المركب‎ IL-4 / TNF ‏قاعدة وزن الجسم للتركيب‎ .intravenous infusion ‏داخل الوريد‎ oy wall ‏بطريقة الحقن‎

EAY

YY

‏لأورام الصلبة تظهر أكثر مقاومة‎ ١ ‏بينما نجد العديد من الأور ام مثل‎ ‏عن غيرها مثل أبيضاض الدم فمن المهم بالنسبة للأطباء المعالجبين أن‎ TNF ‏ل‎ ‏الجرعة المطلوبة ويعدلوا في طريقة إعطاء الجرعة‎ titer ‏يعايروا حجمياً‎ ‏كما‎ . Target ‏المطلوبة للحصول على أفضل نشاط سمي خلوي تجاه الورم المستهدف‎ ‏أو التجارب‎ biopsy ) ‏م يمكن تقدير ذلك بفحص العيتة الحية ( الخزعة‎ ‏مستضد‎ Jia putative cancer markers ‏التشخيصية لواسمات السرطان المفترض‎ ‏وذلك نظراً إلى أي سمية مولفة‎ [carcinoembryonic antigen] ‏السرطان الجيني‎

Aad ye ‏تتم عند جرعة‎ ‏ميكروغرام / لكل‎ ١١ ‏للفئران :- تصل حتى‎ TNF ‏ونجد عموماً أن جرعات‎ ‏كغرام وزن جسم / باليوم وعن طريق التعاطي بالوريد حيث وجد ذلك أساساً لا‎ ٠ -: ‏سمياً وفعالاً في الأنسجة الحية 10180 . كما أن جرعة 11-4 في الفتران‎ ‏ميكروغرام / لكل كيلو غرام وزن جسم / باليوم بالتعاطي‎ ١٠١ ‏أيضاً تصل حتى‎ ‏عن طريق الوريد.‎ ‏وقد وجد أنه لاسمي وفعال في الأنسجة الحية . ولا يعرف أن 1105 له‎ ‏لغير‎ TNF ‏في نشاطها السمي الخلوي حيث أن‎ species specific ‏أنواع متخصصة‎ yo ‏الناتجة من مصادر الور أو الخنزير قد توظف في تركيب هذا‎ Jie ‏الإنسان‎ ‎. ‏من‎ TNF ‏الاختراع في علاج أورام الإنسان . ونجد أنه من المفضل استخدام‎ 0 ‏الأنواع المعالجة لكي نتجنب إمكانية ظهور جيل من أجسام مضادة ذاتية‎ ‏هذا وبعد أن وصفنا هذا الاختراع بصفة عامة » إلا أنه لاستيعاب‎ ْ ‏التخصصية التالية:‎ ALA) ‏وفهم كاملين يتم بالرجوع إلى‎ ٠ (1) ‏نل‎ ‏في وسط الزرع‎ cell culrure ‏إجراءات زرع الخلية‎ ‏يحافظ عليها بشكل صارم في أوساط‎ cell lines ‏جميع النسل الخلوي‎ ‏طم‎ .subconfluent ‏زرع تحت المندمجة‎

Y¢

TVX ‏بمقدار ات‎ petri dish ‏في أطباق بتري‎ LDA) ‏وتوضع‎ ‏مضاف إليه‎ DMEM ‏ميلي متر من طبق بتري في وسط‎ TO ‏خلية / في كل‎ ‏هذه‎ Aa gig 7٠١ ‏؟ مبلي مول ؛ ومصل جنيني بقري‎ glutamine ‏جلوتامين‎ ‎Coy ‏المزرعة في حاضنة مُرّطبة تحت تهوية و © ثاني أكسيد الكربون‎ (Y) Jia ° cytoxicity ‏تجارب السمية الخلوية‎ x 103 cells jules) ‏في‎ "٠١*58 ‏ولإجراء تجارب السمية الخلوية توضع‎ ‏في الحضانة طول‎ all ‏وبعد‎ . 96 well costar plates ‏من الوسط في‎ 10 0.1 ml ‏عند درجة حرارة الم ؛» وجو رطب من 78 مسن و00 في الهواء ؛‎ Jl ‏مللي من‎ ١.١ ‏يخرج الوسط وتجرى له سلسلة تخفيفات على عينة الاختبار حتى‎ ٠ ‏ساعة في الحاضنة عند درجة حرارة 7١م تم إزالة الوسط‎ VY ‏الوسط وبعد البقاء‎ ‏والكشف عن الخلايا القابلة للنمو بالصبغة الببفسجية المتبلورة‎ media ‏عينة الاختبار‎ ‏تم‎ Sugarman, et al. (1985) Science 230:943. ‏كما شرحها‎ crystal violet staining ‏حساب النسصسبة المئنوية لعدد الخلايا القابلة للنمو على جهاز قياس الكثافة‎ ‏الضوئية في وجود عينة الاختبار مقسومة على الكثافة الضوئية في‎ .٠٠١ * ‏غياب عينة الاختبار ( الوسط ) مضروب‎ )”١( ‏مثال‎ ‎Radioreceptor ‏تجرية الممستقبل الإشعاعي‎ -: ‏وتجرى تجارب ارتباط المستقبل كما وصفه‎

WL sa ale ‏باختصار تحفظ في‎ Aggarwal, etal. ) 1985 ( Nature 318:665 ٠٠ ‏في‎ )12<*75 mm) ‏أبعادها‎ polypropylene «auld ‏في‎ ]0.25*1 0° cell [ ‏عددها:‎ ‏يحتوي على‎ [ DMEM + 10% FBS [ Freshice cold ‏ميلي ليتر‎ ١,7 ‏وسط‎ ‏إما في وجود ( رابطة غير تخصصية‎ [cpmof PI-TNF] [ 10°

EAY

Yo

TNF ‏مرة زيادة من‎ ٠٠١ ‏أو في غياب ( الارتباط الكلي ) في‎ ( nonspecific binding ‏ام‎ ١ ‏دقيقة على درجة‎ ٠١ ‏وبعد حضاتته لمدة‎ . unlabeled ‏غير الموسوم‎ ‏يستخرج الوسط ؛ وتغسل الخلايا ثلاث مرات بإخضاعها للطرد المركزي‎ ‏وبعد ذلك يقدر النتشاط الإشعاعي للخلايا المرتبطة . وجميع التقديرات‎ ‏تكون مكررة ثلاث تكرارات.‎ ‏(؛)‎ Jia

IL-4 ‏بواسطة‎ TNF ‏تحسين التأثير المضاد للتكاثقر ل‎ يحسن 11-4 التأثير المضاد للتكاثر الذي يمارسه ‎TNF‏ عند اختباره ضد أنواع مختلفة من الخلية . ويمكن الكشف عن تركيزات مختلفة مسن ‎TNF ٠‏ بمفرده أو متحدة مع تركيز محدد من 4- .11 ‎(100ng/ ml)‏ وذلسك على نسل خلوي لسرطان الصدر : 330 148- ‎MDA‏ . ويوضح الشكل البياني ‎sul )١(‏ = المتحصل عليها . بعد ذلك توضع في الحاضنة (9ل» 103 ‎(5x‏ ‏في ‎١.١‏ ميلي لير من الوسط الحاوي على كمية محددة من السيتوكينات ‎cytokines‏ ‎VY sad]‏ ساعة ؛ وتقدر بعد ذلك قابلية بقاء الخلايا حية بالطريقة التي تم شرحها بالمثال رقم ‎)١(‏ ويلاحظ أن جميع التقديرات تجري وتكرر ثلاثاً. ونجد أن ‎TNF‏ منفرداً حتى عند تركيزات ‎٠٠٠٠٠١ defied le‏ وحدة ميلي لتر له تأثير على تلك الخلايا . غير أنه عند إضافة 11-4 ‎٠‏ الأوساط الزرعات مع ‎TNF‏ فإن تكاثر الخلايا يُحبط في الجرعة المعتمدة ‎dependent manner‏ . وكما هو موضح في الشكل ‎)١(‏ ؛ ولم يلاحظ إلا نسبة ‎ZV YL‏ من إحباط نمو الخلايا عند تركيز ‎(10.000U/ml)‏ . وغير أنه عند إضافة ‎ng/ ml‏ 100 من ‎IL-4‏ ؛ نجد أن إحباط نمو وتكاثر الخلاياً السرطائية يزداد إلى ما نسبته 760 . كذلك لوحظ تحفيز التأثيرات السمية الخلوية ‎cytotoxic [‏ ] ل ‎TNF‏ بواسطة 4 - ‎IL‏ مع أنواع أخرى من الخلية مقل :- خلايا ‏ادل

سرطان المهبل ‎(vulvar carcinoma cells ( A431‏ والخلايا الليمفاوية النسيجية ‎histolytic lymphoma cell U - 937‏ ويوضح الشسكل ‎(24,2B)‏ تأثير تركيزات مختلفة من ‎IL-4 ¢ TNF‏ ‎ng/ml)‏ 100) على القابلية النسبية لنمو الخلايا ( مئوياً ) بالنسبة للتسل الخلوي م السرطاني الظاهري البشري: ;431 - ‎Human epithelial carcinoma cell line ( A‏ ( الشكل ‎(2A)‏ والنسل الخلوي للورم اللمفاوي النسيجي ‎(U=937)‏ ‎human histolytic Lymphoma cell line ) U - 937 lower panel ).‏ ( وتوضع الخلايا )10° *0.5) في حاضنة ضمن ‎١,١‏ ملي لتر من العينة المختبرة المحتوية على الكمية المعروفة من السيتوكين [ ‎cytokines‏ ] لمدة ‎VY‏ ‎٠‏ ساعة وبعد ذلك تقدر قابلية الخلايا للنمو كما وصفت في مثال ‎.)١(‏ ‏ويوضح الشكل (23 ,8 2 ) التأثير الهام ل 11-4 على تعديل وتغييبر نمو ‎(TNF - dependent growth modulation (‏ للخلايا ‎A431‏ ( شكل م 2 ) التي نت ملاحظتها عند تركيزات منخفضة ‎١/١‏ وحدة للميلي لتر من السيتوكين [ ‎[cytokines‏ ‏وتحسن التأثيرات السمية الخلوية [ ‎cytotoxic‏ ] بالنفسبة — ‎TNF‏ ‎Vo‏ بواسطة 11-4 يكون ‎Walla all la nly‏ 17-937 ( الشسكل 8 2) عند تركيز أعلى أي عند ألف وحدة / ‎ll‏ لكر . كما درس أيضاً تأثيسر تركيزات مختلفة من 11-4 على تركيز ثابت من ‎٠٠٠١ TNF‏ وحدة / لكل ميلي الثر : حيث تحضّن ‎cells)‏ 10° 5 ) في ‎١,١‏ مللي للعينة المختبرة لمدة 27 . ساعة قابلية الخلايا للنمو تقدر وفق الطريقة المشار إليها في مثال ‎)١(‏ وجميع ‎٠‏ هذه التقديرات كررت ثلاث مرات ‎triplicate‏ ‏ويوضح الشكل ( 38,33 ) تأثير التركيزات المختلفة من 4-.11 على السمية الخلوية ‎cytotoxicity‏ بالنسبة لتركيز ‎units / ml)‏ 1000 ) من ‎Jie TNF‏ ّ| الخلايا 431 ‎A‏ ( الشكل م 3 ) و النسل الخلوي ‎MDA-MB-330‏ ( الشكل ‎(3B‏ ‏ا

ف ‎ag‏ أيضاً تأثير جرعة مفردة من 4.]آ بتركيرز ‎ug / ml)‏ 0. ونجد أن خلايا ‎cells‏ 8-431 في ( شكل م 3 ) قد أحبط نموها بطريقة معتمدة على ‎dose dependent manner de yall‏ في وجسود كل من 11217 و 4 - ‎IL‏ ‎Lora‏ كما وجد أن 4-.11 بمفرده غير فعال حتى عند تركيز ‎)١ ug/ml)‏ . ‎oo‏ كما لوحظت تأثير الجرعة ذاتها ل ‎IL-4‏ مع خلايا سرطان الصدر ( شكل ‎(3B‏ ‏مثال )0( مقارنة بين تقوية 11-4 وانترفيرون جاما ‎(TFN-g)‏ للسمية الخلوية كما وجد سابقاً أن انترفيرون جاما ‎(IFN-g)‏ يحسن من التأثيبسرات السمية الخلوية ل ‎TNF‏ ضد أنواع عديدة الإنسال الخلوية للأورام كما في ‎٠‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم الات متر ‎Lee . et al. ( 1984 ). J.

Immunol 133:1003; sugarman, et al. ( 1985) Science‏ ‎Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; vilcek, et al. ) 1986):‏ ;230:943 ‎Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferons.‏ وفي كتاب: ‎The Biology of the Interferon System‏ الذي قام بتحريره: ‎H. schellekenes and W.

E.

Stewart. vo‏ ‎Elsevier Science Publishers, Amsterdam. , page 249 .‏ بالإضافة إلى المراجع الأخرى التالية: ‎Fransen, et al. (1986). Eur.

J. cancer Clin.

Oncol 22:419-426; Campbell, et al.‏ ‎J.

Immunol 14:2325-2329: Schiller, et al. (1987 ) cancer Res 47:2809-‏ . )1988( ‎Tsujimoto, etal. ( 1986) J.

Immunol 137:2272-2276 ). Y.‏ ;2813 ويوضح شكل (4) مقارنة بين تأثير انترفهيرون جاما ) 1071-8 ) و ‎(IL-4)‏ على ‎TNF‏ بالنسبة للسمية الخلوية ضد :- ‎MDA-MD-330 Wa‏ . توضع في حاضنة ‎(5x 10° cells)‏ موجودة في ‎Je)‏ لقر من وسط العينة المختبرة المحتوية على تركيزات مختلفة من ‎TNF‏ مع إما: ‎EAY‏

YA

‏وتقدر قابلية الخلايا‎ . IL-4 (100 ng/ml) or IFN-g ( 100 ng / ml ) for 72 hours ‏وتتم كل التقديرات والكميات ثلاث مرات‎ ١ ‏للنمو كما سبق إيضاحه في المثقال‎ . triplicate ‏متكررة‎ ‏يتعامل بآلية‎ IL-4 ‏و‎ (IFN-g) ‏ومن أجل تحديد إذا كان انترفيرون جاما‎ ‏فقد تمت مقارنة‎ TNF ‏م متشابهة لتحفيز التأثيرات السمية الخلوية على‎ ١

IL-4 ‏على منع التكاشر والنمو الخلوي بوجود‎ TNF ‏تعزيز أو تحسين فعل‎ ‏مقارنة بوجود انترفيرون جاما (1774-8) . وتوضح النتائج في الشكل ؛ أنه‎ ‏على خلايا سرطان الصدر أن كلا من 800124-81 11-4] عند تركيزات متساوية‎ ‏تحسّن من التأثيرات المائعة للنمو التي يحدثها ضمن مدى‎ (100 ng / ml)

Joan ‏كما تم‎ . 7 Ve = 60 ‏إحباط نمو الخلايا بنسبة‎ aad ‏متشابه حيث‎ ٠ .) 1 ‏أنظر ( جدول‎ (A431 ‏و‎ 11-937 cells) ‏على نتائج متشابهة مع خلايا‎

Table 1 )0( J gi

Effect of IL-4 and IFN-g on the TNF Dependent Antiproliferative EFFects Against

Various Human cell Line'

Relative cell Viability ( percent ) vo

Cooke | MDAMBAO | A-s Cue - ‏ااا بس ممعي‎ 0 33 Cs i ‏ب إ!‎ CINFHL4 | a so a es A ‏ل‎ ‎ سهبسشم‎ ©» ‏هاا‎ se ‏بس‎ ‎| ‏انضوعي‎ 38 20 | 41

Ya ‏في حاضنة ضمن حجم 0 )0 مللي لسر من‎ ) 51 03 cells ) ‏ض توضع‎ ‏وسط العينة المختبرة 018« محتوية على إما:-‎ ‏أو اتحاد‎ ) IFN-g ) 100 ng/ml) ‏أى‎ IL-4 (100 ng/ml) ‏أر‎ ¢ TNF )200 ng/ml)

A-431 ‏المذكورة أعلاه في الجدول . وفي حالة‎ cytokines ‏من السيتوكينات‎

IFN-g ‏انترفيرون جاما‎ 1 ng/ml ‏م كان تركيز كل السيتوكينات متساوياً باستثاء‎ ١ ‏يتم تقدير‎ cytokines ‏في الحضانة مع السيتوكينات‎ del VY ‏وبعد قضاء فترة‎ crystal violet staining ‏قابلية الخلايا للنمو بواسطة صبغة البنفسجي المتبجلورة‎ ‏السابق.‎ ١ ‏كما هو مبين في مثال‎ ‏ولكن‎ TPN-g ‏ويظهر أن 11.4 تحسن لحد ما تأثيرات منع التكاثر ل‎ ‏علاوة على ذلك فإن‎ . )١( ‏جدول‎ TNF ‏ليس بنفس الحد ( المدى ) بالنسبة ل‎ ye . ‏تكون فعالة لدرجسة قصسوى‎ Lae ‏الثلاشة‎ cytokines ‏اتحاد السيتوكينات‎ ‏؛ لوحظ ما نسبته‎ A431 cells ‏سبيل المثال عند اختبارها على خلايا‎ ad ‏و 788 عند إضافة كل من‎ . TNF ‏فقط من منع النمو الخلوي مع‎ ٠ ‏الثلاشة معاً إلى‎ cytokines ‏تتوفر السيتوكينات‎ Laie 780 ‏و‎ TNF ‏و‎ 114 .)١ ‏في (جدول‎ TNF, IL-4, IFN-g ‏وجود‎ Yo ‏التي بواسطتها يعزر‎ mechanism ‏وتوضح تلك النتائج اختلاف الآلية‎ ‏عن تلك الخاصسة ل 11-4 . ومن أجل‎ TNF ‏الاستجابة السمية الخلوية‎ IFN-g ‏بواسطة 1774-8 و11-4 تم تقدير‎ INF ‏أن نوضح الفرق في ألية تقوية ل‎ ‏ومن المعروف‎ . TNF ‏على تحفيز مُستقبل‎ cytokines ‏تأثير كل من السيتوكينات‎ ٠ ‏وتوضح النتافج‎ TNF ‏يحفز مستقبل ال‎ (TFN-g) ‏انترفيرون جاما‎ SRE ‏بواسطة 11-4 على‎ (U-937 cells ) ‏المبينة في جدول )11( أن تعريضاً مسبقاً لخلايا‎ ‏كما‎ TNF ‏امتداد الليل 74 لا يؤدي إلى زيادة في الارتباط التخصصي ل‎ ‏لا يؤدي إلى زيادة في تخليق مستقبلات جديدة . وبناء على ذلك فإن آلية‎ [FN-g 20 ‏تختلف عن‎ TNF ‏تقوية 11-4 ل‎ ‏ادل‎

Ye (Y ) ‏جدول‎

EFFect of Interleukin-4 on the Binding of

Tumor Necrosis Factor To U. 937 cells

Total | Non-Specific ْ Specific ْ ْ Treatment ْ ٍْ ٍْ ْ'

Binding | Bindng Binding ‏الترابط المحدد | الترابط الغير محدد | الترابط الكلي | المعالجة‎ '

Nome ‏صر ب 1 ا‎ dears 1007 ma noeso | ames os ‏عن 1) لمدة 14 ساعة عند‎ / ml) IL-4 ‏تعامل الخلايا + ]937 11] ب‎ (V) °

You, int ‏وتوضع‎ . media ‏ثم تغسل بعد ذلك بالوسط‎ a TV ‏درجة حرارة‎ ‏مللي لتر‎ ١7 ‏خلية في حاضنة عند درجة حرارة 4 أم لمدة ساعة واحدة في‎ ‏في‎ [0.2% 10° cpm of "PI-TNF [ ‏من وسط العينة المختبرة 0168م محتوية على‎

Ji ‏غير الموسوم . وبعد أن‎ TNF ‏من‎ [100mm] ‏وجود أو في غياب‎ ‏متكرر‎ (Y) ‏الخلايا يتم تقدير حدود النشاط الإشعاعي كما هو موضح في مثال‎ ve

Triplicate ‏كل التقديرات ثلدثة مرات‎ تؤدي إضافة 11-4 بمفرده إلى تكاثر بعض الخلايا . كما هو موضح في جدول )11( فهو يحسن من نمو النسل الخلوي لسرطان للصدر ‎(ZR-75-1)‏ ‎٠‏ بحوالي 740 أعلى من عينة المقارنة الخالية من إضافة 11-4 . كما لوحظ أيضاً تأثيرات على تكاشثر الخلية مع عدد من الأنسال الخلوية ولكن بدرجة أقل . ووجد أن نمو الخلايا ‎cells‏ 8-431 قد تأثر بدرجة طفيفة في ( جدول 1 ) بواسطة 11-4 . وتكون تلك التأثيرات المحفزة للنتمو بالنتسبة ل ‎Ld‏ معتمدة على الجرعة ( إتكالية الجرعة ‎dose dependent‏ ). لام

A

(¥) ‏جدول‎ ‎Modulation of Growth of Various Human Tumor cell Lines by

Interleukin-4'

ClTwms Relativecell viability (percent)

ZR-75-1(Breasttumor) ‏اع‎ } MAO B

MDA-MB-4GS(Breast tumor) ‏إٍْ ا ل ااا 1 ا‎

HSOSTST(restwmony um

BT-20(Breastuumor) ‏ااا‎ I ne

MCR? resstwmony 1s ٍ A-375 (Melanoma) ‏ااا ا‎ 0 ee 0

MDAMB330 (Breastuwmon) | 10

A-431 (Vulvar Carcinoma) ‏ااا‎ 1 86

U-937 (Histiocytic lymphoma) i ‏نس للد‎

VY ‏لمدة‎ 11-4 )1 ug/ml) ‏في حاضنة مع‎ ]5* 103 cells] ‏توضع الخلايا‎ )١( ٠ ‏الخلايا للنمو بواسطة صبغة البنفسمي المتبلور‎ ALE ‏ساعة بعد ذلك تقدر‎

Triplicate ‏وتكرر التقديرات ثلاث مرات‎ . )١( Jal ‏طبقاً لما ورد في‎ ّ )2( ‏مثال‎ ‎Enhancement of Lymphotoxin

Antiproliferative Effect by 11-4 ٠ ‏عند اختباره‎ Lymphotoxin ‏أي‎ LT ‏ويحسن 11-4 التأثيرات مضادة للتكاشر‎ ‏بمفرده‎ ) 1000 u/ml) ‏تركيز‎ LT — ‏على الخلايا الورمية . ويقارن تأثير تضاد التكاثر‎ 7 ‏بمفرده أو متحد مع‎ TNF ) 1000 u/ ml) ‏مع تأثير‎ 11-4 (lug / ml) ‏أو متحد مع‎ ‏يتبع ذلك‎ MOA-MB 330 ‏على خلية خطية ورمية صدرية‎ 11-4 ) 108/01 ( media ‏مللي من العينة المختبرة‎ ١51 ‏في‎ ]5710* cells] ‏وضع في حضانة للخلايا‎ vo ‏ساعة ؛ ونجد قابلية الخلية‎ VY ‏لمدة‎ cytokines ‏محتوية على الكمية المعرفة من‎ . ‏وتتم كل التقارير الحسابات في ثلاثة نسخ‎ )١( ‏للنمو كما هو موضح في مثال‎ ‏وتوضع النتائج في رسم )0( فد‎

YY

‏بمفرده له تأثهير أقل على تلك الخلايا مائعة لنمو الخلية‎ TNF ‏ونجد أن‎ . ‏بمفرده له تأثير تكاثري طفيف على تلك الخلايا‎ LT ‏بحوالي 78 . ونجد أن‎ . 58 - 48 ‏كما أن قابلية الخلايا للنمو في وجود 11-4 بمفرده كانت بحوالي‎ ‏أو 17 نجد أن‎ TNF ‏على أي حال عند إضافة 11-4 للأوساط الزرعات مع‎ (0) ‏م نمو تلك الخلايا قد أحبط بصورة هامة كما هو موضح في الشكل‎

Lod ‏في وجود‎ Zh ‏نمو الخلية الورمية إلى حوالي‎ ple la di ‏فقد زاد‎ ‏وإلى 7460 في وجود 11-4 و 11 . أما آلية ( تحفيز انترفيرون جاما‎ TNF ‏و‎ ‏فهي غير مفهومة.‎ TNF ‏للاستجابة الخاصة ب‎ (IFN-g) ‏التأثيرات السمية الخلوية‎ upregudation ‏فمن المعروف أن رفع تنظيم‎ ‏وضح ذلك:-‎ LS TNF ‏بواسطة 1111-8 يصاحبه رفع التنظيم لمستقبلات‎ TNF ‏ال‎ ve ( Aggarwal, etal. ) 1985) Nature 318:665; Vilcek, etal. ( 1986 ): The Biology of the Interferon System, page 249). ‏للخلايا‎ TNF ‏لا يرفع تتظيم مستقبلات‎ IL-4 ‏وقد وضحت دراستنا أن‎ [Ld ‏بواسطة‎ TNF ‏المتأثرة بها . وكما لوحظ أن آلية تحسين مستقبل‎ ‏وقد نشرت تقارير تتقضسمن أن رفع تنظيم‎ . TFN-g ‏تختلف عن آلية‎ ve ‏غير كافية من أجل التجارب السمية للخلايا‎ TFN-g ‏بواسطة‎ TNF ‏مستقبلات‎ ‏كما وضحه:-‎ synergistic cytotoxic response ‏المتدائبة‎ ‎Tsujimoto, et al. ) 1986 ( J. Immunol 137:2272:2276 « Aggarwal, et al. ) 1987) J.

Biol. Chem. 262:10000-10007 ). ae IL4 5 TNF ‏يحفز استجابة‎ IFN-g ‏أن‎ Load ‏ووضحت دراستا‎ x. ‏يعمل هذان العاملان كل منهما من خلال آلية‎ of ‏ونجد أنه من المحتمل‎ ‏عن الآخر . وقد عرف أن 11-4 يحسن التأثيرات السمية‎ independent ‏مسستقلة‎ ‏كما كتب عن ذلك:-‎ TNF ‏الخلوية ل‎

Ruggiero and Baglioni ( 1987 ) J. Immunol. 138:0661-0663 , Holtmann and wallach ( 1987 ) J. Immunol. 139:1161-1167. Yo

EAY vy ‏غيسر‎ TNF ‏وهكذا فإن الآلية التي بواسطتها يحفز 11-4 تأثهيرات‎ ‏؛ فإن 11-4 يقوم بتخفيض التنظيم لمستقبلات‎ IFN-g ‏عكس‎ le ‏واضحة‎ ‏مشبطات‎ Jie ‏هناك عوامل أخرى‎ cytokines ‏وبالإضافة إلى السيتوكينات‎ . TNF

TNF dependent [ ‏وارتفاع درجت الحرارة يزيد من‎ ¢ protein ‏تخليق البروتين‎ ‏كما وضح ذلك:-‎ ] Cytotoxicity | ٠

Watanabe , et al. ( 1988) Cancer Res. 48:650-563 Niitus, et al. 1988 cancer Res . 48:654-657.

TNE ‏أن‎ protein ‏وتتضمن الدراسات الخاصسة بمثبطات تخليق البروتين‎ ‏تحمي الخلايا من التأثير السمي‎ (A protein ‏يحفز تخليق بعض البروتينات‎ ‏المرجع:‎ TNF ‏الخلوي ل‎ ٠

Himeno , et al. ( 1990 ) cancer Res. 50:4941-4945 , Watanabe, et al. ( 1988).

Immunohparmacol . Immunotoxicol. 1 0:479-499. ‏وعامل النمو المحول‎ epidermal ‏ونجد أن كلا من عامل نمو البشرة‎ ‏على عدد من الخلايا‎ TNF ‏يمنعان التأثهرات مضادة للتكائر ل‎ transforming . (sugarman, et al. ( 1987) cancer Res. 47:780-786 ) ‏المختلفة ؛ كما وضح ذلك‎ ١٠ ‏وهذه العوامل المؤثرة على النمو من المعروف على أنها تنتج بواسطة‎ ‏خلايا ورمية متعددة . لذلك من المحتمل أن يوظطف 11,4 لمنع تخليق‎

Ld ‏ونجد أيضاً أنه من المحتمل أن يوظف‎ . growth Factors ‏عوامل التنمى‎ ‏المعروفة‎ ] Cfos and C- myc oncogenes | ‏لتخفيض تنظيم تعبير جينات‎ ‏بدورها في عمليات تكاثر الخلية.‎ x. ‏قد تم استتسالها‎ TNF ‏لمستقبلات 11-4 و 1771-8 و‎ [DNAs] ‏ونجد أن‎ ‏بواسطة:-‎ Tuas

Idzerda, et al. ( 1990 ) J .Exp. Med. Shall et al. ( 1990) cell 61:361-370,

Loetscher, etal. (1990) cell 61:351-359, Smith, etal. ) 1 990 ) Science 248:1019- 1023, Auget, et al. ( 1988) cell 55:273-280. Yo

EAY ve ‏ويكشف تركيب تلك المستقبلات أن المستقبلات بمفردها غير كافية‎ ‏فمن المعروف أن يقوم‎ ] Signal Transduction [ ‏لعمل إشارة أو أمر تحويل‎ ‏كما وضسح‎ [ macrophages [ ‏من البلاعم‎ TNF ‏بتخفيض تعديل إنتاج‎ IL-4 -: ‏ذلك‎ ‎Essner. et al. (1989) 1. Immunol. 142:3857, Hamilton, ) 1989 ) proc. Natl. Acad. o

Sci. USA 86:3803. ‏أبحاث تفيد أن 11.4 يمكن أن يحسن السمية الخلوية للبراعم‎ ‏كما وضح ذلك:-‎ ] macrophage mediated cytotoxicity

Somers and Erickson ) 1989 ) cell Immunol. 122:178-187 [macrophage mediated cytotoxicity] ‏وهذه الأخيرة أي السمية الخلوية للبراعم‎ ١ ‏كما هو موضح في المرجع:-‎ TNF ‏تعزى في المقام الأول إلى‎

Feinamn , et al. ( 1987 ) J. Immunol 138:63 5-640. ‏المترافقة مع تحسين‎ TNF ‏إلا أنه من غير الواضح كيفية منع إنتاج‎ ‏بواسطة 11-4 . فمن‎ [ Macrophage cytotoxicity [ ‏السمية الخلوية للبلاعم‎ ‏المحتمل أن تحسين السمية الخلوية للبلاعم تجاه الخلايا الورمية يتم‎ ١ ‏المنتج‎ IL-4 ‏وقد تبين أن‎ TNF and IL-4 ‏بواسطة التأثير ات التازرية لكل من‎ ‏لخلايا ورمية يظهر نشاطاً للورم في الأنسجة الحية ضد غيرهامن‎ ‏الأورام كما وضح ذلك:-‎ ( Tepper, etal. ) 1989 ( cell 57:503-512) ‏ونجد أن 14[ بمفرده لا ينتج مباشرة تأثيرات مضاداً للتكاثر في‎ x ‏السسرطانئية.‎ LOAN ‏مزرعة‎ ‏عمل 4 كعامل مضاد للورم في الأنسجة الحية غير‎ all ‏هذا‎ ‏مفهومة ؛ فمن المحتمل في هذا الوضع أن يعمل 11-4 كعامل مضاد للورم‎ cy HE ‏عن طريق تحفيز‎ Lads ‏وذلك عن طريق تنشيط البلاعم‎ ‏المضاد للورم التي يمارسيا.‎ vo

EAY

Claims (1)

1. Yo ‏عناصر_الحمابة‎

   ‎-١ ١‏ استخدام تركيب خال من الخلية مكو ن من 11-4 و ‎TNF‏ بنسب فعالة ما بين

   ‎١ : + \ ] 7‏ [ إلى ] ‎٠‏ :ا َّ لتصنيع دواء لعلاج ‎Lal‏ السرطائنية .

   ‎١‏ ؟- الاستخدام طبقاً للبند )1( ؛ أينما وجد ( ‎TNF‏ المذكور ) فهو يمل ‎TNF‏ بشري.

   ‎١‏ ©- الاستخدام طبقاً للبند ‎)١(‏ أو البند (7) ‎١‏ أينما وجد ( 11.4 المذكور ) فهو يمئل ‎(IL-4) Y‏ للإنسان.

   ‎0١‏ 4- الاستخدام طبقاً للبنود من ‎١‏ إلى 7 ؛ أينما وجد التركيب المكون من 114و ‎TNF‏ في مقدار فغّال بنسبة [ ‎١ : ٠١‏ ].

   ‎lymphotoxin ‏وليمفوتوكسين‎ IL-4 ‏استخدام تركيب خال من الخلية يتكون من‎ -© ١ ‏لصنع دو اء لمعالجة‎ [ ١٠: ٠ 1 ‏إلى‎ [ ١٠ : ١ 1 ‏نسبثه من‎ Js ‏في مقد ار‎ Y ‏الخلايا السرطانية.‎ v ‏بشري.‎ (IL-4) ‏يكون‎ (IL-4 ) ‏استخدام وفقاً لبند )0( ؛» أينما وجد‎ >“ ١ ‏استخدام طبقاً للبندين (*) أو )1( حيث يشمل التركيب إضافياً على انترفيرون‎ -7 ١ .interferon 7

   ‏: ل