DE3751527T2

DE3751527T2 - Zusammensetzungen zur Modulation der Effekten von TNF und IL-1.

Info

Publication number: DE3751527T2
Application number: DE3751527T
Authority: DE
Inventors: Helmut Holtmann; David Wallach
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-09-09
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2007-09-10
Also published as: IL80005A; ES2080042T3; CA1322713C; IL80005A0; EP0259863A2; US5211945A; JPS63146830A; EP0259863A3; EP0259863B1; DE3751527D1; ZA876783B; AU603134B2; JPH07106986B2; AU7820587A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von TNF und/oder IL-1 zum Herstellen eines Medikaments zum Modulieren des schädlichen und therapeutischen Effekts von TNF und/oder IL-1 in Säugern und Verfahren zum Aufzeichnen der Modulation des TNF-Effekts in Säugern. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen umfassend wirksame Mengen an TNF und IL-1.
Die Strukturen von Tumornekrosefaktor (TNF) und von Interleukin-1 (IL-1), wie durch ihre Aminosäuresequenzen (1-6) angegeben, zeigen keine Ähnlichkeiten untereinander. Jedoch legt jüngste Information über die Funktion dieser Zytokine nahe, daß ihre Wirkungsmechanismen eng verwandt sind. TNF-α und das strukturell homologe Lymphokin, Lymphotoxin, auch TNF-β genannt, wurden anfänglich identifiziert anhand ihrer Fähigkeit, einen zytotoxischen Effekt in vitro auf einige kultivierte Tumorzellen zu vermitteln und in Mäusen haemorrhagische Nekrose in bestimmten transplantierbaren Tumoren zu induzieren (7-9). Es ist später gefunden worden, daß TNF neben zytoxischer Aktivität viele andere Effekte von stark heterogener Natur auf Zellfunktionen ausübt (10). Mehrere dieser Effekte schienen nicht unterscheidbar von denen von IL-1. Von TNF und IL-1 ist beispielsweise gefunden worden, daß sie das Wachstum von Fibroblasten stimulieren und in diesen Zellen die Synthese von Collagenase, Prostaglandin E&sub2; und Interferon β-2 induzieren (11-16), daß sie in Adipozyten die Aktivität von Lipoproteinlipase verringern (17, 18), daß sie Osteoclasten aktivieren (19, 20), und daß sie in endothelialen Zellen die Anheftbarkeit für Blutleukozyten und die Synthese eines Zelloberflächenproteins steigern, das vermutlich an dem Anheften beteiligit ist (21-23). Wie TNF ist IL-1 zytotoxisch für einige Tumorzellen (24).
Unter den vielen möglichen Effekten der Zytotoxine (CTXe) besteht kein Zweifel daran, daß der weitreichendste Einfluß auf das Funktionieren der Zelle der Zelltod ist, der eine Folge der zytotoxischen Aktivität der CTXE ist. Von Zellen, die mit Interf eronen (IFNe) behandelt wurden, ist gefunden worden, daß sie eine signifikant gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber dem Abtöten durch die CTXE aufweisen (10,30) aufgrund einer Zunahme der TNF-Rezeptorexpression, induziert in solchen Zellen durch IFNE (28,30,33,34). Es gibt mehrere Hinweise dafür, daß die Empfindlichkeit gegenüber dem zytotoxischen Effekt der Regulation von Mechanismen unterliegt, die mindestens teilweise unabhängig von denen sind, die die Antwort auf andere Effekte von CTXEN kontrollieren. Somit hat ein Vergleich der Effekte der CTXE auf Zellen von verschiedenen kultivierten Linien deutliche Unterschiede hinsichtlich der Empfindlichkeit von einer Zelle zur anderen hervorgebracht; Tumorzellen sind im allgemeinen empfindlicher als normale. Diese Unterschiede korrelierten nicht mit dem Spiegel an Rezeptoren für die CTXe noch mit der Wirksamkeit, mit der nichtzytotoxische Effekte in den Zellen induziert werden konnten. Das Abtöten von Zellen durch die CTXE wird nicht nur durch IFNE verstärkt, sondern auch durch metabolische Blocker, wie Inhibitoren der RNA- und Proteinsynthese (10). Stand der Technik betreffend den Umstand, daß TNF und IL- 1 über die Bindung an hochaffine Zelloberflächenrezeptoren wirken, ist offenbart in Literaturstellen (26) bis (32).
Inhibitoren der RNA- und Proteinsynthese sensibilisieren bestimmte Zellen gegenüber dem zytoxischen Effekt von Tumornekrosisfaktor (TNF). Behandeln von Zellen mit TNF für einige wenige Stunden in der Abwesenheit einer solchen Hemmung verringert die Sensitivität gegenüber dem Abtöten durch anschließende Anwendung von TNF zusammen mit diesen Inhibitoren. Eine solche Abnahme in der Empfindlichkeit gegenüber dem Abtöten durch TNF konnte auch beobachtet werden, wenn die Zellen mit Präparationen aus von Leukozyten hergestellten Zytokinen behandelt wurden, die im wesentlichen frei waren von TNF- und Lymphotoxinaktivität (10).
Es ist somit bekannt, daß TNF eine zytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen in Kultur aufweist. Es ist weiterhin bekannt, daß das Abtöten durch TNF deutlich verstärkt wird durch sensibilisierende Reagenzien, insbesondere durch Reagenzien, die die Synthese von RNA und von Proteinen hemmen, d.h. metabolischen Blockern. Somit steigern solche sensibilisierenden Reagenzien die Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber der zelltötenden Aktivität von TNF. Es ist auch bekannt, daß INFE einen verstärkenden Effekt auf die zelltötende Aktivität von TNF besitzen, ähnlich zu dem Effekt eines sensibilisierenden Reagenzes.
Es wurde auch kürzlich gefunden, daß TNF, von dem angenommen wurde, daß es eine selektive Antitumorfunktion besitzt, auch störende Effekte auf normale Gewebe vermitteln kann. Somit kann TNF, mit oder ohne einem sensibilisierenden Reagenz oder einem anderen verstärkenden Material, während es als therapeutisches Material potentiell wirksam ist gegen Tumorzellen, auch potentiell schädlich sein gegenüber normalen Zellen.
Es ist zuvor gezeigt worden (50), daß das Behandeln von Zellen mit rohen, von Leukozyten hergestellten Zytokinpräparationen zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber dem zytotoxischen Effekt führen kann, den die Zytotoxine (TNF und das verwandte Protein-Lymphotoxin) in solchen Präparationen ausüben können. Dieser schützende Effekt wurde beobachtet, wenn Präparationen der Zytotoxine für einige wenige Stunden angewendet wurden, und sie dann wieder in der Anwesenheit von Cycloheximid (CHI) angewendet wurden. Das Ausmaß des Zelltods im Falle der Behandlung mit den von Leukozyten hergestellten Zytokinpräparationen vor der Behandlung mit der gleichen Präparation in der Anwesenheit von CHI war viel geringer als er beobachtet wurde bei der Anwendung dieser Präparationen direkt in der Anwesenheit von CHI. Der aktive Bestandteil in der von Leukozyten hergestellten Zytokinpräparation war nicht bekannt.
Die Identifizierung, gemäß der vorliegenden Erfindung, von IL-1 als dem von Leukozyten hergestellten Zytokin, das Zellen gegenüber dem zytotoxischen Effekt von TNF desensibilisiert (d.h. die Antwort auf den zerstörenden Effekt von TNF verringert), und die Studien, die anhand von in vitro- und in vivo-Systemen erfolgten, ermöglichten es, die vorliegende Erfindung zu erzielen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von TNF und/oder IL-1 zum Herstellen eines Medikaments zum Modulieren der Effekte von TNF und IL-1, sowohl des schädlichen und des therapeutischen Effekts dieser Zytokine. Im Falle der schädlichen Effekte stellt die vorliegende Erfindung Medikamente bereit zum Modulieren des schädlichen Effekts von TNF und/oder IL-1 in Säugern, wobei die Medikamente verwendet werden können, um einem Säuger subschädliche Mengen an TNF und/oder IL-1 zu verabreichen. Das zu modulierende TNF und/oder IL-1 kann endogener Art sein, d.h. in dem Organismus in schlimmen Fällen erzeugt in Mengen, die für den Organismus schädlich sind, oder exogen verabreicht worden sein an einen Patienten in Mengen, die potentiell schädlich sind.
Das in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendete TNF und IL-1 kann beliebigen Ursprungs sein, nativ oder rekombinant. Alle Arten von TNF werden von der Erfindung umfaßt, insbesondere TNF selbst, auch TNF-α genannt, und TNF-β, auch Lymphotoxin genannt. In dem Fall von IL-1 kommen alle Subtypen in Betracht, insbesondere IL-1-α und IL-1-β.
Auch vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt ist die Verwendung von TNF- und IL-1-ähnlichen Peptiden in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Dies sind Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von humanem TNF oder IL-1 zeigen.
Auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Derivate von TNF und IL-1 und von TNF- und IL-1-ähnlichen Peptiden, einschließlich Salze von entweder einem oder sowohl dem Carboxywie auch dem Aminoterminus oder von Seitenkettengruppen und kovalente Modifikationen der terminalen Polypeptidreste oder der Seitenketten.
Es kann auch gewünscht sein, den therapeutischen Effekt von TNF in besonders schweren Fällen zu steigern durch seine Verabreichung zusammen mit IL-1 und umgekehrt. In diesem Zusammenhang stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Zusammensetzungen bereit umfassend TNF und IL-1 (oder ein Derivat oder TNF- oder IL-1 ähnliches Peptid) und mindestens einen pharmazeutisch zulässigen Hilfsstoff. Diese Zusammensetzungen können in kritischen Fällen hilfreich sein, vorausgesetzt der schädliche Effekt kann überwunden werden.
Wenn therapeutisch wirksame aber potentiell schädliche Mengen an TNF oder IL-1 einem Patienten verabreicht werden, umfaßt die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform Arzneimittel für die Verabreichung von nicht schädlichen Mengen von TNF oder IL- 1 vor dem Verabreichen der therapeutisch wirksamen aber potentiell schädlichen Mengen an TNF oder IL-1. Entweder TNF oder IL-1 können als einzelnes Wirkstoffmaterial verabreicht werden; jedoch kann auch eine Kombination beider Materialien verwendet werden zum Verabreichen sowohl im Stadium der Vorbehandlung der Verabreichung von nicht schädlichen Mengen wie auch dem zweiten Stadium der Verabreichung der therapeutisch wirksamen Mengen.
Das TNF und/oder IL-1 kann ohne weiteren Wirkstoff verabreicht werden, aber es ist bevorzugt, die therapeutisch wirksamen aber potentiell schädlichen Mengen an TNF und/oder IL-1 in Kombination mit wirksamen Mengen eines Sensibilisierungsmittels zu verabreichen. Bevorzugte Sensibilisierungsmittel sind metabolische Blocker oder chemotherapeutische Wirkstoffe, wie Actinomycin-D. Die Sensibilisierung kann auch bewirkt werden durch eine Behandlung mit ionisierender Strahlung.
Gemäß einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das Arzneimittel zum Modulieren der schädlichen Wirkungen von TNF und/oder IL-1 verwendet werden zum Verabreichen von IFNen zu verschiedenen Zeitpunkten der Behandlung, entweder vor, folgend oder gleichzeitig mit der Verabreichung der nicht schädlichen Menge an IL-1 und/oder TNF. INFe beliebigen Ursprungs, nativ oder rekombinant, und alle Arten von Subtypen -α, β oder γ, können in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird rekombinantes IFN-γ verwendet.
Die Erfindung stellt auch ein Arzneimittel zum Modulieren der schädlichen Wirkung von TNF und/oder IL-1 bereit, worin TNF und/oder das IL-1 und gegebenenfalls das sensibilisierende Mittel oder das Interferon in einer Form vorliegen, die geeignet ist, an eine spezifische Zelle geleitet zu werden. Das zielgerichtete Hinführen wird durchgeführt durch einen Antikörper, der ein spezielles Zelloberflächenantigen erkennt, oder durch andere bekannte Verfahren, basierend auf zellspezifischen Eigenschaften, wie die Assoziation mit einem Hormon, das auf solche Zellen einwirkt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Aufzeichnen der Modulation des TNF-Effekts in einem Patienten bereit, der mit nicht schädlichen Mengen an IL-1 behandelt wird, umfassend die Quantifizierung des TNF-Rezeptorspiegels in Zellproben dieses Patienten. Bevorzugte Zellproben sind periphere Blutleukozyten. Dieser Aspekt der Erfindung beruht auf dem Befund der Anmelder, daß die Bindung von radiomarkiertem TNF an die Zelloberflächenrezeptoren deutlich verringert wurde im Anschluß an die Berhandlung mit IL-1. Die Abnahme der TNF-Bindung wurde innerhalb von Minuten nach dem Verabreichen von IL-1 eingeleitet und beruhte nicht auf der Kompetition von IL-1 und TNF um die Bindung an einem gemeinsamen Rezeptor, sondern spiegelte viel mehr die verringerte Expression des Rezeptors für TNF als Teil der zellulären Antwort auf IL-1 wieder. Die Regulierung ist reversibel, und der TNF-Rezeptorspiegel wird vollständig wiederhergestellt innerhalb von wenigen Stunden nach Entfernen von IL-1 (siehe Tabelle III).
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die wirksame Mengen an TNF und IL-1 mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können hergestellt werden durch Vormischen des aktiven Bestandteils oder durch Tandemverabreichung eines jeden aktiven Bestandteils, d.h. durch in vivo-Mischen. Die Natur des Trägers hängt ab von dem Weg, auf dem es für die therapeutische Zwecke verabreicht wird - sei es in der Form einer Creme oder einer Lotion für die topische Verabreichung oder in der Form einer Flüssigkeit, worin die Wirkstoffmaterialien stabilisiert werden durch den Zusatz von Bestandteilen, wie humanes Serumalbumin, für die Verabreichung durch Injektion. Das TNF ist beispielsweise wirkungsvoll cytotoxisch gegen einen Tumor und virusinfizierte Zellen bei niedrigen Konzentrationen wie 10 Picogramm/ml. Die Mengen an TNF und/oder IL-1, die für die Therapie angewendet werden, werden so eingestellt, daß sie solche Konzentrationsbereiche oder höhere in den Zielgeweben erreichen. Die Zusammensetzungen können auch Sensibilisierungsmittel umfassen, z.B. metabolische Blocker, wie Cycloheximid (CHI), Actinomycin D oder Mitomycin C oder INFe, insbesondere IFN-γ.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den Ansprüchen angegeben.

Beschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Beispiele beschrieben unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die zeigen:
Fig. 1 zeigt die Identifizierung von IL-1 als das von Leukozyten hergestellte Zytokin, das Zellen gegenüber der Zytotoxizität von TNF desensibilisiert. Eine rohe Zytokinpräparation, hergestellt von aktivierten U937 Zellen, wurde einer Fraktionierung in zwei Phasen unterzogen: (a) durch Gelfiltration auf eine Ultrogel AcA 54-Säule in 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 0,1% Polyethylenglykol, 30% Ethylenglykol und (b) durch Ionenaustausch-HPLC oder eine Mono Q- Säule. Die Probe wurde in 20 mM Triethanolamin, pH 10 eingesetzt und mit einem Natriumchloridgradienten eluiert (0 bis 0,125 M). In beiden Phasen werden die desensibilisierende Aktivität und die IL-1 Aktivität (Thymidinaufnahme durch Thymozyten) gemeinsam aufgereinigt. Durch Analyse mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese wurde gefunden, daß sie ein Hauptprotein mit m.w. von ungefähr 17000 und nur geringere Mengen an anderen Proteinen von niedrigerem m.w. enthält.
Figur 2 zeigt die Identifizierung von IL-1 als ein von Leukozyten hergestelltes Cytokin, das Zellen gegenüber der Zytotoxizität von TNF desensibilisiert durch das Untersuchen der schützenden Aktivität von IL-1 und der Neutralisierung der schützenden Aktivität von mit pH 2,0 behandelten Zytokinen durch Antiserum gegen IL-1. Die Konzentrationsabhängigkeit der schützenden Wirkung von IL-1 ( ) und einer Präparation von mit pH 2,0 behandelten Zytokinen, die einer Reinigung unterzogen wurde folgend auf den Schritt der Gelfiltration (Figur 1), nach Inkubation für zwei Stunden bei 40ºC mit einem Medium enthaltend monospezifisches Kaninchenantiserum gegen IL-1 (angewendet in einer Verdünnung von 1:100) (x---x) oder mit Medium alleine (x---x).
Figur 3 zeigt einen Vergleich der schützenden Aktivität von rTNF und IL-1 in den humanen Zellinien SV80, HeLa und L132 und der Mauszellinie L929. Der schützende Effekt wurde hervorgerufen durch Inkubation für vier Stunden mit den angegebenen Konzentrationen der zwei Zytokine, gefolgt von einer 12-stündigen Inkubation mit rTNF (100 U/ml) + CHI (50 ug/ml).
Figur 4 zeigt die Kinetiken der Induktion der Resistenz gegen die Zytotoxizität von TNF durch TNF und durch IL-1. SV80-Zellen wurden vorinkubiert für die angegebenen Zeitspannen mit rTNF (20 pM) (x) ode IL-1 (7 pM) ( ) (unterbrochene Linie: Lebensfähigkeit in Kulturen, die vorinkubiert wurden mit Kulturmedium alleine). Danach wurden die Zellen abgespült und inkubiert mit TNF (100 pm) + CHI (50 ug/ml) für 12 Stunden. Lebensfähigkeit der Zellen wird ausgedrückt als Prozentsatz der Lebensfähigkeit im Vergleich mit Kulturen, die mit CHI alleine konfrontiert wurden.
Figur 5 zeigt die Kinetiken der Abnahme der Bindung von TNF an SV80-Zellen als Antwort auf IL-1 und die Zunahme der Bindung als Antwort auf IFN-γ. IL-1 (3,5 pM) wurde auf SV80-Zellen angewendet entweder bei 4ºC ( ) oder bei 37ºC (x) und rIFN-γ (0,6 nM) bei 37ºC ( ). Folgend auf die Inkubation für die angegebenen Zeiten wurde die spezifische Bindung von ¹²&sup5; J-TNF (angewendet bei 0,9 nM) quantifiziert. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozentsatz der Bindung an unbehandelte Zellen (4286 cpm). Die Bindung von 125 J-TNF folgend auf die Inkubation für 16 Stunden mit rIFN-γ (0,6 nM) und dann für weitere 4 Stunden mit IL-1 (3,5 pM) ist ebenfalls gezeigt (*).
Figur 6 zeigt die Bindung des radiomarkierten TNF an IL-1 behandelte und unbehandelte SV80-Zellen. Radiomarkiertes TNF wurde angewendet bei den angegebenen Konzentrationen entweder in der Abwesenheit (durchgezogene Linie) oder Anwesenheit (unterbrochene Linie) eines 1000-fachen Überschusses an nichtmarkiertem TNF auf Zellen, die für 4 Stunden mit IL-1 (60 pg/ml) ( ) behandelt wurden oder auf unbehandelte Zellen (o). Eine Scatchard-Plot-Analyse der Bindung unter Verwendung des LIGAND-Programms ²&sup5; ist in dem Einsatz dargestellt.
Figur 7 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve der IL-1 induzierten Verringerung der TNF-Bindung an verschiedene Zellen. FS11- Vorhautzellen ( ), SV80-Zellen (o), Hela-Zellen (x) und U937- Zellen ( ) wurden für 4 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen an IL-1 inkubiert&sub1; und die spezifische Bindung von ¹²&sup5; J-INF, angewendet bei 3,6 ng/ml, wurde dann quantifiziert wie beschrieben in Tabelle I und wird dargestellt als Prozentsatz der Bindung an unbehandelte Kontrollzellen (1800 CPM in FSll-Zellen, 1400 CPM in SV80-Zellen, 5500 CPM in Hela-Zellen und 3300 CPM in den U937-Zellen).
Figur 8 zeigt die Bindung von TNF und die Empfindlichkeit gegenüber seiner zytolytischen Wirkung folgend auf das Entfernen von IL-1 von vorbehandelten Zellen. SV80-Zellen wurden für 4 Stunden inkubiert mit IL-1 (3,5 pM), dreimal abgespült und zu verschiedenen Zeiten danach für die Bindung an TNF (x) und für die Empfindlichkeit gegenüber dessen zytolytischem Effekt ( ) getestet. Die Bindung von radiomarkiertem TNF (0,2 nM) wird dargestellt in Prozent der Bindung an Zellen, die nicht mit IL- 1 behandelt worden sind (2595 CPM); das Ausmaß des Abtötens durch TNF (100 pm) wird dargestellt als Prozent Lebensfähigkeit im Vergleich zu Kulturen, die nur mit CHI alleine konfrontiert wurden.
Figur 9 zeigt die Verstärkung der Zytotoxizität von TNF durch IL-1 in der Anwesenheit des metabolischen Blockers Cycloheximid (CHI). Der zytolytische Effekt wurde an vier verschiedenen Zellinien, SV80, Hela, L132 und L929, untersucht. IL-1 wurde für 12 Stunden bei den angegebenen Konzentrationen entweder zusammen mit CHI (50 ug/ml) ( ) oder sowohl mit CHI (50 ug/ml) und rTNF (10 U/ml) (x) angewendet.
Figur 10 zeigt den desensibilisierenden Effekt in Mäusen in Antwort auf TNF und IL-1. Mäuse wurden mit den angegebenen Mengen an TNF ( ) oder IL-1 ( ) (oder sowohl mit TNF wie auch IL-1, jedes bei 0,5 ug/Maus) ( ), injiziert. 12 Stunden später wurden sie erneut injiziert mit TNF (5 ug) und Act-D (20 ug), und ihre Überlebensdauer danach wurde aufgezeichnet.
Figur 11 zeigt die homologe und heterologe Desensibilisierung in Antwort auf TNF und IL-1 in Mäusen. Die Mäuse wurden mit TNF (5 ug; ) mit IL-1 (0,2 ug; ) oder nur mit PBS (E)) injiziert. Zwölf Stunden später wurden sie erneut injiziert entweder mit TNF (2 pg) oder mit IL-1 (0,4 ug), dieses Mal zusammen mit entweder Act-D (20 pg) oder GalN (18 mg), und ihre Überlebensdauer danach wurde aufgezeichnet.
Figur 12 zeigt die Kinetiken der Desensibilisierung in Antwort auf TNF. Mäuse wurden injiziert mit TNF (10 ug; ) mit IL-1 (0,4 ug;, ) oder nur mit PBS (O). Folgend auf die angegebene Zeit wurden sie injiziert mit Galactosamin (GalN) (18 mg) und 10 Minuten später wieder mit TNF (3 ug) und ihre Überlebensdauer danach wurde aufgezeichnet.
Figur 13 zeigt die schützende Wirkung von TNF und IL-1, wenn sie in sublethalen Dosen injiziert wurden, gegen die lethale Wirkung von bakteriellem Endotoxin (LPS) auf BCG sensibilisierte (primed) Mäuse. C57/BL-Mäuse wurden intravenös injiziert mit 0,38 mg Bacillus Calmette Guerin (BCG) in 0,5 ml PBS. Zwei Wochen später wurden sie i.p. injiziert entweder mit PBS oder mit TNF (10 ug) oder mit IL-1 (0,4 ug). Zwölf Stunden später wurden die Mäuse i.v. injiziert mit 0,5 ml PBS enthaltend LPS (Escherichia coli, Serotyp 0127:BSB, hergestellt durch Phenolextraktion), und ihr Überleben danach wurde aufgezeichnet.

1. Identifizierung von Il-1 als das von Leukozyten produzierte Zytokin, das Zellen gegenüber dem zytotoxischen Effekt von TNF desensibilisiert

Rohe Präparationen von Zytokinen, hergestellt von Leukozyten, wurden pH 2,0 ausgesetzt. TNF wird durch eine solche Behandlung inaktiviert - sowohl hinsichtlich seiner zytolytischen Funktion und auch seiner Fähigkeit, die Resistenz gegen seine eigene Zytotoxizität zu induzieren. Die TNF-freien Präparationen wurden fraktioniert, wie in Figur 1 gezeigt, und die Desensibilisierungsaktivität wurde gleichzeitig mit IL-1 aufgereinigt. Die Desensibilisierungsaktivität wurde gemessen durch Anwenden der getesteten Probe auf humane SV80-Zellen für einige wenige Stunden, und anschließend Anwenden von TNF und CHI und Messen des Grads des erhaltenen Zelltods.
Eine weitere Bestätigung der Identität des desensibilisierenden Zytokins als IL-1 wurde gezeigt anhand der Neutralisation von IL-1 mit einem monospezifischen Antikörper gegen IL-1, wie in Figur 2 gezeigt. Die Titration der Desensibilisierungsaktivität der halbrohen Zytokinpräparation, hergestellt von U937-Zellen, mit (x---x) oder ohne (x x) eine Behandlung dieser Präparation mit Antiserum, das gegen IL-1 gerichtet war, zeigte, daß IL-1 den desensibilisierenden Effekt ( ) vermitteln kann.
Der desensibilisierende Effekt von IL-1 in Zellen von drei verschiedenen humanen Zellinien: SV80, Hela, L132 wurde ebenfalls gezeigt, wobei dies die allgemeine Gültigkeit dieses Phänomens erläutert, wie in Figur 3 gezeigt.
Zytolytische und schützende (desensibilisierende) Aktivitäten der Zytokine wurden ermittelt in sämtlichen der Figuren unter Vewendung von SV80-Zellen, die für die Messung der zytolytischen Aktivität inkubiert wurden mit serienmäßigen Verdünnungen der getesteten Zytokine für 12 Stunden zusammen mit 50 ug/ml CHI; zum Messen der schützenden Aktivität wurden sie für 4 Stunden mit dem getesteten Zytokin und dann für 12 Stunden mit TNF bei den angegebenen Konzentrationen zusammen mit 50 ug/ml CHI inkubiert. Das Ausmaß der Zellabtötung wurde quantifiziert durch den Assay der Neutralrot-Aufnahme. Eine Einheit zytolytische Aktivität ist definiert als die Konzentration des getesteten Zytokins, bei der die Menge an lebensfähig verbleibenden Zellen 50% von denen betrug, die bei der Inkubation mit CHI alleine lebensfähig blieben. Eine Einheit schützende Aktivität wird definiert als die Zytokinkonzentration, die 50% der Zellen vor dem Abtöten durch TNF schützt.
Somit wurde der Bestandteil der pH 2,0-behandelten Zytokinpräparationen, der die Resistenz gegen das Abtöten durch TNF induziert, als IL-1 identifiziert, basierend auf den folgenden Befunden:
a) Die schützende Aktivität und eine typische Aktivität von IL- 1 (Tymozytenaktivierung) wurden gleichzeitig aufgereinigt, wenn rohe Präparationen der von U937 hergestellten Zytokine einer Reihe von Fraktionierungsschritten unterzogen wurden, wobei dies zu eine wirksamen Reinigung von IL-1 führte (siehe Figur 1).
b) Monospezifisches Antiserum gegen IL-1 neutralisierte die schützende Aktivität solcher Präparationen (siehe Figur 2).
c) IL-1 aus verschiedenen Quellen induzierte die Resistenz gegen die Zytotoxizität von TNF genauso wirksam wie es die Rohpräparationen von Zytokinen erzielten; etwas Resistenz wurde selbst bei einer so niedrigen Behandlung wie mit 0,1 Einheiten (3 pg) IL-1 pro ml beobachtet, wie in Figur 2 gezeigt. Bakterielles Lipopolysaccharid, das IL-1-Präparationen kontaminieren kann, induzierte nicht die Resistenz, selbst wenn es in Konzentrationen in Höhe von 10 ug/ml angewendet wurde.

2. Präparation von nativem gereinigtem IL-1

Natives gereinigtes IL-1 wurde wie folgt hergestellt: Rohe Präparationen von Zytokinen, die in der humanen histiozytären Lmphomzellinie U937 (47) durch 4-β-Phorbol-12-myristat-13- acetat (5 ng/ml) und Sendai-Virus (48) induziert wurden, wurden an Glaskügelchen mit kontrollierter Porengröße (PG-350-200, Sigma, St. Louis, Mo) adsorbiert. Das meiste der schützenden Aktivität und der LAF-Aktivität und nur ein geringer Teil der zytolytischen Aktivität und von IFN wurde in dem nicht gebundenen Material wiedergewonnen. Es wurde konzentriert durch Ultrafiltration auf eine Amicon YMS-Membran und an IFN-α und dem restlichen TNF verarmt durch Aufbringen auf Immunadsorptionssäulen, die mit gegen diese gerichteten monoklonalen Antikörpern hergestellt waren. Es wurde dann dialysiert für 12 Stunden gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 2,0. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt.
Folgend auf das Equilibrieren mit 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wurde das Protein fraktioniert auf einer Ultrogel AcA 54-Säule (16 x 110 mm) in 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1% Polyethylenglykol (Mr 7000-9000) und 30% Ethylenglykol. Fraktionen von 2,5 ml wurden gesammelt und getestet auf LAF- Aktivität und auf die Induktion der Resistenz gegen TNF. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert, equilibriert mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 und auf eine DEAE Sephacel- Säule (7 ml) (Pharmacia, Uppsala, Schweden), vorequilibriert mit dem gleichen Puffer (49), gegeben. Sowohl die schützende wie auch die LAF-Aktivität wurde vollständig wiedergewonnen in dem Material, das nicht an die Säule gebunden wurde. In einer Analyse durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese wurde von dem Material gefunden, daß es ein Hauptprotein mit einem Mr von ungefähr 17000 und nur geringe Mengen an anderen Proteinen mit niedrigerem Mr enthielt. (LAF-Aktivität - Lymphozyten-aktivierender Faktor-Aktivität).

3. Wechselbeziehung zwischen den Effekten von IL-1 und TNF auf die Lebensfähigkeit von Zellen

Der schützende Effekt von IL-1, induziert in humanen SV80- Zellen in der Abwesenheit von CHI, war vergleichbar zu dem, der durch TNF induziert wurde, wie in Figur 3 gezeigt. Jedoch besitzt IL-1, nicht wie TNF, wie in Figur 9 gezeigt, lediglich einen kaum nachweisbaren zytolytischen Effekt auf diese Zellen in der Anwesenheit von CHI. Wie in Figur 9 unter speziellen Situationen erläutert, d.h. wenn die Proteinsynthese in der Zelle blockiert ist, kann IL-1 einen umgekehrt verstärkenden Effekt auf das Zellabtöten zeigen. Selbst bei winzigen Konzentrationen steigerte IL-1 die Zytotoxizität von TNF, wobei es die Wirksamkeit des Zellabtötens durch geringe Konzentrationen an TNF steigerte, zu einem Ausmaß, das bei einer 25-fach höheren Konzentration in der Abwesenheit von IL-1 gezeigt wird. In zwei anderen humanen Zellinien, Hela und L132, war IL-1 selbst deutlich zytolytisch, wenn es zusammen mit CHI angewendet wurde, und diese Zytotoxizität schien additiv zu sein zu der von TNF (Figur 7). Sowohl in Hela- wie auch in L132-Zellen konnte ein schützender Effekt von IL-1 wie auch von TNF beobachtet werden, wenn diese Zytokine in der Abwesenheit von CHI angewendet wurden (Figur 3).
IL-1 oder TNF stellen einen Schutz nicht nur gegen die in der Anwesenheit von CHI vermittelte Zytotoxizität bereit, sondern auch gegen das Abtöten von Zellen, in denen die Synthese von Proteinen durch andere Mittel supprimiert worden ist. Tabelle 11 zeigt die Zytotoxizität von TNF gegen SV80-Zellen in der Anwesenheit des Proteinsyntheseinhibitors Emetin und des RNA- Syntheseinhibitors Actinomycin D. Ähnlich wie CHI sensibilisierten diese zwei anderen Inhibitoren SV80-Zellen gegenüber dem Abtöten durch TNF; und wie bei CHI ist die Sensibilisierung durch beide Inhibitoren stark verringert bei der Vorbehandlung entweder mit IL-1 oder mit TNF in der Abwesenheit der Inhibitoren.

4. Beziehung zwischen der Abnahme der TNF-Rezeptoren und der Zunahme der Resistenz gegen die Cvtotoxizität von TNF, die folgend auf eine Behandlung mit IL-1 beobachtet wird

Zellen, die mit IL-1 wie auch mit TNF behandelt werden, werden resistenter gegenüber dem cytolytischen Effekt von TNF. Wie in Figur 4 gezeigt, folgte die Induktion der Resistenz durch IL-1 und durch TNF einem ähnlichen Zeitverlauf, nur daß die Resistenz mit TNF früher erreicht wurde. Die Resistenz gegenüber der Cytolyse blieb ansteigend bis ungefähr 5 Stunden folgend auf die Anwendung von IL-1 (Figur 4), obwohl der TNF-Rezeptorspiegel seinen niedrigsten Wert bereits ungefähr nach einer Stunde erreicht hatte (Figur 5). Diese langsame Entwicklung der Resistenz bei der Behandlung von SV80-Zellen mit IL-1 kann vielleicht in Beziehung stehen zu dem Umstand, daß IL-1 in diesen Zellen auch den gegenteiligen Effekt zeigen kann. Während es die Resistenz gegenüber der Cytolyse steigert, wenn es vor der Verabreichung von TNF verabreicht wird, wird von ihm gefunden, daß es die Cytotoxizität steigert, wenn es zusammen mit TNF verabreicht wird. Tatsächlich zeigten SV80-Zellen, die mit IL-1 für weniger als eine Stunde behandelt wurden, wie in Figur 4 gezeigt, eine höhere Empfänglichkeit gegenüber dem cytolytischen Effekt von TNF als dies unbehandelte Zellen (gestrichelte Linie in Figur 4) zeigten.
Ein sogar noch deutlicherer Unterschied zwischen dem Effekt von IL-1 auf die Rezeptoren für TNF und auf die Empfänglichkeit der Zellen gegenüber der Cytolyse durch TNF konnte beobachtet werden bei der Erhohlung von diesen zwei IL-1-Effekten.
Wie in Figur 8 gezeigt, war die Entfernung von IL-1 von SV80- Zellen gefolgt von einem ziemlich raschen Wiederauftreten der Rezeptoren für TNF aber nicht der Empfänglichkeit gegenüber seinem cytolytischen Effekt. Nach 7 Stunden folgend auf das Entfernen von IL-1 waren die TNF-Rezeptoren nahezu bis zu ihrem normalen Spiegel wieder hergestellt, während die Resistenz gegenüber dem Abtöten durch TNF unverändert blieb. Das Aufrechterhalten der Resistenz gegenüber dem Abtöten durch das Protein folgend auf das Entfernen von IL-1 von behandelten Zellen und das Wiederauftreten der TNF-Rezeptoren zeigt an, daß IL-1 andere Änderungen, die zu der Zellresistenz gegenüber dem Abtöten durch TNF beitragen, zusätzlich zu seinem Effekt auf die Rezeptoren für TNF, induziert.

5. Abnahme von TNF-Rezeptoren als Antwort auf IL-1

Die Behandlung von SV80-Zellen mit IL-1 führte zu einer verringerten Expression der Rezeptoren für TNF. In kinetischen Untersuchungen wurde für die TNF-Bindung gefunden, daß sie innerhalbe weniger Minuten der IL-1-Verabreichung abnimmt, wobei sie ihren niedrigsten Spiegel nach ungefähr einer Stunde erreicht. Danach stieg sie langsam an; nichtsdestoweniger war selbst nach 20 Stunden in der Anwesenheit von IL-1 die TNF-Bindung signifikant geringer als bei unbehandelten Zellen (Figur 5). Die Scatchard-Blot-Analyse der Bindung, gezeigt in Figur 6, zeigte, daß sowohl in IL-1 behandelten wie auch in unbehandelten Zellen TNF an Rezeptoren einer homogenen Natur bindet, und daß die Affinität der Bindungsstellen folgend auf die IL-1-Behandlung unverändert bleibt, während ihre Dichte stark abnimmt (900 Rezeptoren/Zellen und Kd von 9,7 x 10&supmin;¹¹M in Zellen, die 4 Stunden mit 60 pg/ml IL-1 behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollwerten von 6200 Rezeptoren/Zelle und Kd von 1,1 x 10&supmin;¹&sup0;M). In wiederholten Untersuchungen wurden die Veränderungen in dem Spiegel der Rezeptoren für TNF (2234 bis 6960 Bindungsstellen/Zelle) und einige Änderungen auch bei den ermittelten Werten von Kd (9,6 x 10&supmin;¹¹M bis 3,1 x 10&supmin;¹&sup0;M) beobachtet. Dennoch wurde in sämtlichen Experimenten für IL-1 wie auch für PMA gefunden, daß es nur die Anzahl der Bindungsstellen für TNF und nicht deren Affinität beeinflußt. Die Daten für ein repräsentatives Beispiel sind in Figur 6 gezeigt. (PMA - 4-β-Phorbol-12-myristat- 13-acetat).
Die Abnahme der TNF-Rezeptoren war temperaturabhängig. Wie in Figur 5 gezeigt, konnte dies nicht bei 4ºC beobachtet werden, selbst wenn IL-1 für wenige Stunden vor dem Zusatz von TNF oder in einem großen Überschuß (bis zu dem 500-fachen) an TNF Zugesetzt wurde. Andererseits scheint es so zu sein, daß der Effekt von IL-1 nicht von der Proteinsynthese abhängig war.
Von TNF und IL-1 wurde gefunden, daß sie nicht direkt um die Bindung an ihre Zielzellen konkurrieren. Diese Befunde zeigen, daß die Rezeptoren für TNF und IL-1 verschiedene Moleküle sind, und daß die Expression der Rezeptoren für TNF der Regulierung durch IL-1 unterliegen kann. Wie in Tabelle 1 und Figur 5 gezeigt, besaß IL-1 bei 4ºC, den Zellen entweder zusammen mit radiomarkiertem TNF oder wenige Stunden vor der Anwendung von TNF zugesetzt, keinen Effekt auf die Bindung von TNF. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung der humanen fibroblastoiden SV80- Zellen und von Vorhautfibroblasten (FS-11) mit IL-1 bei 37ºC zu einer deutlichen und raschen Verringerung der TNF-Bindung. Die Bindung wurde maximal gehemmt eine Stunde folgend auf die Verabreichung von IL-1 und erholte sich dann langsam. Jedoch selbst 20 Stunden folgend auf das Einleiten der IL-1-Behandlung war die Bindung immer noch deutlich verringert.
Der Effekt von IFN-γ auf TNF-Rezeptoren wurde ebenfalls untersucht, wie in Figur 5 gezeigt. Wie in anderen Zellen induzierte IFN-γ in den SV80-Zellen eine Zunahme der Rezeptoren für TNF, die eingeleitet wurde wenige Stunden folgend auf den Zusatz von IFN. Zellen, bei denen die Rezeptoren für TNF durch IFN gesteigert worden waren, antworteten ebenfalls auf IL-1 durch eine Abnahme der Anzahl der TNF-Rezeptoren, obwohl nicht auf den gleichen niedrigen Spiegel wie in Zellen, die nicht mit IFN behandelt worden waren. Die Quantifizierung der IFN-γ-Rezeptoren in den SV80-Zellen zeigte keine Veränderung in ihrem Spiegel nach der Behandlung der Zellen mit IL-1 oder TNF.
Wie in Figur 7 gezeigt, zeigten humane Vorhautfibroblasten eine Antwort auf den Effekt von IL-1 auf die TNF-Bindung zu einem noch größeren Ausmaß als dies bei SV80-Zellen erfolgte. Die TNF-Rezeptoren zeigten eine stärkere Abnahme, und der Effekt konnte bei niedrigeren IL-1-Konzentrationen beobachtet werden. Etwas Abnahme wurde in diesen Zellen bei so wenig wie 3,5 x 10&supmin;¹&sup4; M IL-1 (0,02 LAF U/ml) induziert. Die Abnahme von TNF- Rezeptoren wurde durch IL-1 auch in HeLa-Zellen induziert, wenn auch weniger wirkungsvoll als bei den SV80-Zellen. Andererseits konnte keine Abnahme der TNF-Rezeptoren beobachtet werden, wenn U937 histiocytere Lymphomzellen mit IL-1 behandelt wurden. Untersuchung der Bindung von radiomarkiertem IL-1 an diese verschiedenen Zelltypen, wie in Tabelle 1 gezeigt, legte eine Beziehung zwischen dem Effekt von IL-1 und dem Spiegel der Rezeptoren für dieses Protein nahe. Die IL-1-Bindung war am höchsten in den FS11-Zellen, niedriger in SV80-Zellen, noch niedriger in HeLa-Zellen und unterhalb nachweisbarer Spiegel in U937-Zellen. TNF konkurrierte nicht mit dem markierten IL-1 um die Bindung. Weiterhin führte die Behandlung der Zellen für 4 Stunden mit TNF (bei 17 ng/ml) nicht zu einer Abnahme in ihrer Fähigkeit, IL-1 zu binden (Tabelle I). Auch war die Bindung von radiomarkiertem rIFN-γ an diese Zellen nicht signifikant verändert folgend auf die Behandlung mit IL-1 oder TNF.

6. Desensibilisierung gegenüber den lethalen Effekten von TNF und von IL-1

Neun bis dreizehn Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden in sämtlichen Experimenten verwendet. TNF, IL-1, LPS, Actinomycin-D (Act-D) und D-Galactosamin (GalN) wurden in PBS solubilisiert und i.p. injiziert; jeweils in Aliquots von 0,5 ml. Für die Lethalitätsbestimmung wurde TNF, IL-1 oder LPS alleine oder 10 Minuten folgend auf die Injektion von Act-D oder GalN verabreicht; für die Desensibilisierungsexperimente wurden Mäuse injiziert mit TNF oder IL-1 12 Stunden vor einer Konfrontation bestehend aus dem gleichen Behandlungsschema wie bei dem Lethalitätstest. Folgend auf die Behandlungen wurden die Mäuse kontinuierlich über eine Zeitspanne von 72 Stunden beobachtet, um den Zeitpunkt ihres Todes zu ermitteln. In sämtlichen Fällen erschienen Mäuse, die 72 Stunden überlebten vollständig normal zu diesem Zeitpunkt. Weiterhin wurde ein Teil dieser Mäuse für eine Woche beobachtet, und es wurde kein Anzeichen einer Beeinträchtigung gefunden. Sämtliche Experimente wurden zweifach ausgeführt mit qualitativ den gleichen Ergebnissen. Zwei Mäuse wurden für jeden experimentellen Punkt in jedem der Experimente untersucht.
Ihre tatsächliche Überlebenszeit wie auch der Durchschnitt der Überlebenszeit der zwei Mäuse, die für jeden Punkt verwendet wurden, sind dargestellt.
Act-D und GalN sensibilisieren Mäuse gegenüber dem lethalen Effekt von TNF und IL-1. Bei dem Versuch, die Natur des sensibilisierenden Effekts von Act-D und GalN zu ermittelt, wurde getestet, ob die Injektion von TNF oder IL-1 in der Abwesenheit dieser Mittel die Antwort der Mäuse gegenüber einer anschließenden Injektion von TNF oder IL-1 zusammen mit Act-D oder GalN beeinflußt. Wie in Figuren 10 und 11 gezeigt, überlebten Mäuse, die mit TNF + Act-D 12 Stunden nach der Injektion mit TNF injiziert wurden, den lethalen Effekt von TNF + Act-D für eine längere Zeit als Mäuse, die nicht vorher TNF alleine ausgesetzt worden waren. Dieser schützende Effekt war deutlich in Mäusen, die vorbehandelt worden waren mit einer hohen Dosierung an TNF (5 ug/Maus) , aber er war selbst deutlich wahrnehmbar in Mäusen, die mit einer geringen Menge wie 0,02 ug TNF vorbehandelt worden waren. Auf ähnliche Weise war die Lebensfähigkeit der Mäuse folgend auf die Injektion mit IL-1 + Act-D verlängert bei vorheriger Injektion mit IL-1. Die Vorbehandlung mit IL-1 steigerte auch die Fähigkeit der Mäuse, eine anschließende Injektion TNF + Act-D zu überleben. Umgekehrt zeigten Mäuse, die mit TNF vorbehandelt wurden, eine gesteigerte Fähigkeit, den lethalen Effekt von IL-1 + Act-D zu überleben. Injizieren von TNF und IL-1 zusammen in Mäuse schützte sie vor dem lethalen Effekt von TNF + Act-D noch stärker als die vorherige Injektion entweder mit TNF oder IL-1 alleine, wie von den Rechtecken in Figur 10 gezeigt.
Mäuse, denen TNF oder IL-1 injiziert worden waren, waren auch vor dem lethalen Effekt einer anschließenden Injektion von TNF oder IL-1 in der Anwesenheit von GaIN geschützt. Dieser Schutz war sogar noch wirkungsvoller als der Schutz gegen den lethalen Effekt, den diese Cytokine in Anwesenheit von Act-D ausüben. Bei solchen Konzentrationen an TNF und IL-1, wie sie in dem in Figur 11 beschriebenen Experiment angewendet wurden, war der Tod bei der Sensibilisierung mit Act-D lediglich verzögert bei einer vorherigen Behandlung mit IL-1 oder TNF, während der Tod, der bei der Sensibilisierung mit GalN auftritt, tatsächlich verhindert worden war. GalN sensibilisierte Konfrontationen wurden deshalb ausgewählt zum Untersuchen der Kinetiken des schützenden Effekts, wie in Figur 12 gezeigt. Teilschutz vor dem lethalen Effekt von TNF + GalN, wiedergegeben anhand der Verlängerung der Überlebenszeit, konnte bereits 30 Minuten nach der Injektion mit TNF oder IL-1 alleine (10 ug bzw. 0,4 ug/Maus) beobachtet werden. Eine Stunde nach der TNF/IL-1- Injektion waren die Mäuse voll geschützt. Sie blieben 12 Stunden nach der Injektion geschützt. 24 Stunden nach der Vorbehandlung mit TNF starb eine der zwei Mäuse, wenn sie mit TNF + Galn injiziert wurde, wobei dies eine Abnahme in dem schützenden Effekt nahelegt. 48 Stunden nach der Vorbehandlung war der Schutz vollständig verschwunden.

7. Brauchbarkeit und Verabreichung

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können für eine Antitumor-, antibakterielle, antivirale oder antiparasitäre Behandlung verwendet werden.
Wirksame Mengen für die Vorbehandlung mit IL-1, die an Mäuse verabreicht werden, liegen in dem Bereich zwischen 0,5 bis 25 ng pro Gramm Körpergewicht der Maus, und für die anschließende Behandlung (subkutan) mit TNF in dem Bereich von 0,1 bis 10 ug/g Körpergewicht, oder für die anschließende Behandlung (intraperitoneal) mit TNF + Actinomycin-D, bei 4 bis 40 ng/g bzw. 0,5 bis 1,5 ug/g.
Die Menge an aktiver Verbindung, die Menschen verabreicht wird, hängt ab von verschiedenen Faktoren, wie dem Zustand des Patienten, den zu behandelnden Symptomen, der Schwere der Beeinträchtigung, dem Weg der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes. In schlimmeren Fällen können höhere Dosierungen der Kombinationen an TNF und IL-1 in Betracht kommen, gegebenenfalls zusammen mit Interferon und/oder einem Sensibilisierungsmittel.
Die Verabreichung des IL-1 und TNF, mit oder ohne Interferon, metabolischem Blocker oder chemotherapeutischem Wirkstoff, kann nach jeder beliebigen Art der Verabreichung erfolgen. Die Behandlung in Form einer Injektion ist bevorzugt. Bekannte geeignete Arten der Verabreichung sind die intravenöse Injektion, die intraperitoneale, intramuskuläre oder intralesionale Injektion oder Infusion. Die lokale Behandlung kann im Falle von externen Infektionen in Betracht kommen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden für die Verabreichung hergestellt durch Mischen der Wirkstoffmaterialien, d.h. von IL-1, TNF, IFNen, metabolischen Blockern oder den chemotherapeutischen Wirkstoffen mit einem physiologisch verträglichen Träger, d.h. Trägein, die nicht toxisch für den Empfänger sind bei den angewendeten Dosierungen uns Konzentrationen. Zum Beispiel kann der Träger ein oder mehrere der folgenden zwei Materialien darstellen: Puffer, Antioxidanz, Benetzungsoder Emulgiermittel, Aminosäuren, Polypeptide, Proteine, Kohlenhydrate, Chelatbildner, wie EDTA, oder andere Stabilisatoren und Hilfsstoffe.
Ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung lautet wie folgt: zwei sterilisierte Glasgefäße, wobei Gefäß A nicht schädliche Mengen an IL-1 enthält, gelöst in einer physiologischen Kochsalzlösung, und Gefäß B therapeutisch wirksame Mengen an TNF enthält, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung. Die Verabreichung von Gefäßen A und B erfolgt in Übereinstimmung mit den schriftlichen Anleitungen, die diesen zwei Gefäßen beigefügt sind, wobei die Instruktionen angeben, den Inhalt von Gefäß A zu Injizieren und nach einem festgelegten Zeitintervall den Inhalt von Gefäß B zu injizieren. TABELLE I: Effekte von IL-1 aud die Bindung von TNF, von TNF auf die Bindung von IL-1, und von TNF und IL-1 aud die Bindung von IFN-γ an verschiedene Zellen Kompetition Vorbehandlung Kompetition * n.d. = nicht emittelt

Lebende zu Tabelle I: Effekt von IL-1 auf die Bindung von TNF. von TNF auf die Bindung von IL-1 und von TNF und IL-1 auf die Bindung von IFN-γ an verschiedene Zellen

Die Bindung von ¹²&sup5;J-rTNF (bei 3,6 ng/ml), ¹²&sup5;J-IL-1 (bei 49 ng/ml) und ¹²&sup5;J-rIFN-γ (bei 13 ng/ml) an die angegebenen Zellen wurde bei 40ºC wie oben beschrieben ermittelt. Die Kompetition von IL-1 und TNF untereinander und die Bindung an ihre Rezeptoren wurde untersucht durch Anwenden der nicht markierten Cytokine bei ihren angegebenen Konzentrationen gleichzeitig mit den markierten Proteinen in dem Bindungsassay. Der Effekt der Vorbehandlung mit IL-1 oder TNF wurde untersucht durch Anwenden der Proteine auf die Zellen bei 37ºC für 4 Stunden vor dem Anwenden der markierten Cytokine. Humanes TNF und IFN-γ wurden radiomarkiert wie zuvor beschrieben (30, 44); ersteres mit dem Chloramin-T-Reagenz auf eine spezifische Radioaktivität von 42 Ci/g, und das zweite mit dem Bolton und Hunter Reagenz auf eine spezifische Radioaktivität von 18 Ci/g. IL-1 wurde radioiodiert mit dem Chloramin-T-Reagenz (31) auf eine spezifische Radioaktivität von 40 Ci/g. Die Wiedergewinnung der Bioaktivität folgend auf die Iodierung, wie ermittelt durch Messen des schützenden Effekts des Proteins gegen die Cytotoxizität von TNF (25), betrug über 95%. Zum Bestimmen der Bindung der radiomarkierten Proteine an SV80- (45) oder an HeLa- (46) Zellen oder die FS11-Linie der Vorhautfibroblasten (in dem Labor etabliert) wurden diese Zellen ausplattiert in Kulturmedium (Eagle's minimal essential medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum) in 18 mm-Gewebekulturplatten bei einer Dichte von 2,5 x 10&sup5; Zellen/Platte. Folgend auf eine 24-stündige Inkubation bei 37ºC wurden die Platten auf Eis übertragen, das Kulturmedium wurde entfernt und die radiomarkierten Proteine angewendet, in Duplikaten, entweder alleine oder in der Anwesenheit eines 1000- fachen Überschusses des nicht markierten Proteins in 150 ul Kulturmedium, ferner enthaltend 20 mM Hepespuffer und 15 mM Natriumazid. Die nicht adhärenten U937-Zellen (47) wurden mit dem markierten TNF in Proben von 5 x 10&sup5; Zellen pro Gefäß unter ansonsten identischen Bedingungen inkubiert. Folgend auf die 2- stündige Inkubation unter konstantem Schütteln bei 4ºC wurden die FS11- und HeLa-Zellen dreimal mit einem Puffer, enthaltend 140 mm NaCl, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 8 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2,7 mM KCl, 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,9 mM CaCl&sub2;&sub1; 0,5 % Rinderserumalbumin und 15 mM Natriumazid (PBS/BSA) abgewaschen. Die Zellen wurden dann in Ca²&spplus; und Mg²&spplus; freiem PBS, enthaltend 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, abgelöst und in Zählgefäße überführt, um die mit ihnen assoziierte Markierung zu ermitteln. Von SV80-Zellen wurde gefunden, daß sie sich von dem Substrat in der Kälte ablösen, und deshalb wurden sie folgend auf die Inkubation mit den markierten Proteinen in Gefäße übertragen, dreimal durch Zentrifugieren gewaschen jeweils für 10 Minuten, bei 250 g und resuspendiert in 5 ml PBS/BSA und dann in Zählgefäße überführt. U937- Zellen wurden auf die gleiche Weise gewaschen. Die unspezifische Bindung des radiomarkierten TNF und IL-1, das in der Anwesenheit eines Überschusses der nicht markierten Cytokine beobachtet wurde, war wie folgt in SV80-Zellen 200 und 200 CPM, in FSll-Zellen 200 und 200 CPM, in HeLa-Zellen 700 und 500 CPM und in den U937-Zellen 600 und 200 CPM für das markierte TNF bzw. IL-1. Die unspezifische Bindung von IFN-7 betrug 300 CPM in SV80-Zellen und 600 CPM in den FSII-Zellen. Die spezifische Bindung wurde berechnet durch subtrahieren der Werte der unspezifischen Bindung von der Bindung, die mit den markierten Cytokinen alleine beobachtet wurde. Die Variation innhalb eines Duplikats hinsichtlich der Bindung lag in dem Bereich von 10 % des Durchschnittswerts. TABELLE II: Schützender Effekt von IL-1 und von TNF gegen die durch TNP vermittelte Cytoxizität in der Anwesenheit von CHI, Emetin und Actinomycin-D LEBENSFÄHIGKEIT DER ZELLEN in Abwesenheit von TNF bei Behandlung mit TNF (500 U/ml) keine Vorbehandlung Vorbehandlung mit Sensibilisierungsmittel Cycloheximid Emetin Actinomycin-D
SV80-Zellen wurden folgend auf die Vorbehandlung für 4 Stunden mit IL-1 odre TNF oder ohne eine solche Vorbehandlung auf ihre Empfänglichkeit gegenüber dem cytolytischen Effekt von TNF getestet, das für 12 Stunden zusammen mit den angegebenen Sensibilisierungsmitteln angewendet wurde. Die Lebensfähigkeit der Zellen ist dargestellt als die Neutralrotaufnahme (OD&sub5;&sub4;&sub0;) und in den Kulturen mit TNF in Form von % im Vergleich zu der Lebensfähigkeit in Kulturen, die mit dem Sensibilisierungsmittel alleine inkubiert wurden. TABELLE III Abnahme der TNF-Rezeptorexpression bei humanen periphären Blutleukozyten in Antwort auf IL-1 angewendetes TNF-Bindung an: Granulocyten mononukleäre Leukozyten n.d. = nicht ermittelt
Granulocyten und mononukleäre Leukozyten wurden aus frisch gesammeltem Blut isoliert durch Zentrifugieren durch ein "Monopoly"-Kissen. Sie wurden dann für eine Stunde bei 37ºC in einem Dulbecco's modified Eagle's medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum und IL-1 mit den angegebenen Konzentrationen, inkubiert. Die Bindung des ¹²&sup5;J-markierten TNF's an Aliquots von 10&sup6; Leukozyten wurde dann ermittelt. Wie in der Tabelle gezeigt, wurde eine signifikante Abnahme der TNF-Rezeptorexpression bei Granulozyten gefunden, die bereits bei 0,1 U/ml (LAF- Aktivität) von IL-1 induziert wurde.

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Claims

1. Verwendung nicht schädlicher Mengen TNF, TNF-ähnlicher Peptide oder Derivate davon und/oder IL-1, IL-1-ähnlicher Peptide oder Derivate davon zum Herstellen eines Medikamentes zum Modulieren der schädlichen und therapeutischen Wirkungen von TNF, TNF-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon und/oder IL-1, IL- 1-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das modulierte TNF und/oder- IL-1 endogen sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das modulierte TNF, die TNF-ähnlichen Peptide oder Derivate davon und/oder IL-1, IL-1- ähnlichen Peptide oder Derivate davon exogen sind.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das TNF natives TNF ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das TNF ein rekombinantes TNF ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das TNF α-TNF ist.

7. Verwendung nach Anspruch l, wobei das TNF β-TNF ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das IL-1 natives IL-1 ist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das IL-1 ein rekombinantes IL-1 ist.

10. Verwendung nach AnsPruch 1, wobei weiter ein sensibilisierendes Mittel verwendet wird.

11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei weiter Interferon verwendet wird.

12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das sensibilisierende Mittel ein metabolischer Blocker oder ein chemotherapeutisch aktiver Wirkstoff oder Actinomycin D ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Interferon ein natives Interferon ist.

14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Interferon ein rekombinantes Interferon ist.

15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Interferon ein α-Interferon oder β-Interferon oder γ-Interferon ist.

16. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament bei der Antitumorbehandlung verwendet wird.

17. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament bei der antibakteriellen Behandlung verwendet wird.

18. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament bei der antiviralen Behandlung verwendet wird.

19. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament bei der antiparasitischen Behandlung verwendet wird.

20. Zusammensetzung, umfassend TNF, TNF-ähnliche Peptide oder Derivate davon und IL-1, IL-1-ähnliche Peptide oder Derivate davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20 zum Modulieren der Wirkung von TNF, TNF-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon und/oder IL-1, IL-1-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21 zum Modulieren der schädlichen Wirkungen von TNF, TNF-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon und/oder IL-1, IL-1-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22 zum Modulieren der schäd- lichen Wirkungen von endogenem TNF und/oder IL-1.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 zum Modulieren der schädlichen Wirkungen von exogenem TNF, TNF-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon und/oder IL-1, IL-1-ähnlichen Peptiden oder Derivaten davon.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 20 zum Verstärken der cytotoxischen Wirkungen von TNF.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 20 zum Verstärken der cytotoxischen Wirkungen von IL-1.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend TNF, TNF- ähnliche Peptide oder Derivate davon in Mengen, die für Säuger nicht schädlich sind, und IL-1, IL-1-ähnliche Peptide oder Derivate davon in therapeutisch wirksamen, aber möglicherweise schädlichen Mengen.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend IL-1, IL-1- ähnliche Peptide oder Derivate davon in Mengen, die für Säuger nicht schädlich sind, und TNF, TNF-ähnliche Peptide oder Derivate davon in therapeutisch wirksamen, aber möglicherweise schädlichen Mengen.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 20 als kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verwendung.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiter umfassend ein sensibilisierendes Mittel.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiter umfassend ein Interferon.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das sensibilisierende Mittel ein metabolischer Blocker oder ein chemotherapeutisch aktiver Wirkstoff oder Actinomycin D ist.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei das Interferon aus α-, β- und γ-Interferon ausgewählt ist.

34. Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei das Interferon ein natives Interferon ist.

35. Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei das Interferon ein rekombinantes Interferon ist.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 27, umfassend TNF in Mengen, die für einen Säuger nicht schädlich sind, und IL-1 in therapeutisch wirksamen, aber möglicherweise schädlichen Mengen.

37. Zusammensetzung nach Anspruch 28, umfassend IL-1 in Mengen, die für einen Säuger nicht schädlich sind, und TNF in therapeutisch wirksamen, aber möglicherweise schädlichen Mengen.

38. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend eine nicht schädliche Menge IL-1, IL-1-ähnliche Peptide oder Derivate davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (a) und eine therapeutisch wirksame, aber möglicherweise schädliche Menge TNF, TNF-ähnliche Peptide oder Derivate davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (b) , und Anweisungen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) vor dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (b) an einen Patienten.

39. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend eine nicht schädliche Menge TNF, TNF-ähnliches Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (a) und therapeutisch wirksame, aber möglicherweise schädliche Menge IL-1, IL-1-ähnliches Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (b), und Anweisungen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) vor dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (b) an einen Patienten.

40. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend eine nicht schädliche Menge IL-1, IL-1-ähnliches Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (a) und eine therapeutisch wirksame, aber möglicherweise schädliche Menge TNF, TNF-ähnliches Peptid oder Derivat davon und IL-1, IL-1-ähnlichem Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (b), und Anweisungen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) vor dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (b) an einen Patienten.

41. Zusammensetzung nach Anspruch 20, umfassend eine nicht schädliche Menge TNF, TNF-ähnliches Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (a) und eine therapeutisch wirksame, aber möglicherweise schädliche Menge IL-1, IL-1-ähnliches Peptid oder Derivat davon und TNF, TNF-ähnliches Peptid oder Derivat davon mit mindestens einem pharinazeutisch verträglichen Korrigenz in einem Behälter (b) , und Anweisungen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) vor dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (b) an einen Patienten.

42. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, weiter umfassend einen Behälter (c), umfassend Interferon, begleitet von Anweisungen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (c) vor, gleichzeitig mit oder nach dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) oder Behälter (b).

43. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, weiter umfassend einen Behälter (c), umfassend ein sensibilisierendes Mittel, begleitet von Anweisungenen zum Verabreichen des Inhaltes von Behälter (c) vor, gleichzeitig mit oder nach dem Verabreichen des Inhaltes von Behälter (a) oder von Behälter (b).

44. Zusammensetzung nach Anspruch 43, wobei das sensibilisierende Mittel ein metabolischer Blocker oder Actinomycin D ist.

45. Verfahren zum Beobachten der Modulation der TNF-Wirkung in einem Patienten, der mit IL-1 behandelt wurde, umfassend die Quantifizierung der TNF-Rezeptorbeladung in Zellproben des Patienten.

46. Verfahren nach Anspruch 45, worin die Zellproben periphere Blutleukozyten sind.