JP2022064869A - 多価ワクチン抗原及びポリクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む複数の微生物に対する多価ワクチン抗原を提供する。【解決手段】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導する、多価ワクチン抗原。【選択図】なし
Description
本発明は、少なくともＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びその他の微生物に対する免疫を誘導する多価ワクチン抗原及びポリクローナル抗体に関する。
２０１９年に中国武漢で発生した新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を病原体とする感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は、世界中にてパンデミックを引き起こし、大きな社会問題となっている。ＣＯＶＩＤ－１９は、患者の多くが軽症又は無症状である一方、一部の患者で重症化することが事態を深刻化させており、重症化リスクに対して適切に対処することが極めて重要であると考えられている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン開発は世界中で急速に進められている。２０２０年１０月現在で承認されているワクチンは、ロシアで承認されたスプートニクＶのみである（非特許文献１）。
一方で、ワクチン及び治療薬の開発と並行して、ＣＯＶＩＤ－１９に関する症状に関する臨床データも蓄積されてきている。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９発症患者では、細菌を中心とした混合感染が極めて高い確率（９４．２％）で確認されていること、更に、重症のＣＯＶＩＤ－１９症例で、ウイルスの重感染、真菌の重感染、および細菌と真菌との重感染の割合が、最も高かったことが報告されている（非特許文献２）。
ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ， ＶＯＬＵＭＥ ３９６， ＩＳＳＵＥ １０２５５， Ｐ８８７－８９７， ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ ２６， ２０２０
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ２８５， Ａｕｇｕｓｔ ２０２０， １９８００５
スプートニクＶはまだ臨床試験を実施している段階であり、安全性や有効性には疑問の声も上がっている。また、仮にワクチンの接種が始まったとしても、効果が小さかったり、重い副作用が見つかったりするリスクは依然として存在し、感染症流行抑止の決定打になるかどうかは不明である。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するワクチンにはさらなる選択肢が望まれる。また、ＣＯＶＩＤ－１９症例における重感染の高さに鑑みると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２だけでなく、他の微生物に対しても免疫を誘導できるワクチンが望まれる。
そこで本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む複数の微生物に対する多価ワクチン抗原を提供することを目的とする。
本発明者は、鋭意検討の結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構成タンパク質のうちスパイクタンパク質を構成する受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の微生物由来の抗原との組み合わせが、多価ワクチン抗原として有効であることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。
すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導する、多価ワクチン抗原。
項２． 前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とが融合体を形成している、項１に記載の抗原。
項３． 前記受容体結合モチーフがＴ細胞エピトープを有さず、前記他の抗原がＴ細胞エピトープを有する、項１又は２に記載の抗原。
項４． 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、項１～３のいずれかに記載の抗原。
項５． 項１～４のいずれかに記載の抗原を含むワクチン。
項６． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフをコードするＤＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程１と、
前記形質転換体を培養し、培養物を得る工程２と、
前記培養物から、前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とを含む産生物を回収する工程３と、を含む、多価ワクチン抗原の製造方法。
項７． 工程１において、前記宿主細胞に、前記受容体結合モチーフをコードするＤＮＡと前記他の抗原をコードするＤＮＡとを含む組み換えベクターを導入する、項６に記載の製造方法。
項８． 前記宿主細胞が大腸菌又は動物細胞である、項６又は７に記載の製造方法。
項９． 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、項６～８のいずれかに記載の製造方法。
項１０． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とに特異的なポリクローナル抗体。
項１１． 項１～４のいずれかに記載の多価ワクチン抗原を動物に免疫し得られる、ポリクローナル抗体。
項１． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導する、多価ワクチン抗原。
項２． 前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とが融合体を形成している、項１に記載の抗原。
項３． 前記受容体結合モチーフがＴ細胞エピトープを有さず、前記他の抗原がＴ細胞エピトープを有する、項１又は２に記載の抗原。
項４． 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、項１～３のいずれかに記載の抗原。
項５． 項１～４のいずれかに記載の抗原を含むワクチン。
項６． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフをコードするＤＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程１と、
前記形質転換体を培養し、培養物を得る工程２と、
前記培養物から、前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とを含む産生物を回収する工程３と、を含む、多価ワクチン抗原の製造方法。
項７． 工程１において、前記宿主細胞に、前記受容体結合モチーフをコードするＤＮＡと前記他の抗原をコードするＤＮＡとを含む組み換えベクターを導入する、項６に記載の製造方法。
項８． 前記宿主細胞が大腸菌又は動物細胞である、項６又は７に記載の製造方法。
項９． 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、項６～８のいずれかに記載の製造方法。
項１０． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とに特異的なポリクローナル抗体。
項１１． 項１～４のいずれかに記載の多価ワクチン抗原を動物に免疫し得られる、ポリクローナル抗体。
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む複数の微生物に対する多価ワクチン抗原が提供される。
１．多価ワクチン抗原
本発明の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導することを特徴とする。
本発明の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導することを特徴とする。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ、以下ＲＢＭともいう）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の最小単位である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン開発においては、感染において重要な役割を担うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質、又はスパイクタンパク質のうち感染において特に重要な役割を担う受容体結合領域（ＲＢＤ）をターゲットにすることが有効と考えられるが、その一方で、スパイクタンパク質に対する不完全な免疫が誘導されれば、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）が起りうる。このため、本発明の多価ワクチンでは、ＡＤＥリスク低減のため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原として、ＲＢＤ中のＲＢＭを用いる。
本発明の多価ワクチン抗原に用いられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭとしては、以下の（１）～（３）が挙げられる。
（１）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入及び／又は欠失されてなり、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と複合体を形成するポリペプチド、及び
（３）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列において、配列番号１との配列同一性が８０％以上であり、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と複合体を形成するポリペプチド。
（１）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入及び／又は欠失されてなり、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と複合体を形成するポリペプチド、及び
（３）配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列において、配列番号１との配列同一性が８０％以上であり、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と複合体を形成するポリペプチド。
前記（１）のポリペプチドにおいて、配列番号１は、ＮＣＢＩにＮＣ＿０４５５１２として収載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（以下において、「特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」とも記載する。）のスパイクタンパク質（ＹＰ＿００９７２４３９０．１）のアミノ酸配列であり、その４３８～５０６位のアミノ酸配列がＲＢＭに相当する。
前記（１）～（３）のポリペプチドには、人為的に置換等して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
前記（２）及び（３）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドと同様のＡＣＥ２との複合体形成能を有する限り、（１）のポリペプチドと比較してアミノ酸配列に相違があることを許容するものであり、前記（１）のポリペプチドの相違体ともいう。前記（２）及び（３）のポリペプチドは、それ自体が変異体であってもよいし、野生型であってもよい。つまり、前記（２）及び（３）のポリペプチドは、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型ＲＢＭの変異体であってもよいし、特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における野生型ＲＢＭ又はその変異体であってもよい。
前記（２）のポリペプチドにおけるアミノ酸の相違は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の相違（例えば置換）のみを含んでいてもよいし、２種以上の相違（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２）のポリペプチドにおいて、アミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～１５個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～７個又は１～６個、一層好ましくは１～５個又は１～４個、より一層好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、最も好ましくは１個が挙げられる。
また、前記（３）のポリペプチドのアミノ酸配列と、配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であればよい。好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、一層好ましくは９６％以上、より一層好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上が挙げられる。
ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
また、前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における第４８７位（アスパラギン）、第４９３位（グルタミン）、第４９８位（グルタミン）、及び第５０５位（チロシン）は、ＡＣＥ２受容体の主なホットスポットアミノ酸残基との相互作用に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい場合もある。
前記（２）及び（３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
本発明の多価ワクチン抗原に用いられる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原（以下において、単に「他の抗原」とも記載する。）としては特に限定されない。当該他の抗原としては、細菌由来の抗原及びウイルス由来の抗原が挙げられ、より具体的には、弱毒化又は不活化したウイルス、毒素、トキソイド、莢膜多糖、タンパク質等が挙げられる。これらの他の抗原は、１種が単独で選択されてもよいし、複数種が選択されてもよい。
他の抗原の好ましい例としては、ＣＯＶＩＤ－１９患者においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と重感染する細菌及び／又はウイルスが挙げられ、より具体的には、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （肺炎桿菌）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（コウジカビ）、ＥＢＶ（エプスタインバールウイルス）、Ｅ． ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ （黄色ブドウ球菌）、ＨＲＶ（ヒトライノウイルス）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ Ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（モラクセラ・カタラーリス）、ＨＡｄＶ（ヒトアデノウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、Ａ． ｂａｕｍａｎｎｉｉ（多剤耐性アシネトバクター）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎クラミジア）、Ｍｕｃｏｒ（ケカビ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎マイコプラズマ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＨＢｏＶ（ヒトボカウイルス）、ＨＭＰＶ（ヒトメタニューモウイルス）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（クリプトコッカス菌）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）が挙げられる。
本発明の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他の微生物に対する免疫を誘導するものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導するとは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭに対する特異的抗体（特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ特異的血清中ＩｇＧ）を誘導することを含み、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２への結合阻害活性及び／又は細胞死抑制活性を誘導すること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を有する抗体を誘導すること、並びに／若しくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる症状に対する生体防御反応を誘導すること等を含む。他の微生物に対する免疫を誘導するとは、他の微生物由来の抗原に対する特異的抗体（例えば、当該抗原特異的血清中ＩｇＧ抗体）、好ましくは中和抗体を誘導することを含み、より好ましくは、当該抗原による細胞死に対する中和活性、並びに／もしくは、他の微生物により引き起こされる症状に対する生体防御反応を誘導すること等を含む。
本発明の多価ワクチン抗原のさらに好ましい態様においては、ＲＢＭがＴ細胞エピトープを有さず、他の抗原がＴ細胞エピトープを有するものである。これによって、単独では免疫を誘導できないＲＢＭであっても、他の抗原が抗原性だけでなくアジュバント能を有することで、本発明の多価ワクチン抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と他の微生物とに対する免疫を誘導することが可能となる。
なお、Ｔ細胞エピトープとは、Ｔ細胞によって認識される抗原の一部であり、Ｔ細胞受容体に結合する抗原部分である。ＭＨＣクラスＩ分子が提示するＴ細胞エピトープは、典型的には８～１１アミノ酸長のペプチドであるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は１３～１７アミノ酸長のより長いペプチドを提示し、また非古典的ＭＨＣ分子は糖脂質などの非ペプチド性エピトープも提示する。Ｔ細胞エピトープは、当業者に周知の方法で予測することができる。例えば、ＴｅｐｉＴｏｏｌなどのアルゴリズムを用いることで、Ｔ細胞エピトープを予測することができる。他の抗原がＴ細胞エピトープを有するか否かは、上述のアルゴリズムを用いることで調べることができる。また、抗原性とは、免疫を誘導する能力をいう。さらに、アジュバント能とは、免疫賦活剤としての能力をいい、抗原の免疫誘導を増強する能力をいう。他の抗原がＴ細胞エピトープを有することで、Ｔ細胞による免疫を誘導することが可能となるため、他の抗原はアジュバント能を有する。
つまり、上記の他の抗原の好ましい例としては、抗原性だけでなくアジュバント能も有するものが挙げられ、具体的には、Ｔ細胞エピトープを有する抗原が挙げられる。抗原がＴ細胞エピトープを有するか否かは、上述のアルゴリズムを用いることで調べることができる。このようにＴ細胞エピトープを有する他の抗原の限定されない例として、肺炎球菌（好ましくは肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ））、コレラ菌、志賀毒素産生性大腸菌などが挙げられる。
本発明の多価ワクチン抗原においては、抗原性だけでなくアジュバント能を備えさせる点から、ＲＢＭと前記他の抗原とは典型的には、融合体を形成している。
上記の融合体は、ＲＢＭと他の抗原とを含んで一体化されているものであればよく、その形態は限定されない。また、融合体にはＲＢＭと他の抗原以外の構造が含まれていてもよい。融合体としては、例えば、ＲＢＭと他の抗原との融合タンパク質、他の抗原を封入したリポソームとＲＢＭとの結合体、他の抗原を担持したナノマテリアルとＲＢＭとの結合体などが挙げられ、好ましくはＲＢＭと他の抗原との融合タンパク質が挙げられる。なお、融合タンパク質とは、２つ以上のタンパク質をコードする遺伝子が一体となり形成された、１つのタンパク質をいう。融合タンパク質は、当業者に周知な方法で作られる。例えば、１つのベクター内で、タンパク質をコードする遺伝子内の開始コドンや終止コドンの部分に、グルタチオン・S-トランスフェラーゼ(GST)やポリヒスチジン(Hisタグ)等の遺伝子をタグとして挿入し、開始コドンと終止コドンの間に２つ以上のタンパク質をコードする遺伝子を挿入することで、融合タンパク質が作られる。
ＲＢＭと他の抗原との融合体において、ＲＢＭと他の抗原以外の構造としては、例えばＲＢＭと他の抗原とを結合するリンカーが挙げられる。リンカーは、他の抗原を２種以上用いる場合においては他の抗原同士を結合するためにも用いることができる。リンカーの例としては、特に限定されないが、例えば以下のアミノ酸配列からなるリンカーが挙げられ、好ましくはリンカー例１及びリンカー例２のようなＧＳリンカーが挙げられる。
リンカー例１：（ＧＧＧＧＳ）ｎ ｎ＝１～５
リンカー例２：（ＧＧＧＧＳ）ｎＧＧ ｎ＝１～５
リンカー例３：（Ｇ）ｎ ｎ＝５～１０
リンカー例４：（ＥＡＡＡＫ）ｎ ｎ＝１～４
リンカー例５：（ＰＡ）ｎ ｎ＝２～３４
リンカー例１：（ＧＧＧＧＳ）ｎ ｎ＝１～５
リンカー例２：（ＧＧＧＧＳ）ｎＧＧ ｎ＝１～５
リンカー例３：（Ｇ）ｎ ｎ＝５～１０
リンカー例４：（ＥＡＡＡＫ）ｎ ｎ＝１～４
リンカー例５：（ＰＡ）ｎ ｎ＝２～３４
２．多価ワクチン抗原の製造方法
本発明は、上記の多価ワクチン抗原の製造方法も提供する。本発明の多価ワクチン抗原の製造方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフをコードするＤＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程１と；前記形質転換体を培養し、培養物を得る工程２と；前記培養物から、前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とを含む産生物を回収する工程３と、を含む。なお、形質転換体とは、外部からＤＮＡを取り込むことにより、形質が（発現している状態が）変化した個体や細胞をいう。形質とは生物のもつ性質や特徴をいい、元の情報は遺伝子である。形質が発現している状態とは、遺伝子情報に基づいてタンパク質が発現している状態をいう。本発明においては、組み換えベクターを宿主細胞へ導入することで形質転換体を得ることができる。
本発明は、上記の多価ワクチン抗原の製造方法も提供する。本発明の多価ワクチン抗原の製造方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフをコードするＤＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程１と；前記形質転換体を培養し、培養物を得る工程２と；前記培養物から、前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とを含む産生物を回収する工程３と、を含む。なお、形質転換体とは、外部からＤＮＡを取り込むことにより、形質が（発現している状態が）変化した個体や細胞をいう。形質とは生物のもつ性質や特徴をいい、元の情報は遺伝子である。形質が発現している状態とは、遺伝子情報に基づいてタンパク質が発現している状態をいう。本発明においては、組み換えベクターを宿主細胞へ導入することで形質転換体を得ることができる。
工程１においては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）をコードするＤＮＡと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとは、適当な形態で発現ベクターに挿入し、得られた組み換えベクターを宿主細胞に組み込むことで導入し、形質転換体を得ることができる。ＲＢＭと他の抗原とが融合体（好ましくは融合タンパク質）を形成した多価ワクチン抗原を製造する場合は、ＲＢＭをコードするＤＮＡと他の抗原をコードするＤＮＡとを含む（好ましくは融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む）組み換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することができる。
上記ＤＮＡの設計及び合成の方法においては、目的のポリペプチド、具体的にはＲＢＭ及び他の抗原をコードするそれぞれの遺伝子の塩基配列情報を公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得し、又は公知の方法を用いて目的遺伝子をクローニングし、塩基配列解析を行うことで塩基配列情報を取得し、得られた塩基配列情報に基づいて、目的のＲＢＭ及び他の抗原を有するそれぞれの微生物から核酸を抽出し、ＰＣＲ等の公知の手段を用いて遺伝子を取得し、それぞれの遺伝子を人工的に連結した融合遺伝子（ハイブリッド遺伝子）を作製することができる。
また、目的のポリペプチドが変異を有する場合は、ポリペプチドをコードする遺伝子に変異を導入する。塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法及び部位特異的突然変異誘発法等（具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等）が利用できる。
上記ＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主細胞に最適化したものが好ましい。宿主細胞はタンパク質を発現させるものであれば特に限定されないが、例えば、コドン利用頻度を動物細胞や大腸菌に最適化させたＤＮＡが好ましい。コドン利用頻度を表す指標としては、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。
組み換えベクターは、上記のＤＮＡを、制限酵素切断及びライゲーションなどにより、適当な発現ベクターに挿入することによって得られる。発現ベクターとしては特に限定されないが、宿主細胞内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。
組み換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、上記のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と上記のＤＮＡとが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
宿主細胞としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子のタンパク質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌、酵母、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。これらの中でも動物細胞や大腸菌が特に好ましい。
形質転換体を得るために宿主細胞に組換えベクターを導入する条件は、宿主細胞の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主細胞が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及び電気穿孔法（エレクトロポレーション法）等が挙げられる。宿主細胞が酵母の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主細胞が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主細胞が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
本発明の組換えベクターが宿主細胞に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等の公知の方法により行うことができる。
工程２においては、形質転換体を培養することによって、ＲＢＭ及び他の抗原を含有する多価ワクチン抗原（産生物）を産生することができる。
形質転換体の培養条件は、宿主細胞の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。培養温度は、形質転換体が生育可能であり、且つ形質転換体が多価ワクチン抗原を産生する範囲で適宜設定し得る。
工程３においては、培養物から、ＲＢＭ及び他の抗原を含有する多価ワクチン抗原（産生物）を回収する。培養物としては、培養上清であってもよいし、培養細胞又は培養菌体若しくはそれらの破砕物であってもよい。目的の多価ワクチン抗原（産生物）が宿主細胞内に生産される場合には、宿主細胞を破砕することにより産生物を抽出することができる。また、目的の多価ワクチン抗原（産生物）が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主細胞を除去することができる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組み合わせて用いて単離及び／又は精製することにより、多価ワクチン抗原（産生物）を回収することができる。
３．ワクチン
上記の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の１又は複数の微生物に対する免疫を誘導することから、本発明は、上記の多価ワクチン抗原を含むワクチンも提供する。
上記の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の１又は複数の微生物に対する免疫を誘導することから、本発明は、上記の多価ワクチン抗原を含むワクチンも提供する。
本発明のワクチンには、上記の多価ワクチン抗原の他に、目的及び用途等に応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、アジュバント等の他の成分を含むことができる。
緩衝剤の例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の例としては、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、抗生物質、合成抗菌剤等が挙げられる。抗酸化剤の例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
アジュバントの例としては、動物油（スクアレン等）又はそれらの硬化油；植物油（パーム油、ヒマシ油等）又はそれらの硬化油；無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステル等を含む油性アジュバント；ＰＣＰＰ、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミニウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質等の水溶性アジュバント；水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ、水酸化ナトリウム等の沈降性アジュバント；コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分；その他の成分（ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキン等）等が挙げられる。
上記の成分の他にも、本発明のワクチンには、光吸収色素（リボフラビン、アデニン、アデノシン等）、安定化剤（キレート剤、還元剤等）、炭水化物（ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストラン等）、カゼイン消化物、各種ビタミン、矯臭剤等を含むこともできる。
さらに、本発明のワクチンは、有効成分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他の微生物に対する多価ワクチン抗原であるが、多価ワクチン抗原に加えて、更に別の疾患を発症する微生物に対する１又は複数のワクチン抗原も配合したワクチン（混合ワクチン）であってもよい。
本発明のワクチンの剤型については特に限定されず、投与方法及び保存条件等に基づいて適宜決定することができる。剤型の具体例としては、液体製剤及び固体製剤等が挙げられ、より具体的には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、噴霧剤等の非経口投与剤が挙げられる。
本発明のワクチンの投与方法としては特に限定されず、筋肉、腹腔内、皮内及び皮下等の注射投与、鼻腔及び口腔からの吸入投与、並びに経口投与等が挙げられる。
本発明のワクチンの適用対象としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によりＣＯＶＩＤ－１９症状を引き起こしうる対象であれば特に限定されず、例えば哺乳類が挙げられ、より具体的には、ヒト；イヌ及びネコ等の愛玩動物；ネズミ、マウス、ハムスター等の実験動物等が挙げられる。特に、多価ワクチン抗原が、他の抗原として、ＣＯＶＩＤ－１９患者においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と重感染する細菌及び／又はウイルスの抗原を含む場合は、本発明のワクチンの適用対象としては、好ましくはＣＯＶＩＤ－１９の重症リスクがある対象（例えば、高齢及び／又は基礎疾患を有する等）が挙げられる。
本発明のワクチンの用量としては特に限定されず、有効成分（つまり多価ワクチン抗原）の種類、投与方法、投与対象（年齢、体重、性別、基礎疾患の有無等の条件）に応じて適宜決定することができる。
本発明のワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９及び他の微生物による感染症の発症の予防、及びそれら感染症に伴う症状・病態の予防及び最小化、並びに、症状・病態の治療及び軽減等を目的として用いることができ、好ましくは、上記予防及び最小化を目的として用いることができる。
４．抗体
上記の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の１又は複数の微生物由来の他の抗原とに対する特異的抗体を誘導することから、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体及び他の抗原の特異的抗体も提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭへ特異的に結合する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの異なる部位に結合する複数の抗体が含まれるため、当該抗体はポリクローナル抗体である。他の抗原に対する特異的抗体は、他の抗原へ特異的に結合する。他の抗原に対する特異的抗体には、他の抗原の異なる部位に結合する複数の抗体が含まれるため、当該抗体はポリクローナル抗体である。
上記の多価ワクチン抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の１又は複数の微生物由来の他の抗原とに対する特異的抗体を誘導することから、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体及び他の抗原の特異的抗体も提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭへ特異的に結合する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの特異的抗体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの異なる部位に結合する複数の抗体が含まれるため、当該抗体はポリクローナル抗体である。他の抗原に対する特異的抗体は、他の抗原へ特異的に結合する。他の抗原に対する特異的抗体には、他の抗原の異なる部位に結合する複数の抗体が含まれるため、当該抗体はポリクローナル抗体である。
本発明の抗体は、上記の多価ワクチン抗原を免疫原として動物に免疫することで得ることができる。動物としてはヒト、ウサギ、ヤギ、ブタ、ハムスター、マウス等特に限定されない。
また、本発明の抗体は、多価ワクチン抗原を動物に免疫することで得られる抗血清から、さらに、抗体を精製し得たものであってもよい。精製には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭと他の抗原に特徴的なアミノ酸配列を含むポリペプチド担持されたアフィニティカラムを用いることができる。
本発明の抗体の適用対象としては、上記の多価ワクチン抗原の適用対象と同様である。
本発明の抗体は、ＣＯＶＩＤ－１９及び他の微生物による感染症の発症の予防、及びそれら感染症に伴う症状・病態の予防及び最小化、並びに、症状・病態の治療及び軽減等を目的として用いることができる。
以下、試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の試験例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭとＰｓｐＡの融合タンパク質を指し、図中で「ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ」と記載する場合があり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭは、図中で「ＣｏＶ－２ ＲＢＭ」と記載する場合がある。また、以下の試験例において用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭの配列は、配列番号１の４３８～５０６位のアミノ酸配列である。以下の試験例においてＰｓｐＡは、ｃｌａｄｅ４の血清型３を用いた。
試験例１
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）の作製を行った。
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）の作製を行った。
（１－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）の精製
図１に示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）を、図２の手順に従って以下の通り作製した。ｐＴｆ１６－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ遺伝子（配列番号２；ＮＣ＿０４５５１２に掲載される配列から、大腸菌コドン最適化した配列）及びＰｓｐＡ遺伝子を、ＧＳリンカーで結合したものを利用した。用いたＧＳリンカーの配列は、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号３）である。
図１に示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）を、図２の手順に従って以下の通り作製した。ｐＴｆ１６－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ遺伝子（配列番号２；ＮＣ＿０４５５１２に掲載される配列から、大腸菌コドン最適化した配列）及びＰｓｐＡ遺伝子を、ＧＳリンカーで結合したものを利用した。用いたＧＳリンカーの配列は、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号３）である。
４２℃で４５秒間ヒートショックを与えた後、氷上で３分間インキュベーションした。ＳＯＣ Ｍｅｄｉｕｍを１００ μｌ加え、３７℃で４５分間培養し、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２０ μｇ／ｍｌを含んだＬＢ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、コロニーをアンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２０ μｇ／ｍｌ， アラビノース４ ｍｇ／ｍｌを含んだＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．７まで振とう培養した。その後、１５℃で３０分間コールドショックを与えた後、ＩＰＴＧ １．０ ｍＭを加えて１５℃で２４時間振とう培養した。１００００ ｒｐｍ， ２分で集菌したものにｂｕｆｆｅｒ Ａ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）， ４００ ｍＭ ＮａＣｌ， ５ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１ ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ， １ ｍＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、以下ｂｕｆｆｅｒ Ａと記載する）を培養液の１／１００量加え、超音波で破砕した。１４０００ ｒｐｍ， １５分遠心した上澄みを回収し、０．４５ μｍフィルターで夾雑物を除去した。あらかじめｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したＨｉｓＴｒａｐにサンプルを添加し、ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ２０ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ５００ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａの順にカラムに流し、目的タンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭとＰｓｐＡの融合タンパク質）を抽出した。あらかじめＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０に抽出タンパク質を添加し、ＰＢＳで目的タンパク質を抽出した。ＢＣＡ ａｓｓａｙで目的タンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ， ＣＢＢ染色で純度を確認した。
（１－２）ＰｓｐＡの精製
比較用のＰｓｐＡを、図３の手順に従って以下の通り作製した。ｐＧＴｆ２－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、上記のＰｓｐＡを利用した。
比較用のＰｓｐＡを、図３の手順に従って以下の通り作製した。ｐＧＴｆ２－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、上記のＰｓｐＡを利用した。
４２℃で４５秒間ヒートショックを与えた後、氷上で３分間インキュベーションした。ＳＯＣ Ｍｅｄｉｕｍを１００ μｌ加え、３７℃で４５分間培養し、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２０ μｇ／ｍｌを含んだＬＢ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、コロニーをアンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２ μｇ／ｍｌ， テトラサイクリン ５ ｎｇ／ｍｌを含んだＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．７まで振とう培養した。その後、１５℃で３０分間コールドショックを与えた後、ＩＰＴＧ １．０ ｍＭを加えて１５℃で２４時間振とう培養した。１００００ ｒｐｍ， ２分で集菌したものにｂｕｆｆｅｒ Ａを培養液の１／１００量加え、超音波で破砕した。１４０００ ｒｐｍ， １５分遠心した上澄みを回収し、０．４５ μｍフィルターで夾雑物を除去した。あらかじめｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したＨｉｓＴｒａｐにサンプルを添加し、ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ２０ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ５００ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａの順にカラムに流し、目的タンパク質（ＰｓｐＡ）を抽出した。あらかじめＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０に抽出タンパク質を添加し、ＰＢＳで目的タンパク質を抽出した。ＢＣＡ ａｓｓａｙで目的タンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ， ＣＢＢ染色で純度を確認した。
（１－３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭの精製
比較用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭを、図４の手順に従って以下の通り作製した。ｐＴｆ１６－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭを利用した。
比較用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭを、図４の手順に従って以下の通り作製した。ｐＴｆ１６－ＢＬ２１ １０ μｌ（形質転換した大腸菌ＢＬ２１株のコンピテントセル、タカラバイオ社）に、目的遺伝子を組み込んだｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ社）を挿入し、氷上で３０分間インキュベーションした。目的遺伝子としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭを利用した。
４２℃で４５秒間ヒートショックを与えた後、氷上で３分間インキュベーションした。ＳＯＣ Ｍｅｄｉｕｍを１００ μｌ加え、３７℃で４５分間培養し、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２０ μｇ／ｍｌを含んだＬＢ ｐｌａｔｅに播種した。翌日、コロニーをアンピシリン１００ μｇ／ｍｌ， クロラムフェニコール２０ μｇ／ｍｌ， アラビノース４ ｍｇ／ｍｌを含んだＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．７まで振とう培養した。その後、１５℃で３０分間コールドショックを与えた後、ＩＰＴＧ １．０ ｍＭを加えて１５℃で２４時間振とう培養した。１００００ ｒｐｍ， ２分で集菌したものにｂｕｆｆｅｒ Ａを培養液の１／１００量加え、超音波で破砕した。１４０００ ｒｐｍ， １５分遠心した上澄みを回収し、０．４５ μｍフィルターで夾雑物を除去した。あらかじめｂｕｆｆｅｒ Ａで平衡化したＨｉｓＴｒａｐにサンプルを添加し、ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ２０ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａ， ５００ ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ Ａの順にカラムに流し、目的タンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＭ）を抽出した。あらかじめＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０に抽出タンパク質を添加し、ＰＢＳで目的タンパク質を抽出した。ＢＣＡ ａｓｓａｙで目的タンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ， ＣＢＢ染色で純度を確認した。
（１－４）結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ、ＰｓｐＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭの作製を確認した結果を図５に示し、それぞれの大腸菌発現系における収量を表１に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ、ＰｓｐＡ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭの作製を確認した結果を図５に示し、それぞれの大腸菌発現系における収量を表１に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭは大腸菌発現系では可溶性が悪いが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに可溶性の良いＰｓｐＡを融合することで収量が向上した。
試験例２
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）による免疫誘導を行った。
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ（多価ワクチン抗原）による免疫誘導を行った。
（２－１）ＩｇＧ免疫誘導
図６の手順に従って、下記の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ免疫誘導を行った。
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ １μｇ、ＰｓｐＡ ５．７ μｇ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ ６．７μｇ（うち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭパートは１ μｇ相当， ＰｓｐＡパートは５．７ μｇ相当）と、水酸化アルミニウムゲル （１０ μｇ）との混合液を、２週に１回、計３回筋肉注射した。最終免疫の２週間後に血清を回収した。
図６の手順に従って、下記の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ免疫誘導を行った。
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ １μｇ、ＰｓｐＡ ５．７ μｇ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ ６．７μｇ（うち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭパートは１ μｇ相当， ＰｓｐＡパートは５．７ μｇ相当）と、水酸化アルミニウムゲル （１０ μｇ）との混合液を、２週に１回、計３回筋肉注射した。最終免疫の２週間後に血清を回収した。
９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭを０．１ μｇとなるように播種し、４℃で一晩固相化した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ ２００ μｌを加えて、室温で２時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ， ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈した血清１００ μｌを加え、室温で２時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ， ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ １００ μｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加え、室温で１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、ＴＭＢ １００ μｌを加え、室温で２分間反応させた。０．５ Ｎ ＨＣｌ ５０ μｌを加えて反応停止後に、吸光度４５０ ｎｍを測定した。
（２－２）ＩｇＭ免疫誘導
図７の手順に従って、下記の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ及びＰｓｐＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＭ免疫誘導を行った。
図７の手順に従って、下記の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ及びＰｓｐＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＭ免疫誘導を行った。
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ １μｇ、ＰｓｐＡ ５．７ μｇ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ ６．７μｇ（うち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭパートは１ μｇ相当，ＰｓｐＡパートは５．７ μｇ相当）と、水酸化アルミニウムゲル（１０ μｇ）との混合液を、２週に１回、計３回筋肉注射した。最終免疫の２週間後に血清を回収した。
９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭを０．１ μｇとなるように播種し、４℃で一晩固相化した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ（又は５％スキムミルク）含有ＰＢＳ ２００ μｌを加えて、室温で２時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×６回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ（又は５％スキムミルク）及び ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈した血清１００ μｌを加え、室温で２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ（又は５％スキムミルク）及び ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ－ＨＲＰ １００ μｌ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を加え、室温で１時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×６回洗浄した後に、ＴＭＢ １００ μｌを加え、室温で３０分間反応させた。０．５ Ｎ ＨＣｌ ５０ μｌを加えて反応停止後に、吸光度４５０ ｎｍを測定した。
（２－３）結果
（２－１）のＩｇＧ免疫誘導結果を図８に示す。図８に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ単独ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ特異的血清ＩｇＧは誘導されず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡではＩｇＧを誘導した。（２－２）のＩｇＭ免疫誘導結果を図９に示す。図９に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ特異的血清ＩｇＭが誘導された。ＩｇＧを誘導するためにはＴ細胞エピトープが必要であるため、Ｔ細胞エピトープを有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭはＩｇＧを誘導しないことが確認された。ＰｓｐＡはＴ細胞エピトープを有しているため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡがＩｇＧを誘導したものと思われる。
（２－１）のＩｇＧ免疫誘導結果を図８に示す。図８に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ単独ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ特異的血清ＩｇＧは誘導されず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡではＩｇＧを誘導した。（２－２）のＩｇＭ免疫誘導結果を図９に示す。図９に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ特異的血清ＩｇＭが誘導された。ＩｇＧを誘導するためにはＴ細胞エピトープが必要であるため、Ｔ細胞エピトープを有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭはＩｇＧを誘導しないことが確認された。ＰｓｐＡはＴ細胞エピトープを有しているため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡがＩｇＧを誘導したものと思われる。
試験例３
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡにより免疫誘導される血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を評価した。
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡにより免疫誘導される血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を評価した。
（３－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＡＣＥ２結合中和ａｓｓａｙ
図１０の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清を用い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈｕｍａｎ ＡＣＥ２への結合阻害を評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は、試験例２の手順にて取得した。Ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２発現２９３Ｔ細胞 （２．０×１０4 ｃｅｌｌｓ）を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で一晩培養した。翌日、あらかじめ３７℃で１時間反応させた上記の免疫血清とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス（自社作製）の混合液を細胞に播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で２４時間培養した。培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓを２５ μｌ添加し、５分間シェーカーで反応させた。９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２０ μｌ（プロメガ社）と細胞可溶液５ μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈｕｍａｎ ＡＣＥ２への結合阻害を示したことを確認した。
図１０の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清を用い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈｕｍａｎ ＡＣＥ２への結合阻害を評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は、試験例２の手順にて取得した。Ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２発現２９３Ｔ細胞 （２．０×１０4 ｃｅｌｌｓ）を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で一晩培養した。翌日、あらかじめ３７℃で１時間反応させた上記の免疫血清とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス（自社作製）の混合液を細胞に播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で２４時間培養した。培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓを２５ μｌ添加し、５分間シェーカーで反応させた。９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２０ μｌ（プロメガ社）と細胞可溶液５ μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈｕｍａｎ ＡＣＥ２への結合阻害を示したことを確認した。
（３－２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和ａｓｓａｙ
図１１の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清を用い、野生型およびＤ６１４Ｇ （ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ の流行変異体）に対する中和活性を評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は、試験例２の手順にて取得した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞 （２．０×１０4 ｃｅｌｌｓ）を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で一晩培養した。翌日、あらかじめ３７℃で１時間反応させた上記免疫血清とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型又はＤ６１４Ｇの変異体）の混合液を細胞に播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で２４時間培養した。培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓを２５ μｌ添加し、５分間シェーカーで反応させた。９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２０ μｌ（プロメガ社）と細胞可溶液５ μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、当該中和活性を確認した。
図１１の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清を用い、野生型およびＤ６１４Ｇ （ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ の流行変異体）に対する中和活性を評価した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は、試験例２の手順にて取得した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞 （２．０×１０4 ｃｅｌｌｓ）を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で一晩培養した。翌日、あらかじめ３７℃で１時間反応させた上記免疫血清とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型又はＤ６１４Ｇの変異体）の混合液を細胞に播種し、３７℃， ５％ ＣＯ2で２４時間培養した。培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓを２５ μｌ添加し、５分間シェーカーで反応させた。９６ ｗｅｌｌ ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２０ μｌ（プロメガ社）と細胞可溶液５ μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、当該中和活性を確認した。
試験例４
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染防御効果を評価した。
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染防御効果を評価した。
図１２の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感受性のあるシリアンハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡを免疫し、抗体誘導を評価し、免疫シリアンハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を呼吸器感染させ、体重変化・肺の病理解析により感染防御効果を評価した。４週齢のシリアンハムスター（雄）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ ６．７μｇ（うち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭパートが１ μｇ相当，ＰｓｐＡパートが５．７ μｇ相当）と、水酸化アルミニウムゲル（１０ μｇ）との混合液を、２週に１回、計３回筋肉注射した。最終免疫の２週間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を呼吸器感染させ、体重を測定した。結果を図１３に示す。図１３が示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡの免疫によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染防御効果が確認された。
試験例５
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫による肺炎球菌に対する感染防御効果を評価した。
本試験例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫による肺炎球菌に対する感染防御効果を評価した。
図１４及び図１５の手順に従って、以下の通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡをマウスに免疫し、ＰｓｐＡ特異的抗体誘導を評価し、免疫マウスに肺炎球菌 （ｃｌａｄｅ５）を呼吸器感染させ、生存率から防御効果を評価した。
試験例２の手順にて、マウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡを免疫し、免疫血清を取得した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＰｓｐＡを０．０５ μｇとなるように播種し、４℃で一晩固相化した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ ２００ μｌを加えて、室温で２時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ， ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈した血清１００ μｌを加え、室温で２時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、１％ ＢＳＡ， ０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４０００倍希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ １００ μｌを加え、室温で１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ ２００ μｌ×３回洗浄した後に、ＴＭＢ １００ μｌを加え、室温で２分間反応させた。０．５ Ｎ ＨＣｌ ５０ μｌを加えて反応停止後に、吸光度４５０ ｎｍを測定した。結果を図１６に示す。図１６に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ及びＰｓｐＡ免疫群において、ＰｓｐＡ特異的抗体の誘導が確認された。
また、最終免疫の２週間後に肺炎球菌 （ＡＴＣＣ６３０３） ２．５×１０5 ＣＦＵを呼吸器感染させ、１４日間の生存を観察した。また、感染前の体重に比べて２０％以上体重減少が認められた個体は麻酔下で安楽死させた。結果を図１７に示す。図１７に示す通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ及びＰｓｐＡによる肺炎球菌感染防御効果が確認された。
まとめ
以上の試験例から、（Ａ）大腸菌発現系で収量の低いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭにＰｓｐＡを融合することで生産性が上がること、（Ｂ）Ｔ細胞エピトープを有していないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ抗体が誘導されないが、ＰｓｐＡを融合することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ抗体が産生されること、（Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和すること（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、（Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染防御すること、及び（Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は肺炎球菌を感染防御することが示された。
以上の試験例から、（Ａ）大腸菌発現系で収量の低いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭにＰｓｐＡを融合することで生産性が上がること、（Ｂ）Ｔ細胞エピトープを有していないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ抗体が誘導されないが、ＰｓｐＡを融合することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭに対するＩｇＧ抗体が産生されること、（Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和すること（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、（Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染防御すること、及び（Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＭ－ＰｓｐＡ免疫血清は肺炎球菌を感染防御することが示された。
配列番号２は、SARS-CoV-2のRBMをコードする塩基配列のコドン最適化配列である。
配列番号３は、合成GSリンカー配列である。
配列番号３は、合成GSリンカー配列である。
Claims (11)
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とを含み、少なくとも前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び前記微生物に対する免疫を誘導する、多価ワクチン抗原。
- 前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とが融合体を形成している、請求項１に記載の抗原。
- 前記受容体結合モチーフがＴ細胞エピトープを有さず、前記他の抗原がＴ細胞エピトープを有する、請求項１又は２に記載の抗原。
- 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、請求項１～３のいずれかに記載の抗原。
- 請求項１～４のいずれかに記載の抗原を含む多価ワクチン。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフをコードするＤＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原をコードするＤＮＡとを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程１と、
前記形質転換体を培養し、培養物を得る工程２と、
前記培養物から、前記受容体結合モチーフと前記他の抗原とを含む産生物を回収する工程３と、を含む、多価ワクチン抗原の製造方法。 - 工程１において、前記宿主細胞に、前記受容体結合モチーフをコードするＤＮＡと前記他の抗原をコードするＤＮＡとを含む組み換えベクターを導入する、請求項６に記載の製造方法。
- 前記宿主細胞が大腸菌又は動物細胞である、請求項６又は７に記載の製造方法。
- 前記他の抗原が肺炎球菌表面タンパク質Ａである、請求項６～８のいずれかに記載の製造方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合モチーフと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の少なくとも１つの微生物由来の他の抗原とに特異的なポリクローナル抗体。
- 請求項１～４のいずれかに記載の多価ワクチン抗原を動物に免疫し得られる、ポリクローナル抗体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023190998A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 融合タンパク質及びワクチン |
-
2021
- 2021-10-12 JP JP2021167726A patent/JP2022064869A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023190998A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 融合タンパク質及びワクチン |
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