CZ302114B6

CZ302114B6 - Farmaceutický prostredek pro inhibici produkce IL-18

Info

Publication number: CZ302114B6
Application number: CZ20020195A
Authority: CZ
Inventors: Dinarello@Charles
Original assignee: Ares Trading S.A.
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2010-10-20
Also published as: TR200200169T2; DE60035049T2; IL131047A0; IL147675A; US7741276B2; KR20020027493A; MXPA02000838A; WO2001007480A3; DE60035049D1; CY1107932T1; JP4827352B2; EA005419B1; UA73745C2; PL202477B1; CA2380216A1; BRPI0012675B8; EP1206274A2; HU228780B1; PL353732A1; HUP0202107A3

Abstract

Použití inhibitoru produkce a/nebo pusobení IL-18 pri výrobe farmaceutických prostredku pro inhibici tvorby tumorových metastáz melanomu. Rešení se zvlášte týká prevence tvorby tumorových metastáz melanomu inhibicí produkce a/nebo pusobení interleukinu-18 (IL-18). Inhibitory IL-18 jsou zvoleny z protilátek proti podjednotkám receptoru IL-18, antagonistu IL-18, kterí souteží s IL-18 a vazebných proteinu IL-18.

Description

Farmaceutický prostředek pro inhibici produkce IL-18

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká tvorby tumorových metastáz melanomu a způsobů jejich inhibice. Vynález se zvláště týká prevence tvorby tumorových metastáz melanomu inhibici produkce a/nebo působení interleukinu-18 (IL-18). Inhibitory IL-18 jsou zvoleny z protilátek proti podjednotkám receptoru IL-18, antagonistů IL-18, kteří soutěží s IL-18 a vazebných proteinů ILio 18.

Dosavadní stav techniky ts Adheze cirkulujících rakovinných buněk k endotheliu kapilár je kritický krok při tvorbě metastáz (Kohn, E. C., a Liotta, L. A. (1995) Cancer Res., 55 (9), 1856 - 62; Nicolson, G. L., a Winkelhake, JL L. (1975) Nátuře, 255, 230- 232). Adhezi hematopoetických buněk a aktivovaných leukocytů k prozánětlivým endotheliálním buňkám aktivovaným cytokiny zprostředkuje molekula 1 adheze k cévním buňkám (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) (Freedman,

A. Munro, M., Rice, G. E., Bevilacqua, Μ. P., Morimoto, C., Mclntyre, B. W., Rhynhart, K., Pober, J. S., a Nadler, L. M. (1990) Science, 249, 1030- 1033; Miyake, M., Fuchimoto, S., Iwagaki, H., Matsubara, N,, Edamatsu, R., Hiramatsu, M., a Orita, K. (1991) Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 71, 293- 307; Simmons, P. I, Mašino vsky, B., Longenecker, Β. M., Berenson, R., Torok-Storb, B., a Gallatin, W. M. (1992) Blood, 80 (2), 388- 95). Živočišné a lidské rakovinné buňky však musí použít adhezní funkce VCAM-1, aby došlo k zesílení experimentálního šíření metastáz (Rice, G. E., a Bevilacqua, Μ. P. (1989), Science, 246,1303 - 1306).

Například je známo, že IL-Ιβ a TNF-α zesilují tvorbu metastáz melanomových buněk exprimujících VLA-4 v plicní tkáni mechanismem, který zahrnuje řízení ve smyslu zesílení exprese

VCAM-1 endotheliálními buňkami (Okahara, H., Yagita, H., Miyake, K., a Okumura, K. (1994) Cancer Res., 54, 3233 - 3236; Garofalo, A., Chirivi, R. G. S., Foglieni, C., Pigot, R., Mortarini, R., Martin-Padura, I., Anichini, A., Gearing, A. 1, Sanchez-Madrid, F., Dejana, E., a Giavazzi, R. (1995) Cancer Res., 55, 414 - 419; Martin-Padura, I., Mortarini, R., Lauri, D:, Bemasconi, S., Sanchez-Madrid, F., Parmiani, G., Mantovani, A., Anichini, A., a Dejana, E. (1991), Cancer

Res., 51, 2239 - 2241). Bylo také ukázáno, že IL-1 a TNF-β podstatným způsobem přispívají ke kolonizaci jater buňkami B16M jak u normálních myší, tak i u myší, kterým byly podány lipopolysacharidy (Okahara, H., Yagita, H., Miyake, K., a Okumura, K. (1994) Cancer Res., 54, 3233 - 3236; Garofalo, A., Chirivi, R. G. S., Foglieni, C., Pigot, R., Mortarini, R., MartinPadurea, I., Anichini, A., Gearing, A. J., Sanchez-Madrid, F., Dejana, E., a Giavazzi, R. (1995)

Cancer Res., 55, 414 - 419; Lauri, D., Bertomeu, M.-C., a Orr, F. W. (1990) Clin. Exp. Metastasis, 8, 27 - 32; Anasagasti, M. J., Alvarez, A., Martin, J. J., Mendoza, L., a VidalVanaclocha, F. (1997), Hepatology, 25, 840 - 846; Bani, M. R., Garofalo, A:, Scanziani, E., a Giavazzi, R. (1991) J. Nati. Cancer Inst., 83, 119- 123; Betomeu, M. C., Gallo, S., Lauri, D., Haas, T. A., Orr, F. W., Bastida, E., a Buchanan, M. R. (1993) Clin. Exp. Metastasis, 11, 243 45 250; Burrows, F. J., Haskard, D. O., Hart, I. R., Marshall, J. F., Selkirk, S., Pool, S., a Thorpe, P.

E. (1991) Cancer Res., 51, 4768 - 4775; Chirivi, R. G. S., Garofalo, A., Padura, I. M., Mantovani, A., a Giavazzi, R. (1993) Cancer Res., 53, 5051 - 5054; Vidal-Vanaclocha, F., Amezaga, C., Asumendi, A., Kaplanski, G., a Dinarello, C. A. (1994) Cancer Res., 54, 2667 2672; Vidal-Vanaclocha, F., Alvarez, A., Asumendi, A., Urcelay, B., Tonino, P., a Dinarello, C.

A. (1996) J. Natí Cancer Inst., 88, 198 - 205; Malik, S. T, Naylor, M. S, East, N, Oliff, A., a Balkwíll, F. R. (1990) Eur. J. Cancer, 26, 1031 - 1034; Orosz, P., Echtenacher, B., Falk, W., Ruschoff, I, Weber, D., a Mannel, D.N. (1993) J. Exp. Med, 177, 1391 - 1398; Orosz, P., Kriiger, A., Hubbe, M., Ruschoff, J., Von Hoegen, P., a Mannel, D. N. (1995) Int. J. Cancer, 60, 867 - 871). Navíc zahrnuje aktivace buněk endothelia jatemích sinusoidů (hepatic sinusoidal epithelium, HSE) zprostředkovaná mannosovým receptorem autokriímí, ΙΕ-Ιβ-zprostředkova-1 CZ 302114 B6 nou expresi VCAM-1 buňkami HSE, která vede ke zvýšení adheze buněk B16M a tvorbě metastáz (Mendoza, L„ Olaso, E., Anasagasti, M.J., Fuentes, A., a Vidal-Vanaclocha, F. (1998) J. Celí Physiol, 174, 322- 330). Bylo také ukázáno, že buňky HSE aktivované IL—1 β uvolňují faktory stimulující VLA—4, které zesilují adhezi buněk B16M k buňkám HSE (Anasagasti, M. J., Alvarez, A., Matín, J.J., Mendoza, L., a Vidal-Vanaclocha, F. (1997) Hepaiology, 25, 840846). IL—l β tedy indukuje expresi VCAM-1 a uvolňování faktoru stimulujícího VLA-4 z buněk HSE, což jím může propůjčit schopnost vytvořit prometastatické mikroprostředí pro některé rakovinné buňky exprimuj ící VLA-^4, zadržené v jatém ích sinusoidech.

Blokování IL-Ιβ a TNF-α však vedlo pouze k částečnému odstranění tvorby metastáz, což naznačuje, že procesu se účastní také další faktory, které buď kompenzují nepřítomnost výše uvedených faktorů, nebo působí alternativními biochemickými cestami. Navíc je známo, že většina rakovinných buněk tvořících metastázy a cílových buněk není schopna tvořit tyto prozánětlivé cytokiny. Koncentrace ligandu receptoru pro endotoxin nebo mannózu navíc obvykle nevede k dostatečnému zvýšení pro indukci uvolňování prozánětlivých cytokinů. Je tedy zřejmé, že nejsou dobře charakterizovány četné další mediátory, které vyvolávají regulaci nahoru (upregulation) VCAM-1, ani jejich účast v průběhu kapilárního přenosu rakovinných buněk.

IL-18 (faktor indukující lFN-γ) je nový cytokin, který sdílí strukturní vlastnosti se skupinou proteinů IL-1 (Bazan, J. F., Timans, J, C., a Kastelein, R. A. (1996) Nátuře, 379 (6566) 591) a funkční vlastnosti s IL—12 (Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Táni moto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Nam ba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., a Kurimoto, M. (1995) Nátuře, 378, 88 - 91). Uvádí se, že produkce 1L~ 18 Kupfferovými buňkami aktivuje hepatotoxické biochemické cesty podmíněné jak ligandem TNF-a, tak i FAS, při poškození jater indukovaném endotoxiny (Tsutsui, H„ Matsui, K., Kawada, N„ Hyodo, Y., Hayashi, N., Okamura, H., Higashino, K., a Nakanishi, K. (1997) J. Immunol, 159 (8), 3961 - 7). Nedávno bylo odhaleno, že 1L-18 má také prozánětlivé vlastnosti způsobené přímou stimulací exprese genu a syntézy TNF-α buňkami CD3⁺/CD4⁺ a buňkami přirozenými zabíječi, s následnou produkcí IL—Iβ a IL-8 populací buněk CD14⁺, čímž byla ukázána neočekávaná klíčová úloha 1L-I8 v hierarchii cytokinů (Puren, A. J., Fantuzzi, G., Gu, Y., Su, M. S.-S., a Dinarello, C. A. (1998) J. Clin. Invest., 101, 711 - 724). Jeho možná úloha při tvorbě rakovinných metastáz však dosud nebyla objasněna.

Protein vázající se na interleukin-18 (interleukin-18 binding protein, IL-18BP) byl vyčištěn zmoci chromatografií na kuličkách s navázaným IL-18, sekvenován, klonován a exprimován v buňkách COS7. IL-18BP zrušil indukci interferonu-γ (IFN-γ), IL—8 a aktivaci NF-κΒ in vitro prostřednictvím IL—18. Podávání IL-18BP myším odstranilo cirkulující IFN-γ po podání LPS. IL-18BP tedy funguje jako inhibitor časné cytokinové odpovědi Thl. IL-I8BP je konstitutivně exprimován ve slezině, patří do širší skupiny imunoglobulinů a má omezenou homologii s IL-1 receptorem typu II. Jeho gen byl lokalizován na lidském chromosomu 11 q 13 a v genomové sekvenci 8,3 kb nebyl nalezen žádný exon kódující transmembránovou doménu. Několik poxvirů kóduje domnělé proteiny s vysokou homologii kIL-l8BP, což ukazuje, že virové produkty mohou oslabit IL-18 a interferovat s cytotoxickou odpovědí T-buněk (Novick, D., Kim, S.-H., Fantuzzi, G., Reznikov, L. L., Charles A., Dinarello, C. A., a Rubinstein, M. (1999) Immunity, 10, 127 - 136; a WO 99/09063). Jak se popisuje zvláště ve WO 99/09063, IL-18BP a muteiny, fúzované proteiny, funkční deriváty, aktivní frakce nebo cirku lamě permutované deriváty a jejich směsi jsou schopny vázat se na IL-18 a/nebo jsou schopny modulovat aktivitu IL-18 a/nebo jsou schopny blokovat aktivitu IL-18.

WO98/41232 popisuje farmaceutické prostředky, které obsahují antagonistu IL-18 pro modulaci odpovědí na kortikosteroidy.

EP 0 850 952 popisuje použití protilátky proti receptoru IL—18 pro inhibici aktivity IL-18.

-2 CZ 302114 B6

V Immunity Letters 68“ 135-139 se analyzuje korelace mezi intratumorovou expresí IFN-gama a klinickým výsledkem u pacientů postižených karcinomem děložního čípku nebo kolorektálním karcinomem. Popisuje se, že nedostatečná exprese IFN-gama koreluje s existencí vzdálených metastáz a špatnou prognózou.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje použití inhibitorů produkce a/nebo působení IL-18 pří výrobě io farmaceutických prostředků pro inhibici tumorových metastáz melanomu. Inhibitory produkce

IL—18 jsou například inhibitory kaspázy-1.

Inhibitory působení IL—18 se volí z protilátek proti IL—18, protilátek proti jakékoli z podjednotek receptoru IL—18, antagonistú IL-18, kteří soutěží s IL-18 a blokují receptor IL—18 a vazebných proteinů, muteinů, fúzovaných proteinů, funkčních derivátů, aktivních frakcí nebo cirkulárně permutovaných derivátů IL-18, které mají stejnou aktivitu jako IL-18BP.

Používají se s výhodou inhibitory jako vazebné proteiny IL-18, nebo jejich mutein, fúzovaný protein, funkční derivát, aktivní frakce nebo cirkulárně permutovaný derivát, které mají stejnou aktivitu jako IL-18 BP.

Farmaceutické prostředky pro inhibici produkce a/nebo působení IL-18 pro inhibici tumorových metastáz melanomu jsou předkládaným vynálezem poskytovány také.

Další způsob inhibice produkce a/nebo působení IL—18, s cílem inhibovat tvorbu tumorových metastáz, je zavedení expresního vektoru obsahujícího kódující sekvenci pro inhibitor produkce a/nebo působení IL-18, jakoje IL-18BP, do těla.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Experimentální kolonizace jater po intrasplenické injekci buněk B16M myším standardního typu, IL-Ιβ“'^- a ICE“\ Játra byla odstraněna desátý den po injekci buněk B16M a fixována ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem s 10% formaldehydem. Téměř všechny experi35 mentální metastázy (černé melanotické uzliny) byly z jater myší IL—1 β^_/~ a ICE^- odstraněny.

Obr. 2. Vliv ireverzibilního inhibitoru ICE a protilátky proti myšímu IL-18 na adhezi buněk B16M k buňkám HSE, a produkci IL—1 β a TNF-α neošetřenými buňkami a buňkami HSE ošetřenými B16M-CM. Kultivované buňky HSE byly inkubovány v přítomnosti B16M-CM 10 h.

V některých experimentech dostaly jak ošetřené buňky HSE, tak i neošetřené buňky 10 μΜ ICEi nebo 10 pg/ml protilátky proti myšímu IL-18 před B16M-CM. Procento buněk B16M, které přilnuly k substrátu HSE, bylo vypočteno jako relativní hodnota vzhledem k počátečnímu počtu přidaných buněk. Navíc byly odebrány před adhezi supematanty z kultur pro stanovení koncentrace IL—1 β a TNF-α metodou ELISA. Údaje znamenají střední hodnotu ±SD ze čtyř oddělených experimentů, přičemž každý se provádí při šesti násobném opakování (n = 24). Zvětšení adheze buněk B16M k buňkám HSE ošetřeným B16M-CM a produkce IL-lb nebo TNF-α vzhledem k neošetreným buňkám HSE (*P < 0,01) bylo statisticky významné podle Studentova nepárového t-testu (Student's two-tailed, unpaired t-test). Nedocházelo k žádným statisticky významným změnám v produkci IL—1 β nebo TNF-α a v adhezi buněk B16M k buňkám HSE, jestliže byly tyto buňky ošetřeny ICEi nebo protilátkou anti-IL-18 v nepřítomnosti B16M-CM (údaje nejsou ukázány).

Obr. 3. Vliv ICEi na adhezi buněk B16M k buňkám HSE ošetřeným B16M-CM in vitro. Buňky HSE byly inkubovány s bazálním médiem nebo B16M-CM 8 h. Některé buňky HSE

- j CZ 302114 B6 dostávaly 10 μΜ ICEi 18 h před BI6M-CM. Navíc byl k některým buňkám HSE přidáván v koncentraci I ng/ml rekombinantní myší IL-Ιβ spolu sBI6M-CM po dobu 8 h. V dalších experimentech bylo k buňkám HSE přidáváno 1 ng/ml myšího IL-Ιβ nebo 100 pg/ml TNF-a 6 h, a bylo nebo nebylo přidáváno 10 pg/ml králičí polyklonální protilátky proti myšímu IL-18 1 h před působením cytokinů. K neošetřeným buňkám HSE a buňkám ošetřeným cytokiny byla také přidávána nespecifická IgG polyklonální protilátka. Potom byly buňky HSE promyty a byly přidány buňky B16M značené BCEFCF-AM a buňky byly o 8 min později opět promyty. Procento buněk B16M, které přilnuly k substrátu HSE, bylo vypočteno jako relativní hodnota vzhledem k počátečnímu počtu přidaných buněk. Výsledky vyjadřují střední hodnotu ±SD tří oddělených experimentů, přičemž každý byl prováděn v šestinásobném opakování (η = 18). Rozdíly ve stupni adheze vzhledem k neošetřeným buňkám HSE (*) a buňkám HSE (**) ošetřeným IL-Ιβ nebo TNF-α byly statisticky významné (P < 0,01), podle Studentova nepárového ttestu. Nedocházelo ke statisticky významným změnám k adhezi buněk B16M na jiné kontrolní buňky HSE ošetřené ICEi, které navíc dostávaly nebo nedostávaly 1 ng/ml myšího IL-Ιβ po dobu 8 h (data nejsou ukázána).

Obr. 4. In vitro adheze buněk B16M k buňkám HSE ošetřeným IL—18. Buňky HSE byly inkubovány s 1 ng/ml rekombinantního myšího IL—18 6 h. V některých experimentech bylo přidáno 10 pg/ml TNF-sRp55 nebo 100 ng/ml IL-IRa 10 min před přidáním IL—18. V dalších experimentech bylo přidáváno k buňkám HSE 10 pg/ml protilátky anti-VCAM-1 nebo podobná koncentrace nespecifické protilátky proti myšímu IgG 30 min před přidáním buněk B16M. Potom bylo určeno procento adheze buněk B16M, tak, jak se popisuje dále v příkladech. Výsledky reprezentují střední hodnotu ±SD u tří oddělených experimentů, kdy každý se provádí v šestinásobném opakování (n = 18). Rozdíly ve stupni adheze vzhledem k buňkám HSE s bazálním médiem (*) a buňkám HSE ošetřeným IL—18 (**) byly podle Studentova nepárového t-testu statisticky významné (P < 0,01).

Podrobný popis vynálezu

Adhezi rakovinných buněk na endotheliální buňky, která vede k metastatickému šíření tumorů, podporuje několik prozánětlivých cytokinů, včetně interleukinu (IL-Ιβ) a tumorového nekrózního faktoru-alfa (TNF-α). Tyto prozánětlivé cytokiny podporují adhezi a tvorbu metastáz pravděpodobně indukcí molekuly I adheze k cévním buňkám (VCAM-I). Předkládaný vynález ukazuje, že působení kondicionovaného média (CM) z kultur B16 melanomových buněk (B16M), tedy kultur (B16M-CM), podporuje adhezi mezi buňkami B16M a HSE in vitro. B16M-CM také indukuje produkci IL-Ιβ a TNF-α buňkami HSE in vitro. Nebylo však dosud jasně ukázáno, že tvorba tumorových metastáz je skutečně zprostředkována IL—1 β a TNF-a.

Předkládaný vynález ukazuje, že B16M-CM indukuje produkci IL—18 buňkami HSE, a že IL—Ϊ 8 je cytokin přispívající ke zvýšené adhezi buněk B16MM k buňkám HSE. IL-18 zvyšuje adhezi aktivací exprese VCAM-1 v buňkách HSE bez účasti TNF-α nebo IL—1 β. Inkubace buněk HSE se specifickým inhibitorem kaspázy-1 (10 μΜ, 18 h) úplně zastaví adhezivitu indukovanou B16M-CM bez snížení produkce TNF-α, a tento účinek není odvrácen přidáním myšího IL-Ιβ, Přidávání protilátky proti myšímu IL-18 do buněk HSE zabrání adhezivitě indukované BI6MCM, aniž by došlo k interferenci s indukcí IL—1 β a TNF-α prostřednictvím B16M-CM. Podobně také zabraňuje nedávno klonovaný vazebný protein IL-18 (IL-18BP) Β16M-CM-indukovanou adhezivitu buněk B16M na buňky HSE in vitro. Inhibitory TNF-α a IL—Ιβ jako je antagonista p55 rozpustného receptorů TNF nebo receptorů IL-1, nebyly schopny odvrátit tuto adhezi indukovanou IL-18. Předkládaný vynález tedy poskytuje inhibitory produkce a působení IL— 18 jako nástroje pro inhibici tvorby tumorových metastáz melanomu. Inhibitory tvorby IL-18 zahrnují inhibitory kaspázy-1. Inhibitory působení IL-18 se volí ze skupiny protilátek proti IL-18, protilátek zaměřených proti kterékoli ze dvou známých podjednotek receptorů IL-18, antagonistů IL-4 CZ 302114 Β6

18, kteří soutěží s IL-18 a blokují IL-18 a vazebných proteinů IL-18, které se vážou na IL-18 a blokují jeho biologickou aktivitu.

Předkládaný vynález se týká možné úlohy IL-18 v prozánětlivé regulaci směrem ke zvýšení exprese VCAM-1 podmíněné cytokiny, její možné interakce s dalšími cytokiny a prostředků pro prevenci této indukce VCAM-1. Podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že IL-18 funguje při iniciaci prozánětlivých událostí vedoucích k regulaci nahoru VCAM-1 ve stěně jatém ich sinusoidů, Čímž je umožněna adheze rakovinných buněk a tvorba metastáz. Jako model aktivace endotheliálních buněk závislé na rakovinných buňkách byly použity primárně kultivované myší buňky HSE ošetřené B16M-CM s cílem vyšetřit úlohu IL-18 indukovaného buňkami B16M na mechanismus adheze buněk B16M na buňky HSE mechanismem závisejícím na VCAM-1. Specifická úloha IL-18 byla vyšetřována za podmínek specifické blokády receptoru IL-1 použitím IL-ÍRa, zralého IL—1 β a inhibice sekrece IL-18 použitím ireverzibilního enzymového inhibitoru konvertujícího IL-1 (irreversible IL-1 converting enzyme inhibitor, ICEi), blokování TNF použitím rozpustného receptoru p55 TNF (TNF-sR p55) a blokování funkce IL-18 použitím protilátek proti IL-18 a vazebného proteinu IL-18. Navíc byly buňky B16M vstríknuty do sleziny myší 1CE a IL—1 β “- Nižší hustota metastáz pozorovaná u deficientních myší ve srovnání s normálními kontrolami ukazuje na účast IL-1 β a pravděpodobně IL—18 v prometastatické úloze zánětu (tabulka 1).

Prováděné experimenty in vitro ukazují, že produkce IL-18 je odpovědná za účinky stimulující adhezi na buňky HSE indukované supematanty odvozenými z buněk B16M. Protože regulace ve smyslu zesílení exprese VCAM-1 je odpovědná za veškerou aktivitu stimulující adhezi buněk HSE ošetřených B16M-CM, tyto údaje ukazují, že IL-18 zprostředkuje expresi VCAM-1 buňkami HSE indukovanými cytokiny. Navíc protilátky proti IL-18 snižovaly adhezi buněk inhibovanou B16M-CM bez ovlivnění produkce TNF—a a IL—1 β buňkami HSE. Proto byla produkce 1L— 1 β a TNF-α v buňkách HSE IL-18-independentní a nepřispívala k adhezi. Naopak ani TNFsR p55, ani IL-IRa nebyly schopny inhibovat zvýšení adheze v buňkách HSE ošetřených IL-18, což potvrzuje, že ani autokrinní TNF-<x, ani IL-Ιβ, neodpovídají za adhezivitu HSE indukovanou IL-18.

Výsledky u buněk HSE jsou v kontrastu s výsledky získanými v jiných buněčných systémech, jakojsou například non CD14⁺ mononukleární buňky lidské krve (Puren, A. J., Fantuzzi, G., Gu, Y., Su, M. S.-S., a Dinarello, C. A. (1998)7. Clin. Invest., 101, 711 - 724), kde IL-18 indukoval IL—1 β prostřednictvím produkce TNF-α. Je pravděpodobné, že existuje hierarchie HSE-specifických prozánětlivých cytokinů, ve které TNF-α a IL-1 β jsou nezávislé na řízení IL-18, ale používají IL-18 jako downstream mediátor regulace nahoru VCAM-1.

Na rozdíl od myších buněk HSE neexprimovaly buňky B16M gen IL-18, jak bylo zjištěno, RTPCR, a inkubace s ICEi po dobu 18 h nezastavily aktivity B16M-CM ve smyslu stimulace cytokinů a adheze na buňky HSE. Místní produkce IL-18 však může ovlivnit chování buněk B16M v průběhu jejich přechodu, nebo zachycení v mikrocévách jater. Dále bylo zjištěno, že inkubace buněk B16M a 1 ng/ml myšího IL-18 po dobu 6 h dvojnásobně zvýšila jejich adhezi k neošetřeným buňkám HSE, a navíc snížil přídavek protilátky anti-VCAM-1 k buňkám HSE o 80% adhezi zprostředkovanou IL-18, což ukazuje, že procesu se účastnila interakce VCAMl/VLA-4. Podobně buňky B16M, ke kterým byl přidán supematant z buněk HSE ošetřených B16M-CM na 6 h rovněž statisticky významně (/* < 0,01) dvojnásobně zvýšily svou adhezi k buňkám HSE VCAM-1 -dependentním mechanismem a protilátka anti—IL—18 zrušila tento stimulační účinek na adhezi.

Zjištění podle předkládaného vynálezu ukazují, že IL-18 představuje novou vazbu mezi uvolňováním prozánětlivých cytokinů v játrech a rozvojem metastáz. Jeho produkce buňkami HSE aktivovanými tumorem určuje dva komplementární mechanismy, které se účastní při regulaci adheze melanomových buněk k buňkám HSE: autokrinní mechanismus v buňkách HSE, který řídí TNF-5CZ 302114 B6 α/IL-lβ-zprostředkovanou regulaci nahoru VCAM-l, a parakrinní mechanismus v buňkách

B16M, kde dochází k regulaci nahoru VLA -4 melanomových buněk, což umocňuje jejich adhezní kapacitu závislou na VCAM-L Tato současná molekulární vzestupná regulace obou součástí buněčné adheze způsobuje vysokou účinnost biochemické cesty interakce rakovinných buněk s s endotheliálními buňkami kapilár.

IL-18-indukovaná adheze buněk B16M je zastavena inhibitory produkce a/nebo působení IL-18. Inhibitory produkce IL—18 zahrnují inhibitory kaspázy-1. Inhibitory působení 1L-18jsou zvoleny ze skupiny protilátek zaměřených proti 1L-18, protilátek zaměřených proti jakékoli ze dvou io známých podjednotek receptoru IL-18, antagonistů IL-18, kteří soutěží s IL-18 a blokují receptor pro IL—18, a vazebných proteinů IL—18, které se vážou na IL-18 a blokují jeho biologickou aktivitu.

Navíc k přímému použití inhibitorů produkce a/nebo působení IL-18 předpokládá předkládaný vynález také zavedení do buněk, kde je požadován inhibiČní účinek na produkci a/nebo působení IL—18. K tomuto účelu je nezbytný systém pro specifické zavádění například DNA kódující IL18BP do buněk. V oboru je známo několik možností, jak toho může být dosaženo. Do buněk například může být zaveden vhodný vektor nesoucí výše uvedenou DNA, kde tento vektor je schopný ovlivnit vložení DNA do buněk takovým způsobem, že DNA je v buňkách exprimová20 na. Metody dodávání do buněk se popisují mj. například v patentu US 5 910 487, WO 99/29349 a dalších.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu pro inhibici produkce a/nebo působení 1L-18 jsou prostředky, které obsahují jako účinnou složku inhibitor zvolený z inhibitoru kaspázy-1, protilátky proti IL-18, protilátky proti kterékoli z podjednotek receptoru IL—18, inhibitoru signální biochemické cesty receptoru IL-18, antagonisty, který soutěží s IL—18 a blokuje receptor IL-18 a 1L-18BP, nebo jejich mutein, fúzovaný protein, funkční derivát, účinná frakce nebo cirkulárně permutovaný derivát, které mají stejnou účinnost.

Termíny mutein, fúzovaný protein, funkční derivát, účinná frakce a cirkulárně permutovaný derivát mají stejný význam jako ve WO 99/09063.

Výhodnými účinnými složkami farmaceutických prostředků jsou protilátky proti IL—18 a IL18BP.

Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat běžné nosiče, pomocné látky a další složky známé v boru, v závislosti na způsobu podávání, tj. injekcí, orálně nebo jakýmkoli jiným v oboru známým způsobem.

Konkrétní dávkování bude záviset na způsobu podávání, tělesné hmotnosti pacienta a dalších faktorech a bude je v každém případě určovat ošetřující lékař.

Po popisu vynálezu nyní budou následovat příklady, na kterých může být vynález snadněji pochopen, a které se poskytují pro ilustraci a nemají předkládaný vynález omezovat.

Příklady provedení vynálezu

Reagencie

Krysí protilátka proti myšímu IgG a krysí monoklonální protilátka proti myšímu VCAM-1 byly získány od firmy Serotec Ltd. (Oxford, Anglie). Rekombínantní myší IL—1 β byl získán od firmy R&D System Inc. (Minneapolis, MN). Rekombínantní antagonista lidského receptoru IL-1 (ILIRa) byt laskavý dar firmy The Upjohn Co., Kalamazoo, MI a lidský rozpustný receptor p55

TNF (TNFsR p55) byl laskavý dar firmy Serono lne., Norwell, MA. Inhibitor enzymu konvertu-6CZ 302114 B6 jícího IL-Ιβ (ICEi) byl získán od firmy Alexis Co. (San Diego, CA). Rekombinantní myší IL— 18 a králičí polyklonální protilátka IgG proti myšímu IL—18 byly zakoupeny od firmy PeproTech

EC Ltd. (London, UK). Vazebný protein IL-18 (IL-18BP) byl vyroben jak bylo popsáno v Novick, D., Kim, S.-H., Fantuzii, G., Reznikov, L. L., Charles A., Dinarelío, C, A., a

Rubinstein, M. (1999) Immunity, 10, 127-136.

Kultivace buněk B16M

Buňky B16M byly kultivovány, udržovány a pasážovány jak bylo popsáno v Anasagasti, M. J., io Alvarez, A:, Martin, J, J., Mendoza, L., a Vidal-Vanaclocha, F. (1997) Hepatology, 25, 840846. Médium kondiciované buňkami B16M (B16M-CM) bylo připraveno následujícím způsobem: 5 χ 10⁵ buněk bylo vyseto v 25 cm² T-baňce a kultivováno 24 h. Potom byly buňky kultivovány další 24 h v 5 ml bez sérového média (konečná hustota buněk 6 χ 10⁴ buněk/cm²). Supernatanty byly odděleny, zředěny 3 : 1 v čerstvém bezsérovém médiu a protlačeny filtrem 0,22 pm.

Analýza cytokinů

Uvolňování cytokinů z primárně kultivovaných buněk HSE a buněk B16M bylo měřeno použitím specifických kitů ELISA založených na monoklonálních protilátkách proti myšímu IL-Ιβ a

TNF-α podle doporučení výrobce (R & D, Systems, Minneapolis, MN).

Příklad 1

Kvantitativní adheze buněk B16M k primárním kulturám HSE

Buňky HSE byly separovány ze syngenních myší, identifikovány a kultivovány jak bylo popsáno dříve (Vidal-Vanaclocha, F., Rocha, M., Asumendi, A., a Barbera-Guillem, E. (1993) Hepatology, 18, 328- 339). Buňky B16M byly značeny roztokem 2',7'-bis-(2-karboxyethyl)-5,630 karboxyfluoresceinacetoxy methy lesteru (BCECF-AM, Molecular Probes, Eugen, OR) jak bylo popsáno v Vidal-Vanaclocha, F., Amezaga, C., Asumendi, A., Kaplanski, G., a Dinarelío, C. A. (1994) Cancer Res. 54, 2667 - 2672. Potom bylo 2 χ 10⁵ buněk/jamku přidáno do buněk HSE kultivovaných v 24-jamkové destičce a o 8 min později byly jamky třikrát promyty čerstvým médiem. Počet přichycených buněk byl zjišťován kvantitativní metodou založenou na dříve popsaném fluorescenčním měřicím systému (Vidal-Vanaclocha, F., Amezaga, C., Asumendi, A., Kaplanski, G,, a Dinarelío, C. A. (1994) Cancer Res., 54, 2667 - 2672). V některých experimentech byly buňky HSE před inkubovány s médiem B16M-CM několik hodin před přidáním buněk B16M.

Příklad 2

Test metastáz do jater

Samci myší C57BL/6J standardního typu, IL-Ιβ“⁷“ ICE““ byli získáni jak bylo popsáno výše (Fantuzzi, G., Puren, A. J., Harding, M. W., Livingston, D. J., a Dinarelío, C. A. (1998) Blood, 91,2118 - 2125). Byly použity myši stáří 6 až 8 týdnů umístěné v klecích po pěti. Metastázy do jater byly získány intraslezinnou injekcí anestetizovaným myším (Nembutal, 50 mg/kg intraperitoneálně) 3xl0⁵ živých melanomových buněk B16 suspendovaným v 0,1 ml Hanksova vyváženého solného roztoku. Desátý den po injekci rakovinných buněk byly myši v anestézii usmrceny. Jatemí tkáně byly zpracovány pro histologické vyšetření. Pro rozlišeni metastatických buněk B16M od normální jatemí tkáně a určení hustoty jatém ích metastáz byla použita denzitometrická analýza digitalizovaných mikroskopických obrazů. Hustota jatém ích metastáz je počet metastáz na 100 mm³ jater (založený na středním počtu ohnisek detekovaných v 15 řezech 10 x

10 mm² na játra). Hodnota byla vypočtena pomocí drive popsaných stereo logických postupů

-7CZ 302114 B6 (Vidal-Vanaclocha, F„ Alvarez, A., Asumendi, A., Urcelay, B., Tonino, P., a Dinarello, C. A.

(1996) J. Nati. Cancer ínst., 88, 198 - 205).

s Příklad 3

Snížený počet metastáz a růst buněk Β16M injikovaných do IL—1 β- a ICE-deficientních myší

V odstupu jednoho roku byly provedeny dva nezávislé experimenty s použitím dvou různých io šarží stejných buněk Bl 6M vstříknutých do sleziny dospělých myší C57BL/6J standardního typu,

ICE^_/“ a IL—1 β^_/“. Vyšetření získaných tkání prokázalo viditelné melanotické tumory ve slezině všech hodnocených myší bez významných rozdílů ve velikosti vyhodnocované na základě hmotnosti sleziny (tabulka 1). Naopak v játrech myší ÍL-Ιβ'', a zvláště ICE^_/_ došlo k podstatnému snížení metastáz ve srovnání s játry myší standardního typu (obr. 1). Pro zjištění hustoty metastáz byla prováděna kvantitativní histologická analýza počtu a velikosti metastatických ohnisek (jako počet ohnisek/100 mm³) a objemu (procenta obsazení orgánu) u studovaných myších jater. Ve srovnání s myšmi standardního typu (tabulka 1) statisticky významně poklesla hustota jatemích metastáz (P < 0,01) u jater myší IL-Ιβ'“ a 1CE“⁷“ o 84 až 90 %, což ukazuje, že většina vstříknutých buněk B16M nebyla schopná vrůst do jatémí tkáně těchto myší. Navíc také statisticky io významně (P < 0,01) poklesl u myší IL— 1 β^_/_ a 1CE ⁷ šest až sedmkrát ve srovnání s hodnotami u jater myší standardního typu, což ukazuje, že buňky B16M schopné kolonizovat játra měly také sníženou růstovou rychlost. Autoři vynálezu také pozorovali rozdíl v těchto parametrech metastáz mezi játry myší IL—1 β“^7- a ICE^_/“ vedoucí k odstranění metastáz u téměř všech jater myší ICE^_/z experimentu 1 (obr. 1).

Tabulka 1

Kvantitativní histologická analýza experimentálního osídlení jater buňkami B16M vstříknutými

30	do sleziny u myší IL— 1, ¹ a ICĚ '
		Hustota metastáz	Objem metastáz
	Skupina myší	(počet ohni sek/100 mm)	(jako % objemu jater)
35	Experiment I Myši standardního typu 66,18%	234,16 ±58,36
40	Myši IL-1	25,18±21,02*
	10,05% Myši ICE“^Z“	13,56 ± 16,20*	2,1 %
	Experiment II
45	Myši standardního typu 59,62 %	198,40 ± 100,54
	Myši IL-1 β 9,70 %	33,79 ± 19,89*
50	Myši ICE^Z~ 8,08 %	27,73 ± 15,68*

-8CZ 302114 B6

Údaje reprezentují průměrné hodnoty ± SD ze dvou nezávislých experimentů (7 až 15 myší v experimentální skupině).

* Jsou uvedeny rozdíly, které byly statisticky významné (dvoustranné, p < 0,01) vzhledem s k myším standardního typu při použití analýzy variance (ANOVA) a Scheffeova F-testu.

Příklad 4 ío Autokrinní IL—18 zprostředkuje adhezivitu indukovanou TNF-α aIL-1β u buněk HSE aktivovaných B16M-CM

B16M-CM statisticky významně (P <0,01) zvyšovalo produkci TNF—a a IL—I β buňkami HSE a jejich adhezivitu k jiným buňkám B16M in vitro (obr. 2). Inkubace buněk HSE s 10 μΜ lCEi po dobu 18 h úplně zastavila adhezivitu indukovanou B16M-CM bez poklesu produkce TNF-a buňkami HSE. Exogenně přidaný myší IL-1 β nevykompenzoval blokující účinek lCEi na HSE, což je v rozporu s podstatným zvýšením adheze buněk B16M v kontrolních buňkách HSE ošetřených IL—1 β (obr. 3). Skutečnost, že zvýšení adheze indukované B16M-CM bylo potlačeno v přítomnosti zvýšených koncentrací endogenně produkovaného TNF-α a exogenně přidaného IL,—1 β ukazuje, že žádný z těchto cytokinů přímo vzestupně nereguloval adhezivitu HSE. Je důležité, že přítomnost protilátky proti myšímu IL—18 přidané k buňkám HSE před stimulací médiem B16MCM zabránila B16M-CM-indukované adhezivitě bez ovlivnění produkce indukovaného IL—1 β a TNF-α buňkami HSE (obr. 2). Navíc také protilátka proti IL—18 zabránila účinkům myšího IL1β a TNF-α stimulujícím adhezi na HSE (obr. 3), což ukazuje, že proadhezivní působení těchto cytokinů na HSE byla obě zprostředkovaná IL—18. RT-PCR potvrdila, že buňky HSE exprimovaly gen IL—18 (údaje nejsou ukázány). Naopak myší IL—18 statisticky významně (P < 0,01) zvýšil adhezi buněk B16M k buňkám HSE (obr. 4) a ani TNF-sR p55, ani IL-IRa nebyly schopny tuto adhezi inhibovat, což potvrzuje, že ani autokrinní TNF-α, ani IL—1 β neodpovídaly za IL-18-indukovanou adhezivitu k buňkám HSE. Jak je však ukázáno na obr. 4, protilátka proti

VCAM-1 úplně inhibovala adhezi buněk B16—M k buňkám HSE ošetřeným IL—18. Kontrolní nespecifický IgG neovlivňoval vzestupnou regulaci adheze buněk B16M na buňky HSE ošetřené IL—18.

Příklad 5

IL-18BP zabraňuje adhezi melanomových buněk B16 indukované médiem kondicionovanými buňkami B16

Jak je ukázáno v tabulce 2, přídavek 1L-I8BP k buňkám HSE stimulovaným B16-CM snížil procento přichycených buněk z 35 na 8,70% (p < 0,01). To představuje stoprocentní inhibici, protože míra adheze byla nižší než míra přichycených buněk pri použití bazálního média. Tento výsledek naznačuje, že endogenní IL—18 z buněk HSE může být endogenním zdrojem IL-18 navíc k IL—18 přítomnému v B16M-CM.

Tabulka 2

Inhibiční účinek IL-IBP na adhezi vlivem média kondicionovaného buňkami B16 melanomo50 vých buněk B16 na endotheliální buňky jaterních sinusoidu

-9CZ 302114 B6

Bazální médium BI6-CM

B16-CM/IL-18BP (1 ng/ml) B16-CM/1L-18BP (10 ng/ml) % adheze melanomových buněk 10,15 ± 1,5 35,10 ±4,4 15,00 ±2,5**

8,70± 1,1**

Údaje reprezentují průměrné hodnoty ± SD ze dvou nezávislých experimentů prováděných v šestinásobném opakování (N = 12).

** Jsou uvedeny rozdíly, které byly statisticky významné (dvoustranné, p < 0,01) vzhledem k B16-CM s použitím analýzy variance (ANOVA) a Scheffeova F-testu.

Claims

1. Použití inhibitorů produkce a/nebo působení IL-18 při výrobě farmaceutických prostředků pro inhibici tvorby tumorových metastáz melanomu, kde inhibitor IL—18 je zvolen z protilátek proti IL—18, protilátek proti kterékoli z podjednotek receptoru 1L—18, antagonistů IL—18, kteří soutěží slL-18 a blokují receptor IL-18, a vazebných proteinů, muteinů, fúzovaných proteinů, funkčních derivátů, aktivních frakcí nebo cirkulámě permutovaných derivátů IL-18 se stejnou aktivitou jako vazebný protein IL-18,1L-18BP.

2. Použití podle nároku 1, kde melanomem je hepatický melanom.

3. Použití podle nároku 1, kde inhibitorem produkce IL-18 je inhibitor kaspázy-1 vázající se specificky a ireverzibilně na IL-18.

4. Použití podle nároku 1, kde inhibitorem IL—18 je protilátka proti IL-18.

5. Použití podle nároku 1, kde inhibitorem působení IL—18 je 1L-18BP, nebo jeho mutein, derivát nebo fragment, který má stejnou aktivitu jako IL-18BP.

6. Použití expresního vektoru kódujícího inhibitor produkce a/nebo působení IL-18 definovaný v nároku I pro výrobu farmaceutických prostředků pro inhibici tvorby tumorových metastáz melanomu.