JP2016528185A - 黄色ブドウ球菌ロイコシジンの細胞毒性に関与する細胞因子:新規治療標的 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、黄色ブドウ球菌感染を処置および予防する方法、ならびに黄色ブドウ球菌感染の処置および予防のための新規治療法を特定する方法に関する。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) (S. aureus)は、人口の25%超に片利共生的に定着する細菌である。血流へのアクセスを得ると、黄色ブドウ球菌は伝播し、広範囲の疾患を引き起こす。黄色ブドウ球菌は、院内感染の主な原因であり、感染性心内膜炎ならびに皮膚および軟組織感染の最も一般的な病原体であり、食中毒の4大原因の1つである。総計で、黄色ブドウ球菌は、米国の病院内で年間120万人超の患者に感染しているものと推定される。ヒトの健康に対する黄色ブドウ球菌の脅威は、黄色ブドウ球菌感染に対する最後の砦と考えられる抗生物質バンコマイシンに耐性である株を含む、抗生物質耐性株(すなわち、MRSA株)の出現によってさらに強調される。これらの事実は、この重要な病原体に対する新規の治療法を開発する重要性を強調する。
本発明の第1の局面は、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法に向けられる。この方法は、黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階と、選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する(すなわち、LukEおよび/またはHlgAとのCXCR1/CXCR2の相互作用を阻害することにより)組成物を投与する段階とを伴う。
SEQ ID NO:2(以下に示される)のアミノ酸配列を有するCXCL8(3〜74) K11R/G31P/P32GおよびSEQ ID NO:3(以下に示される)のアミノ酸配列を有するCXCL8(3〜74) K11R/T12S/H13F/G31Pのような、CXCL8(3〜74) K11R/G31Pの類似体も、本発明の方法で用いるのに適している。
SEQ ID NO:2; CXCL8(3〜74) K11R/G31P/P32G
SEQ ID NO:3; CXCL8(3〜74) K11R/T12S/H13F/G31P
式中で
式IのRは、
H、OH、C1〜C5アルキル、C3〜C6シクロアルキル、C2〜C5アルケニル、C1〜C5アルコキシおよびフェニル;
置換および非置換ピロール、チオフェン、フラン、インドール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、ピリジンおよびピリミジンより選択されるヘテロアリール基;
R''がHもしくはC1〜C5アルキルであり、nが0〜2の整数である、式-CH2CH2O-(CH2-CH2O)nR''の残部
より選択され;
または式IのRは、カップリングされるNH基とともに、(2S)-2-アミノプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-フェニルプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミド、(2S)-2-アミノ-3-カルボキシプロパンアミド、(2S)-2,6-ジアミノエキサナミド(diaminoexanamide)のような天然アミノ酸の第1級アミドのラジカル基である。上記のNH基は、天然アミノ酸の第1級アミドのラジカル基の一部として、天然アミノ酸のアミノ基を表す。
式IのR'は、
直鎖もしくは分枝C1〜C5アルキル、C3〜C6シクロアルキル、C2〜C5アルケニルおよびトリフルオロメチル;
置換もしくは非置換フェニル;
置換もしくは非置換ベンジル;
置換および非置換ピリジン、ピリミジン、ピロール、チオフェン、フラン、インドール、チアゾールおよびオキサゾールより選択されるヘテロアリール基
より選択される。
式中で式IIのRが、直鎖または分枝4-(C1〜C6)アルキル、4-トリフルオロメタンスルホニルオキシまたは3-ベンゾイルより選択され、かつ式IIのR1が直鎖または分枝(C1〜C6)アルキルである。
式中で式IVおよびVのR1およびR2が、水素、2-もしくは3-もしくは4-ハロ-フェニル、ヘテロアルキル、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキルからなる群より独立して選択され;
式中で式IVおよびVのR3が-B(R4R5)、-R6-B(R4R5)、R6、-C(O)-R6、-O-R6、-S(O)y-R6 (式中でy=0、1、もしくは2)、-P(O)-(R4R5)および-N(R7R8)より選択され;
式中で式IVおよびVのR6がアルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルより選択され;
式中で式IVおよびVのR4およびR5が独立して水素、ヒドロキシル、アリールオキシ、もしくはアルコキシであり、または式中でR4およびR5がともに、環状エステル、もしくは酸無水物(混合酸無水物もしくは対称酸無水物のどちらか)を形成し;
式中で式IVおよびVのR7およびR8が、水素、アルキル、ハロアルキル、アリール、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルより独立して選択され; R7およびR8が両方とも酸素であってニトロ基を形成し; またはR7およびR8は、それらが付着される窒素とともに、ヘテロシクリルを形成し; ならびに
式中で式IVおよびVのX1が炭素もしくは窒素であり; 式IVおよびVのX2が-S(O)y- (式中でy=0、1、もしくは2)、窒素、もしくは酸素であり; かつ式IVおよびVのnが0〜8の整数である。
のアミノ酸配列を含む黄色ブドウ球菌LukEのエピトープを認識し、かつそれに結合する、抗体またはその抗体結合部分が含まれる。この種の別の例示的な抗体には、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応する、
のアミノ酸配列を含む黄色ブドウ球菌HlgAのエピトープを認識し、かつそれに結合する、抗体またはその抗体結合部分が含まれる。LukEおよびHlgAのCXCR1/CXCR2受容体結合領域に結合する抗体は、以下にさらに詳細に記述されている。
SEQ ID NO:10; LukEP184A,G186A,P187A
SEQ ID NO: 11; LukEP184A,G186A,P187A,G189A
細胞培養条件およびウイルス形質導入
特に明記しない限り、10%ウシ胎仔血清(FBS; Atlanta Biologicals)ならびにペニシリン(100 U ml-1)およびストレプトマイシン(0.1 mg ml-1) (Mediatech)を補充したRPMI中5% CO2とともに37℃で初代ヒト細胞およびTHP-1を培養した。Cxcr2または非標的shRNAの過剰発現およびレンチウイルスに基づくノックダウンは、既述のように行い(Wan et al., "Cytokine Signals Through PI-3 Kinase Pathway Modulate Th17 Cytokine Production by CCR6+ Human Memory T Cells," J. Exp. Med. 208: 1875-1887 (2011)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、1.3μg ml-1のピューロマイシン中で維持した。HEK293T細胞をDMEM (Cellgro)中5% CO2とともに37℃で培養し、上記のように補充を行った。
ニューヨーク血液センター(New York Blood Center)より匿名化されたドナーの同意を得て、血液をバフィーコートとして得た。PBMCをFicoll-Paque PLUS勾配(GE Amersham)によって血液から単離し、CCR5+細胞に対してゲーティングした後に、リンパ球および単球集団に対しての抗CD3およびCD14細胞表面染色を行った。細胞をその後、マラビロク(MVC, 100 ng ml-1)の存在下または非存在下においてLukED (75 nM)とともにインキュベートした。
マラビロクは、AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS (NIAID, NIH)を通じて入手し、100 ng ml-1の終濃度で用いた。CXCL8およびCXCL1は、BioLegendから入手し、テキストに示されている濃度で用いた。
細胞染色は、既述のように行った(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。FACSデータはLSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)にてFACSDivaソフトウェアを用いて得た。FlowJoソフトウェア(Treestar)を用いてデータを分析した。
初代ヒト細胞の表面染色に用いた抗体には、以下が含まれた: CXCR1-APC (クローン8F1/CXCR1)、CXCR2-PE (クローン5E8/CXCR2)、CD3-PE-Cy7 (クローンUCHT1)、CD8-Pacific Blue (クローンHIT8 a)、CD14-Alexa Fluor 700 (クローンHCD14)、CD16-Alexa Fluor 488 (クローン3G8)、CD56-PerCP-Cy5.5 (クローンHCD56)、CD19- Brilliant Violet 650 (クローンHIB19)、HLA-DR-Brilliant Violet 605 (クローンL243)、CD14-FITC (クローンM5E2)、CD18-PE-Cy5 (クローンTS1/18) (BioLegend)およびCCR5-PE (クローン2D7) (BD Pharmingen)。
同質遺伝子DR変異体株を重複PCRによって作出した(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1〜3を参照のこと)。lukEDR1を作出するため、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT891; VJT297かつVJT894; またはVJT892かつVJT893で増幅させた。lukEDR2の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT895; VJT898かつVJT297; またはVJT896かつVJT897で増幅させた。lukEDR3の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT899; VJT902かつVJT297; またはVJT900かつVJT901で増幅させた。lukEDR4の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを、鋳型として用い、プライマーVJT296かつVJT903; VJT914かつVJT297; またはVJT904かつVJT905で増幅させた。lukEDR5の場合、lukEを含んだVJT8.87由来のプラスミドを用い、プライマーVJT296およびVJT911; またはVJT906およびVJT297で増幅させた。lukS-PVを含んだVJT8.89由来のプラスミドを用い、プライマーVJT912およびVJT913で増幅させて、lukEDR5遺伝子座を完成させた。最終PCR産物を得るため、隣接プライマーVJT296かつVJT297を含んだPCR反応に各DNA断片を含めた。XhoIおよびBamHI制限部位を用いてpET14b-6xHis (Novagen)へ単位複製配列をクローニングし、N末端6×ヒスチジン(His)タグ付lukEDRキメラ配列を得た。
pET14b-6xHis-lukEDRプラスミドを大腸菌(Escherichia coli (E. coli)) DH5αへ形質転換し、形質転換体をアンピシリン(Fisher)耐性によって選択した。陽性クローンを既述のように組み換えタンパク質の精製のために大腸菌T7 LysY/LacQ (New England BioLabs)へ形質転換した((Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); DuMont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assayキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。
HlgA/DDR4を作出するため(HlgA由来のアミノ酸番号182〜196を、LukE由来の対応するアミノ酸と置き換える)、NewmanゲノムDNAを鋳型として用い、プライマーVJT635かつVJT1267; およびVJT1209かつVJT1266で増幅させた(詳細なプライマーおよび株情報については以下の表1〜3を参照のこと)。完全な変異体遺伝子座を作出するため、得られたDNA産物を、隣接プライマーVJT635かつVJT1209を用いた最終の重複伸長PCR (sewing overlap extension PCR)反応の鋳型として用いた。BamHIおよびPstI制限部位を用いてpOS1-PlukAB-lukAS.S.-6xHisベクターへ最終の単位複製配列をクローニングし、これによってN末端6×ヒスチジンタグ付HlgA/EDR4を得た。
全てのプラスミドを大腸菌DH5αへ形質転換し、アンピシリン耐性によって選択した。陽性プラスミドを次に、制限陰性の黄色ブドウ球菌RN4220コンピテント細胞へエレクトロポレーションし、その後にタンパク質産生のために黄色ブドウ球菌Newman無毒素コンピテント細胞(Newman ΔlukED, hlg::tet, lukAB::spec, hla::ermC)へのエレクトロポレーションを行った。黄色ブドウ球菌における変異体の選択は、クロラムフェニコール耐性によって行った。
HEK293T細胞、THP-1、初代ヒトPBMCおよび初代マウス腹腔滲出細胞を既述のようにLukE、LukDまたはLukEDで処理した(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。全ての実験において、細胞1〜2×105個を96ウェルプレートに播種した。初代ヒト細胞またはマウス細胞を用いた実験の場合、中毒を氷上で30分間実行し、細胞を次に、固定可能な生存性色素で染色し、同様に細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、その後にフローサイトメトリー分析を行った。その他全ての細胞毒性アッセイ法の場合、細胞を37℃に加えて5% CO2で1時間毒素の存在下でインキュベートし、その後に代謝色素(Cell Titer, Promega)とともにさらに1〜2時間インキュベートした。
3Alonzo et al., Mol. Microbiol.83:423-435 (2012); 4Alonzo et al., Nature 493:51-55 (2013); 19Dumont et al., PNAS (2013)
3Alonzo et al., Mol. Microbiol.83:423-435 (2012); 19Dumont et al., PNAS (2013)
結合アッセイ法の場合、漸増濃度のGFP-LukEまたはGFP-LukDを5×104個のヒトPMNに加え、氷上で30分間インキュベートし、その後にFACS緩衝液中で1回洗浄し、室温で15分間固定し、引き続きフローサイトメトリー分析を行った。GFP+細胞の平均蛍光強度(MFI)を測定して、飽和結合を達成するのに必要とされる毒素濃度を確立した。残りの競合アッセイ法の場合、漸増濃度のLukEまたはLukS-PVのどちらかを30分間、一定の飽和濃度のLukE-GFP (300 nM)と共インキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、FACS固定緩衝液中で15分間固定し、FACS緩衝液中で再度洗浄し、フローサイトメトリーにより結合について評価した。平均GFP蛍光強度は、300 nM GFP-LukEとのインキュベーションによって観察された最大蛍光に基づき、%GFP+として表される。CXCL8またはCXCL1を用いた競合アッセイ法の場合、用量反応量のどちらかのケモカインを氷上で30分間、ヒトPMNに加えておき、引き続いて300 nM GFP-LukEの添加を行った。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、FACS固定緩衝液中で15分間固定し、FACS緩衝液中で再度洗浄し、上記のようにフローサイトメトリーにより結合について評価した。GraphPad PRISMソフトウェア(バージョン5.0f, GraphPad PRISM Software, Inc.)を用いて、これらのアッセイ法の結果をグラフにより描いた。
WT LukEDによる補完のため、lukED遺伝子座全体を、以下のプライマー: VJT605およびVJT299を用いて黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAから増幅させ、染色体組み込みを記述のように(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)行った。lukEDR4D組み込み構築体を作出するため、lukEDプロモーター領域を、プライマーVJT605およびVJT1019を用いて黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAから増幅させた。lukEDR4コード領域を、鋳型としてlukEDR4を含んだVJT34.58株からの精製プラスミドを用いて増幅させ、プライマーVJT1020およびVJT1021で増幅させた。プライマーVJT1022およびVJT299を用いてlukDおよびlukEとlukDとの間の遺伝子間領域を増幅させるために、黄色ブドウ球菌NewmanゲノムDNAを用いた。最終の重複PCR反応を、得られたDNA断片ならびにプライマーVJT605およびVJT299でセットアップした。lukEDおよびlukEDR4D構築体を大腸菌DH5αへ形質転換し、クローンをアンピシリン耐性によって選択した。精製されたプラスミドを、BamHIおよびPstI制限部位を用いてpJC1112へクローニングし、DH5αへ形質転換した。得られた組み換えプラスミドを、SaPI-1ファージインテグラーゼをコードするプラスミドpRN7023を含んだRN9011株へのエレクトロポレーションにより導入して、SaPI-1部位への単一コピーの染色体組み込みを容易にし、既述のようにクロラムフェニコールおよびエリスロマイシン耐性に基づき選択をした(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。SaPI-1組み込み済の構築体をその後、既述の方法を用いて、VJT8.16, Newman ΔlukED株へ形質導入した(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
大腸菌株を、アンピシリンを補充したルリアベルターニ(LB)ブロス中、180 RPMで振盪させながら30℃で日常的に増殖させた。大腸菌由来のタンパク質を精製するため、細菌を1:100で、アンピシリンを補充したLBへ継代培養し、220 RPMで振盪させながら37℃でインキュベートし、その後に16℃および220 RPMで0.1 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの終濃度により終夜誘導した。黄色ブドウ球菌株を表示のように抗生物質の存在下または非存在下においてRPMIに加えて10%カザミノ酸またはトリプチックソイブロス中、180 RPMで振盪させながら37℃で日常的に増殖させた。黄色ブドウ球菌Newman無毒素株を作出するため、既述されているNewman ΔlukED親株(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に、hlgACB::tet、引き続きlukAB::spec、その後にhla::ermをコードするファージで形質導入した。
エクスビボでのLukEDおよびその誘導体LuEDR4Dの効果の研究は、インビトロ増殖の条件下での毒素の低レベル発現(Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)およびエクスビボアッセイ法において用いられる類似の細胞種を標的とする他のロイコトキシンのインビトロ存在量の多さによって複雑化される。これらの複雑化させる要因を克服するため、分離してロイコトキシン活性を評価するシステムを、上記の無毒素Newman株ΔΔΔΔ(ΔlukED, Δhlg::tet, ΔlukAB::spec, Δhla::erm)、ならびにプラスミドに基づくLukEDおよびその誘導体LuEDR4Dの発現の使用によって実施した。lukEDおよびlukEDR4D遺伝子座をBamHIおよびPstI制限部位とともに、プライマーVJT629およびVJT630を用いて上記のpJC1112染色体組み込み株から増幅させた。単位複製配列を、既述のように(Dumont et al.,「The Staphylococcus aureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunit of the Integrin Mac-1」, PNAS (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) lukAプロモーターの制御下で6×Hisタグ付ロイコトキシンを発現するようデザインされた改変pOS1ベクター(pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis)へサブクローニングし、引き続いて無毒素黄色ブドウ球菌株Newman ΔΔΔΔ(ΔlukED, Δhlg::tet, ΔlukAB::spec, Δhla::erm)への形質転換を行った。
無毒素(空)、lukEDまたはlukEDR4Dを含んだpOS1-plukA-lukAs.s.-6xHisベクター構築体を含んだ黄色ブドウ球菌株を4.5時間継代培養し、RPMI + 10% FBS中で1 mlあたり1×109 CFUへの規準化を行った。細胞を1:10で希釈し、20μlを、96ウェルプレート中に播種された2×105個のPMNを含有する培地80μlに加えた。180 RPMで振盪させながら37℃で3.5時間感染を行った。2μg ml-1のリソスタフィンを180 RPMで振盪させながら37℃で20分間加えて、全ての細菌を死滅させた。細胞を1,500 RPMおよび4℃で5分間遠心分離し、引き続いてFACS固定緩衝液(PBS + 2% FBS + 2%パラホルムアルデヒド + 0.05%アジ化ナトリウム)中での固定を行った。フローサイトメトリーにより毒素媒介性の死滅化を分析するため、ゲート生細胞からの細胞枯渇を評価した。生ゲートに残存している細胞を、0%死に設定した、空のpOS1-plukA修飾空ベクター(無毒素)を含んだNewman ΔΔΔΔ株のものと比較することによって、%細胞死を計算した。
HEK293T細胞に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてN末端HAタグ付CXCR1またはCXCR2 (Missouri S&T cDNA Resource Center)をコードするcDNAを一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後に、5 mM EDTAを含有するPBSで細胞を引きはがし、溶解緩衝液(PBS + 10 mMイミダゾール(Fisher) + 1% Brij O10 (Sigma) + 1 mM PMSF (Thermo Scientific) + 2×プロテアーゼ阻害剤ペレット(Roche))を用いて1時間、膜タンパク質を可溶化した(およそ細胞1×106個/条件)。Hisタグ付LukEおよびLukDを2時間、平衡化Ni-NTA樹脂(Qiagen)とともにインキュベートし、引き続いて溶解緩衝液中での3回の洗浄を行った。溶解物および樹脂をその後、2時間ともにインキュベートし、引き続いて溶解緩衝液中での3回の洗浄および4×SDSサンプル緩衝液45μl中での樹脂の最終の再懸濁を行った。タンパク質サンプルを80Vにて10% SDS-PAGEゲル上で泳動し、引き続いて1 Ampにて1時間、ニトロセルロース膜(GE)への転写を行った。膜を1時間、PBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳でブロッキングし、毒素の場合にはPBS + 0.01% Tween-20中で1:3,000に希釈した抗His抗体(Cell Sciences)または受容体の場合にはPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1:1,000に希釈した抗HA抗体(Covance)のどちらかとともに4℃で終夜インキュベートした。翌日、二次ヤギ抗マウスHRP抗体(Bio-Rad)をPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1時間、膜に加えておき、引き続いてオートラジオグラフィーフィルム(LabScientific, Inc)上での検出のためにSuper Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific)とのインキュベーションを行った。
既述のように(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)蛍光カルシウム指示薬Fluo4-AM (Invitrogen)を用いてヒトPMN上でのCXCR1およびCXCR2の活性化を評価した。手短に言えば、細胞をハンク平衡塩溶液(HBSS)中、3μMのFluo4-AMとともに室温で30分間インキュベートし、引き続いてHBSS中での3回の洗浄および30分間37℃での平衡化を行った。ベースラインのカルシウムレベルを60秒間、フローサイトメーターにて経時的に分析した。この時点で、CXCL8、CXCL1またはLukE (300 nM)を細胞に加え、経時的な平均蛍光強度をさらに4分間評価した。5秒超の間隔での平均蛍光強度をグラフ表示のためにプロットした。
インビトロでのLukED媒介性のマウス細胞死滅化を評価するため、C57BL/6 WTマウス(Taconic)に1×107 CFUの、熱死滅化された黄色ブドウ球菌Newman ΔlukEDを腹腔内注射した。注射から24時間後に、別用量の1×107 CFUの、熱死滅化された黄色ブドウ球菌Newman ΔlukEDを先のように注射した。さらに24時間後、マウスを殺処理し、8 mlのPBSを用い腹膜腔洗浄によって免疫細胞を集めた。ACK溶解緩衝液(Gibco) 2 mlを用いて赤血球を溶解させ、その後にRPMI + 10% FBS中での残存腹腔滲出細胞の再懸濁を行った。細胞をPBS、LukEDまたはLukEDR4D (300 nM)とともにインキュベートし、氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、その後に固定可能な生存性色素eFluor-450で染色し、引き続いてCD11b、B220、F480、CD3、Ly6G、CCR5およびCXCR2抗体での細胞表面染色を行った。特異的免疫細胞集団の細胞生存性をその後、LSRIIフローサイトメーター(BD)にて分析した。FACSプロットは、少なくとも3匹の独立的な動物から単離した細胞から得られた結果を代表するものである。細胞死を定量化し、eFluor-450+細胞の割合としてグラフ表示した。
黄色ブドウ球菌株Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukEDR4D、Newman ΔlukED + pJC1112-、Newman ΔlukED + pJC1112-lukED、Newman ΔlukED + pJC1112-lukE DR4DおよびNewman ΔlukEDΔhlgACBを5時間、180 RPMで振盪させながら37℃で後期対数期まで増殖させた。細菌培養物をその後、15分間4,000 RPMで遠心分離し、引き続いて細菌上清1.3 mlの除去およびトリクロロ酢酸の添加(10%の終濃度)を行った。タンパク質を4℃で終夜沈殿させた。翌日、沈殿したタンパク質を30分間15,000 RPMで遠心分離によりペレットとし、100%エタノールで洗浄し、1×サンプル緩衝液60μlに再懸濁した。サンプルをボルテックスし、SDS-PAGEの前に5分間煮沸した。抗His、抗LukE、および抗LukD免疫ブロットの場合、黄色ブドウ球菌細胞外タンパク質を10% SDS-PAGEゲル上で分離し、引き続いて1時間1 Ampでのニトロセルロースへの転写を行った。膜をPBS + 0.01% Tween-20 + 5%無脂肪乳中で1時間ブロッキングし; 以下の希釈: 抗His (1:3,000)、抗LukE (1:5,000)、および抗LukD (1:5,000)にて一次抗体でプローブし; PBSTで3回洗浄し; 二次ヤギ抗マウス(抗His抗体の場合)または抗ウサギ(抗LukE抗体および抗LukD抗体の場合) Alexafluor-680結合抗体で1時間プローブし; 引き続いてOdyssey撮像装置(LI-COR)での撮像を行った。LukEDまたはLukEDR4D (Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、Newman ΔΔΔΔ + pOS1-plukAlukAs.s.-6xHis-lukEDR4D)を過剰発現する菌株の場合、LukEDR4変異体に対するLukE抗体の親和性の減少を実証するために、クマシー染色されたゲルを示す。内因性レベルのLukEDおよびLukEDR4D (Newman ΔlukED + pJC1112-、Newman ΔlukED + pJC1112-lukED、Newman ΔlukED + pJC1112-lukEDR4D)を産生する菌株の場合、HlgC3との抗LukE抗体の交差反応性に起因してΔlukEDΔhlgACB二重変異体を含めた。全ての画像は少なくとも3回の独立した実験を代表するものである。α-LukEおよびα-LukD抗体は、既述のように作出された。
LukEおよびLukS-PVアミノ酸配列を、ClustalWで整列させ、ESPriptを用い配列多様性の程度にしたがってRislerマトリックスでスコア化した。スコアを色の傾斜(赤色、橙色、黄色、緑色、明るい青色、暗い青色)によってLukE構造表面に表示したが、ここで厳密に保存されていた残基には赤色をつけ、最も相違する残基には暗い青色をつけた。保存的置換は中間色によって表されている。構造図は全てPyMOLを用いて準備した。
黄色ブドウ球菌は、世界中で相当な罹患率および死亡率に関与しているグラム陽性細菌である(DeLeo & Chambers,「Reemergence of Antibiotic-Resistant Staphylococcus aureus in the Genomics Era」, J. Clin. Invest. 119:2464-2474 (2009)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。この生物の病原性は、免疫回避およびその後の疾患顕在化に寄与するものと考えられる病毒性因子の備蓄庫の作出に依る(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012); Nizet, V.,「Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert Innate Immunity to Reveal Novel Therapeutic Targets」, J. Allergy Clin. Immunol. 120: 13-22 (2007)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。ヒト感染と関連する菌株は、最大5種の異なる二成分性ロイコトキシン(LukSF-PV/PVL、HlgAB、HlgCB、LukED、およびLukAB/HG)を産生することができる(Alonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins」, PLoS Pathog 9:e1003143 (2013); Alonzo et al.,「Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo」, Mol. Microbiol. 83:423-435 (2012); Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013); Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012); Panton & Valentine,「Staphylococcal Toxin」, The Lancet 506-508 (1932); Loffler et al.,「Staphylococcus aureus Panton- Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils」, PLoS Pathog. 6:e1000715 (2010); Labandeira-Rey et al.,「Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin Causes Necrotizing Pneumonia」, Science 315: 1130-1133 (2007); Yamashita et al.,「Crystal Structure of the Octameric Pore of Staphylococcal Gamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore Formation Mechanism by Two Components」, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 108: 17314-17319 (2011); Dalla Serra et al.,「Staphylococcus aureus Bicomponent Gamma-Hemolysins, HlgA, HlgB, and HlgC, Can Form Mixed Pores Containing All Components」, J. Chem. Inf. Model. 45: 1539-1545 (2005); Morinaga et al.,「Purification, Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family」, Microbiol. Immunol. 47:81-90 (2003); Gravet et al.,「Characterization of a Novel Structural Member, LukE-LukD, of the Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family」, FEBS Lett. 436:202-208 (1998); DuMont et al.,「Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis」, Mol. Microbiol. 79:814-825 (2011); Dumont et al.,「Staphylococcus aureus Elaborates Leukocidin AB to Mediate Escape From Within Human Neutrophils」, Infect. Immun. 81: 1830-1841 (2013); Ventura et al.,「Identification of a Novel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell Surface Proteomics」, PLoS One 5:e11634 (2010)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの毒素はヒト好中球(多形核細胞; PMN)、つまり細菌感染に対する防御に重要な先天性免疫細胞を強力に標的化して死滅させる(Loffler et al.,「Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils」, PLoS Pathog. 6:e1000715 (2010)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。何年にもわたって、これらの毒素は余剰であるものと考えられていたが、しかしその独特な向細胞性を促進する細胞因子に関する最近の特定によって、そうではないことが証明された(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013); Spaan et al.,「The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors」, Cell Host & Microbe 13:584-594 (2013); Dumont et al.,「The Staphylococcus aureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunit of the Integrin Mac-1」, PNAS (2013)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。初代ヒト末梢血単核細胞(PBMC)に及ぼすLukEDの効果を調べている間に、細胞表面のCCR5を生来欠いている、Δ32Ccr5個体から単離されたPBMC内の単球(Oswald-Richter et al.,「Identification of a CCR5-Expressing T Cell Subset That is Resistant to R5-Tropic HIV Infection」, PLoS Pathog. 3:e58 (2007)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)がLukEDを介して、CCR5非依存的に標的化されることが観察された(図1A)。同様に、Ccr5+/+個体から単離されたPBMC由来の単球は、LukED媒介性のCCR5+細胞死滅化を遮断することが知られているCCR5アンタゴニストであるマラビロクの存在下でさえもLukEDに対して感受性であった(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) (図2)。さらに、Ccr5+/+およびΔ32Ccr5ドナー由来のPMNはLukEDに等しく感受性であったこと(図1B)から、LukEDがCCR5非依存的にヒト単球およびPMNを標的化することが示唆される。
黄色ブドウ球菌ロイコトキシンの共通の特徴は、それらが全て、PMNを標的化して死滅しうるということである(Vandenesch et al.,「Staphylococcus aureus Hemolysins, Bi-Component Leukocidins, and Cytolytic Peptides: A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors?」 Front. Cell. Infect. Microbiol. 2: 12 (2012)およびAlonzo & Torres,「Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught: The Contribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.」 PLoS Pathog. 9:e1003143 (2013)、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。本明細書において記述される所見から、LukEDがCXCR1/CXCR2を標的化することによりPMNを死滅させることが示唆される。LukEDはLukSF-PV、HlgABおよびHlgCBとの有意なアミノ酸同一性(70%超)を示すので、これらの受容体がまた、宿主細胞をこれらのロイコトキシンに対して感受性にするかどうかについても評価した。CCR5ではなく、CXCR1、CXCR2、およびDARCは、HlgCBまたはLukSF-PVに対してではなく、HlgABに対して細胞を感受性にした(図4A〜4B)。HlgCBではなくHlgABがこれらの受容体を標的化するという知見から、HlgAがこの毒素の指向性に関与するサブユニットであることが示唆される。DARCがHlgAB細胞毒性を補助するという所見はまた、この毒素が溶血活性を示すという知見と一致している。
黄色ブドウ球菌に対する防御での主な役割のため(Rigby & DeLeo,「Neutrophils in Innate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections」, Semin. Immunopathol. 34:237-259 (2012)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、本明細書において記述される研究の残りは、LukEDを介した初代PMNのCXCR1/CXCR2標的化に焦点を合わせる。結合アッセイ法を利用したが、ここではPMNを緑色蛍光タンパク質融合LukEまたはLukD (GFP-LukEまたはGFP-LukD)とともにインキュベートした(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。GFP-LukEだけが用量依存的かつ飽和可能な形でPMNに結合し、その一方でGFP-LukDは飽和不能な表面結合を示した(図6A)。GFP-LukEの結合はLukEで競合除去されたが、等価なPVLサブユニットLukS-PVではそうでなかったこと(図6B)から、CXCR1/CXCR2との特異的相互作用が示唆された。
LukEおよび高度に相同なロイコトキシンLukS-PVは、71%のアミノ酸同一性を共有するが、しかしLukS-PVはPMNを標的化して死滅させるためにCXCR1/CXCR2受容体を用いない(Spaan et al.,「The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors」, Cell Host & Microbe 13:584-594 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる) (図1D)。LukEおよびLukS-PVのアミノ酸配列アライメントから、有意な配列多様性を含んだ5つの領域(多様性領域1〜5; DR1〜5)が明らかにされた(図8)。これらのDRは、受容体の認識に関与するものと仮定されている、LukEおよびLukS-PV構造のrimドメインに主として位置している(図9A〜9B) (Menestrina et al.,「Ion Channels and Bacterial Infection: The Case of Beta-Barrel Pore-Forming Protein Toxins of Staphylococcus aureus」, FEBS Lett. 552:54-60 (2003)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの5つのDRのいずれかがヒトPMNに対するLukEの特異性の付与に関与するかどうか試験するため、ハイブリッドLukE/S-PV毒素が作出された。LukE/S-PVハイブリッドタンパク質を精製し、LukDと等モル比で混合し、PMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。LukEDR4DおよびLukEDR5D毒素のみ、WT LukEDと比べてPMNに対するその細胞毒性が減弱された(図9C)。
LukEDがまた、CXCR1/CXCR2依存的にマウス白血球を死滅させるかどうか評価するため、マウス腹腔滲出細胞(PEC)をLukEDまたはLukEDR4Dで処理した。LukEDはおよそ79%のPMNを死滅させたが、LukEDR4Dは顕著に損傷され、これらの細胞のおよそ8%を死滅させただけであった。PMNに及ぼす影響とは対照的に、PEC集団内由来のCCR5+マクロファージはLukEDおよびLukEDR4Dの両方に対して等しく感受性であって(図12Aおよび13A)、LukEDが厳密にCCR5依存的にこれらの細胞を死滅させるという所見と一致していた(Alonzo et al.,「CCR5 is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED」, Nature 493:51-55 (2013)、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。さらに、同質遺伝子黄色ブドウ球菌ΔlukED、ΔlukED::lukEDまたはΔlukED::lukEDR4D株を感染させた組織由来のPMNの生存性を評価した(図11B)。黄色ブドウ球菌ΔlukED::lukEDR4D感染マウス由来のPMNは、ΔlukED感染マウスと同様に、ΔlukED::lukED感染マウスのものと比べて毒素媒介性の死から大部分が保護された。顕著には、ΔlukED::lukEDR4D感染マウス由来のPMNは、ΔlukED感染マウス由来のPMNと同じくらい健常であったこと(図12Bおよび13B)から、CXCR1/CXCR2とのDR4ドメインの相互作用がインビボでのPMNの標的化に必要とされることが示唆された。
LukEおよびHlgAは70%超のアミノ酸同一性を共有し、ともにCXCR1およびCXCR2受容体を標的化してhPMNを死滅させる。LukE DR4ドメインに対応するHlgAにおけるアミノ酸(すなわち、HlgAアミノ酸番号180〜192)がまた、CXCR1/CXCR2の標的化に関与するかどうか評価するため、いくつかのハイブリッドHlgAタンパク質の操作が行われた。HlgA DR4ドメインをLukE (HlgALukE-DR4)またはLukS-PV (HlgALukS-DR4) DR4ドメインと交換した。HlgALukE-DR4およびHlgALukS-DR4ハイブリッドタンパク質を精製し、HlgBと等モル比で混合し、hPMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。多様性領域4におけるHlgAアミノ酸残基番号180〜192は、ヒト好中球(hPMN)、CXCR1/CXCR2+細胞のHlgAB標的化に必要とされる(図14)。HlgA/HlgBおよびHlgALukE-DR4/HlgBの組み合わせは、hPMNに対して強力な細胞毒性活性を示したが、しかしHlgALukS-DR4/HlgBの組み合わせではそうでなかった。これらのデータから、LukEDと同様に、HlgAのDR4ドメインがCXCR1およびCXCR2の標的化に関与することが実証される。
LukEはDR4ドメインを介してCXCR1/CXCR2+細胞に結合すること、およびこのドメインをLukS-PV DR4とスイッチすることで、ヒト好中球を含むCXCR1/CXCR2+細胞に対してLukEDが不活性にされることが実証された(図9A〜9H)。HlgAにおけるDR4ドメインは、HlgABによるヒト好中球の標的化かつ死滅化に必要とされることも分かった(図14)。LukE DR4は、CXCR1およびCXCR2に対するLukEの指向性を決定する可能性が高い、LukS-PVのDR4のものとは十分に異なる極性表面を提示する2つのグリシン残基(G186およびG189)ならびに2つのプロリン残基(P184およびP187)を含んだループを形成する。興味深いことに、これらの4つのアミノ酸のうちの3つが同様に、HlgAにおいて保存されている。LukED媒介性のhPMN死滅化におけるP184、G186、P187、およびG189の関与を直接評価するため、全4つのアミノ酸をアラニンへ変異させて、LukEP184A, G186A, P187A, G189Aタンパク質(LukEP184,G186,P187)を生じさせた。WT LukEおよびLukEP184,G186,P187,G189タンパク質を精製し、LukDと等モル比で混合し、ヒトhPMNとともにインキュベートして、その細胞毒性活性を評価した。WT LukED毒素はhPMNを標的化かつ死滅させたが、LukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素の場合には検出可能な活性は観察されなかった(図15A)。このデータから、LukED媒介性のCXCR1/CXCR2+細胞死滅化に対してP184、G186、P187、およびG189アミノ酸により作出される極性表面の重要性が実証される。LukE P184、G186、およびP187に対応するHlgA残基がCXCR1/CXCR2へのHlgAの結合において同様の役割を果たすものと予測される。
DARC発現プラスミドでのHEK293T細胞のトランスフェクションは、これらの細胞をLukEDおよびHlgABに対して感受性とさせるのに十分である(図3および4A)。ヒト赤血球(RBC)に対するLukEDの溶血活性を試験したが、ドナーのなかにはLukED溶血に対して感受性であるものもいたが、そうでないものもいたことが観察された(図16Aおよび16B)。蛍光活性化細胞選別(FACS)によるRBC表面上のDARCレベルの評価から、LukEDに対する抵抗性がこれらのRBC表面の検出不能なDARCに関係していることが明らかにされ、LukED媒介性のRBC溶解にはDARCが必要とされることが示唆された。
[本発明1001]
黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。
[本発明1002]
黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記組成物が、CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する薬剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記薬剤がCXCR1およびCXCR2のタンパク質またはペプチド阻害剤である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、CXCケモカインリガンド8 (CXCL8)に由来し、CXCL8(3-74)K11R/G31P (SEQ ID NO:1)、CXCL8 (3-74) K11R/G31P/P32G (SEQ ID NO:2)、およびCXCL8 (3-74) K11R/T12S/H13F/G31P (SEQ ID NO:3)からなる群より選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、黄色ブドウ球菌CXCR1/CXCR2受容体結合ドメイン配列を含んだ組み換えペプチドである、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するアミノ酸配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するアミノ酸配列を含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記薬剤がCXCR1およびCXCR2の小分子阻害剤である、本発明1003の方法。
[本発明1010]
前記小分子阻害剤が、2-ヒドロキシ-N,N,-ジメチル-3-[[2-[[1(R)-(5-メチル-2-フラニル)プロピル]アミノ]-3,4-ジオキソ-1-シクロブテン-1-イル]アミノ]ベンズアミド(SCH-527123)、N-(2-ヒドロキシ-3-ジメチルスルホニルアミド-4-クロロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)-N''-シアノグアニジン(SCH468477)、SCH-479833、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記小分子阻害剤が、R(-)-2-[(4-イソブチルフェニル)プロピオニル]-メタンスルホンアミド(レパリキシン)、R(-)-2-[(4'-トリフルオロメタンスルホニルオキシ)フェニル]プロピオニル-メタンスルホンアミド(メラキシン)、4-[(1R)-2-アミノ-1-メチル-2-オキソエチル]フェニルトリフルオロメタンスルホネート(DF 2162)、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記組成物が、SB-656933、N-(2-ヒドロキシ-3-スルファミル-4-クロロフェニル)-N'-(2,3ジクロロフェニル)尿素(SB-332235)、N-(2-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)尿素(SB 225002)、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるCXCR2阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記組成物が、CXCR1遮断抗体もしくはその抗体結合部分、CXCR2遮断抗体もしくはその抗体結合部分、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記組成物が、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌ロイコシジンE (LukE)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記組成物が、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌γ溶血素A (HlgA)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、本発明1001の方法。
[本発明1022]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、本発明1001の方法。
[本発明1023]
LukEとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
HlgAとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、本発明1001の方法。
[本発明1025]
黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(Duffy antigen receptor for chemokines, DARC)との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。
[本発明1026]
黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記組成物がDARC阻害剤を含む、本発明1025の方法。
[本発明1028]
DARC阻害剤がDARC遮断抗体である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階をさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1030]
皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、本発明1025の方法。
[本発明1031]
前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、本発明1025の方法。
[本発明1032]
前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、本発明1025の方法。
[本発明1034]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、本発明1025の方法。
[本発明1035]
黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、本発明1025の方法。
[本発明1036]
LukEとのDARCの相互作用が阻害される、本発明1025の方法。
[本発明1037]
HlgAとのDARCの相互作用が阻害される、本発明1025の方法。
[本発明1038]
黄色ブドウ球菌感染を有する対象からサンプルを得る段階;
該サンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC、またはそれらの組み合わせの発現レベルを定量化する段階; および
該定量化段階に基づいて該対象への処置を施す段階
を含む、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を処置する方法。
[本発明1039]
前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCタンパク質発現を測定することを含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC mRNA発現を測定することを含む、本発明1038の方法。
[本発明1041]
前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCの定量化された発現レベルを、CXCR1、CXCR2、および/またはDARCの参照発現レベルと比較する段階をさらに含み、
該比較段階に基づいて適当な処置が判定される、
本発明1038の方法。
[本発明1042]
SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するエピトープに結合する、単離されたLukE抗体、またはその抗体結合断片。
[本発明1043]
前記抗体結合断片が、単一の可変V H ドメイン、単一の可変V L ドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、本発明1042の単離された抗体。
[本発明1044]
SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するエピトープに結合する、単離されたHlgA抗体、またはその抗体結合断片。
[本発明1045]
前記抗体結合断片が、単一の可変V H ドメイン、単一の可変V L ドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、本発明1044の単離された抗体。
[本発明1046]
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
[本発明1047]
前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20〜263を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、本発明1046の組成物。
[本発明1048]
P184、G186、P187、およびG189からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1050]
前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、本発明1047の組成物。
[本発明1051]
前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、本発明1057の組成物。
[本発明1052]
単離されたロイコシジンD (LukD)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、本発明1046の組成物。
[本発明1053]
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:12と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたLukDタンパク質を含む、本発明1052の組成物。
[本発明1054]
SEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20〜281を含む単離されたLukDポリペプチドを含む、本発明1052の組成物。
[本発明1055]
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
[本発明1056]
前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号20〜258を含み、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
P182、G184、およびP185からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、本発明1056の組成物。
[本発明1058]
前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、本発明1056の組成物。
[本発明1059]
前記単離されたHlgAタンパク質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、またはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、本発明1056の組成物。
[本発明1060]
単離されたγ溶血素B (HlgB)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、本発明1055の組成物。
[本発明1061]
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:16と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたHlgBタンパク質を含む、本発明1060の組成物。
[本発明1062]
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を有する対象またはHIV感染を有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてHIVを予防または処置するのに有効な条件の下で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防または処置する方法。
[本発明1063]
単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドおよび単離されたLukDタンパク質またはそのポリペプチドを含む組成物と組み合わせて、HIVの処置において有用な1つまたは複数の抗ウイルス剤または他の薬剤を投与する段階
をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
抗ウイルス剤が、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
抗ウイルス剤が、ジドブジン、ラミブジン、ザルシタビン、ジダノシン、スタブジン、アバカビル、アデホビルジピボキシル、ロブカビル、BC H-10652、エミトリシタビン、ベータ-L-FD4、DAPD、ロデノシン、ネビラピン、デラビリジン、エファビレンツ、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-カラノライドAおよびB、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、ラシナビル、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、アンプレナビル、ヒドロキシウレア、リバビリン、IL-2、IL-12、ペンタフシド、Yissum番号1 1607、ならびにAG-1549からなる群より選択される、本発明1063の方法。
[本発明1066]
滑沢剤、抗菌剤、湿潤剤、乳化剤、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる薬剤をさらに含む、本発明1046、本発明1052、本発明1055、または本発明1060の組成物。
[本発明1067]
セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたは白ろう、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される滑沢剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1068]
プロピレングリコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗菌剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1069]
ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エデト酸二ナトリウム、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗酸化物質を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1070]
エチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物からなる群より選択される湿潤剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1071]
カルボマー、ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステル、ステアリン酸、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される乳化剤を含む、本発明1066の組成物。
[本発明1072]
局所投与用に製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1073]
膣投与および/または直腸投与用に製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1074]
含嗽液として製剤化されている、本発明1066の組成物。
[本発明1075]
HIV感染に曝露される危険性がある対象を選択する段階;
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドを含む、本発明1046、本発明1052、または本発明1066の組成物を提供する段階; および
組織における細胞のHIV感染性を阻害するのに有効な条件の下で対象の組織を組成物と接触させ、それにより対象においてHIV感染を予防する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防する方法。
[本発明1076]
炎症状態を有する対象を選択する段階、および
選択した対象に、炎症状態を処置するのに有効な条件の下で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象において炎症状態を処置する方法。
[本発明1077]
炎症状態が急性炎症状態である、本発明1076の方法。
[本発明1078]
急性炎症状態が限局性である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
急性炎症状態が皮膚または軟組織における感染創傷である、本発明1077の方法。
[本発明1080]
炎症状態が、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、炎症性腸疾患、結核症、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、アレルギー性接触皮膚炎、急性過敏症、ならびに急性神経炎症性傷害からなる群より選択される、本発明1076の方法。
[本発明1081]
移植片対宿主病(GVHD)を有する対象またはGVHDを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象において移植片対宿主病(GVHD)を予防または処置するのに有効な量で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてGVHDを予防または処置する方法。
[本発明1082]
がんを有する対象またはがんを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてがんを予防または処置するのに有効な量で本発明1046または本発明1052の組成物を投与する段階
を含む、対象においてがんを予防または処置する方法。
[本発明1083]
がんが、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、および肺がんからなる群より選択される、本発明1082の方法。
[本発明1084]
がんが転移がんである、本発明1082の方法。
Claims (84)
- 黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、CXCR1およびCXCR2との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。 - 黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、請求項1記載の方法。
- 前記組成物が、CXCR1およびCXCR2の両方を阻害する薬剤を含む、請求項1記載の方法。
- 前記薬剤がCXCR1およびCXCR2のタンパク質またはペプチド阻害剤である、請求項3記載の方法。
- 前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、CXCケモカインリガンド8 (CXCL8)に由来し、CXCL8(3-74)K11R/G31P (SEQ ID NO:1)、CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G (SEQ ID NO:2)、およびCXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P (SEQ ID NO:3)からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
- 前記タンパク質またはペプチド阻害剤が、黄色ブドウ球菌CXCR1/CXCR2受容体結合ドメイン配列を含んだ組み換えペプチドである、請求項4記載の方法。
- 前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。
- 前記組み換えペプチドが、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するアミノ酸配列を含む、請求項6記載の方法。
- 前記薬剤がCXCR1およびCXCR2の小分子阻害剤である、請求項3記載の方法。
- 前記小分子阻害剤が、2-ヒドロキシ-N,N,-ジメチル-3-[[2-[[1(R)-(5-メチル-2-フラニル)プロピル]アミノ]-3,4-ジオキソ-1-シクロブテン-1-イル]アミノ]ベンズアミド(SCH-527123)、N-(2-ヒドロキシ-3-ジメチルスルホニルアミド-4-クロロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)-N''-シアノグアニジン(SCH468477)、SCH-479833、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 前記小分子阻害剤が、R(-)-2-[(4-イソブチルフェニル)プロピオニル]-メタンスルホンアミド(レパリキシン)、R(-)-2-[(4'-トリフルオロメタンスルホニルオキシ)フェニル]プロピオニル-メタンスルホンアミド(メラキシン)、4-[(1R)-2-アミノ-1-メチル-2-オキソエチル]フェニルトリフルオロメタンスルホネート(DF 2162)、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- 前記組成物が、SB-656933、N-(2-ヒドロキシ-3-スルファミル-4-クロロフェニル)-N'-(2,3ジクロロフェニル)尿素(SB-332235)、N-(2-ヒドロキシ-4-ニトロフェニル)-N'-(2-ブロモフェニル)尿素(SB 225002)、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるCXCR2阻害剤を含む、請求項1記載の方法。
- 前記組成物が、CXCR1遮断抗体もしくはその抗体結合部分、CXCR2遮断抗体もしくはその抗体結合部分、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 前記組成物が、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌ロイコシジンE (LukE)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、請求項1記載の方法。
- 前記組成物が、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するアミノ酸配列を含んだ黄色ブドウ球菌γ溶血素A (HlgA)のエピトープに結合する抗体またはその抗体結合部分を含む、請求項1記載の方法。
- 抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、請求項1記載の方法。
- 前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、請求項1記載の方法。
- 前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、請求項1記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、請求項1記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、請求項1記載の方法。
- LukEとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、請求項1記載の方法。
- HlgAとのCXCR1およびCXCR2の相互作用が阻害される、請求項1記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染を有する対象または黄色ブドウ球菌感染を有する危険性がある対象を選択する段階、ならびに
選択した対象に、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置するのに有効な条件の下で、ダッフィ抗原ケモカイン受容体(Duffy antigen receptor for chemokines, DARC)との黄色ブドウ球菌の相互作用を阻害する組成物を投与する段階
を含む、対象において黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態を予防または処置する方法。 - 黄色ブドウ球菌感染がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)感染である、請求項25記載の方法。
- 前記組成物がDARC阻害剤を含む、請求項25記載の方法。
- DARC阻害剤がDARC遮断抗体である、請求項27記載の方法。
- 抗感染剤、抗生剤、および抗菌剤からなる群より選択される薬剤を、前記組成物と組み合わせて投与する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 皮膚創傷および感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、ならびに毒素性ショック症候群からなる群より選択される、黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置または予防される、請求項25記載の方法。
- 前記投与段階を繰り返すことをさらに含む、請求項25記載の方法。
- 前記対象が、乳幼児、若年者、または成人である、請求項25記載の方法。
- 前記対象が、免疫無防備状態の乳幼児、若年者、または成人である、請求項25記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が予防される、請求項25記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染および/または黄色ブドウ球菌感染から生じる状態が処置される、請求項25記載の方法。
- LukEとのDARCの相互作用が阻害される、請求項25記載の方法。
- HlgAとのDARCの相互作用が阻害される、請求項25記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌感染を有する対象からサンプルを得る段階;
該サンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC、またはそれらの組み合わせの発現レベルを定量化する段階; および
該定量化段階に基づいて該対象への処置を施す段階
を含む、黄色ブドウ球菌感染を有する対象を処置する方法。 - 前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCタンパク質発現を測定することを含む、請求項38記載の方法。
- 前記定量化段階が、前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、DARC mRNA発現を測定することを含む、請求項38記載の方法。
- 前記対象由来のサンプル中のCXCR1、CXCR2、および/またはDARCの定量化された発現レベルを、CXCR1、CXCR2、および/またはDARCの参照発現レベルと比較する段階をさらに含み、
該比較段階に基づいて適当な処置が判定される、
請求項38記載の方法。 - SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応するエピトープに結合する、単離されたLukE抗体、またはその抗体結合断片。
- 前記抗体結合断片が、単一の可変VHドメイン、単一の可変VLドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、請求項42記載の単離された抗体。
- SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応するエピトープに結合する、単離されたHlgA抗体、またはその抗体結合断片。
- 前記抗体結合断片が、単一の可変VHドメイン、単一の可変VLドメイン、Fab断片、または一本鎖抗体断片を含む、請求項44記載の単離された抗体。
- 非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。 - 前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号20〜263を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸残基番号182〜196に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、請求項46記載の組成物。
- P184、G186、P187、およびG189からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、請求項47記載の組成物。
- 前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、請求項47記載の組成物。
- 前記単離されたLukEタンパク質がSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、請求項47記載の組成物。
- 前記単離されたLukEポリペプチドがSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項57記載の組成物。
- 単離されたロイコシジンD (LukD)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、請求項46記載の組成物。
- SEQ ID NO:12のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:12と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたLukDタンパク質を含む、請求項52記載の組成物。
- SEQ ID NO:12のアミノ酸残基番号20〜281を含む単離されたLukDポリペプチドを含む、請求項52記載の組成物。
- 非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたHlgAタンパク質またはそのポリペプチド、および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。 - 前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号20〜258を含み、SEQ ID NO:6のアミノ酸残基番号180〜192に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基が置換または欠失されている、請求項55記載の組成物。
- P182、G184、およびP185からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸が置換または欠失されている、請求項56記載の組成物。
- 前記単離されたHlgAタンパク質がSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、請求項56記載の組成物。
- 前記単離されたHlgAタンパク質が、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、またはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項56記載の組成物。
- 単離されたγ溶血素B (HlgB)タンパク質またはそのポリペプチドをさらに含む、請求項55記載の組成物。
- SEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:16と少なくとも70%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離されたHlgBタンパク質を含む、請求項60記載の組成物。
- ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を有する対象またはHIV感染を有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてHIVを予防または処置するのに有効な条件の下で請求項46または請求項52記載の組成物を投与する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防または処置する方法。 - 単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドおよび単離されたLukDタンパク質またはそのポリペプチドを含む組成物と組み合わせて、HIVの処置において有用な1つまたは複数の抗ウイルス剤または他の薬剤を投与する段階
をさらに含む、請求項62記載の方法。 - 抗ウイルス剤が、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
- 抗ウイルス剤が、ジドブジン、ラミブジン、ザルシタビン、ジダノシン、スタブジン、アバカビル、アデホビルジピボキシル、ロブカビル、BC H-10652、エミトリシタビン、ベータ-L-FD4、DAPD、ロデノシン、ネビラピン、デラビリジン、エファビレンツ、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-カラノライドAおよびB、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、ラシナビル、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、アンプレナビル、ヒドロキシウレア、リバビリン、IL-2、IL-12、ペンタフシド、Yissum番号1 1607、ならびにAG-1549からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
- 滑沢剤、抗菌剤、湿潤剤、乳化剤、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される1つまたは複数のさらなる薬剤をさらに含む、請求項46、請求項52、請求項55、または請求項60記載の組成物。
- セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたは白ろう、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される滑沢剤を含む、請求項66記載の組成物。
- プロピレングリコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗菌剤を含む、請求項66記載の組成物。
- ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エデト酸二ナトリウム、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される抗酸化物質を含む、請求項66記載の組成物。
- エチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、またはそれらの2つもしくはそれ以上の混合物からなる群より選択される湿潤剤を含む、請求項66記載の組成物。
- カルボマー、ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、モノステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステル、ステアリン酸、およびそれらの2つまたはそれ以上の混合物からなる群より選択される乳化剤を含む、請求項66記載の組成物。
- 局所投与用に製剤化されている、請求項66記載の組成物。
- 膣投与および/または直腸投与用に製剤化されている、請求項66記載の組成物。
- 含嗽液として製剤化されている、請求項66記載の組成物。
- HIV感染に曝露される危険性がある対象を選択する段階;
非機能的CXCR1/CXCR2結合ドメインを有する単離されたLukEタンパク質またはそのポリペプチドを含む、請求項46、請求項52、または請求項66記載の組成物を提供する段階; および
組織における細胞のHIV感染性を阻害するのに有効な条件の下で対象の組織を組成物と接触させ、それにより対象においてHIV感染を予防する段階
を含む、対象においてHIV感染を予防する方法。 - 炎症状態を有する対象を選択する段階、および
選択した対象に、炎症状態を処置するのに有効な条件の下で請求項46または請求項52記載の組成物を投与する段階
を含む、対象において炎症状態を処置する方法。 - 炎症状態が急性炎症状態である、請求項76記載の方法。
- 急性炎症状態が限局性である、請求項77記載の方法。
- 急性炎症状態が皮膚または軟組織における感染創傷である、請求項77記載の方法。
- 炎症状態が、関節リウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、I型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変症、炎症性腸疾患、結核症、皮膚創傷および皮膚感染、組織膿瘍、毛包炎、骨髄炎、肺炎、熱傷様皮膚症候群、敗血症、化膿性関節炎、心筋炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、アレルギー性接触皮膚炎、急性過敏症、ならびに急性神経炎症性傷害からなる群より選択される、請求項76記載の方法。
- 移植片対宿主病(GVHD)を有する対象またはGVHDを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象において移植片対宿主病(GVHD)を予防または処置するのに有効な量で請求項46または請求項52記載の組成物を投与する段階
を含む、対象においてGVHDを予防または処置する方法。 - がんを有する対象またはがんを有する危険性がある対象を選択する段階、および
選択した対象に、対象においてがんを予防または処置するのに有効な量で請求項46または請求項52記載の組成物を投与する段階
を含む、対象においてがんを予防または処置する方法。 - がんが、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、および肺がんからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
- がんが転移がんである、請求項82記載の方法。
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