KR100682219B1 - 종양 전이를 저해하는 인터루킨-18 저해물질의 용도 - Google Patents

Abstract

종양 전이에서 IL-18 저해물질의 용도를 개시한다. IL-18 결합단백질(IL-18BP)의 활용이 바람직하다.

Description

종양 전이를 저해하는 인터루킨-18 저해물질의 용도{USE OF INTERLEUKIN-18 INHIBITORS TO INHIBIT TUMOR METASTASIS}

본 발명은 종양 전이 및 이를 저해하는 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 인터루킨-18(IL-18)의 생산 및/또는 작용을 저해하여 종양 전이를 예방하는 방법에 관한다.

미세혈관내피세포(capillary endothelium)에 대한 순환 암세포의 유착은 전이 발생에서 중요한 단계다(1,2). 면역글로불린 대과의 일원인 혈관세포 유착 분자-1(VCAM-1)은 친염증성 사이토킨-활성화된 내피 세포에 대한 조혈세포 및 활성화된 백혈구의 유착을 매개한다. 하지만, VCAM-1의 유착 기능은 동물과 사람의 암세포에 의해 악용되어 실험적인 전이 확산을 강화시킬 수 있다(6).

가령, IL-1β및 TNF-α는 내피 세포에 의한 VCAM-1 발현의 상향-조절을 포함하는 기전으로 폐 조직에서 VLA-4-발현 흑색종 세포의 전이를 강화시키는 것으로 알려져 있다(7,9). 또한, IL-1β및 TNF-α는 정상 생쥐와 리포폴리사카라이드-처리된 생쥐 모두에서 B16M 세포의 간 전이증식에 상당히 기여하는 것으로 입증되었다(7,8,10-20). 이에 더하여, 만노스 수용체-매개된 간 시누소이드 내피(HSE) 세포 활성화에는 VCAM-1의 자가분비 IL-1β매개된 HSE 세포 발현이 포함되는데, 이는 증가된 B16M 세포 유착 및 전이를 결과한다(21). 또한, IL-1β-활성화된 HSE 세포는 VLA-4-자극 인자를 방출하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 HSE 세포에 대한 B16M 세포 유착을 강화시킨다(11). 따라서, IL-1β는 HSE 세포로부터 VCAM-1 발현 및 VLA-4-자극 인자 방출을 촉진하는데, 이는 특정 시누소이드 사이에 정지된 VLA-4-발현 암세포를 위한 친전이성 미세환경을 조장하는 능력을 제공한다.

하지만, IL-1β및 TNF-α를 차단하면 부분적인 전이 중단이 발생하는데, 이는 이들의 존재를 보상하는 또는 대안 경로를 통하여 작용하는 다른 인자가 관여한다는 것을 시사한다. 또한, 대부분의 전이성 암세포와 표적 조직은 이들 친-염증성 사이토킨을 생산할 수 없다. 이에 더하여, 내독소 또는 만노스 수용체 리간드 농도는 친염증성 사이토킨 방출을 유도할 만큼 충분히 증가하지 않는다. 따라서, VCAM-1 상향조절 및 암세포의 미세혈관 전이동안 이의 관여를 촉발하는 다중 매개물질의 특징은 별로 알려져 있지 않다.

IL-18(IFN

-유도 인자)은 IL-1 단백질군(22)과 구조적 특징을, IL-12(23)와 기능적 특성을 공유하는 신규한 사이토킨이다. 쿠퍼 세포로부터 IL-18 생산은 내독소-유도된 간 손상에서 TNF-α와 FAS 리간드-매개된 간독성 경로를 활성화시키는 것으로 보고되었다. 좀더 최근에, IL-18은 유전자 발현 및 CD3⁺/CD4⁺과 자연 킬러 세포로부터 TNF-α 합성의 직접적인 자극, 이후 CD14⁺ 개체군으로부터 IL-1β와 IL-8의 생산으로 친염증적 특성을 보유하는 것으로 밝혀졌고, 이로써 사이토킨 계층에서 IL-18의 예상치못한 중심적 위치가 드러났다(25). 하지만, 암 전이에서 이의 역할은 해명되지 않고 있다.

인터루킨-18 결합단백질(IL-18BP)은 IL-18 비드에서 크로마토그래피로 소변으로부터 정제하고, 서열화하고, 클론하고, COS7 세포에서 발현시킨다. IL-18BP는 시험관내에서 인터페론-

(IFN-

)의 IL-18 유도, IL-18 및 NF-κB의 활성화를 저해한다. 생쥐에 IL-18BP를 투여하면, LPS이후 순환 IFN-

가 소멸한다. 따라서, IL-18BP는 초기 Th1 사이토킨 반응의 저해물질로서 기능한다. IL-18BP는 비장에서 본질적으로 발현되고, 면역글로불린 대과에 속하며, IL-1 II형 수용체와 제한적인 상동성을 보유한다. 이의 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다. 몇몇 폭스바이러스는 IL-18BP와 고도로 상동한 추정 단백질을 인코드하는데, 이는 바이러스 산물이 IL-18을 감쇄시키고 세포독성 T-세포 반응을 간섭한다는 것을 시사한다(28, WO99/09063). WO/09063에 언급된 바와 같이, IL-18BP와 뮤테인(mutein), 융합단백질, 기능 유도체, 활성 분취물 또는 순환적으로 치환된 유도체, 이들의 혼합물은 IL-18 결합하고, IL-18의 활성을 조절 및/또는 IL-18의 활성을 차단할 수 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 종양 전이를 저해하는 약물의 제조에 사용되는 IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질의 용도에 관한다.

IL-18 생산의 저해물질은 예로써, 카스파제-1의 저해물질이다.

IL-18 작용의 저해물질은 IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 부분유니트중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 수용체 시그널링 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질 및 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질, 기능 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18과 결합하는 순환적으로 치환된 이의 유도체에서 선택된다.

바람직하게는, 사용되는 저해물질은 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질, 기능 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18BP와 동일한 활성을 보유하는 순환적으로 치환된 이의 유도체이다.

또한, 본 발명은 종양 전이를 저해하기 위하여 IL-18 생산 및/또는 작용을 저해하는 제약학적 조성물을 제공한다.

종양 전이를 저해하기 위하여 IL-18 생산 및/또는 작용을 저해하는 다른 방법은 IL-18 생산 및/또는 작용 저해물질, 예를 들면 IL-18BP에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 체내에 도입하는 것이다.

도1은 야생형, IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐에 비장내 B16M 주사한 이후 실험적 간 전이증식을 도시한다. 간은 B16M 세포 주사로부터 10일후에 떼어내고, 10% 포름알데하이드를 함유한 인산염 완충 식염수에 고정시킨다. 거의 모든 실험적 전이(검은 흑색종 덩어리)는 IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐 간에서 소멸되었다.

도2는 HSE 세포에 대한 B16M 세포 유착 및 처리되지 않은 HSE 세포와 B16M-CM-처리된 HSE 세포에서 IL-1β와 TNF-α생산에 대한 비가역적 ICE 저해물질과 안티-생쥐 IL-18 항체의 효과를 도시한다. 배양된 HSE 세포는 10시간동안 B16M-CM의 존재하에 배양한다. 일부 실험에서, 처리된 HSE 세포와 처리되지 않은 HSE 세포 모두 B16M-CM에 앞서 10μM ICEi 또는 10㎍/㎖ 안티-생쥐 IL-18 항체를 흡수하였다. HSE 기질에 유착된 B16M 세포의 퍼센트는 추가된 세포의 초기값에 대한 상대값으로 계산한다. 또한, 배양 상층액은 ELISA로 IL-1β와 TNF-α농도를 측정하기 위하여, 유착에 앞서 수거한다. 데이터는 4번의 개별 실험의 평균 ±SD를 나타내고, 각 실험은 6회 실시한다(n=24). B16M-CM-처리된 HSE에 대한 B16M 세포 유착 및 처리되지 않은 HSE 세포와 대비한 IL-1β또는 TNF-α생산의 증폭(*P<0.01)은 스튜던트의 양쪽꼬리 비대합 t-검증에서 통계학적으로 유의성이 있었다. B16M-CM의 부재하에 ICEi 또는 안티-IL-18 항체로 처리하는 경우, IL-1β또는 TNF-α생산 및 HSE 세포에 대한 B16M 세포의 유착에서 통계학적으로 유의성있는 변화는 없었다.

도3은 시험관내에서 B16M-CM-처리된 HSE 세포에 대한 B16M 세포의 유착에 대한 ICEi 효과를 도시한다. HSE 세포는 8시간동안 기저 배지 또는 B16M-CM과 함께 배양한다. 일부 HSE 세포는 B16M-CM에 앞서 18시간동안 10μM ICEi를 흡수한다. 이에 더하여, 일부 HSE 세포에 B16M-CM과 함께 1ng/㎖ 재조합 뮤린 IL-1β를 8시간동안 첨가한다. 다른 실험에서 HSE 세포는 6시간동안 1ng/㎖ 뮤린 IL-1β또는 100pg/㎖ TNF-α를 흡수하고, 사이토킨 처리보다 1시간 앞서 10㎍/㎖ 토끼 안티-생쥐 IL-18 다클론항체를 첨가하거나 또는 첨가하지 않는다. 또한, 처리되지 않은 HSE 세포와 사이토킨-처리된 HSE 세포에 비-특이적 IgG 다클론항체를 첨가한다. 이후, HSE 세포는 세척하고, BCEFCF-AM-라벨된 B16M 세포를 첨가하고, 8분후 한번 더 세척한다. HSE 기질에 유착된 B16M 세포의 퍼센트는 추가된 세포의 초기값에 대한 상대값으로 계산한다. 결과는 3번의 개별 실험의 평균 ±SD를 나타내고, 각 실험은 6회 실시한다(n=18). 처리되지 않은 HSE(*) 및 IL-1β또는 TNF-α-처리된 HSE 세포(**)에 대한 유착 정도의 차이는 스튜던트의 양쪽꼬리 비대합 t-검증에서 통계학적으로 유의성이 있었다(P<0.01). 1ng/㎖ 뮤린 IL-1β를 8시간동안 추가로 흡수한 또는 이를 흡수하지 않은 다른 ICEi-처리된 대조군 HSE에 대한 B16M 세포의 유착에서 통계학적으로 유의성있는 변화는 없었다.

도4는 IL-18-처리된 HSE에 대한 시험관내 B16M 세포 유착을 도시한다. HSE 세포는 6시간동안 1ng/㎖ 재조합 뮤린 IL-18과 함께 배양한다. 일부 실험에서, 10㎍/㎖ TNF-sRp55 또는 100ng/㎖ IL-1Ra는 IL-18보다 10분전에 첨가한다. 다른 실험에서, 10㎍/㎖ 안티-VCAM-1 항체 또는 유사한 농도의 비-특이적 안티-생쥐 IgG는 B16M 세포보다 30분전에 HSE 세포에 첨가한다. 이후, B16M 세포 유착 퍼센트는 하기 실시예에서 밝힌 바와 같이 측정한다. 결과는 3번의 개별 실험의 평균 ±SD를 나타내고, 각 실험은 6회 실시한다(n=18). 기초 배치-처리된 HSE(*) 및 IL-18-처리된 HSE 세포(**)에 대한 유착 정도의 차이는 스튜던트의 양쪽꼬리 비대합 t-검증에서 통계학적으로 유의성이 있었다(P<0.01).

인터루킨(IL)-1β및 종양 괴사 인자(TNF-α)를 비롯한 몇몇 친염증성 사이토킨은 내피 세포에 대한 암세포의 유착을 촉진하고, 따라서 종양의 전이 확산을 결과한다. 이들 친염증성 사이토킨은 혈관세포 유착분자-1(VCAM-1)을 유도하여 유착 및 전이를 촉진하는 것으로 보인다. 본 발명은 B16 흑색종(B16) 세포 배양액으로 부터 얻은 조건 배지(CM)(B16M-CM)로 일차 배양된 뮤린 HSE 세포를 처리하면 시험관내에서 B16M과 HSE 세포간의 유착이 촉진된다는 것을 보여준다. B16M-CM은 또한, 시험관내에서 HSE 세포에 의한 IL-1β와 TNF-α생산을 유도한다. 하지만, 종양 전이가 IL-1β와 TNF-α에 의해 실질로 매개되는 지는 명확하게 입증되지 않았다.

본 발명은 B16M-CM이 HSE 세포에 의한 IL-18의 생산을 유도하고 IL-18이 HSE 세포에 대한 B16M 세포의 유착 증가에 기여하는 사이토킨이라는 것을 보여준다. IL-18은 TNF-α또는 IL-1β의 관여없이 HSE 세포에서 VCAM-1 발현을 활성화시킴으로써 유착을 강화한다. 특정 카스파제-1 저해물질(10μM, 18시간)과 함께 HSE 세포를 배양하면 TNF-α생산은 감소되지 않으면서 B16M-CM-유도된 유착이 완전히 중단되고, 이의 효과는 생쥐 IL-1β첨가로 반전되지 않는다. HSE 세포에 대한 안티-뮤린 IL-18 항체의 첨가는 IL-1β와 TNF-α의 B16M-CM-유도를 간섭하지 않으면서 B16M-CM-유도된 유착을 예방한다. 유사하게, 최근에 클론된 IL-18 결합단백질(IL-18BP) 또한 시험관내에서 HSE 세포에 대한 B16M의 B16M-CM-유도된 유착을 예방한다. p55 가용성 TNF-수용체 또는 IL-1 수용체 길항물질과 같은 TNF-α또는 IL-1β의 저해물질은 이런 IL-18-유도된 유착을 반전시킬 수 없다. 따라서, 본 발명은 종양 전이를 저해하기 위한 도구로서 IL-18 생산과 작용의 저해물질을 제공한다. IL-18 생산의 저해물질에는 카스파제-1의 저해물질이 포함된다. IL-18 작용의 저해물질은 IL-18에 대한 항체, 공지된 2개의 IL-18 수용체 하부유니트중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 시그널링 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18에 결합하여 이의 생물활성을 차단하는 IL-18 결합단백질에서 선택된다.

본 발명은 VCAM-1 발현의 친염증성 사이토킨-매개된 상향조절, 다른 사이토킨과 이의 상호작용, 이런 VCAM-1 유도를 예방하는 방법에서 IL-18의 가능 역할에 관한다. 본 발명에서 IL-18은 간 시누소이드 벽에서 VCAM-1 상향조절을 결과하는 친염증성 현상의 개시에 작동하고, 이에 따라 암세포 유착 및 전이를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. B16M-CM으로 처리된 일차배양 생쥐 HSE 세포는 VCAM-1-의존 기전으로, HSE에 대한 B16M 세포 유착의 기전에서 B16M 세포-유도된 IL-18의 역할을 탐구하기 위한 암세포-의존한 내피세포 활성화 모델로 이용한다. IL-18의 구체적인 역할은 IL-1Ra, 성숙 IL-1β를 이용한 특이적인 IL-1 수용체-차단, 비가역적 IL-1 전환효소 저해물질(ICEi)을 이용한 IL-18 분비 저해, p55 TNF-가용성 수용체(TNF-sR p55)를 이용한 TNF-차단, 안티-IL-18 항체와 IL-18 결합단백질을 이용한 IL-18 기능 차단의 조건하에 검사한다. 이에 더하여, B16M 세포는 ICE^-/-와 IL-1β^-/- 생쥐의 비강내에 주사한다. 정상 대조군과 비하여 결함 생쥐에서 관찰되는 낮은 전이밀도는 염증의 친전이적 역할에서 IL-1β및 IL-18의 관여를 암시한다(표1).

실시된 시험관내 실험은 IL-18 생산이 B16M 세포로부터 유래된 상층액에 의해 유도된 HSE 유착-촉진 효과의 원인이 된다는 것을 보여준다. VCAM-1 상향조절이 B16M-CM-처리된 HSE의 모든 유착-촉진 활성의 원인이 된다는 점에서, 상기 데이 터는 IL-18이 사이토킨-유도된 HSE로부터 VCAM-1의 발현을 매개한다는 것을 시사한다. 또한, IL-18에 대한 항체는 HSE 세포로부터 TNF-α와 IL-1β의 생산에 영향을 주지 않으면서 B16M-CM-저해된 세포 유착을 감소시킨다. 따라서, HSE 세포에서 IL-1β와 TNF-α생산은 IL-18과 무관하고, 유착에 기여하지 않는다. 반대로, TNF-sR p55와 IL-1Ra는 IL-18-처리된 HSE 세포에서 유착 증가를 저해할 수 없는데, 이는 자가분비 TNF-α와 IL-1β가 IL-18-유도된 HSE 유착의 원인이 아니라는 것을 입증한다.

HSE 세포에서 이런 결과는 다른 세포계, 예를 들면 비-CD14⁺ 사람 혈액 단핵구 세포(25)에서 얻어진 결과와 대조적인데, 여기서 IL-18은 TNF-α생산을 통하여 IL-1β를 유도하였다. HSE-특이적인 친염증성 사이토킨 계층이 존재할 가능성이 높은데, 여기서 TNF-α와 IL-1β는 IL-18 대조군과 독립적으로 존재하지만 IL-18을 VCAM-1 상향조절의 하류 조절물질로 이용한다.

뮤린 HSE 세포와 달리, B16M 세포는 RT-PCR 검사에서 IL-유전자를 발현하지 않고, 18시간동안 ICEi와 함께 배양하여도 HSE 세포에서 B16M-CM의 사이토킨-과 유착-촉진 활성이 소멸되지 않는다. 하지만, IL-18의 국소적 생산은 간 미세혈관에서 이동 또는 정지동안 B16M 세포 행동에 영향을 줄 수 있다. 이에 더하여, 6시간동안 1ng/㎖ 뮤린 IL-18과 B16M 세포를 함께 배양하면 처리되지 않은 HSE에 대한 유착은 2배 증가하고, HSE에 안티-VCAM-1 항체를 첨가하면 IL-18-매개된 유착이 80% 감소하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 VCAM-1/VLA-4 상호작용이 관여함을 암시한 다. 유사하게, B16M-CM-처리된 HSE의 상층액을 6시간동안 흡수한 B16M 세포는 VCAM-1-의존한 기전으로 HSE에 대한 이들의 유착을 2배로 증가시키고(P<0.01), 안티-IL-18 항체는 이런 유착-촉진 효과를 제거한다.

본 발명에 따른 이 발견은 IL-18이 친염증성 사이토킨의 간 방출과 전이 현상간의 새로운 연결고리임을 암시한다. 종양-활성화된 HSE 세포로부터 이의 생산은 HSE 세포에 대한 흑색종 세포 유착의 조절에 관여하는 2가지 상보적 기전: HSE에서 자가분비 기전(이는 TNF-α/IL-1β-매개된 VCAM-1 상향조절을 조정한다) 및 B16M 세포에서 측분비 기전(이는 흑색종 세포 VLA-4를 상향조절하여 이들의 VCAM-1-의존한 유착 능력을 강화시킨다)을 결정한다. 양 세포유착상대의 이런 동시적 분자상향조절로 인해, 암-미세혈관내피세포 상호작용 경로는 더욱 높은 평가를 받고 있다.

B16M 세포의 IL-18-유도된 유착은 IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질에 의해 중단된다. IL-18 생산의 저해물질에는 카스파제-1의 저해물질이 포함된다. IL-18 작용의 저해물질은 IL-18에 대한 항체, 공지된 2개의 IL-18 수용체 하부유니트중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 시그널링 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18에 결합하여 이의 생물활성을 차단하는 IL-18 결합단백질에서 선택된다.

IL-18 생산 및/또는 작용 저해물질의 직접적인 활용이외에, 본 발명은 또한, IL-18 생산 및/또는 작용 저해 효과가 요구되는 세포에 도입을 검토한다. 이를 위해, 예로써 IL-18BP를 인코드하는 DNA를 세포에 특이적으로 도입하는 시스템이 필 요하다. 이를 실시하는데 있어 몇가지 방법이 당분야에 공지되어 있다. 가령, 상기 DNA를 보유하는 적절한 벡터를 세포에 도입할 수 있는데, 상기 벡터는 DNA를 세포에 도입하고 이 세포에서 상기 DNA가 발현되도록 한다. 세포로의 전달 방법은 미국 특허 5,910,487, WO99/29349등에 기술되어 있다.

IL-18 생산 및/또는 작용의 저해를 위한 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 카스파제-1 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 하부유니트중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 수용체 시그널링 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 길항물질, IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질, 기능 유도체, 활성 분취물 또는 동일한 활성을 갖는 순환적으로 치환된 유도체에서 선택되는 저해물질을 활성 성분으로 함유하는 조성물이다.

본원에서 뮤테인, 융합단백질, 기능 유도체, 활성 분취물, 순환적으로 치환된 유도체는 WO99/09603에서와 동일한 의미를 갖는다.

IL-18 및 IL-18BP에 대한 항체는 제약학적 조성물의 바람직한 활성성분이다.

또한, 제약학적 조성물은 사용 방법, 즉 주사, 경구 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 방법에 따라 통상적인 담체, 부형제 및 당분야에 공지된 다른 성분을 함유할 수 있다.

특정 약량은 사용 방법, 환자의 체중 및 다른 요인에 따라 달라지는데, 모든 경우에 임상의가 결정하게 된다.

본 발명은 상세한 설명 및 다음의 실시예를 참고하면 좀더 용이하게 이해할 수 있지만, 이들은 본 발명을 한정하지 않는다.

시약:

쥐 안티-생쥐 IgG와 쥐 안티-생쥐 VCAM-1 단클론항체는 Serotec Ltd(Oxford, England)에서 구하였다. 재조합 뮤린 IL-1β는 R&D System Inc.(Minneapolis, MN)에서 구하였다. 재조합 사람 IL-1 수용체 길항물질(IL-1Ra)은 The Upjohn Co.,Kalamazoo, MI로부터 기증받았고, 사람 p55 TNF 가용성 수용체(TNFsR p55)는 Serono Inc., Norwell, MA로부터 기증받았다. IL-1β전환효소 저해물질(ICEi)은 Alexis Co.(San Diego, CA)로부터 구하였다. 재조합 뮤린 IL-18과 토끼 안티-생쥐 IL-18 다클론항체 IgG는 PeproTech EC Ltd.(London, UK)로부터 구매하였다. IL-18 결합단백질(IL-8BP)은 전술한 바와 같이 만들었다(28).

B16M 세포의 배양:

B16M 세포는 전술한 바와 같이 배양하고, 유지하고, 계대배양한다(11). B16M 조건 배지(B16M-CM)는 다음과 같이 준비한다: 5x10⁵ 세포는 25㎠ T-플라스크에 도말하고 24시간동안 배양한다. 이후, 5㎖ 무-혈청 배지(6x10⁴ 세포/㎠의 최종 세포 밀도)에서 24시간동안 추가로 배양한다. 상층액은 수거하고, 새로운 무-혈청 배지에서 3:1로 희석하고, 0.22

m 필터를 통과시킨다.

사이토킨 분석:

일차배양된 HSE 세포와 B16M 세포로부터 사이토킨의 방출은 제조업자(R&D Sysyems Minepolis, MN)의 지시에 따라, 안티-생쥐 IL-1β와 TNF-α단클론항체에 기초한 특정 ELISA 키트를 이용하여 측정한다.

실시예 1: 일차 HSE 배양액에 대한 정량적인 B16M 세포 유착.

HSE는 동계 생쥐로부터 분리하고, 동정하고, 전술한 바와 같이 배양한다(26). B16M 세포는 2',7'-비스-(2-카르복시에틸)-5,6-카르복시플루레신-아세톡시메틸에스테르 용액(BCECF-AM, Molecular Probe, Eugene, OR)으로 라벨한다(16). 이후, 2x10⁵ 세포/웰은 24-웰-평판 배양된 HSE에 첨가하고, 8분후 웰은 새로운 배지로 3회 세척한다. 유착된 세포의 개수는 전술한 형광 측정 시스템에 기초한 정량 방법으로 측정한다(16). 일부 실험에서, HSE 세포는 B16M 세포의 첨가에 앞서 수시간동안 B16M-CM으로 사전-배양한다.

실시예 2: 간 전이 분석.

야생형, IL-1β^-/-와 ICE^-/- 수컷 C57BL/6J 생쥐는 전술한 바와 같이 만든다(27). 우리당 5마리씩 키운 6 내지 8주된 생쥐를 사용한다. 간 전이는 0.1㎖ 한크 균형 염 용액에 부유시킨 3x10⁵ 생존 B16 흑색종 세포를 마취된 생쥐의 비강내에 주사하여 발생시킨다. 생쥐는 암세포 주사이후 10일째 마취하에 죽인다. 간 조직은 조직검사를 위해 처리한다. 디지털 현미경 영상의 사진농도 분석은 정상 간 조직과 전이성 B16M을 구분하는데 사용하고, 간 100㎣당 전이 개수(간(liver)당 15개의 10x10㎟ 섹션에서 검출되는 병소의 평균값에 기초)인 간 전이 밀도는 전술한 입체형태학적 과정으로 계산한다(17).

실시예 3: IL-1β와 ICE 결핍된 생쥐에 주사된 B16M 세포의 감소된 전이와 성장.

1년 간격으로 실시된 2번의 개별 실험에서, 성숙한 C57BL/6J 야생형, IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐의 비강내에 주사된 동일 B16 세포의 2가지 상이한 배치(batch)를 사용한다. 시체 해부 검사에서, 비장의 중량 크기에서 현저한 차이없이 분석된 모든 생쥐의 비장에서 흑색종 종양이 가시적으로 나타났다(표1). 대조적으로, 야생형 생쥐 간에 비하여 IL-1β^-/-와 특히 ICE^-/- 생쥐 간에서 전이의 현저한 감소가 일어난다(도1). 조사된 생쥐 간에서 전이 밀도(병소개수/100㎣)와 체적(장기 점유 퍼센트) 변수를 측정하기 위하여 전이성 병소의 개수와 크기에 대한 정량적 조직분석을 실시한다. 야생형 생쥐(표1)에 비하여, IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐 간에서 간 전이 밀도가 84% 내지 90% 감소하는데(P<0.01), 이는 주사된 B16M 세포 대부분이 이들 생쥐의 간 조직에 이식되지 않는다는 것을 시사한다. 이에 더하여, 전이 체적 또한 야생형 생쥐 간의 수치에 비하여 IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐 간에서 6 내지 7배 감소하는데(P<0.01), 이는 간에서 전이증식하는데 성공한 B16M 세포가 감소된 성장속도를 갖는다는 것을 시사한다. 또한, IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐 간사이에서 이들 전이 변수의 차이가 관찰되고, 이는 실험 I의 거의 모든 ICE^-/- 생쥐 간에서 전이 중단을 결과한다.

IL-1β^-/-와 ICE^-/- 생쥐의 비강내에 주사된 B16M 세포의 실험적 간 전이증식에서 정량적 조직분석

생쥐군	전이 밀도(병소개수/100㎣)	전이체적(간 체적 %)
실험군 I
야생형 생쥐(66.18%)	234.16 ±58.36
IL-1β-/-생쥐(10.05%)	25.18 ±21.02*
ICE-/-생쥐	13.56 ±16.20*	2.1%
실험군 II
야생형 생쥐(59.62%)	198.40 ±100.54
IL-1β-/-생쥐(9.70%)	33.79 ±19.89*
ICE-/-생쥐(8.08%)	27.73 ±15.68*

데이터는 2번의 개별 실험의 평균값 ±SD를 나타낸다(실험군당 7 내지 15마리를 사용한다).

*변이 분석(ANOVA) 및 Scheffe F-검증에서 야생형 생쥐에 비하여 통계학적으로 유의성이 있는 차이(양쪽, P<0.01)를 표시한다.

실시예 4: 자가분비 IL-18은 B16M-CM-활성화된 HSE로부터 TNF-α와 IL-18-유도된 유착을 매개한다.

B16M-CM은 시험관내에서 HSE 세포의 TNF-α와 IL-1β생산 및 다른 B16M 세포에 대한 이들의 유착을 현저하게 증가시킨다(P<0.01). HSE를 10μM ICEi와 함께 18시간동안 배양하면, HSE로부터 TNF-α생산은 감소되지 않으면서 B16M-CM-유도된 유착이 완전히 중단된다. 외인적으로 첨가된 뮤린 IL-1β는 HSE에 대한 ICEi의 차단 효과를 보상하지 못하는데, 이는 IL-1β-처리된 대조군 HSE에서 B16M 세포의 현 저한 유착 증가와 대조된다(도3). 증가된 농도의 내인적으로 생산된 TNF-α와 외인적으로 첨가된 IL-1β의 존재하에 B16M-CM-유도된 유착 강화가 소멸된다는 것은 이들 사이토킨중 어느 것도 HSE 유착을 직접적으로 상향조절하지 않는다는 것을 시사한다. 특히, B16M-CM 자극에 앞서 HSE에 첨가된 안티-뮤린 IL-18 항체의 존재는 HSE로부터 IL-1β와 TNF-α생산에 영향을 주지 않으면서 B16M-CM-유도된 유착을 예방한다(도2). 이에 더하여, 안티-IL-18 항체는 HSE에 대한 뮤린 IL-1β와 TNF-α의 유착-자극 효과를 예방하는데(도3), 이는 HSE에 대한 이들 사이토킨의 친유착성 작용이 IL-18에 의해 매개된다는 것을 시사한다. RT-PCR에서 HSE 세포가 IL-18 유전자를 발현하는 것으로 입증되었다(데이터 제시하지 않음). 반대로, 뮤린 IL-18은 HSE에 대한 B16M 세포 유착을 현저하게 증가시키는 반면(P<0.01)(도4) TNF-sR p55와 IL-1Ra 모두 이를 저해하지 못하는데, 이는 자가분비 TNF-α와 IL-1β가 IL-18-유도된 HSE 유착의 원인이 아니라는 것을 입증한다. 하지만, 도4에 도시한 바와 같이 안티-VCAM-1 항체는 IL-18-처리된 HSE에 대한 B16M 세포의 유착을 완전히 저해한다. 대조군 비-특이적 IgG는 IL-18-처리된 HSE에 대한 B16M 세포 유착의 상향조절에 영향을 주지 않는다.

실시예 5: IL-18BP는 B16-조건 배지에 의해 유도된 B16 흑색종 세포의 유착을 예방한다.

표2에 도시한 바와 같이, B16-CM으로 자극한 HSE에 대한 IL-18BP의 첨가는 유착된 세포의 퍼센트를 35% 내지 8.50% 감소시킨다(P<0.01). 유착 수준이 기저 배지를 이용하여 유착된 세포의 수준보다 낮다는 점에서, 이는 100% 저해를 의미한 다. 이 결과는 HSE로부터 내인적 IL-18이 B16M-CM에 존재하는 것이외에, IL-18의 내인적 공급원이 된다는 것을 암시한다.

간 시누소이드 내피세포에 대한 B16 흑색종 세포의 B16-조건 배지 유착에 대한 IL-18BP의 저해 효과

	흑색종 세포 유착 %
기저 배지	10.15 ±1.5
B16-CM	35.10 ±4.4
B16-CM/IL-18BP(1ng/㎖)	15.00 ±2.5**
B16-CM/IL-18BP(10ng/㎖)	8.70 ±1.1**

데이터는 6회씩 실시된 2번의 개별 실험의 평균값 ±SD를 나타낸다(N=12).

**변이 분석(ANOVA) 및 Scheffe F-검증에서 B16-CM에 비하여 통계학적으로 유의성이 있는 차이(양쪽, P<0.01)를 표시한다.

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6. IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 서브유닛에 대한 항체, IL-18 결합 단백질 또는 카스파제-1 저해물질을 활성 성분으로 구성하는 종양 전이 저해용 약학 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, IL-18에 대한 항체로 구성된 약학 조성물.
8. 제 6항에 있어서, 카스파제-1 저해물질로 구성된 약학 조성물.
9. 제 6항에 있어서, IL-18 결합 단백질로 구성된 약학 조성물.

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