KR100225322B1 - 종양괴사인자와 인터루킨-4의 상승작용 조성물 - Google Patents

종양괴사인자와 인터루킨-4의 상승작용 조성물 Download PDF

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Abstract

종양 괴사 인자 (TNF) 및 인터루킨-4 (IL-4)를 포함하는 물질의 조성물이 기술되어 있다. 이러한 조성물은 유방암 세포, 사람 외음부암 세포 및 사람 조직구 임파종 세포의 성장을 투여량-의존 방식으로 억제한다. 사람 유방암 세포의 성장 특성은 TNF 또는 IL-4 단독에 노출되었을 때에는 최소한으로 영향을 받는다. 그러나, 이들 두가지 사이토카인을 함께 배합하면 이들 세포의 성장을 투여량-의존적 방식으로 억제한다. 추가로, 인터페론-g(IFN-g)는 TNF와 IL-4 조성물의 증식 억제 효과를 강화시킨다.

Description

[발명의 명칭]
종양괴사인자와 인터루킨-4의 상승작용 조성물
[발명의 분야]
본 발명은 림포카인에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 세포성장 및 세포독성의 억제에 대한 종양괴사인자(TNF; tumor necrosis factor)와 인터루킨(IL; interleukin)-4의 효과 상승 작용에 관한 것이다.
[발명의 배경]
사이토카인은 자신에게 또는 다른 세포들에 영향을 미치는 세포에 의해서 생성된다. 하나의 그룹으로서 정상세포와 비정상세포 모두에 대해 다양한 효과를 나타내는 각종 사이토카인이 있다. 특정한 사이토카인의 특정 세포에 대한 효과는 특정 사이토카인과 표적 세포의 유형 모두에 의존한다.
종양괴사인자는 주로 활성화된 단구 세포 생성물인 사이토카인이며 천연상태에서 고도로 다상유전적이다[참조 : Ayier. et al. (1988) Tumor Necrosis Factors, CRC Handbook on Cytolytic Lymphocytes and Complement : Effectors of the Immune System (E.R. Podack, ed.), CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., p. 105; Goeddel, et al. (1987) Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities. In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Ll : 597]. 이는 배양물중에서 각종 종양 세포의 성장을 억제하고 섬유아세포 B세포 및 흉선 세포의 성장을 자극한다. 종양세포에 대한 TNF의 세포독성 효과는 인터페론에 의해 증가된다[참조: Lee. et al., (1984) J. Immunol. 133:1003; Sugarman, et al. (1985) Science 230:943; Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; Vilcek, et al. (1986) Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferons. in the Biology of the Interferon System. Edited by H. Schellekenes and W.E. Stewart. Elsevier Science Publishers, Amsterdam., p. 249; Fransen, et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22:419-426; Campbell, et al. (1988) J. Immunol. 141: 2325-2329; Schiller, et al. (1987) Cancer Res. 47:2809-2813]. 인터페론에 의한 TNF의 증식억제 효과의 증가로 TNF 수용체의 조절상승이 수반된다[참조 : Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; Fransen, et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22:419-426]. 그러나 인터페론에 의한 TNF 수용체의 조절 향상은 이들의 상승적 세포독성 반응에 대한 주요 기작이 아니다[참조: Tsujimoto, et al. (1986) J. Immunol. 137: 2272-2276; Aggarwal and Eessalu (1987) J. Biol. Chem. 262: 10000-10007].
종양 성장 조절에 대한 인터페론-g 및 TNF의 상승 효과가 미합중국 특허 제4,650,674호(본 명세서에 참조로 인용됨)에 기술되어 있다.
인터루킨-4(IL-4)는 활성화된 T-림프구에 의해 생성되는 면역조절 사이토카인이다. 많은 면역계 조절제중의 하나인 IL-4는 처음에는 B-림프구 증식을 동시-자극하는 이의 능력 때문에 B-세포 성장 인자로서 기술되었다[참조: Howard, et al. J. Exp. Med. 155:914 (1982)]. IL-4는 또한 T-세포, 마스트 세포, 대식세포 및 조혈시원세포를 포함하는 여러 가지 세포에 영향을 끼칠 수 있다[참조: Paul, et al. (1987) Ann. Rev. Immunol. 5:429; Yokota, et al. (1988) Immunol. Rev. 102:137; Carbstein et al., (1986) J. Exp. Med. 163:1405]. IL-4는 T-세포 및 마스트 세포를 포함한 몇몇 세포 유형의 성장을 향상시키고[참조: Fernandez- Botran, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9689; Spits, et al. (1987) J. Immunol. 139:1142; Zlotnik, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3856; Mosmann, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5654], B-세포 및 단구상의 MHC 제II형 항원의 발현을 유도하며[참조: TeVelde, et al. (1988) J. Immunol. 140 : 1548]. 항원 특이적 세포독성 T-세포를 보강시키고, 대식세포 매개된 세포독성을 향상시킨다[참조: Spits, et al. (1988) J. Immunol. 141:29; Widmer, et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1447; Crawford, et al. (1987) J. Immunol. 139 : 135]. IL-4는 IL-1a, IL-b, IFN-g 및 TNF-a를 포함한 몇몇 사이토카인 생성을 하향조절시키지만, B-세포로부터 IL-6 생성을 상승 조절시킨다[참조: Essner, et al. (1989) J. Immunol. 142:3857; Lee, et al. (1990) J. of Leukocyte Biol. 47:475-479; Pelman, et al. (1989) J. Exp. Med. 170:1751). IL-2 유도된 LAK 및 NK 세포 활성은 IL-4에 의해 하향조절된다[참조: Brooks, et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 74 : 162; Nagler, et al. (1988) J. Immunol. 141:2349]. IL-4는 이러한 증식 효과이외에, 최근에는 사람의 림프 및 혈장 세포 신생물의 시험관내 증식도 억제한다는 것이 밝혀졌다[참조: Taylor, et al. (1990) Blood 75:5].
[발명의 간단한 설명]
본 발명은 TNF의 증식억제 활성에 대한 IL-4의 상승작용 효과에 관한 것이다. IL-4는 이로써 한정되지 않으나 유방암 세포, 암종 및 임파종 세포를 포함한 각종 종양 세포에 대해 TNF의 세포독성 효과를 증강 시킨다. 이러한 상승작용 효과는 TNF와 IL-4의 투여량에 의존한다. IL-4에 의한 TNF 세포독성의 증진은 인터페론-γ에 대해 이미 보고된 바와 필적할만하다.
본 발명은 종양 세포에서 TNF의 세포독성 효과에 대한 T-세포 유도된 사이토카인, 인터루킨-4의 상승작용 효과에 관한 것이다. 하나의 양태로서, 본 발명은 실적적으로 정제된 TNF 및 IL-4를 포함하는 물질의 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 실질적으로 정제된 TNF, IL-4 및 인터페론-감마(IFN-g)를 포함하는 물질의 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 이러한 조성물의 용도가 제공된다. 또 다른 양태로서, 종양 세포를 사멸시키기 위한 본 발명 조성물의 용도가 제공된다. 많은 상이한 세포주에 대한 TNF의 증식억제 효과는 IL-4에 의해 증강된다. IL-4 단독으로는 이들 세포주에 대해 성장 억제 효과가 없거나, 몇몇 경우에는 약간의 성장 촉진 효과가 있다. IL-4에 의한 TNF의 세포독성 효과의 증진 정도는 IFN-g의 효과 정도와 정량적으로 필적할만하다 : 그러나, IL-4 및 IFN-g가 TNF 및 임파독소(Lt)의 증식억제 또는 세포독성 효과를 증강시키는 기작은 상이하다.
종양을 갖고 있는 동물에, 종양 괴사 인자 및 인터루킨-4를 포함하는, 종양 세포의 치료에 적합한 세포 비함유 조성물을 투여하면 종양 세포 성장이 저하된다. 바람직하게는 종양 괴사 인자는 사람 종양 괴사 인자이다. 종양 괴사 인자는 어떠한 공급원으로부터도 수득할 수 있다. 이러한 공급원은 당 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 바람직하게는 종양 괴사 인자는 재조합적으로 생성된다. 바람직하게는 IL-4는 사람 IL-4 이다. IL-4는 어떠한 공급원으로부터도 수득할 수 있다. 이러한 공급원은 당 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 가장 바람직하게는 IL-4는 재조합적으로 생성된다.
본 발명은 또한 종양을 갖고 있는 동물에, TNF 및 IL-4를 포함하는 조성물을 종양 치료에 효과적인 양으로 투여함을 특징으로 하여, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 TNF, IL-4 및 IFN-g를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종양을 갖고 있는 동물에, 투여했을 때 종양의 성장을 저하시키고 종양 세포에 선택적 세포독성을 갖는다.
본 발명의 추가의 목적, 양상 및 잇점은 하기 나타낸 바람직한 양태의 상세한 기술, 하기한 도면의 간단한 설명으로부터 분명해진다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 사람 유방암 세포주(MDA-MB-330)의 세포 생존성에 대한 상이한 농도의 TNF와 IL-4(100ng/ml)의 효과를 입증한다.
제2a도 및 2b도는 사람 표피 암 세포주(A-431; 제2a도) 및 사람 조직구 임파종 세포주(U-937; 제2b도)의 세포 생존성에 대한 상이한 농도의 TNF와 IL-4(100ng/ml)의 효과를 입증한다.
제3a도 및 3b도는 A-431(제3a도) 및 MDA-MB-330(제3b도) 세포주에 대한 TNF-의존성 세포독성에 대한 상이한 농도의 IL-4의 효과를 입증한다.
제4도는 MDA-MB-330 세포에 대한 TNF-의존성 세포독성에 대한 IL-4 및 IFN-g의 효과를 입증한다.
제5도는 MDA-MB-330 세포에 대한 TNF 및 Lt 의존성 세포 독성에 대한 IL-4 효과의 비교를 입증한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 종양 세포에 TNF와 함께 IL-4를 투여하여 종양 세포에 대한 TNF의 증식억제 활성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. IL-4는 유방암 세포(MDA-MD-330), 음문 암 세포(A431) 및 조직구 임파종(U-937) 세포를 포함한(이에 한정되지 않는다). 각종 종양 세포에 대해 TNF의 세포 독성 효과를 강화 시킨다. 이러한 상승작용 효과는 TNF와 IL-4의 투여량에 의존한다. IL-4 단독으로는 단독투여시 이들 세포주에 대해 최소의 효과가 있다. 사실, 몇몇 세포주 상에서 IL-4는 단독 투여시에도 상당한 증식 효과를 나타내었다. IL-4에 의한 TNF 세포독성의 증진은 감마 인터페론 (IFN-g)에 대해 이미 보고된 바와 필적할만하다.
본 발명은 T-세포 유래된 사이토카인, 인터루킨-4, 및 TNF를 포함하는 상승작용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 TNF를 단독으로 투여했을때 보다 종양 세포에 대해 보다 현저한 세포 독성 효과를 갖는다. 하나의 양태에서, 본 발명은 실질적으로 정제된 TNF 및 IL-4를 포함하는 물질의 조성물을 제공한다. 이들 사이토카인은 천연적이거나 재조합적으로 생성된 단백질을 포함한 어떠한 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 또 다른 양태에서, 실질적으로 정제된 TNF, IL-4 및 인터페론-감마(IFN-g)를 포함한 물질의 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 이들 조성물의 용도가 제공된다. 또 다른 양태에서, 종양 세포를 사멸시키기 위한 본 발명 조성물의 용도가 제공된다.
용어 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 및 가장 바람직하게는 설치동물, 고양이, 개, 소 또는 사람을 포함함을 의미한다.
용어 종양 괴사 인자는 선호적인 세포독성 활성을 갖고 성숙한 종양 괴사인자 아미노산 서열과 작용적 아미노산 상동성을 나타내는 영역을 갖는, 림포독소 이외의 폴리펩타이드, 이의 단편, 또는 이러한 폴리펩타이드 또는 단편의 유도체를 언급하는데 사용된다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 괴사 인자의 상세한 기술이 본 명세서에서 참조로 인용된 미합중국 특허 제4,650,674에 기록되어 있다.
선호적인 세포독성 활성은 동일한 조건하에서 정상 세포와 비교하여 종양 세포의 우선적인 파괴 또는 성장 억제로서 정의된다. 우선적인 세포독성 활성은 정상 세포 또는 조직과 비교하여 생체내 또는 시험관내에서 종양 세포에 대한 폴리펩타이드의 효과에 의해 검출된다. 세포 용해는 일반적으로 시험관내에서의 진단 증거이며, 종양 괴사는 생체내 실험에서 결정된다. 그러나 세포독성 활성은 세포 성장정지 또는 증식억제 활성으로서 표현될 수 있다. 적합한 검정 시스템이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 기술된 종양 괴사 인자의 비활성을 측정하는데 사용된 세포-용해 검정은 문헌[참조: B. Aggarwal, et al. Thymic Hormones and Lymphokines. 1983. ed. A. Goldstei. Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center] (이 문헌에서 A549 세포주는 ATCC로부터 CCL185로 수득가능하다)에 기술된 검정이 만족할만하다.
TNF의 비활성은 세포성장 억제보다는 표적 세표 용해에 관한 것이다. 종양 괴사 인자 1단위는 표적 세포를 50% 용해시키는데 필요한 양으로서 정의한다. 그러나,이는 비활성을 측정하기 위한 다른 검정, 예를 들어 표적 세포 성장속도에 기초한 방법을 배제시킴을 의미하지는 않는다.
정상적인 생물학적 공급원으로부터의 천연 종양 괴사 인자는 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)상에서 계산된 약 17,000의 분자량을 갖고, 등전점이 약 5.3이고 다수 위치에서 트립신 가수분해에 영향을 받는다. 천연 종양 괴사 인자는 역상 HPLC로 정제된다.
일반적으로, 종양 괴사 인자로서 정의된 폴리펩타이드는 미합중국 특허 제4, 650,674호에 기술된 종양 괴사 인자 단백질과 실질적으로 상동인 영역 또는 약 20 내지 100 아미노산 잔기의 연속 블록, 특히 잔기 35 내지 66 및 110 내지 133을 포함하는 블록에 걸친 이의 단편을 함유한다.
종양 괴사 인자로서 폴리펩타이드의 실체를 확증하는 가장 중요한 인자는 문제의 폴리펩타이드의 세포용해 활성을 실질적으로 중화시키기 위하여 성숙한 종양 괴사 인자의 세포 용해 활성을 실질적으로 중화시킬 수 있는 항혈청의 능력이다. 그러나 면역학적 실체 및 세포독성 실체가 반드시 동시존재하는 것이 아님을 인지해야 할 것이다. 종양 괴사 인자에 대한 중화 항체는 중화 항체가 종양 괴사 인자의 세포독성 활성에 중요한 종양 괴사 인자의 부위에 특이적으로 결합하지 않으므로 후보 단백질과 결합할 수 없다. 대신에 항체는 무해한 영역에 결합하고 입체 장해에 의해 이의 중화 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 이러한 무해한 영역에서 돌연변이된 후보 단백질이 더 이상은 중화 항체에 결합하지 않으나, 그럼에도 불구하고, 문제의 단백질은 실질적인 상동성 및 생물학적 활성의 면에서 종양 괴사 인자가 된다.
말초 림프구 또는 확립된 세포주 배양물로부터 수득된 천연 또는 야생형의 사람 성숙 종양 괴사 인자에 대한 분자량, 등전점등의 특성은 종양 괴사 인자의 천연 종류에 대해 기술하고 있다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 상기 정의에서 고려된 바와 같이 종양 괴사 인자는 천연 종양 괴사 인자의 모든 특성을 나타내지 않는 다른 종류도 포함된다.
본 명세서에서 정의된 종양 괴사 인자는 천연 종양 괴사 인자를 포함하지만 관련된 다른 세포 독성 폴리펩타이드도 이러한 정의내에 포함된다. 예를 들어, 삽입 돌연변이체, 결실 돌연변이체, 또는 융합 단백질과 같은 TNF 유도체는 종양 괴사 인자가 천연의 사람 종양 괴사 인자에 대해 설정된 분자량의 범위 밖에 있게 한다(성숙한 종양 괴사 인자 또는 프레 TNF 자체와이 융합 단백질뿐만 아니라 삽입 돌연변이체는 천연의 성숙한 종양 괴사 인자보다 큰 분자량을 가질 것이며, 천연의 성숙한 종양 괴사 인자는 결실 돌연변이체는 보다 작은 분자량을 가질 것이다). 마찬가지로, 종양 괴사 인자는 트립신 또는 기타 프로테아제에 의한 가수분해에 대한 민감성을 저하 또는 제거시키기 위해 조작될 수 있다. 마지막으로 비영장류 포유동물로부터 유도된 세포주에서 사람 프레 TNF의 해독후 프로세싱으로 발린이 더 이상 아미노 말단 아미노산이 아니도록 아미노 말단 영역에 미세이질성을 갖게할 수 있다.
세포독성 활성에 대한 또는 생체내 종양 괴사에서 할 수 있는이란 말은 종양 괴사 인자가 예를 들어 효소적 가수분해에 의해 지모겐(zymogen)과 유사한 불활성 상태로부터 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩타이드 단편으로 전환될 수 있는 폴리펩타이드를 포함함을 의미한다. 통상적으로, 불활성 전구체는, 성숙한 종양 괴사 인자가 이의 카복실 말단에서 사람 단백질 또는 이의 단편에 펩타이드 결합으로 연결되어 있는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 펩타이드 결합 또는 근접부에서의 서열은 단백질 분해적 가수분해에 민감하여 생체내에서 또는 제조 프로토콜의 일부로서, 시험관내에서 종양 괴사 인자를 방출하도록 선택된다. 이렇게 생성된 종양 괴사 인자는 정의상으로 요구되는 세포독성 활성을 나타낼 것이다.
일반적으로 종양 괴사 인자는 사람 종양 괴사 인자를 의미하지만 쥐, 돼지, 말 또는 소와 같은 기원의 종양 괴사 인자도 상기한 동질성 영역 및 세포독성 활성에 대해 기술한 바와 같은 기준에 부합하는한 종양 괴사 인자의 정의안에 포함된다. TNF는 종특이적이지 않다. 즉 사람 TNF는 마우스 종양에 대해 활성적이다. 따라서 한 종으로부터의 TNF는 다른 종의 치료에 사용될 수 있다. 종양 괴사 인자는 또한 다량체 형태를 포함한다. 종양 괴사 인자의 유도체는 종양 괴사 인자의 용어 범위내에 포함된다. 잔기 35 내지 66 및 110 내지 133 내의 종양 괴사 분자의 영역은 임파독소와 실질적인 상동성 (50%)을 보인다. 두 분자의 소수성 카복시-말단(종양 괴사 인자 잔기 150 내지 157)은 또한 상당히 보존된다. 2개의 단백질은 세포독성 활성 또는 생체내 종양 괴사를 나타내므로, 이들 영역은 임파독소와 종양 괴사 인자의 공유된 활성에 중요한 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명의 실시에 있어서, 임파독소는 TNF를 대신하여 본 발명의 조성물에서 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 인터루킨-4 또는 IL-4는 TPA에 의해 활성화 된 후 EL-4 흉선종 세포에 의해 생성된 인자로서 최초에 기술된 폴리펩타이드를 언급하며, 이는 항-Ig의 서브미토제닉(submitogenic) 투여량에 의해 활성화된 쥐의 B-세포의 증식을 유도한다. IL-4는 또한 B-세포 성장 인자(BOGF), B-세포 자극인자 (BSF-1), T-세포성장인자 Ⅱ(TCGF-Ⅱ) 및 마스트세포 성장 인자 -II (MCGF-II) 라고도 명명된다[참조: Howard, et al. (1982) J. Exp. Med. 155:914-923; Yokota, et al. (1988) Immunol. Rev. 102:137]. 각종 T-세포/림프구 집단에 의해 생성된 IL-4는 면역검정(ELISA) 및 노던 블롯 검정에 의해 검출될 수 있다[참조: Paliard, et al. 1988]. 통상적으로, IL-4 활성은 문헌[참조: Spits, et al., (1987) J. Immunol. 139 : 1142-1147]에 의해 기술된 바와 같이 T-세포 성장 촉진 활성의 생검으로 측정할 수 있다. 그러나 IL-4의 활성을 검정하고 이를 확인하는 다른 방법이 당 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 통상의 생검은 말초혈 단핵세포를 PHA로 72시간 동안 37℃에서 활성화시키고 PHA-블라스트를 세척한 후, 96-웰 평판에 5000세포/0.1ml/웰로 도말하여 수행한다. IL-4 시험 샘플을 연속해서 희석시키고 72시간 동안 37℃에서 세포와 함께 배양한다. 삼중수소 처리된 티미딘을 세포에 가하고, 세포로 혼입된 삼중수소 처리된 티미딘을 측정하여 IL-4 활성을 결정한다. IL-4 1단위는 최대 증식의 절반을 나타내는 사이토카인의 양이다. 혈청 함유 배양 상등액으로부터 천연 IL-4의 정제 방법은 문헌[참조: Le, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10817-10823]에 기술되어 있다. 간단히 요약하면, S-세파로즈 상에서 양이온 교환 크로마토그래피후, 50mM HEPES(pH 7.0)중의 0 내지 0.5M NaCl 구배로 용출시킨 IL-4 함유 분획을 세파덱스 G-100 상에서 겔여과 한다. IL-4 분획을 0.1%(v/v) 트리플루오로 아세트산중의 20 내지 70%(v/v) 아세토니트라이트 구배를 사용하여 역상 HPLC로 정제한다.
이들 방법으로 회수율은 약 60%이고 3000-배 정제(비활성 : 2.6x107U/mg)된다. 혈청 비함유 배양 상등액으로부터 IL-4의 정제시에는 단지 CM-세파로즈상에서의 하나의 크로마토그래피 단계가 필요하며 이에 의한 회수율은 40%이고 100-배 정제(비활성 : 3x107U/mg)된다. IL-4 활성을 갖고 성숙한 IL-4 아미노산 서열, 이의 단편, 또는 이러한 폴리펩타이드 또는 단편의 유도체와 기능적 아미노산 상동성을 나타내는 영역을 갖는 어떠한 폴리펩타이드도 본 발명의 실시에 유용하다.
IL-4의 비활성은, 본 발명에서 이의 용도가 TNF 세포 독성의 강화라는 사실에도 불구하고 세포증식으로 특징화 된다. 그러나 이는 비활성을 측정하기 위한 다른 검정법, 예를 들어 표적 세포상에서의 다른 생물학적 효과에 기초한 방법을 배제시키는 것을 의미하지는 않는다.
IL-4의 물리화학적 특성이 문헌에 기술되어 있다[참조: Yokota, et al. (1988) Immunol. Rev. 102:137 and Le. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:10817-10823]. 정상적인 생물학적 공급원으로 부터의 천연 IL-4는 겔 여과로 측정한 계산 결과 분자량이 약 20,000 내지 22,000Da이고, 당 그룹이 제거되는 경우 등전점은 약 6.7이고 당 그룹이 있는 경우는 10.53이며 트립신 및 키모트립신 가수분해에 민감하다. IL-4 단백질 서열은 15,000 달톤의 이론적 분자량을 갖는 129개 아미노산이다. 이러한 이론적 분자량은 SDS-PAGE로 측정한 분자량 15,000 , 18,000 및 19,000과 근접한다. 겔 여과와 SDS-PAGE로 측정한 분자량 사이의 차이는 탄수화물 잔기에 의한 것이다.
재조합 IL-4는 겔 여과로 측정시 약 22,000Da 및 SDS-PAGE로 측정시 15,000의 계산된 분자량을 가지며, 등전점이 약 10.53이고, 트립신 및 키모트립신 가수분해에 민감하다.
4℃에서 3개월 이상 동안, 보다 바람직하게는 실온에서 1개월 동안 및 56℃에서 약 10분 동안 안정하다. IL-4는 광범위한 pH범위(2 내지 10)에서 안정하며, 종 특이성이 아니어서, 사람 IL-4가 쥐 세포상에서 작용한다(그러나 쥐 IL-4는 종 특이적이다).
본 명세서에서 폴리펩타이드가 IL-4의 정의 범위내에 속하는 아미노산 서열 상동성의 정도는, 문제의 단백질과 IL-4 사이의 상동성이 세포독성 활성에 관계하는 IL-4 영역내에 속하는지의 여부에 따라 다양할 것이다. 세포독성 활성에 중요한 도메인은 고도의 상동성을 나타내어야 정의내에 포함되는 반면에 IL-4 형태의 유지 또는 수용체 결합을 수행하는데 관련되지 않는 서열은 비교적 낮은 상동성을 나타낼 수 있다. 또한,중요한 도메인은 세포용해 활성을 나타내지만,기능적으로 유사한 아미노산 측쇄를 갖는 잔기가 치환되는 경우에도 본 명세서에서 정의되는 바와 같이 여전히 상동성을 지닐 수 있다. 기능적으로 유사하다는 것은 염기성, 중성 또는 산성과 같은 측쇄의 유력한 특성, 또는 입체적 벌크(bulk)의 존재 또는 부재를 언급한다.
IL-4와 같은 폴리펩타이드의 실체를 확립하는 가장 중요한 인자는 IL-4의 생물학적 활성을 실질적으로 중화시켜 문제의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 실질적으로 중화시킬 수 있는 항 혈청의 능력이다. 그러나, 면역학적 실체 및 세포 독성 실체가 반드시 일치하는 것은 아님을 인정해야 한다. IL-4에 대한 중화 항체는 IL-4의 생물학적 활성에 중요한 IL-4 상의 부위와 특이적으로 결합하지 않으므로 문제의 단백질과 결합하지 않을 수 있다. 반면에, 항체는 무해한 영역과 결합하고 입체 장애에 의해 이의 중화 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 이러한 무해 영역에서 돌연변이된 문제 단백질은 더 이상 중화 항체와 결합할 수 없으나, 그럼에도 불구하고 실질적인 상동성 및 생물학적 활성면에서는 IL-4일 수 있다.
말초 림프구 또는 확립된 세포주 배양물로부터 수득된 천연 또는 야생형의 성숙한 IL-4에 대한 분자량, 등전점과 같은 특성은 단지 IL-4의 천연종에 대한 기술이라는 것을 관측하는 것이 중요하다. 앞선 정의에서 고려되는 바와 같이 IL-4는 천연 IL-4의 특성을 모두 나타내지 않는 기타 종류도 포함한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 IL-4는 천연 IL-4를 포함하는 한편 기타 관련된 폴리펩타이드도 이러한 정의에 포함된다. 예를 들어, 삽입 돌연변이체, 결실 돌연변이체, 또는 융합 단백질과 같은 IL-4 유도체는 천연 IL-4에 대해 설정된 분자량 범위밖의 분자량을 가질 것이다(성숙한 IL-4와 융합 단백질뿐만 아니라 삽입 돌연변이체는 천연의 성숙한 IL-4 보다 큰 분자량을 가지며 천연 IL-4의 결실 돌연변이체는 보다 적은 분자량을 갖는다). 마찬가지로, IL-4는 조작되어 트립신 또는 기타 프로테아제에 의한 가수분해에 대한 민감성을 감소 또는 제거시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들어 효소적 가수분해에 의해 지모겐과 유사한 불활성 상태로부터 목적하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드 단편으로 전환될 수 있는 불활성 형태로 어느 하나 또는 모든 폴리펩타이드와 함께 투여될 수 있다. 통상적으로, 불활성 전구체는 하나 이상의 IL-4, TNF 및 IFN-g가 펩타이드 결합에 의해 사람 단백질 또는 이의 단편에 직접적으로 연결되거나 본 발명의 실시에 유용한 또다른 폴리펩타이드에 간접적으로 연결된 융합 단백질이다. 이러한 펩타이드 결합 또는 근접부에서의 서열은 단백질 분해적 가수분해에 민감하여 IL-4, 종양 괴사 인자, 및 IFN-g를 생체내 방출시키거나 제조 프로토콜의 일부로서 시험관내에서 방출시키도록 선택한다. 이렇게 생성된 조성물은 정의상 요구되는 세포독성 활성을 나타낼 것이다.
IL-4는 통상 사람 IL-4를 의미하나, 다른 공급원[예: 쥐, 돼지, 말 또는 소]으로부터의 IL-4도 이것이 상동 영역과 세포독성 활성에 대해 상술한 기준과 일치하는한 IL-4의 정의내에 포함된다.
IL-4의 다량체 형태도 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
IL-4의 유도체는 용어 IL-4의 범위내에 포함된다. 유도체는 아미노산 서열 돌연변이체, 글라이코실화 변이체 및 기타 화학적 잔기와의 공유적 또는 집합적 결합체를 포함 한다. 공유적 유도체는 IL-4 아미노산 측쇄에서 발견되는 그룹 또는 N-또는 C-말단에 당분야에 공지된 방법으로 작용기를 연결시켜 제조한다.
TNF와 함께, 돌연변이체 IL-4 유도체는 IL-4의 예정된, 즉 부위 특이적 돌연변이 또는 본 발명의 실시에 유용한 이의 단편을 포함한다. 돌연변이체 IL-4는 본명세서에 나타낸 IL-4에 대한 상동성 정의내에 속하지만 결실, 치환 또는 삽입에 의한 것과 무관하게 IL-4의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서 정의된다. 공지된 서열을 갖는 DNA에 예정된 부위에서 치환 돌연변이체를 제조하는 기술은 널리 공지되어 있다(예: M13 프라이머 돌연변이 유발).
실질적으로 균질한 IL-4 또는 종양 괴사 인자는 천연 단백질이 분리되는 공급원에 고유한 기타 단백질이 실질적으로 없는 IL-4 또는 종양 괴사 인자를 의미한다. 이것은 상동성인 IL-4 및/또는 종양 괴사 인자가 혈장 단백질, 예를 들어 알부민, 피브리노겐, 세린 프로테아제, a-글로불린, 비-종양 괴사 인자 세포독성 폴리펩타이드(예: 임파독소 또는 인터페론) 또는 전체 세포 및 입자 세포 파편을 포함한 폴리펩타이드의 합성 기원으로 사용되는 세포 또는 유기체의 기타 단백질에는 실질적으로 없음을 의미한다. 그러나, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 하기 기술되는 안정화제 및 부형제와 같은 물질, 합성 기원으로 사용되는 세포 또는 유기체로부터의 예정량의 단백질, 최초 폴리펩타이드 공급 세포 또는 유기체 이외의 단백질, 및 폴리-L-리신과 같은 합성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이질대립 유전자(allogeneic) (예: 세균) 숙주 세포에서 발현되는 재조합 IL-4 또는 종양 괴사 인자는 물론 유전자 공급원 단백질이 완전히 함유되지 않게 발현될 것이다.
본 발명의 실시에 사용된 IL-4 및 종양 괴사 인자는 바람직하게는 당 분야의 전문가에게 공지된 방법으로 재조합 유기체의 배양물중에서 합성된다.
본 발명의 조성물은 목적하는 정도의 순도를 갖는 종양 괴사 인자와 IL-4를 생리학적으로 허용되는 담체, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에 비독성인 담체와 혼합하여 투여용으로 제조한다. 통상적으로, 이는 본 발명의 IL-4와 TNF 조성물을 완충제, 항산화제(예: 아스코르브산), 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코즈 또는 텍스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이트화제(예: EDTA), 및 기타 안정화제 및 부형제를 배합하는 것을 포함한다. 담체는 조성물을 안정화시키도록 제형화되어야한다. 치료적 투여에 사용될 조성물은 멸균 상태여야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과로 수행한다. 조성물은 통상적으로 동결건조 형태로 저장된다.
또한, 인터페론은 IL-4 및 종양 괴사 인자와 효과 상승적으로 작용하므로 알파, 베타 또는 감마 인터페론을 종양 괴사 인자/IL-4 조성물 또는 IL-4/종양괴사 인자 및 임파성독소-함유 조성물과 배합하는 것이 바람직하다. TNF는 약 100U/ng의 비활성을 갖는다. IL-4 및 IFN-g의 비활성은 약 10U/ng 이다. 통상의 제형물은 IL-4 및/또는 IFN, 및 종양 괴사 인자 및/또는 임파성독소를 약 0.1:1 내지 200:1, 통상적으로 10 내지 1의 단위 활성비로 포함하며, 종양 괴사 인자의 일부 또는 모두 대신에 임파성독소를 함유할 수 있다. 이들 비는 물론 치료적 경험에 의해 필요한 바 대로 변형된다.
IL-4/TNF 조성물은 종양을 갖는 동물에 투여된다. 투여 경로는 공지된 방법에 따라 예를 들어 멸균 IL-4/TNF 용액의 정맥내, 복강내, 근육내, 병소내 주입 또는 주사에 따르거나 하기 나타낸 서방 시스템으로 수행한다.
IL-4/TNF는 병소내, 즉 충실성 종양에 직접 주사하여 투여할 수 있다. 백혈병과 같이 전이된 종양의 경우에는, 정맥내 또는 림프계로의 투여가 바람직하다. 난소암과 같은 복부 기관의 종양은 복막 투석 하드웨어 및 복막-적합 용액을 사용한 복강내 주입으로 치료하는 것이 유리하다. 그러나 통상적으로 IL-4/TNF는 환약 주입이 허용되기는 하지만 주사에 의해 연속 투여한다.
IL-4/TNF는 바람직하게는 이식가능한 서방형으로 투여된다. 종양 괴사 인자 이량체 또는 삼량체의 분자량을 갖는 단백질에 적합한 시스템의 예는 L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트[참조: U. Sidman, et al., 1983, Biopolymers 22(1) : 547-556], 폴리(2-하드드록시에틸-메타크릴레이트) [참조: R. Langer, et al., 1981, J. Biomed. Matter. Res. 15: 167-277 and R. Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105] 또는 에틸렌 비닐 아세테이트[참조: R. Langer, et al. Id.]와의 공중합체를 포함한다. 이러한 제품은 종양이 절개된 수술 부위에 이식된다. 달리는, IL-4/TNF 조성물은 종양으로 주입하기 위한 반투과성 미세 캡슐 또는 리포좀에 캡슐화 된다.
이러한 투여 방식은 수술로 절제할 수 없는 종양(예: 뇌종양)에 특히 유용하다.
종양을 갖고 있는 개체에 TNF와 IL-4를 투여함으로써 본 발명의 종양 세포를 치료하는 방법은 이들 폴리펩타이드의 동시적 및 연속적 투여를 모두 고려한다. 개체에게 폴리펩타이드중 어느 하나를 투여한 후 제2폴리펩타이드를 연속 투여함으로써 동시 투여의 효과를 모방할 수 있다는 것이 당 분야의 전문가에게 공지되어 있다. 이러한 연속 투여의 타이밍은 당 분야의 전문가에게는 용이한 일이며, 전적으로 먼저 투여된 폴리펩타이드의 생체내 분해속도에 의해 결정된다.
투여되는 IL-4/TNF 조성물의 양은, 예를 들어 투여 경로, 문제의 종양 및 환자의 상태에 따른다. 병소내 주사가 정맥내 주입보다 체중을 기준으로 하여 적은량의 IL-4/TNF가 필요하며 몇몇 종양 타입(예:충실성 종양)은 다른 종양(예: 백혈병) 보다 종양 괴사 인자에 보다 내성인 것으로 보인다. 따라서 치료자는 예를 들어 종양의 생검에 의하거나 암태아성 항원과 같은 가상의 암 마커에 대한 진단 검정에 의해 결정되는 바와 같이 표적 종양에 대한 최적 세포 독성 활성을 얻는데 요구되는 바와같은 증가된 투여량에서 부딪치는 재조합 독성 측면에 대해 투여 용량을 적정하고 투여 경로를 변형시키는 것이 필요할 것이다. 통상적으로, 마우스에서 종양 괴사 인자 투여량(정맥내 투여에 의해 약 120㎍ 이하/체중 kg/일)이 생체내에서 실질적으로 비-독성이고 효과적인 것으로 밝혀졌다. 마우스에서 IL-4 용량(정맥내 투여에 의해 약 120㎍ 이하/체중 kg/일)이 생체내에서 비-독성이고 효과적인 것으로 밝혀졌다.
종양 괴사 인자는 이의 세포독성 활성상 종 특이적이 아니어서, 사람 종양 괴사 인자이외의 다른 종양 괴사 인자(예:소 또는 돼지 공급원)가 사람의 종양을 치료하는데 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 것으로 믿어진다. 그러나 가능한자가 항체 발생을 피하기 위해서 치료되는 종으로부터의 종양 괴사 인자를 사용하는 것이 바람직하다.
모든 인용문헌은 참조로 인용되고 있다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였으나, 하기 [실시예]를 참조로 보다 완전히 이해될 것이다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 것으로써 달리 언급하지 않는한 제한하려는 것이 아니다.
[실시예 1]
[세포 배양법]
모든 세포주는 서브컨플루먼트(subconfluent) 배양물중에 엄격히 유지된다. 세포를 공기중 5% CO2하의 가습 배양기중의 글루타민(2mM), 페니실린(100단위ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml) 및 태아 소 혈청(10%)으로 보충된 DMEM 배지중에 0.3 내지 1.3x106세포/25mm 페트리 디쉬에 도말한다.
[실시예 2]
[세포독성 검정]
세포독성 검정을 위해서 배지 0.1ml 중의 5x103세포를 96웰 코스타 평판에 도말한다. 공기중 5% CO2의 가습 대기하에 37℃에서 밤새 배양한 후, 배지를 제거시키고 시험 샘플을 연속 희석시켜 배지 0.1ml에 도말한다. 37℃에서 72시간 배양한 후, 배지를 제거시키고 생존 세포를 문헌[참조: Sugarman, et al. (1985) Science 230 : 943]에 기술된 바와 같이 크리스탈 바이올레트 염색에서 모니터링한다. 상대적 세포 생존성에 대한 %는 시험 샘플 존재하의 흡광도를 시험 샘플 부재(배지)하의 흡광도로 나누어 100을 곱하여 계산한다.
[실시예 3]
[방사성 수용제 검정]
수용체 결합 검정은 문헌[참조: Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665]에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다.
간단히 요약하면 0.25x106세포를 12x75mm 폴리프로필렌 튜브내, 100-배 과량의 비표지된 TNF 존재(비특이적 결합) 또는 부재(총 결합)하에125I-TNF 0.2x106cpm을 포함하는 신선한 빙냉 배지(DMEM + 10% FBS) 0.2ml중에서 배양한다. 4℃에서 60분 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 원심분리로 3회 세척하고 세포 결합된 방사성을 측정한다. 모든 측정은 3회 수행된다.
[실시예 4]
[IL-4에 의한 TNF 증식 억제 효과의 증진]
IL-4는 상이한 종양 세포 타입에 대해 시험될 때 TNF의 증식 억제 효과를 증진시킨다. TNF 단독 또는 고정 농도의 IL-4(100ng/ml)와 배합된 TNF의 농도를 달리하여 유방암 세포주, MDA-MB-330상에서 실험한다. 그 결과가 제1도에 나타나 있다. 지시량의 사이토카인을 포함하는 배지 0.1ml중의 5x103세포를 72시간 동안 배양한 후, 세포 생존성을 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정한다. 모든 측정은 3회 수행된다.
TNF 단독으로는 10,000U/ml의 고농도에서도 이들 세포에 최소의 효과를 갖는다. 그러나, IL-4를 TNF와 함께 배양물에 가하는 경우, 이들 세포의 성장이 투여량 의존적으로 억제된다. 제1도에서 볼 수 있는 바와 같이, 10,000U/ml의 농도에서 단지 10%의 세포 성장 억제가 관측되었다. 그러나 IL-4 100ng/ml이 가해지는 경우, 종양 세포 성장 억제가 거의 60%로 증가하였다. IL-4에 의한 TNF의 세포독성 효과의 강화는 외음 암세포(A431) 및 조직구 임파종 세포(U-937)와 같은 다른 세포 타입으로도 관측되었다. 제2a도 및 2b도는 사람 표피 암 세포주(A-431; 제2a도) 및 사람 조직구 임파종 세포주(U-937; 제2b도)의 상대적 세포 생존성(%)에 대한 상이한 농도의 TNF와 IL-4(100ng/ml)의 효과를 입증한다. 0.5x103세포를 지시량의 사이토카인을 포함하는 배지 0.1ml중에서 72시간 동안 배양한 후, 세포 생존성을 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정한다.
제2a도 및 2b도는 A431 세포(제2a도)의 TNF-의존적 성장 조절에 대한 IL-4의 상당한 효과가 사이토카인 0.01U/ml과 같이 낮은 농도에서도 관측될 수 있다는 것을 입증한다.
IL-4에 의한 TNF의 세포독성 효과의 증진은 고농도(1000U/ml)에서 U-937 세포(제2b도)상에서 보다 두드러졌다.
고정 농도의 TNF(1000U/ml)에 대한 다양한 농도의 IL-4의 효과 또한 조사한다. 5x103세포를 배지 0.1ml중의 지정 농도의 사이토카인과 72시간 동안 배양한 후, 세포 생존성을 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정한다. 모든 측정은 3회 수행된다.
제3a도 및 3b도는 A-431(제3A도) 및 MDA-MB-330(제3b도) 세포주에 대한 TNF 1000단위/ml의 세포독성에 대한 다양한 농도의 IL-4의 효과를 입증한다.
IL-4 단독의 단일 용량(1㎍/ml)의 효과가 또한 나타나 있다. A-431 세포 (제3A도)는 IL-4와 TNF 모두의 존재하에서 용량 의존적 방식으로 억제 되었다.
IL-4 단독으로는 1㎍/ml의 농도에서도 비효과적이었다. IL-4의 유사한 용량의존적 반응이 유방암 종양 세포(제3b도)로 관측 되었다.
[실시예 5]
[TNF 세포독성의 IL-4 및 IFN-g 강화 비교]
인터페론-g 또한 각종 종양 세포주에 대해 TNF의 세포독성 효과를 증진시킨다는 것이 입증된 바 있다[참조 : 미합중국 특허 제4,650,674호; Lee, et al. (1984) J. Immunol. 133:1003: Sugarman, et al. (1985) Science 230:943; Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; Vilcek, et al. (1986) Interaction Between Tumor Necrosis Factor and Interferons. The Biology of the Interferon System, Edited by H. Schellekenes and W.E. Stewart. Elsevier Science Publishers, Amsterdam., page 249; Fransen, et al. (1986) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 22:419-426; Campbell, et al. (1988) J. Immunol. 141:2325-2329; Schiller, et al. (1987) Cancer Res. 47: 2809-2813; Tsujimoto, et al. (1986) J. Immunol. 137: 2272-2276]. 제4도는 MDA-MB 330 세포에 대한 TNF 의존성 세포독성에 대한 IL-4 및 IFN-g의 효과를 비교한 것이다. 5x103세포를 상이한 농도의 TNF 및 IL-4(100ng/ml) 또는 IFN-g(100ng/ma)을 포함하는 배지 0.1ml중에서 72시간 동안 배양한후 세포 생존성을 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정한다. 모든 측정은 3회 수행한다.
IL-4 및 IFN-g가 유사한 기작으로 작용하여 TNF의 세포 독성 효과를 강화시킨다는 것을 측정하기 위해서, IL-4 및 인테페론-g에 의한 TNF의 증식 억제 반응의 강화를 비교한다.
제4도에 나타낸 결과는, 유방암 세포에 대해 동일농도(100ng/ml)의 IL-4 및 IFN-g가 모두 유사한 정도로 TNF의 성장 억제 효과를 증진시킨다는 것을 보인다. 세포성장이 약 60 내지 70% 억제되었다. 유사한 결과가 A-431 및 U-937 세포 표1에서도 나나났다.
[표 1]
1: 5x103세포를 TNF(200ng/ml) 또는 IL-4(100ng/ml) 또는 IFN-g(100ng/ml) 또는 상기한 바와 같은 사이토카인 배합물을 배지 0.1ml 용적에서 배양한다. A-431 세포의 경우, 모든 사이토카인의 농도는 IFN-g(1ng/ml)을 제외하고는 동일하다. 72시간 동안 사이토카인과 배양한후, 실시예 1에 기술한 바와 같이 크리스탈 바이올렛 염색으로 세포 생존성을 측정한다.
IL-4는 또한, TNF와 동일한 정도로는 아니나 IFN-g의 증식 억제 효과를 약간 증진시키는 것으로도 보인다(표 1). 더욱이, 세가지 사이토카인 모두의 배합물이 최대로 효과적이다. 예를 들어, A431 세포에 대해 시험되는 경우, 세포성장은 TNF로는 단지 30% 억제, IL-4와 TNF가 함께 가해지는 경우 55% 억제, 세가지 사이토카인이 배합물에 존재하는 경우 즉, IFN-g, IL-4 및 TNF가 존재하는 경우, 80% 억제되었다 (표 Ⅰ).
이들 결과는 IFN-g가 TNF의 세포독성 반응을 증진시키는 기작이 IL-4와 상이함을 나타낸다. IL-4 및 IFN-g에 의한 TNF의 강화 기작에 있어서의 상이함을 추가로 입증하기 위해서, TNF 수용제의 유도에 대한 두 사이토카인의 효과를 측정한다. IFN-g는 TNF에 대한 수용체를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 표Ⅱ에 나타난 결과는, U-937 세포를 IL-4에 밤새 노출시키는 예비 노출에 의해 TNF의 특이적 결합이 증가되지 않는다는 것을 분명히 나타내므로, 이는 새로운 수용체 합성 증가를 제시하지 않는다. 따라서, TNF의 IL-4 강화 기작은 IFN-g와는 상이하다.
[표 2]
1: U 937 세포를 24시간 동안 37℃에서 IL-4(1㎍/ml)로 처리한후, 배지로 세척한다. 250,000 세포를 비표지된 TNF 100nm의 존재 또는 부재하에125I-TNF 0.2x106cpm 함유 배지 0.2ml중에서 1시간 동안 4℃에서 배양한다. 이어서, 세포를 세척하고 세포 결합된 방사능을 [실시예 2]에 기술된 바와 같이 측정한다. 모든 측정은 3회 수행된다.
IL-4는 단독으로 가하는 경우 특정 세포 증식을 유발한다. 표 3에 나타낸 바와 같이 IL-4는 유방암 세포주 ZR-75-1의 성장을 대조군에 비해 거의 40% 증진시켰다. 세포 증식 효과는 또한 다른 세포주를 사용하여 보다 낮은 정도로 관측되었다. A-431 세포의 성장이 IL-4에 의해 약간 억제되었다(표 2). IL-4의 이들 성장 억제 효과는 투여량 의존적인 것으로 밝혀졌다.
[표 3]
1: 5x103세포를 72시간 동안 인터루킨-4(1㎍/ml)과 함께 배양한후, 상대적 세포 생존성을 실시예 1에 따라 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정한다.
모든 측정은 3회 수행된다.
[실시예 6]
[IL-4에 의한 임파독소 증식 억제 효과의 증진]
인터루킨-4는 종양 세포에 대해 시험되는 경우 임파독소(Lt)의 증식 억제 효과를 증진시킨다. 유방암 세포주, MDA-MB 330에 대한 Lt(1000U/ml) 단독 또는 IL-4(1㎍/ml)과 배합한 Lt의 증식 억제 효과를, TNF(1000U/ml) 단독 또는 IL-4 (1㎍/ml)과 배합한 TNF의 효과와 비교한다. 지시량의 사이토카인을 포함하는 배지 0.1ml중에서 5x103세포를 72시간 동안 배양한 후, 세포 생존성을 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정한다. 모든 측정은 3회 수행한다. 그 결과가 제5도에 나타나 있다.
TNF 단독은 이들 세포에 대해 세포 성장을 단지 5%로 억제하는 최소의 효과를 가졌다. Lt 단독으로는 이들 세포에 대해 약간의 증식 효과를 가졌다. IL-4 단독의 존재하에서의 세포 생존성은 95 내지 98%였다. 그러나 ,IL-4를 TNF 또는 Lt 와 함께 배양물에 가하는 경우, 이들 세포의 성장이 상당히 억제되었다. 제5도에서 알 수 있는 바와 같이 종양 세포 성장 억제는 IL-4와 TNF의 존재하에서 거의 60%, IL-4와 Lt의 존재하에서 40% 억제되었다.
IFN-g가 TNF 반응을 강화시키는 기작은 공지되지 않았다. IFN-g에 의한 TNF의 세포독성 효과의 상향조절은 TNF 수용체의 상향조절을 수반하는 것으로 공지되었다[참조: Aggarwal, et al. (1985) Nature 318:665; Vilcek, et al. (1986) The Biology of the Interferon System, page 249]. 그러나, 본 발명자들의 조사에서는, IL-4에 의해 영향을 받는 세포상의 TNF 수용체를 상향조절하지 않는다는 것을 보인다. 이러한 관측은 IL-4에 의한 TNF 반응의 증진 기작이 IFN-g와는 상이하다는 것을 의미하지만, IFN-g에 의한 TNF 수용체의 상향조절이 이들의 효과상승적 세포독성 반응에 충분하지 않다는 것으로 보고되었다[참조: Tsujimoto, et al. (1986) J. Immunol, 137:2272-2276; Aggarwal, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:10000-10007]. 본 발명자들의 관측은 또한 IFN-g가 TNF와 IL-4의 반응을 함께 강화시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 두가지 제제는 독립적 기작으로 작용할 수 있다. 인터루킨-1은 또한 TNF의 세포독성 효과를 증진시키는 것으로 공지되어 있다[참조: Ruggiero and Baglioni (1987) J. Immunol. 138:0661-0663; Holtmann and Wallach (1987) J. Immunol. 139:1161-1167]. 따라서 IL-4가 TNF의 효과를 강화시키는 기작은 분명치 않다. IFN-g와는 대조적으로, IL-1은 TNF의 수용체를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다. 사이토카인 이외에, 단백질 합성 억제제와 같은 다른 제제 및 승온이 TNF의 의존적 세포독성을 증가시킬 수 있다 [참조: Watanabe, et al. (1988) Cancer Res. 48:650-653; Niitsu, et al. (1988) Cancer Res. 48:654-657]. 단백질 합성 억제제를 사용한 조사는 TNF가 이의 세포독성 효과로부터 세포를 보호하는 특정 단백질의 합성을 유도한다는 것을 암시한다[참조: imeno, et al. (1990) Cancer Res. 50:4941-4945; Watanabe, et al. (1988) Immuno pharmacol. Immunotoxicol. 10:479-499]. 표피 성장 인자아 형질전환 성장 인자 모두는 몇몇 세포 타입에 대해 TNF의 증식 억제 효과를 억제하는 것으로 공지되어 있다[참조: Sugarman, et al. (1987) Cancer Res. 47:780-786]. 이들 성장 인자는 각종 종양 세포에 의해 생성되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, IL-4는 이들 성장 인자의 합성을 억제함으로써 작용할 수 있다. 또한 IL-4는 세포 증식에 관여하는 것으로 공지된 c-fos 및 c-myc 온코진의 발현을 하향조절시킴으로써 작용할 수 있다.
TNF, IFN-g 및 IL-4의 수용체에 대한 cDNA가 최근에 클로닝되었다[참조: Idzerda, et al. (1990) J. Exp. Med. 171:861-873; Schall, et al. (1990) Cell 61:361-370; Loetscher, et al. (1990) Cell 61:351-359; Smith, et al. (1990) Science 248: 1019-1023; Auget, et al. (1988) Cell 55:273:280]. 그러나, 이들 수용체의 구조는, 수용체 자체로는 시그날 전달에 충분하지 않다는 것을 보였다.
IL-4는 대식세포로부터 TNF의 생성을 하향 조절할 수 있는 것으로 공지되어 있으나 [참조: Essner, et al. (1989) J. Immunol. 142:3857; Hamilton, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3803]. 또한 IL-4는 대식세포 매개된 세포 독성을 증진시킬 수 있다는 것이 보고되었다[참조: Somers and Erickson (1989) Cell Immunol. 122:178-187]. 대식세포 매개된 세포독성은 주로 TNF에 기인한 것으로 밝혀졌다[참조: Feinman, et al. (1987) J. Immunol. 138:635-640]. 따라서 TNF 생성 억제가 IL-4에 의한 대식세포 세포독성의 증진을 어떻게 수반하는지에 대한 기작이 분명치 않다. IL-4에 의한 종양 세포에 대한 대식세포 세포독성의 증진이 본 명세서에 기술된 TNF와 IL-4의 상승작용 효과에 의해 매개될 수 있다. IL-4 생성 종양 세포는 다른 종양에 대해 생체내 항종양 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조: Tepper, et al. (1989) Cell 57:503-512]. IL-4 단독으로는 배양물중의 종양 세포에 항증식 효과를 직접적으로 나타내지 않으므로 IL-4가 생체내에서 항종양제로서 작용하는 기작은 알지 못한다. 이러한 상황에서 IL-4는 대식세포를 활성화시키며 또한 TNF의 항종양 효과를 강화시킴으로써 항종양제로서 작용할 수 있다.
당 분야의 전문가라면, 본 발명이 목표한 바를 수행하고 언급한 목적 및 잇점 뿐만 아니라 본 발명에 내재한 것들을 구현할 수 있도록 양호하게 채택된다는 것을 용이하게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에 기술된 성분, 방법, 절차 및 기술은 바람직한 태양의 대표적인 것이며, 예시하고자 한것으로서, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다. 본 발명의 취지내에 포함되는 본 발명에서의 변화 및 기타의 이용을 당 분야의 전문가가 수행할 수 있으며 첨부된 특허청구의 범위에 의해서 제한된다.

Claims (6)

  1. 인터루킨-4 및 종양괴사인자를 0.1:1 내지 10:1의 단위 활성 비율로 포함하는 종양 세포 치료에 적합한 세포 비함유 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 종양 괴사 인자가 사람 종양 괴사 인자인 조성물
  3. 제1항에 있어서, 인터루킨-4가 사람 인터루킨-4인 조성물
  4. 인터루킨-4 : 종양괴사인자의 단위 활성 비율이 0.1:1 내지 10:1 이고 인터루킨-4 : 인터페론의 단위 활성 비율이 1:1인, 종양괴사인자, 인터루킨-4 및 인터페론을 포함하는 종양 세포 치료에 적합한 세포 비함유 조성물
  5. 0.1:1 내지 10:1 의 단위 활성 비율로 인터루킨-4 및 임파성독소를 포함하는 종양 세포 치료에 적합한 세포 비함유 조성물
  6. 제5항에 있어서 인터루킨-4가 사람 인터루킨-4인 조성물
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