KR102061735B1 - 황색포도알균 약독화 장독소 및 세포독소 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 황색포도알균 약독화 장독소 단백질 및 세포독소 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 황색포도알균 장독소 단백질, 황색포도알균 세포독소 단백질, 상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 소 유방염 예방용 백신 조성물, 및 상기 백신 조성물을 소에 투여하는 단계를 포함하는 소 유방염 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황색포도알균 장독소 단백질, 황색포도알균 세포독소 단백질 및 상기 단백질을 항원으로 포함한 백신 조성물을 사용하면 모든 종류가 아닌 몇 가지의 항원을 포함시킨 백신으로도 국내에서 발현빈도가 높은 황색포도알균 장독소 및 세포독소 모든 종류에 대해 효과적으로 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있어 더욱 경제적으로 산업에서 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 소 유방염 예방용 백신 조성물은 우수한 안전성 및 높은 CFU의 황색포도알균 공격접종 시에도 효과적인 소 유방염 예방 및 치료 효과를 가지고 있어, 향후 황색포도알균 백신 및 예방 관련 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 황색포도알균 약독화 장독소 단백질 및 세포독소 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 황색포도알균 장독소 단백질, 황색포도알균 세포독소 단백질, 상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 소 유방염 예방용 백신 조성물, 및 상기 백신 조성물을 소에 투여하는 단계를 포함하는 소 유방염 예방 방법에 관한 것이다.
젖소 유방염은 유질 및 산유량에 직접적으로 영향을 주기 때문에 낙농산업에 가장 경제적 피해를 초래하는 질병이다. 특히 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 유방염을 일으키는 원인균 중 가장 중요한 원인체로 다제내성으로 인한 항생제 치료가 어려우며 치료 후에도 예후가 좋지 않아 황색포도상구균에 의한 유방염 감염우는 통상 토대가 권장된다. 따라서 황색포도상구균 유방염 관리를 위해서는 백신 접종을 통한 예방이 가장 효과적인 방법으로 알려져있다. 그러나 현재 개발 중이거나 개발된 백신은 포도상구균 균체에 존재하는 단백질 혹은 캡슐을 기초로 개발되었으나 이들 항원에 대한 변이주가 존재하여 실질적인 예방효과를 보이지 못하고 있으며, 국내 황색포도상구균에서 높은 빈도로 분포하는 병원성인자 및 캡슐 타입 등과 일치하지 않아 예방 효과가 낮다. 황색포도상구균에 의한 유방염은 병원성 인자간의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하며 황색포도상구균이 산생하는 장독소 및 세포독성인자에 의해 유방염이 크게 증가되기 때문에 효과적인 황색포도상구균에 의한 유방염 예방 및 치유를 위해서는 이들 병원성 인자에 대한 방어기작이 필수적인 실정이다.
이에 본 발명자들은 효과적인 황색포도상구균에 의한 유방염 예방 및 치유를 위해 연구하던 중, 국내 젖소의 유방염에서 분리된 황색포도상구균에서 가장 빈번히 발생하는 병원성 인자를 선별하여 약독화 장독소 및 세포독소를 개발하고 이를 포함한 백신의 우수한 안전성 및 공격접종에 대한 뛰어난 방어능을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 황색포도알균 장독소 단백질, 황색포도알균 세포독소 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 삽입된 형질전환체, 상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 소 유방염 예방용 백신 조성물, 및 상기 백신 조성물을 소에 투여하는 단계를 포함하는 소 유방염 예방 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진, 황색포도알균 장독소 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 또는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진, 황색포도알균 세포독소 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질; 및 서열번호 15, 서열번호 23 및 서열번호 27로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질;을 항원으로 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 소 유방염 예방용 백신 조성물을 소에 투여하는 단계;를 포함하는, 소 유방염 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 황색포도알균 장독소 단백질, 황색포도알균 세포독소 단백질 및 상기 단백질을 항원으로 포함한 백신 조성물을 사용하면 모든 종류가 아닌 몇 가지의 항원을 포함시킨 백신으로도 국내에서 발현빈도가 높은 황색포도알균 장독소 및 세포독소 모든 종류에 대해 효과적으로 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있어 더욱 경제적으로 산업에서 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 소 유방염 예방용 백신 조성물은 우수한 안전성 및 높은 CFU의 황색포도알균 공격접종 시에도 효과적인 소 유방염 예방 및 치료 효과를 가지고 있어, 향후 황색포도알균 백신 및 예방 관련 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 정제된 약독화 장독소 및 세포독소 재조합 단백질의 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 항원의 효능을 확인하기 위해, PBS만 접종한 대조군 그룹, 본 발명의 장독소 단백질만 접종한 그룹, 본 발명의 세포독소 단백질만 접종한 그룹, 본 발명의 장독소와 세포독소를 모두 혼합하여 접종한 그룹에서 마우스 공격접종 실험을 통해 생존율을 측정하여 나타낸 도이다.
도 3은 최적의 항체반응을 유도하는 항원량을 결정하기 위하여, 항원량에 따른 IgG 항체가 변화를 측정하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명 백신의 안전성을 확인하기 위하여, 백신 접종군과 대조군의 체세포수와 산유량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명 백신의 유방염 예방 효과와 비교하기 위하여, 대조군(PBS+수산화알루미늄겔)에서 4~10 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화 측정을 통해 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 백신군 (각 약독화 장독소 100 ug+각 약독화 세포독소 100 ug+수산화알루미늄겔)에서 43~48 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과이며, 도 6a는 45 및 48 CFU에서의 결과를, 도 6b은 43 및 46 CFU에서의 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 백신군에서 83~95 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과이며, 도 7a는 88 및 95 CFU에서의 결과를, 도 7b는 83 및 89 CFU에서의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명 세포독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기에 앞서, 대조군인 Bovine Leukocyte를 대상으로 7가지 세포독소(HlgA, HlgB, HlgC, LukD, LukE, LukF, LukS) 항원 조합에 따른 propidium iodide 의 세포내 침투 정도를 flow cytometry로 측정하여 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명 세포독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기 위하여, 중화항체를 사용한 세포독소 중화능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명 장독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기 위하여, 중화항체를 사용한 장독소 중화능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 중화능을 가진 세포독소 3종 및 장독소 3종(HlgA, LukE, LukS, SEG, SEI, SEM)을 포함한 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 26 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 항원의 효능을 확인하기 위해, PBS만 접종한 대조군 그룹, 본 발명의 장독소 단백질만 접종한 그룹, 본 발명의 세포독소 단백질만 접종한 그룹, 본 발명의 장독소와 세포독소를 모두 혼합하여 접종한 그룹에서 마우스 공격접종 실험을 통해 생존율을 측정하여 나타낸 도이다.
도 3은 최적의 항체반응을 유도하는 항원량을 결정하기 위하여, 항원량에 따른 IgG 항체가 변화를 측정하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명 백신의 안전성을 확인하기 위하여, 백신 접종군과 대조군의 체세포수와 산유량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명 백신의 유방염 예방 효과와 비교하기 위하여, 대조군(PBS+수산화알루미늄겔)에서 4~10 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화 측정을 통해 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 백신군 (각 약독화 장독소 100 ug+각 약독화 세포독소 100 ug+수산화알루미늄겔)에서 43~48 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과이며, 도 6a는 45 및 48 CFU에서의 결과를, 도 6b은 43 및 46 CFU에서의 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 백신군에서 83~95 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과이며, 도 7a는 88 및 95 CFU에서의 결과를, 도 7b는 83 및 89 CFU에서의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명 세포독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기에 앞서, 대조군인 Bovine Leukocyte를 대상으로 7가지 세포독소(HlgA, HlgB, HlgC, LukD, LukE, LukF, LukS) 항원 조합에 따른 propidium iodide 의 세포내 침투 정도를 flow cytometry로 측정하여 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명 세포독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기 위하여, 중화항체를 사용한 세포독소 중화능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명 장독소 단백질 항원의 교차 중화능을 확인하기 위하여, 중화항체를 사용한 장독소 중화능 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 중화능을 가진 세포독소 3종 및 장독소 3종(HlgA, LukE, LukS, SEG, SEI, SEM)을 포함한 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여, 26 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 후 임상증상을 확인하기 위해 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진, 황색포도알균 장독소 단백질을 제공한다.
본 발명의 황색포도알균은 Staphylococcus aureus 이며, “황색포도상구균”, "스태프(staph)," "스태프. 아우레우스(Staph. aureus)" 또는 "에스. 아우레우스(S. aureus)"로도 불리는 미생물이다. 또한 상기 황색포도알균은 소 유방염의 중요한 원인균 중 하나로서, 수의학 분야에서도 매우 주목하고 있는 세균 중 하나이다. 또한 본 발명의 황색포도알균은 바람직하게는 젖소의 유방염 원유시료로부터 분리된 미생물일 수 있다.
또한 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 황색포도알균 장독소 SEG 유래이며, 서열번호 4의 아미노산 서열은 황색포도알균 장독소 SEI 유래이며, 서열번호 6의 아미노산 서열은 황색포도알균 장독소 SEM 유래이며, 서열번호 8의 아미노산 서열은 황색포도알균 장독소 SEN 유래이며, 서열번호 10의 아미노산 서열은 황색포도알균 장독소 SEO 유래일 수 있다. 상기 황색포도알균 장독소 SEG, SEI, SEM, SEN 및 SEO은 국내에서 발현빈도가 높은 장독소이다.
본 발명의 황색포도알균 장독소 단백질은 바람직하게는 약독화된 재조합 단백질일 수 있다. 또한 본 발명의 황색포도알균 장독소 단백질은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성(homology)"은 단백질 또는 폴리펩타이드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트(percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
상기 황색포도알균 장독소 단백질은 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 황색포도알균 장독소 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만 원심분리, 여과, 추출, 분무건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 분리될 수 있다. 더 나아가 황색포도알균 장독소 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용 해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열은 서열번호 9의 염기서열에 의해 암호화될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 황색포도알균 게놈 DNA 또는 각 유전자를 주형으로 목적한 염기서열 또는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 염기서열을 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 다양한 염기서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 유전자의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 염기서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한 상기 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10의 아미노산 서열은 MHC class II 결합 부위 아미노산인 히스티딘(Histidine) 및 아스파르트산(Aspartic acid)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 서열일 수 있다. 상기 “치환”은 바람직하게는 중첩 PCR을 통해 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같이 치환함으로써 본 발명의 황색포도알균의 장독소가 MHC class II에 강한 결합력으로 결합하는 것을 억제시킴으로써 약독화시킬 수 있다.
본 발명의 상기 황색포도알균 장독소 단백질은, 백신 조성물에 항원으로 사용하였을 때 5가지 황색포도알균 장독소(SEG, SEI, SEM, SEN 및 SEO) 항원 모두를 중화시킬 수 있으며 소에서 황색포도알균으로 주로 유발되는 유방염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 또는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진, 황색포도알균 세포독소 단백질을 제공한다.
상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 황색포도알균 세포독소 HlgA 유래이며, 서열번호 19의 아미노산 서열은 황색포도알균 세포독소 HlgC 유래이며, 서열번호 23의 아미노산 서열은 황색포도알균 세포독소 LukE 유래이며, 서열번호 27의 아미노산 서열은 황색포도알균 세포독소 LukS 유래일 수 있다. 상기 황색포도알균 세포독소 HlgA, HlgC, LukE 및 LukS은 국내에서 발현빈도가 높은 세포독소이다.
본 발명의 황색포도알균 세포독소 단백질은 바람직하게는 약독화된 재조합 단백질일 수 있다. 또한 본 발명의 황색포도알균 세포독소 단백질은 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. "상동성(homology)"은 단백질 또는 폴리펩타이드 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트(percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
상기 황색포도알균 세포독소 단백질은 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 황색포도알균 세포독소 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만 원심분리, 여과, 추출, 분무건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 분리될 수 있다. 더 나아가 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용 해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.
또한 상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 서열번호 14의 염기서열, 서열번호 19의 아미노산 서열은 서열번호 18의 염기서열, 서열번호 23의 아미노산 서열은 서열번호 22의 염기서열, 서열번호 27의 아미노산 서열은 서열번호 26의 염기서열에 의해 암호화된 후 AXA 모티프(motif)가 절단된 서열일 수 있다. 상기 서열번호 14의 염기서열은 서열번호 11, 12 및 13의 염기서열로 구성되며, 서열번호 18의 염기서열은 서열번호 11, 16 및 17의 염기서열로 구성되며, 서열번호 22의 염기서열은 서열번호 11, 20 및 21의 염기서열로 구성되며, 서열번호 26의 염기서열은 서열번호 11, 24 및 25의 염기서열로 구성된 서열일 수 있다. 또한 상기 서열번호 11의 염기서열은 ETA 프로모터(exfoliative toxin A 프로모터) 염기서열이며, 서열번호 12, 16, 20 및 24의 염기서열은 시그널 펩타이드(signal peptide) 염기서열이며, 서열번호 13, 17, 21 및 25의 염기서열은 성숙 단백질(mature protein) 염기서열일 수 있다. 상기 ETA 프로모터는 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스 균주(Staphylococcus aureus strain) LAC균주의 staphylococcal exfoliative toxin A 프로모터(ETA 프로모터)일 수 있으며, 상기와 같이 ETA 프로모터, 시그널 펩타이드 및 성숙 단백질 염기서열을 결합함으로써 암호화되어 분비되는 황색포도알균 세포독소 단백질을 용이하게 정제할 수 있다.
또한 상기 서열번호 15의 아미노산 서열은 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 19의 아미노산 서열은 서열번호 17의 염기서열, 서열번호 23의 아미노산 서열은 서열번호 21의 염기서열, 서열번호 27의 아미노산 서열은 서열번호 25의 염기서열에 의해 암호화될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한 상기 서열번호 11 내지 14, 서열번호 16 내지 18, 서열번호 20 내지 22 및 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 염기서열 또는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 황색포도알균 게놈 DNA 또는 각 유전자를 주형으로 목적한 염기서열 또는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 염기서열을 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 다양한 염기서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 서열번호 11 내지 14, 서열번호 16 내지 18, 서열번호 20 내지 22 및 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 염기서열 또는 유전자의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 염기서열 또는 유전자는 서열번호 11 내지 14, 서열번호 16 내지 18, 서열번호 20 내지 22 및 서열번호 24 내지 26으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 염기서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 황색포도알균 세포독소 단백질은, 백신 조성물에 항원으로 사용하였을 때 7가지 황색포도알균 세포독소(HlgA, HlgB, HlgC, LukD, LukE, LukF 및 LukS) 항원 모두를 중화시킬 수 있으며 소에서 황색포도알균으로 주로 유발되는 유방염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 황색포도알균 장독소 단백질 또는 황색포도알균 세포독소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 유전자 또는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 염기서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 용어, “형질전환”은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것이며, 본 발명의 “형질전환체”는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자재조합체를 포함한다. 상기 본 발명의 형질전환체는 Staphylococcus aureus RN4220 균주 또는 Escherichia coli BL21 균주일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질; 및 서열번호 15, 서열번호 23 및 서열번호 27로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질;을 항원으로 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 “소 유방염”은, 바람직하게는 젖소에서 발생하는 유방염이며 이는 자연계에 분포되어 있는 여러 가지 미생물 감염에 의해 유선조직에 염증이 유발되는 질병이다. 또한 증상의 정도에 따라 유량감소, 유질저하, 발열, 식욕감퇴 등의 증상을 나타내며, 심한 경우에는 젖소로서의 기능을 상실할 뿐만 아니라 전염성이 있어 폐사되는 위기에까지 처하게 된다. 유방염으로 인한 유량감소 및 유질저하는 낙농가의 경제적 손실과 직접 관련되며, 특히 유질에 따라 유대를 차등지불하는 현행 제도하에서는 그 의미가 더욱 크다고 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “예방”이란 조성물의 투여에 의해 소 유방염 증상을 억제시키거나 유방염 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 용어 '백신'은 감염증의 예방으로 사람이나 동물을 자동적으로 면역하기 위하여 쓰이는 항원을 지칭하는 것으로, 바람직하게 본 발명에서는 소 유방염의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 또한 본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신, 불활화 백신, 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 바람직하게는 유전공학 백신이다.
상기 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질은 각각 황색포도알균 장독소 SEG, SEI 및 SEM 유래이며 본 발명에서 제조한 황색포도알균 장독소 단백질이다. 또한 상기 서열번호 15, 서열번호 23 및 서열번호 27로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질은 각각 황색포도알균 세포독소 HlgA, LukE 및 LukS 유래이며 본 발명에서 제조한 황색포도알균 세포독소 단백질이다. 상기와 같은 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질; 및 서열번호 15, 서열번호 23 및 서열번호 27로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질;을 항원으로 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물을 사용하면, 황색포도알균 장독소 SEG, SEI 및 SEM 뿐만 아니라 5가지 황색포도알균 장독소(SEG, SEI, SEM, SEN 및 SEO) 항원 모두를 중화시킬 수 있다. 또한 황색포도알균 세포독소 HlgA, LukE 및 LukS 뿐만 아니라 7가지 황색포도알균 세포독소(HlgA, HlgB, HlgC, LukD, LukE, LukF 및 LukS) 항원 모두를 중화시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 소 유방염 예방용 백신 조성물을 사용하면, 모든 종류가 아닌 몇 가지의 항원을 포함시킨 백신으로도 국내에서 발현빈도가 높은 황색포도알균 장독소 및 세포독소 모든 종류에 대해 효과적으로 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있어 더욱 경제적으로 산업에서 활용될 수 있다.
또한 상기 소 유방염 예방용 백신 조성물은, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질을 더 포함할 수 있다. 상기 서열번호 8 및 서열번호 10으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질은 각각 황색포도알균 장독소 SEN 및 SEO 유래이며 본 발명에서 제조한 황색포도알균 장독소 단백질이다. 또한 상기 소 유방염 예방용 백신 조성물은, 서열번호 19로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질을 더 포함할 수 있다. 또한 상기 서열번호 19로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질은 황색포도알균 세포독소 HlgC 유래이며 본 발명에서 제조한 황색포도알균 세포독소 단백질이다. 상기 서열번호로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질 또는 황색포도알균 세포독소 단백질을 더 포함하게 되면, 소 유방염 예방 및 치료 효과를 더욱 극대화시킬 수 있다.
또한 상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 1 : 0.5 내지 1 : 1.5 (w/w), 바람직하게는 1 : 0.7 내지 1 : 1.3 (w/w), 더욱 바람직하게는 1 : 0.75 내지 1 : 1 (w/w), 가장 바람직하게는 1 : 0.8 (w/w) 혼합비로 포함할 수 있다. 상기와 같은 혼합비로 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 포함하는 백신 조성물은 높은 CFU의 황색포도알균 공격접종 시에도 효과적인 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한 상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질은 각각 50 내지 200 ug, 바람직하게는 50 내지 150 ug, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 ug 포함될 수 있다. 상기와 같은 항원량으로 포함되면 백신 조성물의 최적 항체반응을 유도할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 보조제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 보조제는 임의의 다양한 보조제를 포함한다. 상기 보조제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 보조제로 ISA70, 수산화알루미늄겔, 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 바람직하게 본 발명의 백신 조성물은 수산화알루미늄겔을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 보조제 외에도 추가적으로 용매 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질이라면, 본 발명의 백신의 작용을 억제하지 않는 한, 제한 없이 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강, 경막외(eidural) 또는 다른 적절한 경로를 통하여 투여를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 근육 주사용으로 제조되어 근육내 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체가 결합된 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 있어서 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다.
상기 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 소 유방염 예방용 백신 조성물을 소에 투여하는 단계;를 포함하는, 소 유방염 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 소 유방염을 예방하기 위하여 백신 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 “약학적으로 유효한 양”으로 투여할 수 있으며, 상기 개체는 동물, 바람직하게는 가축류를 말하며, 보다 바람직하게 본 발명에서는 소를 의미한다. 상기 용어 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 미생물/바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 소 유방염 예방용 백신 조성물을 소에 투여하는 단계;를 포함하는 소 유방염 예방 방법에 따르면, 국내에서 발현빈도가 높은 황색포도알균 장독소 및 세포독소 모든 종류에 대해 효과적으로 소 유방염을 예방할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 황색포도알균 분리 및 타이핑(typing)
경기, 충북, 충남 등의 지역에서 채취된 젖소의 유방염 원유시료 766개를 혈액한천평판배지(blood agar plate)에 도말하여 황색포도알균 207개를 분리하였다. 분리된 황색포도알균의 타입 분석은 Spa typing을 사용하였다. Spa typing은 황색포도알균이 공통적으로 가지고 있는 Staphylococcal protein A의 시퀀스 차이를 이용하여 타이핑하는 기법으로 여러가지 타입의 황색포도알균이 수집되었는지 확인이 가능한 방법이다. 상기 방법을 통해 확인한 한국 젖소 유방염 원유 유래 황색포도알균의 spa 타입 및 클론 복합체(clonal complexes) 분포는 각각 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Clonal complexa (No. isolates, %) |
spa typing | No. of isolate(%) |
CC1-ST1(22, 10.6%) | t127 | 15(7.2) |
t174 | 3(1.4) | |
t286 | 4(1.9) | |
CC8-ST8(5, 1.4%) | t008 | 1(0.5) |
t304 | 4(1.9) | |
CC20-ST20(18, 8.7%) | t164 | 18(8.7) |
CC72-ST72(12. 5.8%) | t126 | 4(1.9) |
t324 | 7(3.4) | |
t664 | 1(0.5) | |
CC188-ST188(70, 33.8%) | t189 | 70(33.8) |
CC398-ST398(11, 5.3%) | t034 | 11(5.3) |
Others(59, 28.5%) |
t2883 | 9(4.3) |
t7629 | 9(4.3) | |
t698 | 7(3.4) | |
t518 | 5(2.4) | |
t267 | 4(1.9) | |
t1991 | 3(1.4) | |
t519 | 3(1.4) | |
t5821 | 3(1.4) | |
t4359 | 2(1.0) | |
t0128(1), t1234(1), t1858(1), t2441(1), t2849(1), t3563(1), t3855(1), t3887(1), t437(1), t5572(1), t701(1), t855(1), t122(1), t208(1) | 14(6.7) | |
Non typeable(10, 4.8%) | 10(4.8) | |
a. Clonal complex is based on the association with MLST in the database of Ridom SpaServer. |
Genes | Total(207) |
CC1
(n=22) |
CC8
(n=5) |
CC20
(n=18) |
CC72
(n=12) |
CC188
(n=70) |
CC398
(n=11) |
Others
(n=59) |
NT
(n=10) |
hla | 188(90.8) a | 19(84.6) | 4(80) | 18(100) | 10(83.3) | 67(95.7) | 11(100) | 50(84.7) | 9(90) |
hlb | 118(57.0) | 3(13.6) | 3(60) | 18(100) | 5(41.7) | 38(54.3) | 10(90.9) | 33(55.9) | 8(80) |
hld | 204(98.4) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 69(98.6) | 11(100) | 58(98.0) | 9(90) |
hlgA | 189(91.3) | 19(84.6) | 4(80) | 18(100) | 11(91.7) | 67(95.7) | 11(100) | 50(84.7) | 9(90) |
hlgB | 181(87.4) | 19(84.6) | 4(80) | 18(100) | 11(91.7) | 67(95.7) | 5(45.5)b | 49(83.1) | 8(80) |
hlgC | 188(90.8) | 19(84.6) | 4(80) | 18(100) | 11(91.7) | 67(95.7) | 10(90.9) | 50(84.7) | 9(90) |
lukA | 187(90.3) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 69(98.6) | 1(9.1)b | 51(86.4) | 9(90) |
lukB | 185(89.4) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 69(98.6) | 1(9.1)b | 49(83.1) | 9(90) |
lukD | 186(89.9) | 22(100) | 5(100) | 16(88.9) | 12(100) | 68(97.1) | 3(27.3)b | 52(88.1) | 8(80) |
lukE | 186(89.9) | 22(100) | 5(100) | 16(88.9) | 12(100) | 68(97.1) | 3(27.3)b | 52(88.1) | 8(80) |
lukF-pv | 1(0.5) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 1(9.1) | 0(0) | 0(0) |
lukS-pv | 1(0.5) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 1(9.1) | 0(0) | 0(0) |
lukM | 25(12.1) | 5(22.7) | 1(20) | 2(11.1) | 0(0) | 8(11.4) | 0(0) | 9(15.3) | 0(0) |
lukF' | 4(1.9) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 3(4.3) | 0(0) | 1(1.7) | 0(0) |
bap | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) |
clfA | 150(72.5) | 20(90.9) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 37(52.9)b | 8(72.7) | 40(67.8) | 10(100) |
clfB | 178(86.0) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 69(98.6) | 2(18.2)b | 45(76.3) | 5(50) |
ebh | 198(95.7) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 70(100) | 8(72.2) | 55(93.2) | 8(80) |
emp | 183(88.4) | 22(100) | 5(100) | 17(94.4) | 12(100) | 70(100) | 1(9.1)b | 48(81.4) | 8(80) |
fbpA | 206(99.5) | 22(100) | 5(100) | 18(100) | 12(100) | 70(100) | 11(100) | 58(98.3) | 10(100) |
fnbA | 128(61.8) | 12(54.5) | 3(60) | 12(66.7) | 11(91.7) | 47(67.1) | 1(9.1)b | 35(59.3) | 7(70) |
fnbB | 178(86.0) | 22(100) | 5(100) | 14(77.8) | 11(91.7) | 69(98.6) | 10(90.9) | 44(74.6) | 3(30) |
chp | 48(23.2) | 0(0) | 0(0) | 1(5.6) | 5(41.7) | 19(27.1) | 0(0) | 21(35.6) | 1(10) |
sak | 80(38.6) | 19(86.4) | 1(20) | 1(5.6) | 5(41.7) | 30(42.9) | 0(0) | 21(35.6) | 2(20) |
scn | 75(36.2) | 19(86.4) | 1(20) | 1(5.6) | 4(33.3) | 28(40) | 0(0) | 19(32.2) | 2(20) |
Sa3 int | 103(49.8) | 17(77.3) | 2(40) | 6(33.3) | 5(41.7) | 34(48.6) | 1(9.1)b | 35(59.3) | 2(20) |
SaPI5 int | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) |
bsa | 54(26.1) | 22(100) | 5(100) | 1(5.6) | 0(0) | 15(21.4) | 0(0) | 6(10.2) | 5(50) |
spl | 190(91.8) | 22(100) | 5(100) | 17(94.4) | 12(100) | 70(100) | 1(9.1)b | 54(91.5) | 9(90) |
arcA | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) |
sea | 21(10.1) | 17(77.3) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 4(6.8) | 0(0) |
seb | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) |
sec | 12(5.8) | 3(13.6) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 2(2.9) | 0(0) | 6(10.2) | 1(10) |
sed | 24(11.6) | 0(0) | 0(0) | 2(11.1) | 8(66.7) | 6(8.6) | 0(0) | 6(10.2) | 2(20) |
see | 16(7.7) | 0(0) | 0(0) | 1(5.6) | 0(0) | 0(0) | 1(9.1) | 9(15.3) | 5(50) |
seg | 63(30.4) | 3(13.6) | 0(0) | 18(100)b | 12(100)b | 8(11.4) | 0(0) | 18(30.5) | 4(40) |
seh | 24(11.6) | 22(100) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 2(3.4) | 0(0) |
sei | 94(45.4) | 3(13.6) | 1(20) | 18(100)b | 12(100)b | 18(25.7) | 2(18.2) | 33(55.9) | 7(70) |
selj | 25(12.1) | 3(13.6) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 11(15.7) | 2(18.2) | 8(13.6) | 1(10) |
selk | 46(22.2) | 14(63.6) | 0(0) | 1(77.8) | 0(0) | 2(2.9)b | 5(45.5) | 9(15.3) | 2(20) |
sell | 9(4.3) | 3(16.7) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 5(8.5) | 1(10) |
selm | 58(28.0) | 2(9.1) | 0(0) | 18(100)b | 11(91.7)b | 5(7.1) | 0(0) | 18(30.5) | 4(40) |
seln | 60(29.0) | 2(9.1) | 0(0) | 18(100)b | 12(100)b | 1(1.4) | 0(0) | 22(37.3) | 5(50) |
selo | 65(31.4) | 0(0) | 2(40) | 18(100)b | 12(100)b | 3(4.3) | 1(9.1) | 23(39.0) | 6(60) |
selp | 8(3.9) | 3(13.6) | 1(20) | 0(0) | 0(0) | 1(1.4) | 0(0) | 2(3.4) | 1(10) |
selq | 90(43.5) | 16(72.7) | 1(20) | 9(50) | 0(0) | 34(48.6) | 1(9.1)b | 29(49.2) | 0(0) |
selr | 8(3.9) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 5(7.1) | 0(0) | 2(3.4) | 1(10) |
selu | 13(6.3) | 0(0) | 0(0) | 5(27.8) | 0(0) | 1(1.4) | 1(9.1) | 5(8.5) | 1(10) |
tst-1 | 5(2.4) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 2(2.9) | 2(18.2) | 1(1.7) | 0(0) |
SCCmec | 23(11.1) | 1(5.6) | 0(0) | 1(5.6) | 7(58.3)b | 8(11.4) | 0(0) | 6(10.1) | 0(0) |
a. Number in parenthesis indicates a ratio of positive isolates in each group b. The difference is significant at the 05 by one-way ANOVA for multiple comparisons(P<05) |
실시예 2. 황색포도알균 병원성 인자 확인
황색포도알균(Staphylococcus aureus)은 세포독소, 장독소, 세포부착인자, 항생제 내성 유전자 등 다양한 병원성 인자를 가지고 있으며 50종의 황색포도알균의 병원성 인자를 multiplex PCR 기법을 통하여 확인이 가능하다. 분리된 207개 균주를 대상으로 타입별 보유하고 있는 병원성 유전자를 multiplex PCR 기법을 이용하여 확인하였다.
실시예 3. 약독화 장독소 및 세포독소 단백질 제작
실시예 3-1. 약독화 장독소 단백질 제작
한국형 유방염 백신을 제조하기 위해, 발현빈도가 높은 황색포도알균 장독소 SEG, SEI, SEM, SEN 및 SEO에 대해 약독화한 재조합(mutant) 클론을 제작하였다. 각각의 장독소 아미노산 치환부위는 항원제시세포의 MHC class II와 높은 결합을 하는데 관여하는 장독소의 히스티딘(Histidine) 및 아스파르트산(Aspartic acid)를 대상으로 치환된 염기서열을 보유한 프라이머를 사용하여 Overlapping PCR법에 의해 치환하였다. 치환된 각각의 단백질 시퀀스는 his-tag을 가지는 벡터에 옮겨져 이미다졸(Imidazole) 농도 구배법으로 정제하였다. 상기 방법을 통해 제작한 약독화 장독소의 염기서열과 아미노산서열은 표 3에 나타내었다. 표 3에서 볼드체로 표시된 부분이 치환부위를 나타낸다.
서열번호 | 명칭 | 서열 |
1 | Mutant SEG | caacccgatcctaaattagacgaactaaataaagtaagtgattataaaaataataagggaactatgggtgctgtaatgaatctttatacgtctccacctgttgaaggaagaggagttattaattctagacagtttttatctcatgatttaatttttccaattgagtataagagttataatgaggttaaaactgaattagaaaatacagaattagctaacaattataaagataaaaaagtagacatttttggcgttccatatttttatacatgtataatacctaaatctgaaccggatataaaccaaaattttggaggttgttgtatgtatggtggtcttacatttaatagttcagaaaatgaaagagataaattaattactgtacaggtaacaatcgacaatagacaatcacttggatttacaataactacaaataagaatatggttactattcaggaactagattacaaagcaagacactggctcactaaagaaaaaaagctatacgaggctgctggttctgcatttgaatctggatatataaaatttactgaaaagaacaatacaagtttttggtttgacttatttcctaaaaaagaactagtaccttttgttccatataagtttttaaatatttacggagataataaagttgttgattctaagagtattaaaatggaagtatttcttaatactcactga |
2 | Mutant SEG | QPDPKLDELNKVSDYKNNKGTMGAVMNLYTSPPVEGRGVINSRQFLSHDLIFPIEYKSYNEVKTELENTELANNYKDKKVDIFGVPYFYTCIIPKSEPDINQNFGGCCMYGGLTFNSSENERDKLITVQVTIDNRQSLGFTITTNKNMVTIQELDYKARHWLTKEKKLYEAAGSAFESGYIKFTEKNNTSFWFDLFPKKELVPFVPYKFLNIYGDNKVVDSKSIKMEVFLNTH |
3 | Mutant SEI | gatattggtgtaggtaacttaagaaatttctatacaaaacatgattatatagatttaaaaggcgtcacagataaaaacctacctattgcaaatcaactcgaattttcaacaggtaccaatgatttgatctcagaatctaataattgggacgaaataagtaaatttaaaggaaagaaactggatatttttggcattgattataatggtccttgtaaatctaaatacatgtatggaggggccactttatcaggacaatacttaaattctgctagaaaaatccctattaatctttgggttaatggcaaacataaaacaatttctactgacaaaatagcaactaataaaaaactagtaacagctcaagaaattgatgttaaattaagaagatatcttcaagaagaatacaatatatatggtaataataacactggtaaaggcaaagaatatggatataaatctaaattttattcaggttttaataatgggaaagttttatttcatttaaataatgaaaaatcattttcatatgatttgttttatacaggagatggactgcctgtaagttttttgaaaatttatgaagataataaaataatagaatctgaaaaatttgctcttgctgtcgaaatatcatatgtagatagtaactaa |
4 | Mutant SEI | DIGVGNLRNFYTKHDYIDLKGVTDKNLPIANQLEFSTGTNDLISESNNWDEISKFKGKKLDIFGIDYNGPCKSKYMYGGATLSGQYLNSARKIPINLWVNGKHKTISTDKIATNKKLVTAQEIDVKLRRYLQEEYNIYGNNNTGKGKEYGYKSKFYSGFNNGKVLFHLNNEKSFSYDLFYTGDGLPVSFLKIYEDNKIIESEKFALAVEISYVDSN |
5 | Mutant SEM | gatgtcggagttttgactcttaggaactattatggtagctatccaattgaagaccaccaaagtattaatcctgaaaataatcatctttcgcatcaattagttttttctatggataattcgacagtaacagctgaatttaagaacgttgatgatgtaaagaaattcaaaaatcatgctgtagatgtatatggtctaagttatagtggatattgtttgaaaaacaaatatatatacggtggagttacattagcaggtgattatttagagaaatctagacgtattcctattaatctttgggttaatggagaacatcaaactatatctactgacaaagtatcaactaataaaaagttagtaacagctcaagaaattgatactaaattaagaagatatctacaagaagaatataatatttatggctttaatgatacaaataaaggaagaaattatggtaataagtcaaaatttagttctggatttaatgcaggaaaaatattatttcatttgaatgatggttcatcattttcttatgacttatttgatactggaacaggacaagctgaaagtttcttaaaaatatataatgacaacaaaactgtcgaaactgaaaaattcgctttagctgtagaaatatcttataaggacgaaagttga |
6 | Mutant SEM | DVGVLTLRNYYGSYPIEDHQSINPENNHLSHQLVFSMDNSTVTAEFKNVDDVKKFKNHAVDVYGLSYSGYCLKNKYIYGGVTLAGDYLEKSRRIPINLWVNGEHQTISTDKVSTNKKLVTAQEIDTKLRRYLQEEYNIYGFNDTNKGRNYGNKSKFSSGFNAGKILFHLNDGSSFSYDLFDTGTGQAESFLKIYNDNKTVETEKFALAVEISYKDES |
7 | Mutant SEN | gaagtagacaaaaaagatttaaagaaaaaatctgatctagatagtagtaagttatttaatttaacaagctattatactgatataacgtggcaattagacgagtcaaataaaattagtacagatcaactactgaataatactataatattaaaaaatattgatatatccgtacttaaaacttctagtttgaaagttgagtttaactcatcagatttagcaaatcaatttaaaggaaaaaatatagatatttatggactgtattttggaaataaatgtgtaggcttaactgaagaaaaaacatcatgcttatacggaggagttacgatacatgatggaaatcaattagatgaagagaaagttataggcgttaatgtatttaaagatggtgtccaacaagaaggttttgttataaaaaccaaaaaggctaaagtaacagtacaagaattagacactaaagttcgatttaaattagaaaatttatataaaatatacaataaagataccggtaacatacaaaaaggatgcattttctttcattctcataatcatcaagatcaatcattttattatgatttatataacgtaaaaggttcagtgggagcagagttttttcaattttatagtgataatagaacagttagctcatctaattatgctattgctgtatttttatataaagattaa |
8 | Mutant SEN | EVDKKDLKKKSDLDSSKLFNLTSYYTDITWQLDESNKISTDQLLNNTIILKNIDISVLKTSSLKVEFNSSDLANQFKGKNIDIYGLYFGNKCVGLTEEKTSCLYGGVTIHDGNQLDEEKVIGVNVFKDGVQQEGFVIKTKKAKVTVQELDTKVRFKLENLYKIYNKDTGNIQKGCIFFHSHNHQDQSFYYDLYNVKGSVGAEFFQFYSDNRTVSSSNYAIAVFLYKD |
9 | Mutant SEO | aatgaagaagatcctaaaatagagagtttgtgtaagaagtcaagtgtagaccctattgctttacataatattaatgatgattatataaataatcgatttacgacagtaaaatcaattgtatcaactacagaaaaattcttagacttcgatttattatttaaaagtattaattggttagatggaatatctgctgaatttaaagatttaaaagtggaatttagctcatcagcgatttctaaagaatttctaggaaagactgttgatatttatggtgtttactataaagcacattgtcgtggtgagcatcaagtggatactgcctgtacatatggtggggtaacacctcatgaaaataataaattaagcgagcctaaaaatataggagtagctgtgtataaggataatgtaaatgttaatacatttatcgttactacagataaaaagaaagttactgcacaagaacttgatattaaagtaagaacaaaattaaataatgcatataaattgtatgacagaatgactagtgatgtacaaaaaggttatattaaatttcattctcattcggagcataaagaatcattttattatgatttattttatattaaaggaaatttaccagatcaatatttgcaaatttataatgataataaaacaatagattcatcagactatgctattgctgtttatttatttacataa |
10 | Mutant SEO | NEEDPKIESLCKKSSVDPIALHNINDDYINNRFTTVKSIVSTTEKFLDFDLLFKSINWLDGISAEFKDLKVEFSSSAISKEFLGKTVDIYGVYYKAHCRGEHQVDTACTYGGVTPHENNKLSEPKNIGVAVYKDNVNVNTFIVTTDKKKVTAQELDIKVRTKLNNAYKLYDRMTSDVQKGYIKFHSHSEHKESFYYDLFYIKGNLPDQYLQIYNDNKTIDSSDYAIAVYLFT |
실시예 3-2. 세포독소 단백질 제작
분리한 황색포도알균의 각각의 세포독소는 용이하게 정제하기 위하여 스타필로코커스 아우레우스 균주(Staphylococcus aureus strain) LAC균주의 staphylococcal exfoliative toxin A 프로모터(ETA 프로모터)와 시그널 펩타이드 시퀀스(signal peptide sequence)를 세포독소 코딩 시퀀스(coding sequence)에 결합하였으며 세포내에서 산생된 세포독소가 세포벽으로 이동시에 엔도펩티다아제(endopeptidase)에 의해 AXA 모티프(motif)가 절단됨으로서 순수한 세포독소만 세포밖으로 분비되도록 제작하였다. 제작된 유전자는 Pmk4 벡터에 클로닝되어 단백질 발현 숙주인 S. aureus RN4220에 형질전환 함으로써 세균배양액 상에 원하는 세포독소가 포함되도록 하였으며 세균배양액의 세포독소는 소수성 컬럼을 통해 최종 정제하였다. 상기 방법에 사용된 서열과 이를 통해 제작한 본 발명 세포독소의 염기서열 및 아미노산 서열을 표 4에 나타내었다. 표 4의 염기서열에서 볼드체로 표시되는 서열은 시그널 펩타이드를 나타낸다.
서열번호 | 명칭 | 서열 |
11 | ETA promoter | aaatatcaacgtgagggctctagtactaacgattttttttgtgcagtatgtagaatcactgacaaggaacaaaagattaaaaatgaaaaatattggggaactattgagtggaattaacaaacgtatttaatgtttagttaattaaaagttaataaaaaataatttgttttgaaatagaaacgttatataatttttaatgtattcgaatacattaaaaaacgcaaatgttaggatgattaata |
12 | HlgA signal peptide | atgattaaaaataaaatattaacagcaactttagcagttggtttaatagcccctttagccaatccatttatagaaatttctaaagca |
13 | HlgA mature protein | gaaaataagatagaagatatcggccaaggtgcagaaatcatcaaaagaacacaagacattactagcaaacgattagctataactcaaaacattcaatttgattttgtaaaagataaaaaatataacaaagatgccctagttgttaagatgcaaggcttcattagctctagaacaacatattcagacttaaaaaaatatccatatattaaaagaatgatatggccatttcaatataatatcagtttgaaaacgaaagactctaatgttgatttaattaattatcttcctaaaaataaaattgattcagcagatgttagtcagaaattaggctataatatcggcggaaacttccaatcagcgccatcaatcggaggcagtggctcattcaactactctaaaacaattagttataatcaaaaaaactatgttactgaagtagaaagtcagaactctaaaggtgttaaatggggagtgaaagcaaattcattcgttacaccgaatggtcaagtatctgcatatgatcaatacttatttgcacaagacccaactggtccagcagcacgagactatttcgtcccagataatcaactacctcctttaattcaaagtggctttaatccatcatttattacaacattgtcacacgaaagaggtaaaggtgataaaagcgagtttgaaatcacttacggcagaaacatggatgctacatatgcttacgtgacaagacatcgtttagccgttgatagaaaacatgatgcttttaaaaaccgaaacgttacagttaaatatgaagtgaactggaaaacacatgaagtaaaaattaaaagcatcacacctaagtaa |
14 | ETA-HlgA | aaatatcaacgtgagggctctagtactaacgattttttttgtgcagtatgtagaatcactgacaaggaacaaaagattaaaaatgaaaaatattggggaactattgagtggaattaacaaacgtatttaatgtttagttaattaaaagttaataaaaaataatttgttttgaaatagaaacgttatataatttttaatgtattcgaatacattaaaaaacgcaaatgttaggatgattaataatgattaaaaataaaatattaacagcaactttagcagttggtttaatagcccctttagccaatccatttatagaaatttctaaagcagaaaataagatagaagatatcggccaaggtgcagaaatcatcaaaagaacacaagacattactagcaaacgattagctataactcaaaacattcaatttgattttgtaaaagataaaaaatataacaaagatgccctagttgttaagatgcaaggcttcattagctctagaacaacatattcagacttaaaaaaatatccatatattaaaagaatgatatggccatttcaatataatatcagtttgaaaacgaaagactctaatgttgatttaattaattatcttcctaaaaataaaattgattcagcagatgttagtcagaaattaggctataatatcggcggaaacttccaatcagcgccatcaatcggaggcagtggctcattcaactactctaaaacaattagttataatcaaaaaaactatgttactgaagtagaaagtcagaactctaaaggtgttaaatggggagtgaaagcaaattcattcgttacaccgaatggtcaagtatctgcatatgatcaatacttatttgcacaagacccaactggtccagcagcacgagactatttcgtcccagataatcaactacctcctttaattcaaagtggctttaatccatcatttattacaacattgtcacacgaaagaggtaaaggtgataaaagcgagtttgaaatcacttacggcagaaacatggatgctacatatgcttacgtgacaagacatcgtttagccgttgatagaaaacatgatgcttttaaaaaccgaaacgttacagttaaatatgaagtgaactggaaaacacatgaagtaaaaattaaaagcatcacacctaagtaa |
15 | HlgA | ENKIEDIGQGAEIIKRTQDITSKRLAITQNIQFDFVKDKKYNKDALVVKMQGFISSRTTYSDLKKYPYIKRMIWPFQYNISLKTKDSNVDLINYLPKNKIDSADVSQKLGYNIGGNFQSAPSIGGSGSFNYSKTISYNQKNYVTEVESQNSKGVKWGVKANSFVTPNGQVSAYDQYLFAQDPTGPAARDYFVPDNQLPPLIQSGFNPSFITTLSHERGKGDKSEFEITYGRNMDATYAYVTRHRLAVDRKHDAFKNRNVTVKYEVNWKTHEVKIKSITPK |
16 | HlgC signal peptide | atgcttaaaaataaaatattaactacaactttatctgtgagcttacttgcccctcttgccaatccgttattagaaaatgctaaagct |
17 | HlgC mature protein | gctaacgatactgaagacatcggtaaaggaagcgatatagaaattatcaaaaggacagaagataaaacaagtaataaatggggcgtgactcaaaatattcaatttgattttgtaaaggataaaaaatataacaaagatgctttgatattaaagatgcaaggattcattagctctagaacaacatattacaactataaaaaaactaatcatgttaaagctatgcgatggccattccaatataatattggtttaaaaacaaatgataaatatgtttctttaattaattatttacctaaaaataaaattgaatctacaaacgtgagtcagacattaggatacaatatcggtggtaatttccaatcagccccatcactcggtggtaatggatcatttaactattctaaatcgattagctatacacaacaaaattatgtaagtgaagtagaacaacaaaactcaaaaagtgttttatggggcgtcaaagcgaattcattcgccactgaatcaggtcaaaaatcagcctttgatagcgatttatttgtaggctacaaacctcatagtaaagatcctagagattatttcgttccagacagtgagttaccacctcttgtacaaagtggatttaacccttcatttatcgccacagtatctcatgaaaaaggttcaagcgatacaagcgaatttgaaattacttacggaagaaacatggatgtcactcatgccattaaaagatcaacgcattatggcaacagttatttagacggacatagagtccataatgcatttgtaaatagaaactatactgtgaaatacgaggtcaattggaagactcatgaaatcaaggtgaaaggacagaattga |
18 | ETA-HlgC | aaatatcaacgtgagggctctagtactaacgattttttttgtgcagtatgtagaatcactgacaaggaacaaaagattaaaaatgaaaaatattggggaactattgagtggaattaacaaacgtatttaatgtttagttaattaaaagttaataaaaaataatttgttttgaaatagaaacgttatataatttttaatgtattcgaatacattaaaaaacgcaaatgttaggatgattaataatgcttaaaaataaaatattaactacaactttatctgtgagcttacttgcccctcttgccaatccgttattagaaaatgctaaagctgctaacgatactgaagacatcggtaaaggaagcgatatagaaattatcaaaaggacagaagataaaacaagtaataaatggggcgtgactcaaaatattcaatttgattttgtaaaggataaaaaatataacaaagatgctttgatattaaagatgcaaggattcattagctctagaacaacatattacaactataaaaaaactaatcatgttaaagctatgcgatggccattccaatataatattggtttaaaaacaaatgataaatatgtttctttaattaattatttacctaaaaataaaattgaatctacaaacgtgagtcagacattaggatacaatatcggtggtaatttccaatcagccccatcactcggtggtaatggatcatttaactattctaaatcgattagctatacacaacaaaattatgtaagtgaagtagaacaacaaaactcaaaaagtgttttatggggcgtcaaagcgaattcattcgccactgaatcaggtcaaaaatcagcctttgatagcgatttatttgtaggctacaaacctcatagtaaagatcctagagattatttcgttccagacagtgagttaccacctcttgtacaaagtggatttaacccttcatttatcgccacagtatctcatgaaaaaggttcaagcgatacaagcgaatttgaaattacttacggaagaaacatggatgtcactcatgccattaaaagatcaacgcattatggcaacagttatttagacggacatagagtccataatgcatttgtaaatagaaactatactgtgaaatacgaggtcaattggaagactcatgaaatcaaggtgaaaggacagaattga |
19 | HlgC | ANDTEDIGKGSDIEIIKRTEDKTSNKWGVTQNIQFDFVKDKKYNKDALILKMQGFISSRTTYYNYKKTNHVKAMRWPFQYNIGLKTNDKYVSLINYLPKNKIESTNVSQTLGYNIGGNFQSAPSLGGNGSFNYSKSISYTQQNYVSEVEQQNSKSVLWGVKANSFATESGQKSAFDSDLFVGYKPHSKDPRDYFVPDSELPPLVQSGFNPSFIATVSHEKGSSDTSEFEITYGRNMDVTHAIKRSTHYGNSYLDGHRVHNAFVNRNYTVKYEVNWKTHEIKVKGQN |
20 | LukE signal peptide | atgtttaagaaaaaaatgttagctgcaactttgtcagtaggactgattgcacctttagcatctccgattcaagaatctagagca |
21 | LukE mature protein | aatactaatattgaaaatattggtgatggtgctgaagtaatcaaacgtacggaggatgtaagtagtaagaaatggggcgttactcaaaatgtccaattcgactttgtaaaagataaaaaatataacaaagacgctttaattgttaaaatgcaaggttttattaattccagaacttcattttcagatgtgaagggtagtggatatgaattaactaaacgaatgatttggccattccaatataatataggactgacgactaaagatccaaatgttagcttaatcaattaccttcctaaaaacaaaatagaaactactgatgttggtcaaacattaggatataacattggaggtaatttccagtcagcaccatctataggtggcaatggctcatttaattattctaaaacaattagttatacccaaaagagttatgtcagtgaagtagacaagcaaaactcaaaatctgttaaatggggtgttaaagcaaacgaatttgttacgcctgatggaaaaaaatctgcgcatgatagatatttattcgtacaaagtccaaatggtccaacaggttcagcaagagaatattttgctcctgataatcaattgccacctttagttcaaagtggctttaatccatcgtttatcactacactatcacatgaaaaaggttcaagtgatacgagtgaatttgaaatttcatatggtagaaacttagatattacatatgcgactttattccctagaactggtatttacgcagaaagaaagcataatgcatttgtaaatagaaactttgtagttagatatgaagttaattggaaaacacacgaaattaaagtgaaaggacataattaa |
22 | ETA-LukE | aaatatcaacgtgagggctctagtactaacgattttttttgtgcagtatgtagaatcactgacaaggaacaaaagattaaaaatgaaaaatattggggaactattgagtggaattaacaaacgtatttaatgtttagttaattaaaagttaataaaaaataatttgttttgaaatagaaacgttatataatttttaatgtattcgaatacattaaaaaacgcaaatgttaggatgattaataatgtttaagaaaaaaatgttagctgcaactttgtcagtaggactgattgcacctttagcatctccgattcaagaatctagagcaaatactaatattgaaaatattggtgatggtgctgaagtaatcaaacgtacggaggatgtaagtagtaagaaatggggcgttactcaaaatgtccaattcgactttgtaaaagataaaaaatataacaaagacgctttaattgttaaaatgcaaggttttattaattccagaacttcattttcagatgtgaagggtagtggatatgaattaactaaacgaatgatttggccattccaatataatataggactgacgactaaagatccaaatgttagcttaatcaattaccttcctaaaaacaaaatagaaactactgatgttggtcaaacattaggatataacattggaggtaatttccagtcagcaccatctataggtggcaatggctcatttaattattctaaaacaattagttatacccaaaagagttatgtcagtgaagtagacaagcaaaactcaaaatctgttaaatggggtgttaaagcaaacgaatttgttacgcctgatggaaaaaaatctgcgcatgatagatatttattcgtacaaagtccaaatggtccaacaggttcagcaagagaatattttgctcctgataatcaattgccacctttagttcaaagtggctttaatccatcgtttatcactacactatcacatgaaaaaggttcaagtgatacgagtgaatttgaaatttcatatggtagaaacttagatattacatatgcgactttattccctagaactggtatttacgcagaaagaaagcataatgcatttgtaaatagaaactttgtagttagatatgaagttaattggaaaacacacgaaattaaagtgaaaggacataattaa |
23 | LukE | NTNIENIGDGAEVIKRTEDVSSKKWGVTQNVQFDFVKDKKYNKDALIVKMQGFINSRTSFSDVKGSGYELTKRMIWPFQYNIGLTTKDPNVSLINYLPKNKIETTDVGQTLGYNIGGNFQSAPSIGGNGSFNYSKTISYTQKSYVSEVDKQNSKSVKWGVKANEFVTPDGKKSAHDRYLFVQSPNGPTGSAREYFAPDNQLPPLVQSGFNPSFITTLSHEKGSSDTSEFEISYGRNLDITYATLFPRTGIYAERKHNAFVNRNFVVRYEVNWKTHEIKVKGHN |
24 | LukS signal peptide | atgaataatagtaaaattatttctaaagttttattgtctttatctctatttactgtaggagctagtgcatttgttattcaagacgaactgatgcaaaaaaaccatgcaaaagca |
25 | LukS mature protein | gataacaatattgagaatattggtgatggcgctgaggtagtcaaaagaacagaagatacaagtagcgataagtggggggtcacacaaaatattcagtttgattttgttaaagataaaaagtataacaaagacgctttgattttaaaaatgcaaggttttatcaattcaaagactacttattacaattacaaaaacacagatcatataaaagcaatgaggtggcctttccaatacaatattggtctcaaaacaaatgaccccaatgtagatttaataaattatctacctaaaaataaaatagattcagtaaatgttagtcaaacattaggttataacataggtggtaattttaatagtggtccatcaacaggaggtaatggttcatttaattattcaaaaacaattagttataatcaacaaaactatatcagtgaagtagaacgtcaaaattcaaaaagtgttcaatggggaataaaagctaattcatttatcacatcattaggtaaaatgtctggacatgatccaaatttatttgttggatataaaccatatagtcaaaatccgagagactattttgttccagacaatgaattacccccattagtacacagtggtttcaatccttcatttattgcaactgtttctcatgaaaaaggctcaggagatacaagtgaatttgaaataacgtatggcagaaatatggatgttactcatgctactagaagaacaacacactatggcaatagttatttagaaggatctagaatacacaacgcatttgtaaacagaaattacacagttaaatatgaagtgaactggaaaactcatgaaattaaagtgaaaggacataattga |
26 | ETA-LukS | aaatatcaacgtgagggctctagtactaacgattttttttgtgcagtatgtagaatcactgacaaggaacaaaagattaaaaatgaaaaatattggggaactattgagtggaattaacaaacgtatttaatgtttagttaattaaaagttaataaaaaataatttgttttgaaatagaaacgttatataatttttaatgtattcgaatacattaaaaaacgcaaatgttaggatgattaataatgaataatagtaaaattatttctaaagttttattgtctttatctctatttactgtaggagctagtgcatttgttattcaagacgaactgatgcaaaaaaaccatgcaaaagcagataacaatattgagaatattggtgatggcgctgaggtagtcaaaagaacagaagatacaagtagcgataagtggggggtcacacaaaatattcagtttgattttgttaaagataaaaagtataacaaagacgctttgattttaaaaatgcaaggttttatcaattcaaagactacttattacaattacaaaaacacagatcatataaaagcaatgaggtggcctttccaatacaatattggtctcaaaacaaatgaccccaatgtagatttaataaattatctacctaaaaataaaatagattcagtaaatgttagtcaaacattaggttataacataggtggtaattttaatagtggtccatcaacaggaggtaatggttcatttaattattcaaaaacaattagttataatcaacaaaactatatcagtgaagtagaacgtcaaaattcaaaaagtgttcaatggggaataaaagctaattcatttatcacatcattaggtaaaatgtctggacatgatccaaatttatttgttggatataaaccatatagtcaaaatccgagagactattttgttccagacaatgaattacccccattagtacacagtggtttcaatccttcatttattgcaactgtttctcatgaaaaaggctcaggagatacaagtgaatttgaaataacgtatggcagaaatatggatgttactcatgctactagaagaacaacacactatggcaatagttatttagaaggatctagaatacacaacgcatttgtaaacagaaattacacagttaaatatgaagtgaactggaaaactcatgaaattaaagtgaaaggacataattga |
27 | LukS | DNNIENIGDGAEVVKRTEDTSSDKWGVTQNIQFDFVKDKKYNKDALILKMQGFINSKTTYYNYKNTDHIKAMRWPFQYNIGLKTNDPNVDLINYLPKNKIDSVNVSQTLGYNIGGNFNSGPSTGGNGSFNYSKTISYNQQNYISEVERQNSKSVQWGIKANSFITSLGKMSGHDPNLFVGYKPYSQNPRDYFVPDNELPPLVHSGFNPSFIATVSHEKGSGDTSEFEITYGRNMDVTHATRRTTHYGNSYLEGSRIHNAFVNRNYTVKYEVNWKTHEIKVKGHN |
또한 상기와 같이 제조하고 정제한 약독화 장독소 및 세포독소의 재조합 단백질의 크로마토그래피 분석 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 4. 마우스 공격접종 실험
상기 실시예 3에서 제조한 5종 약독화 장독소(SAg) 및 4종 세포독소(Cytotoxin)의 항원으로서의 효능을 확인하기 위해 다음과 같이 마우스 공격접종 실험을 실시하였다. 구체적으로 3주령된 마우스 각각 8마리를 하나의 그룹으로 하여 총 4개의 그룹, 즉 PBS만 접종한 대조군 그룹, 장독소 5종만 접종한 그룹(SEG, SEI, SEM, SEN, SEO), 세포독소 4종만 접종한 그룹(HlgA, HlgC, LukE, LukS), 장독소와 세포독소를 모두 혼합하여 접종한 그룹(SEG, SEI, SEM, SEN, SEO, HlgA, HlgC, LukE, LukS)을 만들었다. 각각의 항원은 10ug씩 14일간 2회 접종되었으며, 첫 접종 후 28일째에 2×109 CFU 농도의 S.aureus K30을 복강 내 주사를 통해 공격 접종하여 7일 간의 생존율을 확인함으로써 항원의 효능을 확인하였다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹은 생존율은 0 %인 반면, 장독소만 접종한 그룹 및 세포독소만 접종한 그룹에서의 생존율은 증가함을 확인하였으며, 특히 장독소와 세포독소를 혼합하여 접종한 그룹에서는 100 %의 생존율을 나타내어 본 발명의 장독소와 세포독소를 혼합하여 제조한 백신이 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 5. 최적 항원량 설정
최적의 항체반응을 유도하는 항원량을 결정하기 위하여 우선, 각 약독화 장독소 및 세포독소 유전자 재조합 단백질 5, 10, 25, 50, 100, 150 ug을 최종 볼륨 2ml이 되도록 PBS로 희석하였다. 그 후 8 ml의 수산화알루미늄겔(2%)를 가한 후 잘 혼합하여 건유기에 들어간 착유우 각 3두에 2회씩 2주 간격으로 중둔근에 피하접종 하였다. 또한 최종 백신접종 2주 후에 혈청을 분리하여 혈청 내 총 IgG 항체가와 Sandwich ELISA 방법을 이용하여 특이항원에 대한 항체가를 측정하여 이를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이 항원량에 따른 IgG 항체가 측정 결과, 50 ug이상의 항원에서는 항체가 변화가 없는 것을 확인하였고 최종 백신 접종 농도는 개체별 차이를 고려하여 각 항원별 100 ug으로 설정하였다.
실시예 6. 백신의 안전성 확인
본 발명의 장독소 및 세포독소 백신의 안정성을 확인하기 위하여, 각각의 장독소(5종) 및 세포독소(4종) 항원을 50 ug(2두), 150 ug(6두), 300 ug(8두) 포함하는 백신을, 임신한 착유우(Holstein)에 2주 간격 2회 접종 후 출산까지 백신의 안전성을 평가하였다. 안전성을 평가하기 위해 백신 접종군과 대조군의 체세포수와 산유량을 비교하였으며, 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4 내 붉은색 그래프가 백신접종군, 파란색 그래프가 대조군을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이 안전성 확인 결과, 실험에 이용한 착유우 모두 예정일에 정상 송아지를 출산하였으며, 출산된 송아지 및 어미소에서 이상소견은 발견되지 않았다. 또한, 유방 내 감염증, 원유의 체세포변화, 산유량 변화 등의 부작용 소견도 발견되지 않아 본 발명의 장독소 및 세포독소를 포함한 백신의 안전성을 확인하였다.
실시예 7. 백신의 유방염 예방 또는 치료 효과 확인
본 발명 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 젖소에서의 공격접종에 따른 효과를 확인하였다. 구체적으로 황색포도알균 감염력이 없는 홀스타인 젖소 4두를 대상으로 대조군(PBS+수산화알루미늄겔)과 백신군(약독화 장독소 각100 ug씩 총 500ug(5종 장독소)+약독화 세포독소 각100 ug씩 총 400ug(4종 세포독소)+수산화알루미늄겔)을 건유기 2회 및 착유기 1회 접종을 실시하였다. 그 후 황색포도알균(K30)을 PBS에 희석하여 대조군(4~10 CFU 접종) 및 실험군(43~48 CFU, 83~95 CFU 접종)에 유두로 공격접종을 실시하여 효과를 확인하였으며, 대조군에서의 결과를 도 5에, 백신군에서 43~48 CFU 황색포도알균 접종 시의 결과를 도 6a(45 및 48 CFU) 및 도 6b(43 및 46 CFU)에, 백신군에서 83~95 CFU 황색포도알균 접종 시의 결과를 도 7a(88 및 95 CFU) 및 도 7b(83 및 89 CFU)에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 4~10 CFU의 황색포도알균(K30) 공격접종 시에도 1-3일후 젖소에서 세균수 증가, 체세포 증가, 체온 증가, 우유생산량 감소 결과가 확인되었으며 발열을 동반한 괴사성 유방염이 나타나는 것을 확인하였다.
반면 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 백신군에서는 젖소 4두에 43~48 CFU의 황색포도알균(K30) 접종 시 유방 내 세균감염이 확인되지 않았고 체세포 증가, 체온 증가, 우유생산량 감소 등의 유방염 임상증상이 확인되지 않았다.
또한 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 백신군에서는 젖소 4두에 83~95 CFU의 황색포도알균(K30) 접종 시에도 일시적인 유방염 증상이 확인되었으나 7~9일후 자연적으로 모두 치유되는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 본원 발명의 백신이 대조군 대비 높은 CFU의 황색포도알균 공격접종 시에도 효과적인 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하는 결과이다.
실시예 8. 세포독소 백신 항체의 교차반응 확인
백신의 산업화를 위한 경제성 측면에서 백신에 필요한 항원의 수를 줄이더라도 효과를 나타낼 수 있는 백신을 개발할 필요성이 있다. 따라서 본 실시예에서는 본 발명에서 사용한 세포독소 4종(HlgA, HlgC, LukE, LukS)의 교차반응을 확인하였다. 이를 위해 우선 세포독소 항원을 개별적으로 백신보좌제(Freund’s adjuvant)와 혼합하여 C57BL/C 마우스에 2주 간격으로 3회 피하 접종하여 단일 항원에 따른 혈청을 획득하였다. 또한 세포독소에 대한 교차중화항체 반응을 측정하기에 앞서 대조군으로 사용되는 Bovine Leukocyte의 세포독소에 대한 감수성 검사를 실시하였다. 그 후 7가지 세포독소(HlgA, HlgB, HlgC, LukD, LukE, LukF, LukS)의 중화능 실험을 위해 현재 사용하는 S-component 항원 4가지(HlgA, HlgC, LukE, LukS)와 나머지 F-component 항원 3가지(HlgB, LukD, LukF)를 각각 조합하고 젖소에서 획득한 Leukocyte에 반응시켜 세포막 손상의 척도인 propidium iodide 의 세포내 침투를 flow cytometry로 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 측정 결과 bovine leukocyte에 강한 세포독성을 나타내는 세포독소 조합은 HlgB/HlgA, LukD/HlgA, HlgB/HlgC, LukD/HlgC, HlgB/LukE, LukD/LukE, HlgB/LukS, LukD/LukS 인 것을 확인하였다. 또한 이 중에서도 Bovine Leukocyte의 경우 HlgA/HlgB, HlgA/LukD, LukE/HlgB, LukE/LukD 조합의 세포독소에 가장 민감한 반응을 보였으며, 반대로 LukF 세포독소에는 가장 약한 반응을 보이는 것을 확인하였다.
Mean Fluorescence Intensity (MFI)는 geometric mean scale로서, MFI 10차이는 10배, MFI 20은 500배의 형광차이를 보이는 것으로 MFI 25이상이면 상당히 유의성 있는 차이를 나타내는 것이라 할 수 있다. 또한 세포독소를 투여하지 않은 대조군의 MFI는 5.2를 나타내는 것을 확인하였다.
이에 상기에서 확인한 세포독소 조합 중 Mean fluorescence intensity (MFI) 25 이상을 유도하는 최소농도의 세포독소 조합과 마우스로부터 제작한 본 발명의 세포독소 4종의 각 세포독소 백신 후보주에 대한 면역혈청(1000배 희석)을 1:1로 혼합하여 중화능을 측정하였으며, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이 중화항체를 사용한 세포독소 중화능 측정 결과, HlgA와 LukE에 대한 면역혈청(αHlgA, αLukE)은 HlgA/HlgB, HlgA/LukD, LukE/HlgB, LukE/LukD, HlgC/LukD 세포독소 조합에 대한 세포독성을 35 % 이하로 교차방어하는 중화항체 반응을 보이는 것을 확인하였다. 또한 LukS에 대한 면역혈청(αLukS)의 경우 LukE/HlgB, LukE/LukD, LukS/HlgB, LukS/LukD 세포독소 조합에 대한 세포독성을 35 % 이하로 교차방어하는 중화항체반응을 보이는 것을 확인하였다.
이는 백신에 본 발명의 세포독소 4종(HlgA, HlgC, LukE, LukS)을 모두 포함시키지 않고 HlgA, LukE, LukS 만을 포함시켜 사용하였을 때 모든 조합의 세포독소를 중화할 수 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 9. 장독소 백신 항체의 교차반응 확인
본 실시예에서는 본 발명에서 사용한 장독소 5종(SEG, SEI, SEM, SEN, SEO) 백신의 교차반응을 확인하였다. 이를 위해 우선 장독소 항원을 개별적으로 백신보좌제(Freund’s adjuvant)와 혼합하여 목적동물인 젖소에 2주 간격으로 2회 피하 접종하여 단일 항원에 따른 혈청을 획득하였다. 그 후 장독소에 대한 교차중화항체 반응을 측정하기 위해 장독소 5종 백신을 각각 젖소 혈액에서 분리한 T cell에 처리 후 각각의 장독소 항원을 처리하여 T cell 분화능을 확인하였였으며, 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이 장독소에 대한 중화항체 교차반응 확인 결과, SEM 항체(α-SEM)가 SEN 및 SEO 독소 항원을 중화하여 이들을 항원으로서 작용하지 못하게 함으로써 T cell 분화능이 유의하게 줄어드는 것을 확인하였다(*; p<0.01, **; p<0.05).
따라서 본 발명의 장독소의 경우 5종 모두가 아닌 SEG, SEI, SEM 3종류만 있어도 모든 종류의 장독소 항원을 중화시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 10. 중화능 가진 세포독소 및 장독소를 포함한 백신의 유방염 예방 또는 치료 효과 확인
상기 실시예 8 및 9에서 확인한, 중화능을 가진 본 발명의 세포독소 3종(HlgA, LukE, LukS) 및 장독소 3종(SEG, SEI, SEM)을 포함한 백신의 유방염 예방 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 젖소에서의 공격접종에 따른 효과를 확인하였다. 구체적으로 중화능을 확인한 상기 독소 6종(SEG, SEI, SEM, HlgA, LukE, LukS)을 항원으로 각 독소 200ug과 동량의 수산화알루미늄겔을 혼합한 백신을 젖소 1두에 2주 간격으로 2회 접종 후, 황색포도알균(K30) 26CFU를 공격접종하여 세균수, 체세포수, 체온 및 우유생산량 변화를 측정하였으며 이를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 백신군에서는 젖소에 26CFU의 황색포도알균(K30) 접종 시 유방 내 세균감염이 확인되지 않았고 체세포 증가, 체온 증가, 우유생산량 감소 등의 유방염 임상증상이 확인되지 않았다.
따라서 본 발명의 세포독소 및 장독소 9종을 모두 포함하지 않고도 중화능을 확인한 6종의 독소(SEG, SEI, SEM, HlgA, LukE, LukS)를 포함한 백신이 효과적인 소 유방염 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
비교예 1. 종래 백신의 효능 실험
현재 국내에서 허가되어 있는 소 유방염 백신은 수입품 2종(라백스타프, 히프라스타박) 및 국산 5종이 있으며, 이들 가운데 최근 3년(2015~2017)간 판매되고 있는 백신은 수입품 2종인 라백스타프 및 히프라스타박이다. 따라서 시판 중인 상기 수입품 2종에 대하여 본 발명 백신과의 효능을 비교하기 위해, 라백스타프 및 히프라스타박 백신의 용법용량에 따라 젖소 1두를 대상으로 3회 접종 후 공격접종을 실시하였다. 라백스타프 및 히프라스타박 백신의 실험 결과를 각각 표 5 및 표 6에 나타내었다.
검사항목 | 공격접종 | 공격접종 + 1일차 | 공격접종 + 2일차 | |||
오전 | 오후 | 오전 | 오후 | 오전 | 오후 | |
체세포수 (*1000) |
9 | 73 | 4 | - | - | - |
우유내 세균수 (cfu/ml) |
0 | 0 | 0 | - | - | - |
체온(℃) | 38.5 | 38.4 | 40.8 | 41.8 | 42.6 | |
전체유량 (Kg) |
14 | 10 | 12 | 8 | 0 | 0 |
임상증상 | 이상무 | 이상무 | 절식 | 절식 | 절식 | 폐사 |
상기 표 5에서와 같이, 라백스타프 백신의 경우 황색포도알균 23 CFU 공격접종 1일 후 체온이 40도까지 오르고 사료 미섭취 증상을 보이다 공격접종 2일차 오후에 폐사하는 것을 확인하였다. 또한 폐사한 젖소의 유방 검체 조직에서는 공격접종 균주가 분리되는 것을 확인하였다.
검사항목 | 공격접종 | 공격접종 + 1일차 |
공격접종 + 2일차 |
공격접종 + 3일차 |
공격접종 + 4일차 |
|||||
오전 | 오후 | 오전 | 오후 | 오전 | 오후 | 오전 | 오후 | 오전 | 오후 | |
체세포수(*1000) | 19 | 109 | 87 | 375 | 1,500 | - | - | - | - | - |
우유내 세균수 (cfu/ml) |
0 | 0 | 3,200 | 70,000 | 345,000 | - | - | - | - | - |
체온(℃) | 38.5 | 38.4 | 38.4 | 40.1 | 42.3 | 42.2 | 42.3 | - | - | - |
전체유량(Kg) | 14 | 5.4 | 14.4 | 4.2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
임상증상 | 이상무 | 이상무 | 이상무 | 체온 상승 |
절식 | 절식 | 절식 | 절식 | 절식 | 폐사 |
상기 표 6에서와 같이, 히프라스타박 백신의 경우 황색포도알균 21 CFU 공격접종 1일 후 체온이 40도까지 오르고 사료 미섭취 증상을 보이며 공격 접종한 균주가 우유에서 분리되는 증세를 보이다 공격접종 4일차 오후에 폐사하는 것을 확인하였다.
따라서 현재 국내 시판 중인 라백스타프 및 히프라스타박 유방염 백신을 젖소에 접종한 후 공격접종 실험 결과, 황색포도알균 21~23 CFU의 낮은 용량으로도 4일 이내에 폐사하는 것을 확인하였다. 반면 본 발명의 백신은, 43~48 CFU의 황색포도알균(K30) 접종 시에도 실험 대상인 젖소 4두의 체세포 증가, 체온 증가, 우유생산량 감소 등의 유방염 임상증상이 확인되지 않았으며, 83~95 CFU의 황색포도알균(K30) 접종 시에도 일시적인 유방염 증상이 확인되었으나 7~9일 후에는 자연적으로 모두 치유되는 것을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
MISSISSIPPI STATE UNIVERSITY
<120> A vaccine composition comprising recombinant protein of
attenuated staphylococcal enterotoxin and cytotoxin
<130> 1.92P
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEG
<400> 1
caacccgatc ctaaattaga cgaactaaat aaagtaagtg attataaaaa taataaggga 60
actatgggtg ctgtaatgaa tctttatacg tctccacctg ttgaaggaag aggagttatt 120
aattctagac agtttttatc tcatgattta atttttccaa ttgagtataa gagttataat 180
gaggttaaaa ctgaattaga aaatacagaa ttagctaaca attataaaga taaaaaagta 240
gacatttttg gcgttccata tttttataca tgtataatac ctaaatctga accggatata 300
aaccaaaatt ttggaggttg ttgtatgtat ggtggtctta catttaatag ttcagaaaat 360
gaaagagata aattaattac tgtacaggta acaatcgaca atagacaatc acttggattt 420
acaataacta caaataagaa tatggttact attcaggaac tagattacaa agcaagacac 480
tggctcacta aagaaaaaaa gctatacgag gctgctggtt ctgcatttga atctggatat 540
ataaaattta ctgaaaagaa caatacaagt ttttggtttg acttatttcc taaaaaagaa 600
ctagtacctt ttgttccata taagttttta aatatttacg gagataataa agttgttgat 660
tctaagagta ttaaaatgga agtatttctt aatactcact ga 702
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEG
<400> 2
Gln Pro Asp Pro Lys Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Ser Asp Tyr Lys
1 5 10 15
Asn Asn Lys Gly Thr Met Gly Ala Val Met Asn Leu Tyr Thr Ser Pro
20 25 30
Pro Val Glu Gly Arg Gly Val Ile Asn Ser Arg Gln Phe Leu Ser His
35 40 45
Asp Leu Ile Phe Pro Ile Glu Tyr Lys Ser Tyr Asn Glu Val Lys Thr
50 55 60
Glu Leu Glu Asn Thr Glu Leu Ala Asn Asn Tyr Lys Asp Lys Lys Val
65 70 75 80
Asp Ile Phe Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Thr Cys Ile Ile Pro Lys Ser
85 90 95
Glu Pro Asp Ile Asn Gln Asn Phe Gly Gly Cys Cys Met Tyr Gly Gly
100 105 110
Leu Thr Phe Asn Ser Ser Glu Asn Glu Arg Asp Lys Leu Ile Thr Val
115 120 125
Gln Val Thr Ile Asp Asn Arg Gln Ser Leu Gly Phe Thr Ile Thr Thr
130 135 140
Asn Lys Asn Met Val Thr Ile Gln Glu Leu Asp Tyr Lys Ala Arg His
145 150 155 160
Trp Leu Thr Lys Glu Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Ala Gly Ser Ala Phe
165 170 175
Glu Ser Gly Tyr Ile Lys Phe Thr Glu Lys Asn Asn Thr Ser Phe Trp
180 185 190
Phe Asp Leu Phe Pro Lys Lys Glu Leu Val Pro Phe Val Pro Tyr Lys
195 200 205
Phe Leu Asn Ile Tyr Gly Asp Asn Lys Val Val Asp Ser Lys Ser Ile
210 215 220
Lys Met Glu Val Phe Leu Asn Thr His
225 230
<210> 3
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEI
<400> 3
gatattggtg taggtaactt aagaaatttc tatacaaaac atgattatat agatttaaaa 60
ggcgtcacag ataaaaacct acctattgca aatcaactcg aattttcaac aggtaccaat 120
gatttgatct cagaatctaa taattgggac gaaataagta aatttaaagg aaagaaactg 180
gatatttttg gcattgatta taatggtcct tgtaaatcta aatacatgta tggaggggcc 240
actttatcag gacaatactt aaattctgct agaaaaatcc ctattaatct ttgggttaat 300
ggcaaacata aaacaatttc tactgacaaa atagcaacta ataaaaaact agtaacagct 360
caagaaattg atgttaaatt aagaagatat cttcaagaag aatacaatat atatggtaat 420
aataacactg gtaaaggcaa agaatatgga tataaatcta aattttattc aggttttaat 480
aatgggaaag ttttatttca tttaaataat gaaaaatcat tttcatatga tttgttttat 540
acaggagatg gactgcctgt aagttttttg aaaatttatg aagataataa aataatagaa 600
tctgaaaaat ttgctcttgc tgtcgaaata tcatatgtag atagtaacta a 651
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEI
<400> 4
Asp Ile Gly Val Gly Asn Leu Arg Asn Phe Tyr Thr Lys His Asp Tyr
1 5 10 15
Ile Asp Leu Lys Gly Val Thr Asp Lys Asn Leu Pro Ile Ala Asn Gln
20 25 30
Leu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asn Asp Leu Ile Ser Glu Ser Asn Asn
35 40 45
Trp Asp Glu Ile Ser Lys Phe Lys Gly Lys Lys Leu Asp Ile Phe Gly
50 55 60
Ile Asp Tyr Asn Gly Pro Cys Lys Ser Lys Tyr Met Tyr Gly Gly Ala
65 70 75 80
Thr Leu Ser Gly Gln Tyr Leu Asn Ser Ala Arg Lys Ile Pro Ile Asn
85 90 95
Leu Trp Val Asn Gly Lys His Lys Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ile Ala
100 105 110
Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile Asp Val Lys Leu Arg
115 120 125
Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Thr Gly
130 135 140
Lys Gly Lys Glu Tyr Gly Tyr Lys Ser Lys Phe Tyr Ser Gly Phe Asn
145 150 155 160
Asn Gly Lys Val Leu Phe His Leu Asn Asn Glu Lys Ser Phe Ser Tyr
165 170 175
Asp Leu Phe Tyr Thr Gly Asp Gly Leu Pro Val Ser Phe Leu Lys Ile
180 185 190
Tyr Glu Asp Asn Lys Ile Ile Glu Ser Glu Lys Phe Ala Leu Ala Val
195 200 205
Glu Ile Ser Tyr Val Asp Ser Asn
210 215
<210> 5
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEM
<400> 5
gatgtcggag ttttgactct taggaactat tatggtagct atccaattga agaccaccaa 60
agtattaatc ctgaaaataa tcatctttcg catcaattag ttttttctat ggataattcg 120
acagtaacag ctgaatttaa gaacgttgat gatgtaaaga aattcaaaaa tcatgctgta 180
gatgtatatg gtctaagtta tagtggatat tgtttgaaaa acaaatatat atacggtgga 240
gttacattag caggtgatta tttagagaaa tctagacgta ttcctattaa tctttgggtt 300
aatggagaac atcaaactat atctactgac aaagtatcaa ctaataaaaa gttagtaaca 360
gctcaagaaa ttgatactaa attaagaaga tatctacaag aagaatataa tatttatggc 420
tttaatgata caaataaagg aagaaattat ggtaataagt caaaatttag ttctggattt 480
aatgcaggaa aaatattatt tcatttgaat gatggttcat cattttctta tgacttattt 540
gatactggaa caggacaagc tgaaagtttc ttaaaaatat ataatgacaa caaaactgtc 600
gaaactgaaa aattcgcttt agctgtagaa atatcttata aggacgaaag ttga 654
<210> 6
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEM
<400> 6
Asp Val Gly Val Leu Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile
1 5 10 15
Glu Asp His Gln Ser Ile Asn Pro Glu Asn Asn His Leu Ser His Gln
20 25 30
Leu Val Phe Ser Met Asp Asn Ser Thr Val Thr Ala Glu Phe Lys Asn
35 40 45
Val Asp Asp Val Lys Lys Phe Lys Asn His Ala Val Asp Val Tyr Gly
50 55 60
Leu Ser Tyr Ser Gly Tyr Cys Leu Lys Asn Lys Tyr Ile Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Val Thr Leu Ala Gly Asp Tyr Leu Glu Lys Ser Arg Arg Ile Pro Ile
85 90 95
Asn Leu Trp Val Asn Gly Glu His Gln Thr Ile Ser Thr Asp Lys Val
100 105 110
Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile Asp Thr Lys Leu
115 120 125
Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Phe Asn Asp Thr
130 135 140
Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn Lys Ser Lys Phe Ser Ser Gly Phe
145 150 155 160
Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe His Leu Asn Asp Gly Ser Ser Phe Ser
165 170 175
Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Gly Thr Gly Gln Ala Glu Ser Phe Leu Lys
180 185 190
Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Glu Thr Glu Lys Phe Ala Leu Ala
195 200 205
Val Glu Ile Ser Tyr Lys Asp Glu Ser
210 215
<210> 7
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEN
<400> 7
gaagtagaca aaaaagattt aaagaaaaaa tctgatctag atagtagtaa gttatttaat 60
ttaacaagct attatactga tataacgtgg caattagacg agtcaaataa aattagtaca 120
gatcaactac tgaataatac tataatatta aaaaatattg atatatccgt acttaaaact 180
tctagtttga aagttgagtt taactcatca gatttagcaa atcaatttaa aggaaaaaat 240
atagatattt atggactgta ttttggaaat aaatgtgtag gcttaactga agaaaaaaca 300
tcatgcttat acggaggagt tacgatacat gatggaaatc aattagatga agagaaagtt 360
ataggcgtta atgtatttaa agatggtgtc caacaagaag gttttgttat aaaaaccaaa 420
aaggctaaag taacagtaca agaattagac actaaagttc gatttaaatt agaaaattta 480
tataaaatat acaataaaga taccggtaac atacaaaaag gatgcatttt ctttcattct 540
cataatcatc aagatcaatc attttattat gatttatata acgtaaaagg ttcagtggga 600
gcagagtttt ttcaatttta tagtgataat agaacagtta gctcatctaa ttatgctatt 660
gctgtatttt tatataaaga ttaa 684
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEN
<400> 8
Glu Val Asp Lys Lys Asp Leu Lys Lys Lys Ser Asp Leu Asp Ser Ser
1 5 10 15
Lys Leu Phe Asn Leu Thr Ser Tyr Tyr Thr Asp Ile Thr Trp Gln Leu
20 25 30
Asp Glu Ser Asn Lys Ile Ser Thr Asp Gln Leu Leu Asn Asn Thr Ile
35 40 45
Ile Leu Lys Asn Ile Asp Ile Ser Val Leu Lys Thr Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Val Glu Phe Asn Ser Ser Asp Leu Ala Asn Gln Phe Lys Gly Lys Asn
65 70 75 80
Ile Asp Ile Tyr Gly Leu Tyr Phe Gly Asn Lys Cys Val Gly Leu Thr
85 90 95
Glu Glu Lys Thr Ser Cys Leu Tyr Gly Gly Val Thr Ile His Asp Gly
100 105 110
Asn Gln Leu Asp Glu Glu Lys Val Ile Gly Val Asn Val Phe Lys Asp
115 120 125
Gly Val Gln Gln Glu Gly Phe Val Ile Lys Thr Lys Lys Ala Lys Val
130 135 140
Thr Val Gln Glu Leu Asp Thr Lys Val Arg Phe Lys Leu Glu Asn Leu
145 150 155 160
Tyr Lys Ile Tyr Asn Lys Asp Thr Gly Asn Ile Gln Lys Gly Cys Ile
165 170 175
Phe Phe His Ser His Asn His Gln Asp Gln Ser Phe Tyr Tyr Asp Leu
180 185 190
Tyr Asn Val Lys Gly Ser Val Gly Ala Glu Phe Phe Gln Phe Tyr Ser
195 200 205
Asp Asn Arg Thr Val Ser Ser Ser Asn Tyr Ala Ile Ala Val Phe Leu
210 215 220
Tyr Lys Asp
225
<210> 9
<211> 699
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEO
<400> 9
aatgaagaag atcctaaaat agagagtttg tgtaagaagt caagtgtaga ccctattgct 60
ttacataata ttaatgatga ttatataaat aatcgattta cgacagtaaa atcaattgta 120
tcaactacag aaaaattctt agacttcgat ttattattta aaagtattaa ttggttagat 180
ggaatatctg ctgaatttaa agatttaaaa gtggaattta gctcatcagc gatttctaaa 240
gaatttctag gaaagactgt tgatatttat ggtgtttact ataaagcaca ttgtcgtggt 300
gagcatcaag tggatactgc ctgtacatat ggtggggtaa cacctcatga aaataataaa 360
ttaagcgagc ctaaaaatat aggagtagct gtgtataagg ataatgtaaa tgttaataca 420
tttatcgtta ctacagataa aaagaaagtt actgcacaag aacttgatat taaagtaaga 480
acaaaattaa ataatgcata taaattgtat gacagaatga ctagtgatgt acaaaaaggt 540
tatattaaat ttcattctca ttcggagcat aaagaatcat tttattatga tttattttat 600
attaaaggaa atttaccaga tcaatatttg caaatttata atgataataa aacaatagat 660
tcatcagact atgctattgc tgtttattta tttacataa 699
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant SEO
<400> 10
Asn Glu Glu Asp Pro Lys Ile Glu Ser Leu Cys Lys Lys Ser Ser Val
1 5 10 15
Asp Pro Ile Ala Leu His Asn Ile Asn Asp Asp Tyr Ile Asn Asn Arg
20 25 30
Phe Thr Thr Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Thr Glu Lys Phe Leu Asp
35 40 45
Phe Asp Leu Leu Phe Lys Ser Ile Asn Trp Leu Asp Gly Ile Ser Ala
50 55 60
Glu Phe Lys Asp Leu Lys Val Glu Phe Ser Ser Ser Ala Ile Ser Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Gly Lys Thr Val Asp Ile Tyr Gly Val Tyr Tyr Lys Ala
85 90 95
His Cys Arg Gly Glu His Gln Val Asp Thr Ala Cys Thr Tyr Gly Gly
100 105 110
Val Thr Pro His Glu Asn Asn Lys Leu Ser Glu Pro Lys Asn Ile Gly
115 120 125
Val Ala Val Tyr Lys Asp Asn Val Asn Val Asn Thr Phe Ile Val Thr
130 135 140
Thr Asp Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Ile Lys Val Arg
145 150 155 160
Thr Lys Leu Asn Asn Ala Tyr Lys Leu Tyr Asp Arg Met Thr Ser Asp
165 170 175
Val Gln Lys Gly Tyr Ile Lys Phe His Ser His Ser Glu His Lys Glu
180 185 190
Ser Phe Tyr Tyr Asp Leu Phe Tyr Ile Lys Gly Asn Leu Pro Asp Gln
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Ile Asp Ser Ser Asp Tyr
210 215 220
Ala Ile Ala Val Tyr Leu Phe Thr
225 230
<210> 11
<211> 242
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETA promoter
<400> 11
aaatatcaac gtgagggctc tagtactaac gatttttttt gtgcagtatg tagaatcact 60
gacaaggaac aaaagattaa aaatgaaaaa tattggggaa ctattgagtg gaattaacaa 120
acgtatttaa tgtttagtta attaaaagtt aataaaaaat aatttgtttt gaaatagaaa 180
cgttatataa tttttaatgt attcgaatac attaaaaaac gcaaatgtta ggatgattaa 240
ta 242
<210> 12
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgA signal peptide
<400> 12
atgattaaaa ataaaatatt aacagcaact ttagcagttg gtttaatagc ccctttagcc 60
aatccattta tagaaatttc taaagca 87
<210> 13
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgA mature protein
<400> 13
gaaaataaga tagaagatat cggccaaggt gcagaaatca tcaaaagaac acaagacatt 60
actagcaaac gattagctat aactcaaaac attcaatttg attttgtaaa agataaaaaa 120
tataacaaag atgccctagt tgttaagatg caaggcttca ttagctctag aacaacatat 180
tcagacttaa aaaaatatcc atatattaaa agaatgatat ggccatttca atataatatc 240
agtttgaaaa cgaaagactc taatgttgat ttaattaatt atcttcctaa aaataaaatt 300
gattcagcag atgttagtca gaaattaggc tataatatcg gcggaaactt ccaatcagcg 360
ccatcaatcg gaggcagtgg ctcattcaac tactctaaaa caattagtta taatcaaaaa 420
aactatgtta ctgaagtaga aagtcagaac tctaaaggtg ttaaatgggg agtgaaagca 480
aattcattcg ttacaccgaa tggtcaagta tctgcatatg atcaatactt atttgcacaa 540
gacccaactg gtccagcagc acgagactat ttcgtcccag ataatcaact acctccttta 600
attcaaagtg gctttaatcc atcatttatt acaacattgt cacacgaaag aggtaaaggt 660
gataaaagcg agtttgaaat cacttacggc agaaacatgg atgctacata tgcttacgtg 720
acaagacatc gtttagccgt tgatagaaaa catgatgctt ttaaaaaccg aaacgttaca 780
gttaaatatg aagtgaactg gaaaacacat gaagtaaaaa ttaaaagcat cacacctaag 840
taa 843
<210> 14
<211> 1172
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETA-HlgA
<400> 14
aaatatcaac gtgagggctc tagtactaac gatttttttt gtgcagtatg tagaatcact 60
gacaaggaac aaaagattaa aaatgaaaaa tattggggaa ctattgagtg gaattaacaa 120
acgtatttaa tgtttagtta attaaaagtt aataaaaaat aatttgtttt gaaatagaaa 180
cgttatataa tttttaatgt attcgaatac attaaaaaac gcaaatgtta ggatgattaa 240
taatgattaa aaataaaata ttaacagcaa ctttagcagt tggtttaata gcccctttag 300
ccaatccatt tatagaaatt tctaaagcag aaaataagat agaagatatc ggccaaggtg 360
cagaaatcat caaaagaaca caagacatta ctagcaaacg attagctata actcaaaaca 420
ttcaatttga ttttgtaaaa gataaaaaat ataacaaaga tgccctagtt gttaagatgc 480
aaggcttcat tagctctaga acaacatatt cagacttaaa aaaatatcca tatattaaaa 540
gaatgatatg gccatttcaa tataatatca gtttgaaaac gaaagactct aatgttgatt 600
taattaatta tcttcctaaa aataaaattg attcagcaga tgttagtcag aaattaggct 660
ataatatcgg cggaaacttc caatcagcgc catcaatcgg aggcagtggc tcattcaact 720
actctaaaac aattagttat aatcaaaaaa actatgttac tgaagtagaa agtcagaact 780
ctaaaggtgt taaatgggga gtgaaagcaa attcattcgt tacaccgaat ggtcaagtat 840
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tcgtcccaga taatcaacta cctcctttaa ttcaaagtgg ctttaatcca tcatttatta 960
caacattgtc acacgaaaga ggtaaaggtg ataaaagcga gtttgaaatc acttacggca 1020
gaaacatgga tgctacatat gcttacgtga caagacatcg tttagccgtt gatagaaaac 1080
atgatgcttt taaaaaccga aacgttacag ttaaatatga agtgaactgg aaaacacatg 1140
aagtaaaaat taaaagcatc acacctaagt aa 1172
<210> 15
<211> 280
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgA
<400> 15
Glu Asn Lys Ile Glu Asp Ile Gly Gln Gly Ala Glu Ile Ile Lys Arg
1 5 10 15
Thr Gln Asp Ile Thr Ser Lys Arg Leu Ala Ile Thr Gln Asn Ile Gln
20 25 30
Phe Asp Phe Val Lys Asp Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Ala Leu Val Val
35 40 45
Lys Met Gln Gly Phe Ile Ser Ser Arg Thr Thr Tyr Ser Asp Leu Lys
50 55 60
Lys Tyr Pro Tyr Ile Lys Arg Met Ile Trp Pro Phe Gln Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Ser Leu Lys Thr Lys Asp Ser Asn Val Asp Leu Ile Asn Tyr Leu Pro
85 90 95
Lys Asn Lys Ile Asp Ser Ala Asp Val Ser Gln Lys Leu Gly Tyr Asn
100 105 110
Ile Gly Gly Asn Phe Gln Ser Ala Pro Ser Ile Gly Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Phe Asn Tyr Ser Lys Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr
130 135 140
Glu Val Glu Ser Gln Asn Ser Lys Gly Val Lys Trp Gly Val Lys Ala
145 150 155 160
Asn Ser Phe Val Thr Pro Asn Gly Gln Val Ser Ala Tyr Asp Gln Tyr
165 170 175
Leu Phe Ala Gln Asp Pro Thr Gly Pro Ala Ala Arg Asp Tyr Phe Val
180 185 190
Pro Asp Asn Gln Leu Pro Pro Leu Ile Gln Ser Gly Phe Asn Pro Ser
195 200 205
Phe Ile Thr Thr Leu Ser His Glu Arg Gly Lys Gly Asp Lys Ser Glu
210 215 220
Phe Glu Ile Thr Tyr Gly Arg Asn Met Asp Ala Thr Tyr Ala Tyr Val
225 230 235 240
Thr Arg His Arg Leu Ala Val Asp Arg Lys His Asp Ala Phe Lys Asn
245 250 255
Arg Asn Val Thr Val Lys Tyr Glu Val Asn Trp Lys Thr His Glu Val
260 265 270
Lys Ile Lys Ser Ile Thr Pro Lys
275 280
<210> 16
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgC signal peptide
<400> 16
atgcttaaaa ataaaatatt aactacaact ttatctgtga gcttacttgc ccctcttgcc 60
aatccgttat tagaaaatgc taaagct 87
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<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgC mature protein
<400> 17
gctaacgata ctgaagacat cggtaaagga agcgatatag aaattatcaa aaggacagaa 60
gataaaacaa gtaataaatg gggcgtgact caaaatattc aatttgattt tgtaaaggat 120
aaaaaatata acaaagatgc tttgatatta aagatgcaag gattcattag ctctagaaca 180
acatattaca actataaaaa aactaatcat gttaaagcta tgcgatggcc attccaatat 240
aatattggtt taaaaacaaa tgataaatat gtttctttaa ttaattattt acctaaaaat 300
aaaattgaat ctacaaacgt gagtcagaca ttaggataca atatcggtgg taatttccaa 360
tcagccccat cactcggtgg taatggatca tttaactatt ctaaatcgat tagctataca 420
caacaaaatt atgtaagtga agtagaacaa caaaactcaa aaagtgtttt atggggcgtc 480
aaagcgaatt cattcgccac tgaatcaggt caaaaatcag cctttgatag cgatttattt 540
gtaggctaca aacctcatag taaagatcct agagattatt tcgttccaga cagtgagtta 600
ccacctcttg tacaaagtgg atttaaccct tcatttatcg ccacagtatc tcatgaaaaa 660
ggttcaagcg atacaagcga atttgaaatt acttacggaa gaaacatgga tgtcactcat 720
gccattaaaa gatcaacgca ttatggcaac agttatttag acggacatag agtccataat 780
gcatttgtaa atagaaacta tactgtgaaa tacgaggtca attggaagac tcatgaaatc 840
aaggtgaaag gacagaattg a 861
<210> 18
<211> 1190
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETA-HlgC
<400> 18
aaatatcaac gtgagggctc tagtactaac gatttttttt gtgcagtatg tagaatcact 60
gacaaggaac aaaagattaa aaatgaaaaa tattggggaa ctattgagtg gaattaacaa 120
acgtatttaa tgtttagtta attaaaagtt aataaaaaat aatttgtttt gaaatagaaa 180
cgttatataa tttttaatgt attcgaatac attaaaaaac gcaaatgtta ggatgattaa 240
taatgcttaa aaataaaata ttaactacaa ctttatctgt gagcttactt gcccctcttg 300
ccaatccgtt attagaaaat gctaaagctg ctaacgatac tgaagacatc ggtaaaggaa 360
gcgatataga aattatcaaa aggacagaag ataaaacaag taataaatgg ggcgtgactc 420
aaaatattca atttgatttt gtaaaggata aaaaatataa caaagatgct ttgatattaa 480
agatgcaagg attcattagc tctagaacaa catattacaa ctataaaaaa actaatcatg 540
ttaaagctat gcgatggcca ttccaatata atattggttt aaaaacaaat gataaatatg 600
tttctttaat taattattta cctaaaaata aaattgaatc tacaaacgtg agtcagacat 660
taggatacaa tatcggtggt aatttccaat cagccccatc actcggtggt aatggatcat 720
ttaactattc taaatcgatt agctatacac aacaaaatta tgtaagtgaa gtagaacaac 780
aaaactcaaa aagtgtttta tggggcgtca aagcgaattc attcgccact gaatcaggtc 840
aaaaatcagc ctttgatagc gatttatttg taggctacaa acctcatagt aaagatccta 900
gagattattt cgttccagac agtgagttac cacctcttgt acaaagtgga tttaaccctt 960
catttatcgc cacagtatct catgaaaaag gttcaagcga tacaagcgaa tttgaaatta 1020
cttacggaag aaacatggat gtcactcatg ccattaaaag atcaacgcat tatggcaaca 1080
gttatttaga cggacataga gtccataatg catttgtaaa tagaaactat actgtgaaat 1140
acgaggtcaa ttggaagact catgaaatca aggtgaaagg acagaattga 1190
<210> 19
<211> 286
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HlgC
<400> 19
Ala Asn Asp Thr Glu Asp Ile Gly Lys Gly Ser Asp Ile Glu Ile Ile
1 5 10 15
Lys Arg Thr Glu Asp Lys Thr Ser Asn Lys Trp Gly Val Thr Gln Asn
20 25 30
Ile Gln Phe Asp Phe Val Lys Asp Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Ala Leu
35 40 45
Ile Leu Lys Met Gln Gly Phe Ile Ser Ser Arg Thr Thr Tyr Tyr Asn
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Asn His Val Lys Ala Met Arg Trp Pro Phe Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ile Gly Leu Lys Thr Asn Asp Lys Tyr Val Ser Leu Ile Asn Tyr
85 90 95
Leu Pro Lys Asn Lys Ile Glu Ser Thr Asn Val Ser Gln Thr Leu Gly
100 105 110
Tyr Asn Ile Gly Gly Asn Phe Gln Ser Ala Pro Ser Leu Gly Gly Asn
115 120 125
Gly Ser Phe Asn Tyr Ser Lys Ser Ile Ser Tyr Thr Gln Gln Asn Tyr
130 135 140
Val Ser Glu Val Glu Gln Gln Asn Ser Lys Ser Val Leu Trp Gly Val
145 150 155 160
Lys Ala Asn Ser Phe Ala Thr Glu Ser Gly Gln Lys Ser Ala Phe Asp
165 170 175
Ser Asp Leu Phe Val Gly Tyr Lys Pro His Ser Lys Asp Pro Arg Asp
180 185 190
Tyr Phe Val Pro Asp Ser Glu Leu Pro Pro Leu Val Gln Ser Gly Phe
195 200 205
Asn Pro Ser Phe Ile Ala Thr Val Ser His Glu Lys Gly Ser Ser Asp
210 215 220
Thr Ser Glu Phe Glu Ile Thr Tyr Gly Arg Asn Met Asp Val Thr His
225 230 235 240
Ala Ile Lys Arg Ser Thr His Tyr Gly Asn Ser Tyr Leu Asp Gly His
245 250 255
Arg Val His Asn Ala Phe Val Asn Arg Asn Tyr Thr Val Lys Tyr Glu
260 265 270
Val Asn Trp Lys Thr His Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asn
275 280 285
<210> 20
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LukE signal peptide
<400> 20
atgtttaaga aaaaaatgtt agctgcaact ttgtcagtag gactgattgc acctttagca 60
tctccgattc aagaatctag agca 84
<210> 21
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LukE mature protein
<400> 21
aatactaata ttgaaaatat tggtgatggt gctgaagtaa tcaaacgtac ggaggatgta 60
agtagtaaga aatggggcgt tactcaaaat gtccaattcg actttgtaaa agataaaaaa 120
tataacaaag acgctttaat tgttaaaatg caaggtttta ttaattccag aacttcattt 180
tcagatgtga agggtagtgg atatgaatta actaaacgaa tgatttggcc attccaatat 240
aatataggac tgacgactaa agatccaaat gttagcttaa tcaattacct tcctaaaaac 300
aaaatagaaa ctactgatgt tggtcaaaca ttaggatata acattggagg taatttccag 360
tcagcaccat ctataggtgg caatggctca tttaattatt ctaaaacaat tagttatacc 420
caaaagagtt atgtcagtga agtagacaag caaaactcaa aatctgttaa atggggtgtt 480
aaagcaaacg aatttgttac gcctgatgga aaaaaatctg cgcatgatag atatttattc 540
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aatagaaact ttgtagttag atatgaagtt aattggaaaa cacacgaaat taaagtgaaa 840
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETA-LukE
<400> 22
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gacaaggaac aaaagattaa aaatgaaaaa tattggggaa ctattgagtg gaattaacaa 120
acgtatttaa tgtttagtta attaaaagtt aataaaaaat aatttgtttt gaaatagaaa 180
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taatgtttaa gaaaaaaatg ttagctgcaa ctttgtcagt aggactgatt gcacctttag 300
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tacaattaca aaaacacaga tcatataaaa gcaatgaggt ggcctttcca atacaatatt 240
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275 280
Claims (15)
- 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진, 황색포도알균 장독소 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열,
상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열,
상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열,
상기 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열,
상기 서열번호 10의 아미노산 서열은 서열번호 9의 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 황색포도알균 장독소 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10의 아미노산 서열은 MHC class II 결합 부위 아미노산인 히스티딘(Histidine) 및 아스파르트산(Aspartic acid)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 황색포도알균 장독소 단백질.
- 서열번호 2로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질, 서열번호 4로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질 및 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질을 항원으로 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제4항에 있어서,
서열번호 8 또는 서열번호 10으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질을 더 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
- 제6항의 재조합 벡터가 삽입된, 형질전환체.
- 제7항에 있어서,
상기 형질전환체는 Staphylococcus aureus RN4220 균주 또는 Escherichia coli BL21 균주인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
- 서열번호 2로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질, 서열번호 4로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질, 서열번호 6으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질, 서열번호 15로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질, 서열번호 23으로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질 및 서열번호 27로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질을 항원으로 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
서열번호 8로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질 또는 서열번호 10으로 표시되는 황색포도알균 장독소 단백질을 더 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
서열번호 19로 표시되는 황색포도알균 세포독소 단백질을 더 포함하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질을 1 : 0.5 내지 1 : 1.5 (w/w) 혼합비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 황색포도알균 장독소 단백질 및 황색포도알균 세포독소 단백질은 각각 50 내지 200 ug 포함되는 것을 특징으로 하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 백신 조성물은 수산화알루미늄겔을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 소 유방염 예방용 백신 조성물.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 소 유방염 예방용 백신 조성물을 소에 투여하는 단계;를 포함하는, 소 유방염 예방 방법.
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