DE60035049T2

DE60035049T2 - Verwendung von interleukin-18-inhibitoren zur hemmung von tumormetastasierung

Info

Publication number: DE60035049T2
Application number: DE60035049T
Authority: DE
Inventors: Charles Boulder DINARELLO
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2020-07-18
Also published as: TR200200169T2; IL131047A0; IL147675A; US7741276B2; KR20020027493A; MXPA02000838A; WO2001007480A3; DE60035049D1; CY1107932T1; JP4827352B2; EA005419B1; UA73745C2; PL202477B1; CA2380216A1; BRPI0012675B8; EP1206274A2; HU228780B1; PL353732A1; HUP0202107A3; WO2001007480A2

Description

Feld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Tumormetastasierung von Melanom und Mittel sie zu hemmen. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Prävention von Tumormetastasierung von Melanom durch Hemmen der Produktion und/oder Wirkung von Interleukin-18 (IL-18). Inhibitoren von IL-18 werden aus Antikörpern gegen IL-18 Rezeptoruntereinheiten, Antagonisten von IL-18 und IL-18-Bindeproteinen ausgewählt.
Hintergrund der Erfindung
Die Adhäsion von zirkulierenden Krebszellen an Kapillarendothel ist ein kritischer Schritt bei der Entstehung von Metastasen (1,2). Vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1 ), ein Vertreter der Immunoglobulinsuperfamilie, vermittelt die Adhäsion von hämatopoietischen Zellen und aktivierten Leukozyten an entzündungsfördernde Zytokin-aktivierte Endothelzellen (3-5). Die adhäsive Wirkung von VCAM-1 kann allerdings von tierischen und humanen Krebszellen usurpiert werden, um experimentelle metastatische Streuung (6) zu ermöglichen.
IL-1β und TNF-α sind z.B. bekannt dafür, die Metastasierung von VLA-4-exprimierenden Melanomzellen in Lungengewebe über einen Mechanismus zu ermöglichen, der an der Hochregulierung von VCAM-1-Expression durch Endothelzellen beteiligt ist (7-9). Es wurde auch gezeigt, dass IL-1 und TNF-α signifikant zur hepatischen Kolonisierung von B16M-Zellen sowohl in normalen als auch in mit Lipopolysaccharid behandelten Mäusen beiträgt (7, 8, 10-20). Zusätzlich schließt die durch Mannoserezeptor vermittelte hepatische Sinusoidalendothelzell (HSE)-Aktivierung autokrine IL-1β-vermittelte HSE- Zellexpression von VCAM-1 ein, was zu einer erhöhten Adhäsion von B16M-Zellen und Metastasierung führt (21). Es wurde auch gezeigt, dass IL-1β-aktivierte HSE-Zellen VLA-4-stimulierende Faktoren freisetzen, was die Adhäsion von B16M-Zellen an HSE-Zellen ermöglicht (11). IL-1β induziert also VCAM-1-Expression und Freisetzung von VLA-4-stimulierendem Faktor aus HSE-Zellen, die möglicherweise zulassen können, dass auf ihnen eine entzündungsfördernde Mikroumgebung für gewisse intrasinusoidale gehemmte VLA-4-exprimierende Krebszellen geschaffen wird.
Das Blockieren von IL-1β und TNF-α führte allerdings nur zu einer teilweisen Aufhebung der Metastasierung, was andeutet, dass auch andere Faktoren beteiligt sind, die entweder ihre Abwesenheit kompensieren oder über alternative Wege wirken. Darüber hinaus sind die meisten metastasierenden Krebszellen und die Zielgewebe außer Stande, solche entzündungsfördernden Zytokine zu produzieren. Die Endotoxin- oder Mannoserezeptorligandkonzentration erhöht sich darüber hinaus gewöhnlich nicht ausreichend, um entzündungsfördernde Zytokinfreisetzung zu induzieren. Daher sind die vielfachen Mediatoren, die VCAM-1-Hochregulierung hervorrufen und deren Beteiligung am Kapillartransit von Krebszellen nicht besonders gut charakterisiert.
Aus Cytokine (9, 11), November 1997, 897 ist bekannt, dass Metastasierung und Wachstum von B16-Melanom in IL-1β umsetzendes Enzym (ICE) defizienten Mäusen nach Injektion von B16-Zellen, die mit spezifischen ICE-Inhibitoren inkubiert sind, reduziert sind im Vergleich dazu, wenn unbehandelte B16-Zellen injiziert werden.
IL-18 (IFNγ-induzierender Faktor) ist ein neues Zytokin, das strukturelle Merkmale mit der IL-1-Proteinfamilie (22) und funktionelle Eigenschaften mit IL-12 (23) teilt. Es wurde berichtet, dass IL-18-Produktion von Kupffer-Zellen sowohl TNF-α als auch FAS-Ligand-vermittelte hepatotoxische Wege zum Endotoxin-induzierten Leberschaden (24) aktiviert. Vor kurzem wurde gezeigt, dass IL-18 auch entzündungsfördernde Eigenschaften durch direkte Stimulation von Genexpression und Synthese von TNF-α aus CD⁺/CD4⁺ und natürlichen Killerzellen mit anschließender Produktion von IL-1β und IL-8 aus der CD14⁺-Population besitzt, womit eine unerwartete entscheidende Stellung von IL-18 in der Zytokin-Hierarchie gezeigt wird (25). Allerdings wurde dessen mögliche Rolle bei der Krebsmetastasierung noch nicht beleuchtet.
Ein Interleukin-18 Bindeprotein (IL18BP) wurde durch Chromatographie an IL-18-Beads aus Urin gereinigt, sequenziert, geklont und in COS7-Zellen exprimiert. IL-18BP hob die IL-18-Induktion von Interferon-γ (IFN-γ), IL-8 und Aktivierung von NF-κB in vitro auf. Verabreichung von IL-18BP an Mäuse hob zirkulierendes IFN-γ folgend LPS auf. Daher wirkt IL-18BP als ein Inhibitor der frühen Th1-Zytokinantwort. IL-18BP wird im Wesentlichen in der Milz exprimiert, gehört zur Immunglobulinsuperfamilie und hat eine eingeschränkte Homologie zu dem IL-1-Rezeptor des Typs II. Dessen Gen wurde auf dem menschlichen Chromosom 11g13 lokalisiert und in einer 8,3 kb Genomsequenz wurde kein Exon gefunden, das für eine transmembrane Domäne codiert. Verschiedene Poxviren codieren für vermeintliche Proteine, im hohen Maße homolog zu IL-18BP, und lassen vermuten, dass virale Produkte IL-18 abschwächen und die zytotoxische T-Zellenantwort stören (28 und WO 99/09063). Wie in WO 99/09063 näher beschrieben, sind IL-18BP und Muteine, Fusionsproteine, funktionelle Derivate, aktive Fraktionen oder zirkulär permutierte Derivate und Mischungen davon fähig, an IL-18 zu binden und/oder fähig, die Aktivität von IL-18 zu modulieren und/oder fähig, die Aktivität von IL-18 zu blockieren.
WO 98/41232 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen IL-18-Antagonisten enthalten, um die Empfindlichkeit auf Corticosteroide zu modulieren.
EP 0 850 952 offenbart die Verwendung von einem Antikörper gegen den IL-18-Rezeptor zur Inhibierung der IL-18-Aktivität.
In Immunology Letters 68: 135 – 139 wird der Zusammenhang zwischen intratumoraler IFN-gamma-Expression und klinischem Ergebnis im Fall von Patienten, die von einem zervikalen Karzinom oder kolorektalem Karzinom befallen sind, analysiert. Es wird beschrieben, dass der Mangel an IFN-gamma-Expression mit der Existenz von entfernten Metastasen und schlechter Prognose korreliert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Inhibitoren der IL-18-Produktion und/oder Wirkung zur Herstellung von Medikamenten vor, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen.
Inhibitoren der IL-18-Produktion sind z.B. Inhibitoren von Caspase-1.
Die Inhibitoren der IL-18-Wirkung werden ausgewählt aus Antikörpern gegen IL-18, Antikörpern gegen beliebige IL-18-Rezeptoruntereinheiten, IL-18-Antagonisten, die mit IL-18 konkurrieren und den IL-18-Rezeptor blockieren, und IL-18BPs, Muteine, Fusionsproteine, funktionelle Derivate, aktive Fraktionen oder zirkular permutierte Derivate davon mit der gleichen Aktivität wie das IL-18-Bindeprotein (IL-18BP).
Als bevorzugte Inhibitoren werden IL-18BPs oder ein Mutein, Fusionsprotein, funktionelles Derivat, aktive Fraktion oder zirkulär permutiertes Derivat davon, das die gleiche Aktivität wie IL-18-BP hat, verwendet.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Inhibierung der IL-18-Produktion und/oder Wirkung, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen, werden auch beschrieben.
Eine andere Art, die IL-18-Produktion und/oder -Wirkung zu hemmen, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen, ist die Einführung eines Expressionsvektor in den Körper, der die codierende Sequenz für einen Inhibitor der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung, wie z.B. IL-18BP umfasst.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Experimentelle hepatische Kolonisierung nach Injektion von B16M-Zellen in die Milz von Wildtyp-IL-1β^-/- und ICE^-/- Mäuse. Die Lebern wurden am Tag 10 nach der Injektion der B16M-Zellen entfernt und in Phosphatgepufferter Salzlösung mit 10 % Formaldehyd fixiert. Beinahe alle experimentellen Metastasen (schwarze melanotische Knötchen) wurden aus dem IL-1β^-/- und ICE^-/-Mäuselebern vollständig entfernt.
2 Einfluss von irreversiblem ICE-Inhibitor und Anti-Maus-IL-18-Antikörper auf B16M-Zelladhäsion an HSE-Zellen und IL-1β- und TNF-α-Produktion von unbehandeltem und mit B16M-CM behandeltem HSE. Kultivierte HSE-Zellen wurden in Gegenwart von B16M-CM 10 h inkubiert. In einigen Experimenten erhielten sowohl unbehandelte als auch behandelte HSE-Zellen 10 μM ICEi oder 10 μg/ml Anti-Maus-IL-18-Antikörper vor B16M-CM. Der Anteil an B16M-Zellen, die an das HSE-Substrat anbinden, wurde als relativer Wert bezogen auf die Anfangszahl zugegebener Zellen berechnet. Zusätzlich wurden die Kultur-Überstände vor der Adhäsion zurückgehalten, um über ELISA die IL-1β- und TNF-α-Konzentration zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von 4 separaten Experimenten in jeweils sechsfacher Ausführung (n = 24). Die Zunahme an B16M-Zelladhäsion an B16M-CM-behandeltes HSE und die Zunahme der IL-1β- oder TNFα-Produktion im Hinblick auf unbehandeltes HSE (*P<0,01) waren statistisch signifikant gemäß Student's zweigeteiltem, ungepaarten Test. Es gab Unterschiede in der IL-1β- oder TNF-α-Produktion und bei der Adhäsion von B16M-Zellen an HSE-Zellen, wenn diese mit ICEi oder Anti-IL-18-Antikörper in Abwesenheit von B16M-CM behandelt wurden, die statistisch nicht signifikant waren (Ergebnisse nicht gezeigt).
3 Einfluss von ICEi auf B16M-Zelladhäsion an B16M-CM-behandeltes HSE in vitro. HSE-Zellen wurden mit Basalmedium oder B16M-CM 8 h inkubiert. Einige HSE-Zellen erhielten 10 μM ICEi für 18 h vor B16M- CM. Zusätzlich wurde auch 1 ng/ml rekombinantes murines IL-1β zu manchen HSE-Zellen zusammen mit B16M-CM für 8 h zugegeben. In anderen Experimenten erhielten HSE-Zellen 1 ng/ml murines II-1β oder 100 pg/ml TNF-α für 6 h und 10 μg/ml Kaninchen-Anti-Maus-IL-18 polyklonaler Antikörper wurde 1 h vor der Zytokinbehandlung zugegeben oder nicht. Nicht spezifischer IgG polyklonaler Antikörper wurde auch zu unbehandelten und Zytokinbehandelten HSE-Zellen zugegeben. Anschließend wurden die HSE-Zellen gewaschen und BCEFCF-AM-markierte B16M-Zellen zugegeben und 8 min später nochmals gewaschen. Der Anteil an B16M-Zellen, die an das HSE-Substrat anhaften, wurde als relativer Wert bezogen auf die Anfangszahl an zugegebenen Zellen berechnet. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei separaten Experimenten jeweils in sechsfacher Ausführung (n = 18). Unterschiede im Ausmaß an Adhäsion im Vergleich zu unbehandeltem HSE (*) und zu IL-1β- oder TNF-α-behandeltem HSE (**) waren gemäß Student's zweigeteiltem ungepaarten t-Test statistisch signifikant (P<0,01). Nicht statistisch signifikante Veränderungen bei der B16M-Zell-Adhäsion an andere mit ICEi-behandeltes Kontroll-HSE, das zusätzlich 1 ng/ml murines IL-1β für 8 h erhielt oder nicht (Ergebnisse nicht gezeigt).
4 In vitro B16M-Zellenadhäsion an IL-18-behandeltes HSE. HSE-Zellen wurden mit 1 ng/ml rekombinantem murinem IL-18 6 Stunden inkubiert. In einigen Experimenten wurden 10 μg/ml TNF-sRp55 oder 100 ng/ml IL-1Ra 10 min vor IL-18 zugegeben. In anderen Experimenten wurden 10 μg/ml Anti-VCAM-1-Antikörper oder eine ähnliche Konzentration eines nicht spezifischen Anti-Maus-IgG zu den HSE-Zellen 30 min vor den B16M-Zellen zugegeben. Anschließend wurde der B16M-Zelladhäsionsanteil, wie weiter unten in den Beispielen beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei separaten Experimenten in jeweils sechsfacher Ausführung (n = 18). Unterschiede in dem Ausmaß an Adhäsion im Vergleich zu Basalmedium-behandeltem HSE (*) und zu IL-18-behandeltem HSE (**) waren gemäß Student's zweigeteiltem ungepaarten t-Test statistisch signifikant (P<0,01).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Mehrere entzündungsfördernde Zytokine umfassend Interleukin (IL)-1β und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) fördern die Adhäsion von Krebszellen an Endothelzellen und führen dabei zur metastatischen Streuung von Tumoren. Diese entzündungsfördernden Zytokine fördern wahrscheinlich Adhäsion und Metastasierung durch Induktion des vaskularen Zelladhäsionsmoleküls-1 (VCAM-1). Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Behandlung von primär kultivierten murinen HSE-Zellen in konditioniertem Medium (CM) von B16-Melanom (B16M)-Zellkulturen (B16M-CM) die Adhäsion zwischen B16M und HSE-Zellen in vitro fördert. B16M-CM induziert auch die Prdouktion von IL-1β und TNF-α durch HSE-Zellen in vitro. Es wurde allerdings nicht klar gezeigt, dass Tumormetastasierung tatsächlich durch IL-1β und TNF-α vermittelt wird.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass B16M-CM die Produktion von IL-18 durch HSE-Zellen induziert und dass IL-18 das Zytokin ist, das zu einer verstärkten Adhäsion von B16M-Zellen an HSE-Zellen beiträgt. IL-18 erhöht die Adhäsion durch Aktivierung der VCAM-1-Expression in HSE-Zellen ohne Beteiligung von TNF-α oder IL1β. Inkbuation von HSE-Zellen mit einem spezifischen Caspase-1-Inhibitor (10 μM, 18 h) hebt die B16M-CM-induzierte Haftfähigkeit vollständig auf, ohne die TNF-α-Produktion zu senken und die Wirkung wird durch Zugabe von Maus-IL-1β nicht umgekehrt. Zugabe von antimurinem IL-18-Antikörper zu HSE-Zellen unterdrückt B16M-CM-induzierte Haftfähigkeit, ohne Auswirkung auf die B16-CM-Induktion von IL-1β und TNF-α zu haben. Auf ähnliche Weise unterdrückt auch das kürzlich geklonte IL-18-Bindeprotein (IL-18BP) die B16M-CM-induzierte Haftfähigkeit von B16M an HSE-Zellen in vitro. Inhibitoren von TNF-α und IL-1β, wie z.B. der p55 lösliche TNF-Rezeptor oder der IL-1-Rezeptorantagonist konnten die IL-18 induzierte Adhäsion nicht umkehren. Die vorliegende Erfindung stellt also Inhibitoren der IL-18-Produktion und -Wirkung als Mittel bereit, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen. Inhibitoren der IL-18-Produktion umfassen Inhibitoren von Caspase-1. Inhibitoren der IL-18-Wirkung werden ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Antikörper, die gegen IL-18 gerichtet sind, Antikörper, die gegen irgendeinen der zwei bekannten IL-18-Rezeptoruntereinheiten gerichtet sind, Antagonisten von IL-18, die mit IL-18 konkurrieren und den IL-18-Rezeptor blockieren, und IL-18-Bindeproteine, die an IL-18 binden und dessen biologische Aktivität blockieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die mögliche Rolle von IL-18 bei der entzündungsfördernden Zytokin-vermittelten Hochregulierung der VCAM-1-Expression, dessen mögliche Wechselwirkung mit anderen Zytokinen und Mittel, diese Induktion von VCAM-1 zu unterdrücken. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass IL-18 bei der Initiierung von entzündungsfördernden Ereignissen, die zur VCAM-1-Hochregulierung in der hepatischen sinusoidalen Wand führen, beteiligt ist und daher die Adhäsion von Krebszellen und Metastasierung erleichert. Primär kultivierte Maus-HSE-Zellen, die mit B16M-CM behandelt wurden, wurden als ein Modell der Krebszellen-abhängigen Endothelzellen-Aktivierung verwrendet, um die Rolle von durch B16M-Zellen induziertem IL-18 bei dem Mechanismus der B16M-Zelladhäsion an HSE durch einen VCAM-1-abhängigen Mechanismus zu erforschen. Die spezifische Rolle von IL-18 wurde unter Bedingungen einer spezifischen IL-1-Rezeptorblockierung mittels Inhibierung der Sekretion von IL-1 Ra, reifem IL-1β und Inhibierung der IL-18 Sekretion mittels eines Inhibitors, der IL-1 irreversibel umsetzt (ICEi), der TNF-Blockierung mittels des p55 TNF-löslichen Rezeptors (TNF-sR p55) und der Blockierung der Funktion von IL-18 mittels Anti-IL-18-Antikörper und IL-18-Bindeprotein untersucht. Zusätzlich wurden B16M-Zellen in die Milz von ICE^-/- und IL-1β^-/- Mäuse injiziert. Die geringe Dichte an Metastasen, die bei den defizienten Mäusen im Vergleich zu den normalen Kontrollen beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung von IL-1β und möglicherweise IL-18 bei der metastasenfördernden Rolle der Entzündung vermuten (Tabelle 1).
Die durchgeführten in vitro-Experimente zeigen, dass die IL-18-Produktion die stimulierende Wirkung der HSE-Adhäsion, die durch Überstände, die aus B16M-Zellen stammen, induziert werden, erklärt. Da VCAM-1-Hochregulierung die gesamte Adhäsions-stimulierende Aktivität von mit B16M-CM behandeltem HSE erklärt, zeigen die Ergebnisse, dass IL-18 die Expression von VCAM-1 aus Zytokin-induziertem HSE vermittelt. Darüber hinaus verringerten Antikörper gegen IL-18 die durch B16M-CM gehemmte Zelladhäsion, ohne die Produktion von TNF-α und IL-1β aus HSE-Zellen zu beeinflussen. Daher war die Produktion von IL-1β und TNF-α in HSE-Zellen unabhängig von IL-18 und trug nicht zur Adhäsion bei. Im Gegensatz dazu konnten weder TNF-sR p55 noch IL-1Ra die Adhäsionszunahme bei mit IL-18 behandelten HSE-Zellen hemmen, was bestätigt, dass weder autokrines TNF-α noch IL-1β die durch IL-18-induzierte HSE-haftfähigkeit erklären.
Die Ergebnisse in HSE-Zellen stehen im Gegensatz zu denen, die in anderen zellulären Systemen erhalten werden, wie z.B. in nicht-CD14⁺ menschlichen mononuklearen Blutzellen (25), bei denen IL-18 IL-1β über TNF-α-Produktion induzierte. Es ist wahrscheinlich, dass eine HSE-spezifische entzündungsfördernde Zytokinhierarchie besteht, bei der TNF-α und IL-1β unabhängig von der IL-18-Steuerung sind, aber IL-18 als ein Downstream-Mediator der VCAM-1-Hochregulierung verwendet wird.
Im Gegensatz zu murinen HSE-Zellen exprimierten B16M-Zellen nicht das Gen von IL-18, wie mittels RT-PCR überprüft wurde, und 18 h Inkubierung mit ICEi hob Zytokin- und Adhäsion-stimulierenden Aktivitäten von B16M-CM auf HSE-Zellen nicht auf. Allerdings kann die lokale Produktion von IL-18 das B16M-Zellverhalten während dessen Transits oder Verbleibs in der hepatischen Mikrogefäßversorgung beeinflussen. Zusätzlich wurde gefunden, dass 6 h Inkubation von B16M-Zellen mit 1 ng/ml murinem IL-18 ihre Adhäsion an unbehandeltes HSE um das Zweifache erhöht und Zugabe von Anti-VCAM-1-Antikörper zu HSE die durch IL-18-vermittelte Adhäsion um 80 % verringert wurde, was vermuten lässt, dass VCAM-1/VLA-4-Wechselwirkung beteiligt war. Auf ähnliche Weise erhöhte sich auch die Adhäsion von B16M-Zellen, die den Überstand von B16M-CM-behandelten HSE für 6 h erhielten, an HSE signifikant (P<0,01) um das Zweifache durch den VCAM-1-abhängigen Mechanismus; Anti-IL-18-Antikörper hob diese Adhäsions-stimulierende Wirkung auf.
Die mit der vorliegenden Erfindung übereinstimmenden Ergebnisse lassen vermuten, dass IL-18 eine neue Verbindung zwischen hepatischer Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen und Metastasenentwicklung ist. Dessen Produktion von tumoraktivierten HSE-Zellen bestimmt zwei komplementäre Mechanismen, die an der Regulierung der Adhäsion von Melanomzellen an HSE-Zellen beteiligt sind: ein autokriner Mechanismus in HSE, der die TNF-α/IL-1β vermittelte VCAM-1-Hochregulierung steuert, und ein parakriner Mechanismus in B16M-Zellen, der VLA-4 in der Melanomzelle hochreguliert und dabei ihre VCAM-1-abhängige Adhäsionsfähigkeit ermöglicht. Diese gleichzeitige molekulare Hochregulierung von beiden Gegenstücken der Zelladhäsion macht den Weg der Beeinflussung der Krebskapillarendothelzellen höchst nützlich.
Die IL-18-induzierte Adhäsion von B16M-Zellen wird durch Inhibitoren der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung aufgehoben. Inhibitoren der IL-18-Produktion umfassen Inhbitoren von Caspase-1. Inhbitoren der IL-18-Wirkung werden ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Antikörpern, die gegen IL-18 gerichtet sind, Antikörpern, die gegen irgendeinen der zwei bekannten IL-18-Rezeptoruntereinheiten gerichtet sind, Antagonisten von IL-18, die mit IL-18 konkurrieren und den IL-18-Rezeptor blockieren, und IL-18-Bindeproteine, die an IL-18 binden und dessen biologische Aktivität blockieren.
Zusätzlich zu der direkten Verwendung von Inhibitoren der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung zieht die vorliegende Erfindung auch die Einführung in Zellen, in denen der hemmende Effekt der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung erwünscht ist, in Erwägung. Zu diesem Zweck ist ein System zur spezifischen Einführung von z.B. IL-18BP codierender DNA in die Zellen notwendig. Mehrere Möglichkeiten, dies zu tun, sind im Fachgebiet bekannt. Z.B. kann ein geeigneter Vektor, der die obige DNA trägt, in Zellen eingeführt werden, wobei der Vektor fähig ist, die Insertion der DNA in die Zellen in einer Weise zu bewerkstelligen, dass die DNA in die Zellen exprimiert wird. Verfahren zur Einführung in die Zellen werden u.a. z.B. in US Patent 5,910,487, WO 99/29349 und anderen beschrieben.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verwendung gemäß der Erfindung für die Inhibierung der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung geeignet sind, sind solche, die als aktiven Bestandteil einen Inhibitor umfassen, der ausgewählt ist aus einem Caspase-1-Inhibitor, einem Antikörper gegen IL-18, einem Antikörper gegen irgendeinen der IL-18-Rezeptoruntereinheiten, einem Inhibitor des IL-18-Rezeptorsignalwegs, einem Antagonisten, der mit IL-18 konkurriert und den IL-18-Rezeptor blockiert, und IL-18BP oder einem Mutein, Fusionsprotein, funktionellen Derivat, einer aktiven Fraktion oder einem zirkulär permutierten Derivat davon, das die gleiche Aktivität wie IL-18BP aufweisen.
Die Ausdrücke Mutein, Fusionsprotein, funktionelles Derivat, aktive Fraktion und zirkular permutiertes Derivat haben die gleiche Bedeutung wie in WO 99/09063.
Antikörper gegen IL-18 und IL-18BPs sind die bevorzugten aktiven Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch konventionelle Träger, Hilfsstoffe und andere Bestandteile, die im Fachgebiet bekannt sind, abhängig von ihrer Art der Anwendung, d.h. Injektion, oral oder durch jegliche andere bekannte Weise, die im Fachgebiet bekannt ist, umfassen.
Die jeweilige Dosis hängt von der Art der Anwendung, dem Körpergewicht des Patienten und anderen Faktoren ab und wird im Einzelfall durch den Arzt bestimmt.
Nachdem nun die Erfindung beschrieben wurde, wird das Gleiche leichter unter Bezugnahme der folgenden Beispiele verstanden, die zum Zweck der Erklärung bereitgestellt werden und nicht dazu gedacht sind die vorliegende Erfindung einzuschränken.
Beispiele
Reagenzien:
Ratten-Anti-Maus IyG und Ratten-Anti-Maus VCAM-1 monoklonaler Antikörper wurden von Serotec Ltd. (Oxford, England) erhalten. Rekombinantes murines IL-1β wurde von R&D System Inc. (Minneapolis, MN) erhalten. Rekombinanter humaner IL-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1Ra war ein freundliches Geschenk der The Upjohn Co., Kalamazoo, MI) und humaner p55 TNF-löslicher-Rezeptor (TNFsR p55) war ein freundliches Geschenk von Serono Inc., Norwell, MA. Inhibitor des IL-1β umsetzenden Enzyms (ICEi) wurde von Alexis Co. (San Diego, CA) erhalten. Rekombinantes murines IL-18 und Kaninchen-Anti-Maus-IL-18 polyklonaler Antikörper IgG wurde von PreproTech EC Ltd. (London, UK) bezogen. IL-18-Bindeprotein (IL-18BP) wurde wie beschrieben (28) hergestellt.
Kultivierung von B16M-Zellen. B16M-Zellen wurden kultiviert, aufbewahrt und passagiert wie beereits beschrieben (11). B16M-konditioniertes Medium (B16M-CM) wurde wie folgt hergestellt: 5 × 10⁵ Zellen wurden in einem 25 cm² T-Kolben ausplattiert und für 24 Stunden kultiviert. Danach wurden die Zellen für einen zusätzlichen Zeitraum von 24 h in 5 ml serumfreiem Medium (endgültige zelluläre Dichte von 6 × 10⁴ Zellen/cm²) kultiviert. Überstände wurden gesammelt, 3 : 1 in frischem serumfreien Medium verdünnt und durch ein 0,22 Ïm Filter filtriert.
Zytokin-Analyse. Freisetzung von Zytokinen aus primär kultivierten HSE-Zellen und B16M-Zellen wurde mittels eines spezifischen ELISA-Kits, das auf Anti-Maus-IL-1ß- und TNF-α monoklonalen Antikörpern basierte, wie von dem Hersteller (R&D Systems, Minneapolis, MN) vorgeschlagen, gemessen.
Beispiel 1: Quantitative B16M-Zelladhäsion an primäre HSE-Kulturen.
HSE wurde aus genidentischen Mäusen separiert, identifiziert und kultiviert wie bereits beschrieben (26). B16M-Zellen wurden mit 2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5,6-carboxyfluorescein-acetoxymethylester-Lösung (BCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR) wie berichtet (16) markiert. Anschließend wurden 2 × 10⁵ Zellen pro Well zu in einer 24 Well-Platte kultiviertem HSE gegeben und 8 min später wurden die Wells dreimal mit frischem Medium gewaschen. Die Anzahl an anhaftenden Zellen wurde mittels eines quantitativen Verfahrens bestimmt, das auf einem bereits beschriebenen Fluoreszenzmessungssystem beruht (16). In einigen Experimenten wurden HSE-Zellen für mehrere Stunden vor Zugabe von B16M-Zellen mit B16M-CM vorinkubiert.
Beispiel 2: Hepatischer Metastasierungsassay.
Wildtp, IL-1β^-/- und ICE^-/- männliche C57BL/6J Mäuse wurden wie bereits beschrieben erzeugt (27). Sechs bis acht Wochen alte Mäuse, zu fünft im Käfig untergebracht, wurden verwendet. Hepatische Metastasen wurden durch Injektion von 3 × 10⁵ lebensfähigen B16-Melanomzellen, die in 0,1 ml Hanks' ausgeglichener Salzlösung suspendiert waren, in die Milz von anästhesierten Mäusen (Nembutal, 50 mg/kg intraperitonal) erzeugt. Die Mäuse wurden unter Betäubung am zehnten Tag nach der Injektion der Krebszellen getötet. Lebergewebe wurden für die Histologie aufbereitet. Densitometrische Analyse der digitalen Mikroskopbilder wurde verwendet, um metastatisches B16M von normalem hepatischen Gewebe zu unterscheiden und die Dichte an Lebermetastasen, die als Anzahl von Metastasen pro 100 mm³ Leber definiert ist (bezogen auf die mittlere Anzahl von Herden, die in fünfzehn 10 × 10 mm² Schnitten pro Leber nachgewiesen werden), wurden mittels bereits beschriebenen stereologischen Verfahren berechnet (17).
Beispiel 3: Verringerte Metastasierung und Wachstum von B16M-Zellen. die in IL-1ß und ICE defiziente Mäuse injiziert werden.
Zwei unabhängige Experimente, ein Jahr auseinander, wurden durchgeführt, indem zwei verschiedene Ansätze der gleichen B16M-Zellen in die Milz von erwachsenen C57B1/6J Wildtyp, ICE^-/- und IL-1β^-/- Mäuse injiziert werden. Nekroptische Untersuchung zeigte sichtbare melanotische Tumoren in der Milz aller untersuchten Mäuse ohne signifikante Unterschiede in der Größe, wie nach dem Gewicht der Milz beurteilt (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu trat eine deutliche Verringerung der Metastasierung in IL-1β^-/- und vor allem in ICE^-/- Mäuselebern auf, verglichen zu Lebern der Wildtyp Maus (1). Eine quantitative histologische Analyse der Anzahl und Größe der metastatischen Herde wurde durchgeführt, um die Metastasiendichte (als Anzahl der Herde/100 mm³) und Volumen (Prozent Organbefall)-Parameter in untersuchten Mäuselebern zu bestimmen. Verglichen mit Wildtyp-Mäusen (Tabelle 1) verringerte sich die hepatische Metastasendichte signifikant (P<0,01) in IL-1β^-/- und ICE^-/- Mäuselebern um 84 % bis 90 %, was anzeigt, dass die meisten der injizierten B16M-Zellen nicht geeignet waren, in hepatisches Gewebe von diesen Mäusen zu implantieren. Zusätzlich verringerte sich auch das Metastasenvolumen signifikant (P<0,01) in IL-1β^-/- und ICE^-/- Mäuselebern um das 6- bis 7-fache verglichen mit den Werten in Lebern von Wildtyp-Mäusen, was anzeigt, dass B16M-Zellen, die fortfahren, Leber zu kolonisieren, auch eine verringerte Wachstumsrate aufwiesen. Wir beobachteten auch einen Unterschied in diesen Metastasierungsparametern zwischen IL-1β^-/- und ICE^-/- Mäuselebern, was zu einer Ausrottung der Metastasierung in beinahe allen ICE^-/- Mäuselebern aus Experiment 1 (1) führt. Tabelle 1 Quantitative histologische Analyse der experimentellen hepatischen Kolonisierung von B16M-Zellen, die in die Milz von IL-1^-/- und ICE^-/- Mäuse injiziert wurden
Die Ergebnisse zeigen Durchschnittswerte ± Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten (7 bis 15 Mäuse pro experimentelle Gruppe wurden verwendet).

*Unterschiede, die statistisch signifikant waren (zweiseitig, p<0,01) im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen, wobei die Analyse der Varianz (ANOVA) und der Scheffe F-Tests eingesetzt wurden, sind angegeben.

Beispiel 4: Autokrines IL-18 vermittelt TNF-α und IL-1β induzierte Haftfähigkeit von B16M-CM-aktiviertem HSE.
B16M-CM erhöhte signifikant (P<0,01) die HSE-Zellproduktion von TNF-α und IL-1β und ihre Haftfähigkeit für andere B16M-Zellen in vitro (2). Inkubierung von HSE mit 10 μM ICEi für 18 h hob die B16M-CM-induzierte Haftfähigkeit vollständig auf, ohne TNF-α-Produktion von HSE zu verringern. Exogen zugegebenes murines IL-1β kompensierte die blockierende Wirkung von ICEi auf HSE nicht, was im Gegensatz zu der signifikanten B16M-Zelladhäsionserhöhung in mit IL-1β behandeltem Kontroll-HSE steht (3). Die Tatsache, dass die Steigerung der B16M-CM-induzierten Adhäsion in Gegenwart von erhöhten Konzentrationen von endogen produzierten TNF-α und exogen zugefügten IL-1β aufgehoben wurde, zeigt an, dass keiner dieser Zytokine direkt die HSE-Haftfähigkeit hochreguliert. Wesentlich ist, dass die Anwesenheit von antimurinem IL-18-Antikörper der zu HSE vor Stimulierung mit B16M-CM zugegeben wurde, die B16M-CM-induzierte Haftfähigkeit unterdrückte, ohne die induzierte IL-1β- und TNF-α-Produktion von HSE zu beeinflussen (2). Darüber hinaus unterdrückte Anti-IL-18-Antikörper auch die Adhäsionsstimulierende Wirkung von murinem IL-1β und TNF-α auf HSE (3), was anzeigt, dass anhaftfördernde Wirkungen dieser Zytokine auf HSE beide IL-18 vermittelt waren. RT-PCR bestätigte, dass HSE-Zellen IL-18-Gen exprimierten (Ergebnisse nicht gezeigt). Umgekehrt erhöhte murines IL-18 signifikant (P<0,01) die B16M-Zelladhäsion an HSE (4) und weder TNF-sR p55 noch IL-1 Ra waren fähig, sie zu hemmen, was bestätigt, dass weder autokrines TNF-α noch IL-1β die IL-18 induzierte HSE-Haftfähigkeit erklären. Wie in 4 gezeigt, hemmten allerdings Anti-VCAM-1-Antikörper vollständig die Adhäsion von B16M-Zellen an mit IL-18 behandeltem HSE. Die Kontrolle, nichtspezifisches IgG, beeinflusste die Hochregulierung von B16M-Zelladhäsion an mit IL-18 behandeltes HSE nicht.
Beispiel 5: IL-18BP unterdrückt die Adhäsion von B16-Melanomzellen die durch B16 konditioniertes Medium induziert werden.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, verringerte die Zugabe von IL-18BP zu HSE, das mit B16-CM stimuliert war, den Anteil von anhaftenden Zellen von 35 % auf 8,70 % (p<0,01). Das bedeutet eine 100 %ige Hemmung, da der Grad an Adhäsion unter dem Grad von anhaftenden Zellen bei Verwendung von Basalmedium war. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass endogenes IL-18 von dem HSE eine endogene Quelle von IL-18, zusätzlich zu der die in B16M-CM anwesend ist, sein kann.
Tabelle 2 Hemmender Effekt von IL-1BP auf Adhäsion in B16 konditioniertem Medium von B16-Melanomzellen an hepatisch sinusoidale Endothelzellen
Ergebnisse geben die durchschnittlichen Werte ± Standardabweichung von 2 unabhängigen Experimenten, die jeweils sechsmal durchgeführt (N = 12) wurden, an.

** Unterschiede, die verglichen mit B16-CM statistisch signifikant (zweiseitig, p<0,01) waren sind angegeben, wobei die Analyse der Varianz (ANOVA) und der Scheffe F-Tests eingesetzt werden.

LITERATUR

1. Kohn, E.C. und Liotta, L.A. (1995) Cancer Res 55(9), 1856-62
2. Nicolson, G.L. und Winkelhake, J.L. (1975) Nature 255, 230-232
3. Freedman, A., Munro, M., Rice, G.E., Bevilacqua, M.P., Morimoto, C., McIntyre, B.W., Rhynhardt, K., Pober, J.S. und Nadler, L.M. (1990) Science 249, 1030-1033
4. Miyake, M., Fuchimoto, S., Iwagaki, H., Matsubara, N., Edamatsu, R., Hiramatsu, M. und Orita, K. (1991) Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 71, 294-307
5. Simmons, P.J., Masinovsky, B., Longenecker, B.M., Berenson, R., Torok-Storb, B. und Gallatin, W.M. (1992) Blood 80(2), 388-95
6. Rice, G.E. und Bevilacqua, M.P. (1989) Science 246, 1303-1306
7. Okahara, H., Yagita, H., Miyake, K. und Okumura, K. (1994) Cancer Res 54, 3233-3236
8. Garofalo, A., Chirivi, R.G.S., Foglieni, C., Pigot, R., Mortarini, R., Martin-Padura, I., Anichini, A., Gearing, A.J., Sanches-Madrid, M., Dejana, E. und Giavazzi, R. (1995) Cancer Res 55, 414-419
9. Martin-Padura, I., Mortarini, R., Lauri, D., Bernasconi, S., Sanches-Madrid, F., Parmiani, G., Mantovani, A., Anichini, A. und Dejana, E. (1991) Cancer Res 51, 2239-2241
10. Lauri, D., Bertomeu, M.-C. und Orr, F.W. (1990) Clin Exp Metastasis 8, 27-32
11. Anasagasti, M.J., Alvarez, A., Martin, J.J., Mendoza, L. und Vidal-Vanaclocha, F (1997) Hepatology 25, 840-846
12. Bani, M.R., Garofalo, A., Scanziani, E. und Giavazzi, R. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83, 119-123
13. Bertomeu, M.C., Gallo, S., Lauri, D., Haas, T.A., Orr, F.W., Bastida, E. und Buchanan, M.R. (1993) Clin Exp Metastasis 11, 243-250
14 . Burrows, F.J.„ Haskard, D.O., Hart, I.R., Marshall, J.F., Selkirk, S., Poole, S. und Thorpe, P.E. (1991) Cancer Res 51, 4768-4775
15. Chirivi, R.G.S., Garofalo, A., Padura, I.M., Mantovani, A. und Giavazzi, R. (1993) Cancer Res 53, 5051-5054
16. Vidal-Vanaclocha, F., Amézaga, C., Asumendi, A., Kaplanski, G. Und Dinarello, C.A. (1994) Cancer Res 54, 2667-2672
17. Vidal-Vanaclocha, F., Alvarez, A., Asumendi, A., Urcelay, B., Tonino, P. und Dinarello, C.A. (1996) J Natl Cancer Inst 88, 198-205
18. Malik, S.T., Naylor, M.S., East, N., Oliff, A. und Balkwill, F.R. (1990) Eur J Cancer 26, 1031-1034
19. Orosz, P., Echtenacher, B., Falk, W., Ruschoff, J., Weber, D. und Mannel, D.N. (1993) J Exp Med 177, 1391-1398
20. Orosz, P., Krüger, A., Hubbe, M., Rüschoff, J., Von Hoegen, P. und Männel, D.N. (1995) Int. J. Cancer 60, 867-871
21. Mendoza, L., Olaso, E., Anasagasti, M.J., Fuentes, A. und Vidal-Vanaclocha, F. (1998) J Cell Physio 174, 322-330
22. Bazan, J.F., Timans, J.C. und Kastelein, R.A. (1996) Nature 379 (6566), 591
23. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S. und Kurimoto, M: (1995) Nature 378, 88-91
24. Tsutsui, H., Matsui, K., Kawada, N., Hyodo, Y., Hayashi, N., Okamura, H., Nigashino, K. und Nakanishi, K. (1997) J Immunol 159(8), 3961-7
25. Puren, A.J., Fantuzzi, G., Gu, Y., Su, M.S.-S. und Dinarello, C.A. (1998) J Clin Invest 101, 711-724
26. Vidal-Vanaclocha, F., Rocha, M., Asumendi, A. und Barbera-Guillem, E. (1993) Hepatology 18, 328-339
27. Fantuzzi, G., Puren, A.J., Harding, M.W., Livingston, D.J. und Dinarello, C.A. (1998) Blood 91, 2118-2125
28. Novick, D., Kim, S-H., Fantuzzi, g., Reznikov, L.L., Charles A. Dinarelle, C.A. und Rubinstein, M. (1999) Immunity 10, 127-136.

Claims

Verwendung von Inhibitoren der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung zur Herstellung von Medikamenten, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen, wobei der Inhibitor von IL-18 ausgewählt ist aus Antikörpern gegen IL-18, Antikörpern gegen irgendeinen der IL-18-Rezeptoruntereinheiten, Antagonisten von IL-18, die mit IL-18 kompetieren und den IL-18 Rezeptor blockieren, und IL-18-Bindeproteinen, Muteinen, Fusionsproteinen, funktionellen Derivaten, aktiven Fraktionen oder zirkulär permutierten Derivaten davon, die die gleiche Aktivität wie IL-18-Bindeprotein (IL-18BP) aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Melanom ein hepatisches Melanom ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor der IL-18-Produktion ein Caspase-1-Inhibitor ist, der spezifisch und irreversibel an IL-18 bindet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor von IL-18 ein Antikörper gegen IL-18 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor der IL-18-Wirkung ein IL-18BP oder ein Mutein, Derivat oder Fragment davon ist, das die gleiche Aktivität hat wie IL-18BP.
Verwendung eines Expressionsvektors, der für einen Inhibitor der IL-18-Produktion und/oder -Wirkung, wie in Anspruch 1 definiert, codiert, zur Herstellung von Medikamenten, um Tumormetastasierung von Melanom zu hemmen.