JP7161729B2 - 多価ワクチン - Google Patents
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Description
1.ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片と、ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも1つの抗原とを有効成分とし、ウエルシュ菌を含む2種以上の微生物に対する免疫を誘導し得ることを特徴とする、多価ワクチン。
2.有効成分が、ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片と前記少なくとも1つの抗原とが融合した融合体である、前項1に記載の多価ワクチン。
3.ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導し得る、前項1又は2に記載の多価ワクチン。
4.ウエルシュ菌以外の微生物由来の抗原に対する反応性を有する抗体を誘導し得る、前項1~3のいずれかに記載の多価ワクチン。
5.ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片が、単独では、ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導できない、前項1~4のいずれかに記載の多価ワクチン。
6.ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片が、以下から選択されるタンパク質である、前項1~5のいずれかに記載の多価ワクチン:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列の部分配列を有しており、少なくとも第304位~第319位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2)(1)のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を有しており、免疫原性を有するタンパク質。
7.抗原が、コレラ菌、病原性大腸菌、及びカンピロバクターからなる群から選択される病原体に由来する、前項1~6のいずれかに記載の多価ワクチン。
8.細菌に起因する疾患又は症状を予防及び/又は治療するための、前項1~7のいずれかに記載の多価ワクチン。
9.前項1~7のいずれかに記載の多価ワクチンを含有する、感染症を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
MLSNNLNPMVFENAKEVFLISEDLKTPINITNSNSNLSDGLYVIDKGDGWILGEPSVVSSQILNPNETGTFSQSLTKSKEVSINVNFSVGFTSEFIQASVEYGFGITIGEQNTIERSVSTTAGPNEYVYYKVYATYRKYQAIRISHGNISDDGSIYKLTGIWLSKTSADSLGNIDQGSLIETGERCVLTVPSTDIEKEILDLAAATERLNLTDALNSNPAGNLYDWRSSNSYPWTQKLNLHLTITATGQKYRILASKIVDFNIYSNNFNNLVKLEQSLGDGVKDHYVDISLDAGQYVLVMKANSSYSGNYPYSILFQKF
gtttataata tataatatta tgtttagtga aattatgtta atatactact tatttcttct tttatattaa ttaacatttc aacttgatct ctttaacgta tatctctttt attacccaag ctttaattcc ttcagcatta atatcataaa atgtccatgt agaaatatat tcaagattat taaagatata tattttattt aatattttgt taatacttta aggatatgta tccaaaataa aaacttttaa ataatatatt atataaaaaa aattagaaat aaggagatgt taattataat atgcttagta acaatttaaa tccaatggtg ttcgaaaatg ctaaagaagt atttcttatt tctgaggatt taaaaacacc aattaatatt acaaactcta actcaaattt aagtgatgga ttatatgtaa tagataaagg agatggttgg atattagggg aaccctcagt agtttcaagt caaattctta atcctaatga aacaggtacc tttagccaat cattaactaa atctaaagaa gtatctataa atgtaaattt ttcagttgga tttacttctg aatttataca agcatctgta gaatatggat ttggaataac tataggagaa caaaatacaa tagaaagatc tgtatctaca actgctggtc caaatgaata tgtatattat aaggtttatg caacttatag aaagtatcaa gctattagaa tttctcatgg taatatctct gatgatggat caatttataa attaacagga atatggctta gtaaaacatc tgcagatagc ttaggaaata ttgatcaagg ttcattaatt gaaactggtg aaagatgtgt tttaacagtt ccatctacag atatagaaaa agaaatcctt gatttagctg ctgctacaga aagattaaat ttaactgatg cattaaactc aaatccagct ggtaatttat atgattggcg ttcttctaac tcataccctt ggactcaaaa gcttaattta cacttaacaa ttacagctac tggacaaaaa tatagaatct tagctagcaa aattgttgat tttaatattt attcaaataa ttttaataat ctagtgaaat tagaacagtc cttaggtgat ggagtaaaag atcattatgt tgatataagc ttagatgctg gacaatatgt tcttgtaatg aaagctaatt catcatatag tggaaattac ccttattcaa tattatttca aaaattttaa tattttaaaa taatataatc aaattaattt acaaaagaca gtatgtaata ttaaattatt acatactgtc taattttttt attataattt aatttttcat
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リンカー例2(配列番号30)(GGGGS)nGG n=1~5
リンカー例3(配列番号31)(G)n n=5~10
リンカー例4(配列番号32)(EAAAK)n n=1~4
リンカー例5(配列番号33)(PA)n n=2~34
リンカー例6(配列番号34) GGGGSGGGGSGG
PspA cDNA(入手元:国立大学法人東京大学)を鋳型とし、PCR(forward primer:5’-agggtaccgaagaatctcccgtagcc-3’(配列番号6)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-gcttaattaattctggggctggagtttc-3’(配列番号7)(下線部はPacI切断部位である)により増幅した。PCR産物およびpET16b-OVA-C-CPE(入手元:国立大学法人大阪大学)(Kakutani H., et al.Biomaterials.(2010)31,5463-5471)をKpnI(New England Biolabs:R0142)、PacI(New England Biolabs:R0547)で37℃、2時間酵素処理した。その後、T4 DNA ligase(Takara:2011A)を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とDH5α(TOYOBO:DNA-903)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。氷上で3分間静置後、SOC(Novagen:69319)を加え、37℃で45分間培養した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム(nacalai tesque:02739-74)含有LBプレート(nacalai tesque:20067-85)に全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LB培地(nacalai tesque:20066-95)にコロニーを1つ植菌し、37℃で一晩培養した。得られた大腸菌をQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN:27104)を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをpET16b-PspA-C-CPE184と称する。pET16b-PspA-C-CPE184は、C-CPEとして配列番号1の第184位~第319位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
pET16b-C-CPE194(入手元:国立大学法人大阪大学)(Uchida H., et al. Biochem Pharmacol.(2010)79,1437-1444)とBL21(Novagen:69450)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。氷上で3分間静置後、SOC(Novagen:69319)100μlを加え、37℃で45分間培養した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LBプレートに全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LB培地にコロニーを1つ植菌し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有Terrific broth培地(Invitrogen:22711022)に培養液を1/10量加え、37℃、3時間振盪培養した。IPTG(0.25mM)(nacalai tesque:19742-36)を加え、さらに37℃、3時間振盪培養した。その後、9100×g,2分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにbuffer A(10mM Tris-HCl[pH8.0],400mM NaCl2,5mM MgCl2,0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,1mM 2-mercaptoethanol,及び10% glycerol)を培養液量の1/100量加え、氷上で40秒間×3回超音波破砕を行った。17800×g,15分間遠心し、上清を0.45μmフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、0.05mM EDTA 12ml,MilliQ 15ml,0.1M NiSO4 3ml,MilliQ 5ml,buffer A 10mlを流したHiTrap Chelating HP Columns(GE Healthcare:17040801)にろ液を充填した。カラムに100mM イミダゾール含有buffer Aを10ml流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、500mM イミダゾール 10mlを流すことで目的タンパク質(C-CPEタンパク質(配列番号1の第194位~第319位のアミノ酸配列を有するタンパク質))を抽出した。あらかじめPBS 25mlを流し、平衡化したPD-10カラム(GE Healthcare:17085101)に抽出タンパク質を充填し、PBSを流し込むことでタンパク質のバッファーをPBSに置換した。
図1Aに示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回で、実施例1及び比較例1にて作製した各種タンパク質を、C-CPE量として10μgとなるように調整し、腹腔内に投与した。C-CPE+Alumに関してはC-CPEにImject Alum Adjuvant(Thermo:77161)100μlを混合したものを室温で30分間混和したものを用いた。最終免疫の1週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
pNU212-CTB inaba569B(入手元:国立大学法人東京大学)を鋳型とし、PCR(forward primer:5’-caggtaccacacctcaaaatattact-3’(配列番号8)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-agaattcttaatttgccatactaattgc-3’(配列番号9)(下線部はEcoRI切断部位である))により増幅した。PCR産物およびpColdII DNA(Takara:3362)をKpnI(New England Biolabs:R0142)、EcoRI-HF(New England Biolabs:R3101)で37℃、2時間酵素処理した。その後、T4 DNA ligase(Takara:2011A)を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とDH5α(TOYOBO:DNA-903)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。氷上で3分間静置後、SOC(Novagen:69319)を加え、37℃で45分間培養した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム(nacalai tesque:02739-74)含有LBプレート(nacalai tesque:20067-85)に全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LB培地(nacalai tesque:20066-95)にコロニーを1つ植菌し、37℃で一晩培養した。得られた大腸菌をQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN:27104)を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをpColdII-CTBと称する。
(1)GM1結合性の確認
GM1(Sigma:G7641)(5μg/ml in PBS)を96well plateに100μl/wellで播種し、4℃で一晩固相化した。翌日、0.05% Tween 20-PBSで5回洗浄後、1% BSA-PBS 200μlを加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、実施例2及び比較例1にて作製した各種タンパク質をCTB量として10μg/mlとなるように調整したものを100μl/well播種し、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、Purified anti-His Tag Antibody(BioLegend:652501)を1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで5000倍希釈したものを100μl/well播種し、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、Goat anti-mouse IgG-HRP(Sourthern Biotech:1031-05)を1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで4000倍希釈したものを100μl/well播種し、室温で1時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories:50-76-11)100μl/wellを加え、室温で2分間発色させた。0.5N HCl 50μl/wellを加え、反応停止後、OD450nmを測定した(n=3)。
L細胞もしくはmouse claudin-4発現L細胞(入手元:国立大学法人京都大学)を3.0×105cells/wellとなるように96well plateに播種した。実施例2及び比較例1にて作製した各種タンパク質をC-CPE量として10μg/mlとなるように2% NCS-PBSで希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、Purified anti-His Tag Antibody(BioLegend:652501)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、FITC anti-mouse IgG1 Antibody(BioLegend:406605)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で30分間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、7-AAD Viability Staining Solution(BioLegend:420403)を2% NCS-PBSで100倍希釈したものを50μl/well播種し、氷上で10分間反応させた。2% NCS-PBSで1回洗浄後のサンプルをFACS解析した。
(1)コレラ毒素特異的血清中IgGの産生能の確認
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、糞便を回収し、PBSを100mg/mlとなるように加え、4℃、10分間懸濁した。その後、3000×g,10分間遠心し、上清(糞便抽出液)を回収した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の11日後に24時間以上絶食したマウスにメイロン200μlを経口投与した。その15分後にコレラ毒素(List Biological Laboratories:100B)25μgを経口投与し、解剖まで絶食・絶飲した。13~14時間後にマウスの幽門~直腸までを摘出し、内容物を回収し、その液体量を測定した。(PBS:n=9,CTB:n=8,C-CPE:n=8,CTB-C-CPE:n=8)
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
(1)下痢症状に対する防御作用の確認
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例2及び比較例1にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。
pColdII-CTB-C-CPE184を鋳型とし、mutagenesis kit(TOYOBO)を用いて組み換えを行った。pColdII-CTB-C-CPE184、10×Buffer for iPCR、2mM dNTPs、10pmol/μl forward primer(GCTAGTGGAAATTACCCTTATTCAA(配列番号15))、10pmol/μl reverse primer(TGATGAATTAGCTTTCATTACAAGAACA(配列番号16))、KOD-Plus-、MilliQを混合し、PCRを行った。得られたPCR産物にDpnIを加え、37℃で1時間酵素処理を行った。その後、PCR産物、Ligation high、T4 Polynucleotide Kinase、MilliQの混合液を16℃、1時間反応させることでライゲーションした。得られたライゲーション産物にフェノールを加え混和し、17800×g、5分間遠心した。上清を回収し、99.5% エタノール、3M 酢酸ナトリウム、グリコーゲンを加え混和し、17800×g、5分間遠心した。上清を捨て、70% エタノールを加え混和し、17800×g、5分間遠心した。上清を回収し、ペレットをMilliQに懸濁した。得られたプラスミドとDH5α(TOYOBO:DNA-903)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。氷上で3分間静置後、SOC(Novagen:69319)900μlを加え、37℃で45分間培養した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム(nacalai tesque)含有LBプレート(nacalai tesque)に全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LB培地(nacalai tesque)にコロニーを1つ植菌し、37℃で一晩培養した。得られた大腸菌をminiprep(QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをシークエンス解析した。得られたプラスミドをpColdII-CTB-C-CPE Y306Aとした。
L細胞もしくはmouse claudin-4発現L細胞(入手元:国立大学法人京都大学)を3.0×105cells/wellとなるように96well plateに播種した。実施例3にて作製した各種タンパク質をC-CPE量として10μg/mlとなるように2% NCS-PBSで希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、Purified anti-His Tag Antibody(BioLegend:652501)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、FITC anti-mouse IgG1 Antibody(BioLegend:406605)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で30分間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、7-AAD Viability Staining Solution(BioLegend:420403)を2% NCS-PBSで100倍希釈したものを50μl/well播種し、氷上で10分間反応させた。2% NCS-PBSで1回洗浄後のサンプルをFACS解析した。
図3に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)にCTB量として20μg,C-CPE量として24μgをPBS 200μlに懸濁した各種タンパク質(実施例3にて作製)をマウス皮下に注射した。その1週間後からは、週1回、計3回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。12時間以上絶食したマウスにメイロン(大塚製薬)200μlを経口投与し、その15分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の1週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間遠心し、上清(血清)を回収した。
(1)発現用ベクターの作製
腸管出血性大腸菌(Escherichia coli,O-157,Sakai株)およびカンピロバクター(Campylobacter jejuni,81-176株)のゲノムDNA(入手元:公立大学法人大阪府立大学)を使用した。腸管出血性大腸菌のゲノムDNAを鋳型とし、ベロ毒素2Bサブユニット遺伝子(VT2B)をPCR(forward primer:5’-ggGGTACCatgaagaagatgtttatggcgg-3’(配列番号19)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-gggggGAATTCgtcattattaaactgcacttcag-3’(配列番号20)(下線部はEcoRI切断部位である))により増幅した。腸管出血性大腸菌のゲノムDNAを鋳型とし、ベロ毒素2Bサブユニット遺伝子(VT2B)をPCR(forward primer:5’-ggGGTACCatgaagaagatgtttatggcgg-3’(配列番号21)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-ggTTAATTAAgtcattattaaactgcacttcag-3’(配列番号22)(下線部はPacI切断部位である))により増幅した。カンピロバクターのゲノムDNAを鋳型とし、鞭毛抗原FlaA遺伝子(FlaA)をPCR(forward primer:5’-ggGGTACCatgggatttcgtattaacacaaat-3’(配列番号23)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-gggGTCGACctattgtaataatcttaaaacattttg-3’(配列番号24)(下線部はSalI切断部位である))により増幅した。カンピロバクターのゲノムDNAを鋳型とし、鞭毛抗原FlaA遺伝子(FlaA)をPCR(forward primer:5’-ggGGTACCatgggatttcgtattaacacaaat-3’(配列番号25)(下線部はKpnI切断部位である);reverse primer:5’-ggTTAATTAAttgtaataatcttaaaacattttgct-3’(配列番号26)(下線部はPacI切断部位である))により増幅した。
pColdI-VT2BもしくはpColdI-VT2B-C-CPE194、pColdI-FlaA、pColdI-FlaA-C-CPE194とChaperone Competent Cells pG-Tf2/BL21(Takara:9124)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LBプレートに全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム、20μg/mlクロラムフェニコール(nacalai tesque)含有LBプレートに全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム、20mg/ml クロラムフェニコール、5ng/ml テトラサイクリン塩酸塩(nacalai tesque)含有LB培地(nacalai tesque)にコロニーを植菌し、37℃でOD600=0.4~0.6まで振盪培養した。15℃、30分間静置した後、IPTG(0.25mM)(nacalai tesque:19742-36)を加え、15℃で24時間振盪培養した。9100×g,2分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにbuffer A(10mM Tris-HCl[pH8.0],400mM NaCl2,5mM MgCl2,0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,1mM 2-mercaptoethanol,及び10% glycerol)を培養液量の1/100量加え、氷上で40秒間×3回超音波破砕を行った。17800×g,15分間遠心し、上清を0.45μmフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、0.05mM EDTA 12ml,MilliQ 15ml,0.1M NiSO4 3ml,MilliQ 5ml,buffer A 10mlを流したHiTrap Chelating HP Columns(GE Healthcare:17040801)にろ液を充填した。カラムに100mM イミダゾール含有buffer Aを10ml流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、500mM イミダゾール 10mlを流すことで目的タンパク質(VT2B、VT2B-C-CPE、FlaA、FlaA-C-CPE)を抽出した。あらかじめPBS 25mlを流し、平衡化したPD-10カラム(GE Healthcare:17085101)に抽出タンパク質を充填し、PBSを流し込むことでタンパク質のバッファーをPBSに置換した。
L細胞もしくはmouse claudin-4発現L細胞(入手元:国立大学法人京都大学)を3.0×105cells/wellとなるように96well plateに播種した。実施例4及び比較例1にて作製した各種タンパク質をC-CPE量として10μg/mlとなるように2% NCS-PBSで希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、Purified anti-His Tag Antibody(BioLegend:652501)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で1時間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、FITC anti-mouse IgG1 Antibody(BioLegend:406605)を2% NCS-PBSで200倍希釈したものを100μl/well播種し、氷上で30分間反応させた。2% NCS-PBSで2回洗浄後、7-AAD Viability Staining Solution(BioLegend:420403)を2% NCS-PBSで100倍希釈したものを50μl/well播種し、氷上で10分間反応させた。2% NCS-PBSで1回洗浄後のサンプルをFACS解析した。
(1)免疫方法と血清の回収
図9に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回、実施例4及び比較例1にて作製した各種タンパク質(C-CPE+Alum、VT2B-C-CPE、FlaA-C-CPE)各50μgをマウスの腹腔内に投与した。対照群としてPBSのみを投与したマウスを用意した。C-CPE+Alumに関してはPBS 250μlに溶解したC-CPEと等量のImject Alum Adjuvant(Thermo:77161)を室温で30分間混和したものを用いた。VT2B-C-CPEとFlaA-C-CPEはPBS 500μlに溶解したものを用いた。最終免疫の1週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間,4℃で遠心分離し、上清(血清)を回収した。
C-CPEタンパク質(5μg/ml in PBS)(比較例1で作製)を96well plateに100μl/well播種し、4℃で一晩固相化した。翌日、1% BSA-PBS 170μlを加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで希釈した血清を加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、Goat anti-mouse IgG-HRP(Sourthern Biotech:1031-05)を1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで4000倍希釈したものを100μl/well播種し、室温で1時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories:50-76-11)100μl/wellを加え、室温で2分間発色させた。0.5N HCl 50μl/wellを加え、反応停止後、OD450nmを測定した。(各群:n=3)
(1)免疫方法と血清の回収
図9に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回、実施例4にて作製した各種タンパク質(VT2B-C-CPE、FlaA-C-CPE)各50μgをPBS 500μlに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。対照群としてPBSのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の1週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間,4℃で遠心分離し、上清(血清)を回収した。
Vero細胞(JCRB細胞バンク:JCRB0111)を5.0×104cells/wellで播種し、一晩接着させた。翌日、ウエルシュ菌毒素(Bio academia:01-509)(0.1μg)+血清(40μl)をあらかじめ37℃で1時間反応させたものを細胞に播種し、30分間インキュベートした。PBSで2回洗浄後、Cell Count Reagent SF(nacalai tesque:07553-15)(10μl/well)播種し、37℃で1時間反応させ、OD450nmを測定した。(各群:n=3)
(1)免疫方法と血清の回収
図9に示す通り、8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回、実施例4にて作製した各種タンパク質(VT2B-C-CPE、FlaA-C-CPE)各50μgをPBS 500μlに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。対照群としてPBSのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の1週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間,4℃で遠心分離し、上清(血清)を回収した。
VT2BもしくはFlaAタンパク質(5μg/ml in PBS)(実施例4で作製)を96well plateに100μl/well播種し、4℃で一晩固相化した。翌日、1% BSA-PBS 170μlを加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで希釈した血清を加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、Goat anti-mouse IgG-HRP(Sourthern Biotech:1031-05)を1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで4000倍希釈したものを100μl/well播種し、室温で1時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、TMB(Kirkegaard&Perry Laboratories:50-76-11)100μl/wellを加え、室温で2分間発色させた。0.5N HCl 50μl/wellを加え、反応停止後、OD450nmを測定した。(各群:n=3)
(1)CTB-VT2B-C-CPE発現用ベクターの作製
pColdII-CTB-C-CPE194を鋳型とし、コレラ毒素のBサブユニット遺伝子(CTB)をPCR(forward primer:5’-gggGAGCTCacacctcaaaatattactgatttgt-3’(配列番号27)(下線部はSacI切断部位である);reverse primer:5’-ggGGTACCTCCTCCAGATCCTCCTCCTCCAGATCCTCCTCCTCC atttgccatactaattgcggcaat-3’(配列番号28)(下線部はKpnI切断部位である)により増幅した。PCR産物およびpColdI-VT2B-C-CPE194をKpnI(New England Biolabs:R0142)とSalI(New England Biolabs:R0138)で37℃、2時間酵素処理した。その後、T4 DNA ligase(Takara:2011A)を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とDH5α(TOYOBO:DNA-903)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。氷上で3分間静置後、SOC(Novagen:69319)を加え、37℃で45分間培養した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム(nacalai tesque:02739-74)含有LBプレート(nacalai tesque:20067-85)に全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LB培地(nacalai tesque:20066-95)にコロニーを1つ植菌し、37℃で一晩培養した。得られた大腸菌をQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN:27104)を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミド(pColdI-CTB-VT2B-C-CPE194)を得た。pColdI-CTB-VT2B-C-CPE194は、C-CPEとして配列番号1の第194位~第319位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
pColdI-CTB-VT2B-C-CPE194とChaperone Competent Cells pG-Tf2/BL21(Takara:9124)の混合液を氷上で30分間静置し、42℃、42秒間加熱した。その後、100μg/ml アンピシリンナトリウム含有LBプレートに全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム、20μg/mlクロラムフェニコール(nacalai tesque)含有LBプレートに全量播種し、37℃で一晩培養した。翌日、100μg/ml アンピシリンナトリウム、20mg/mlクロラムフェニコール、5ng/ml テトラサイクリン塩酸塩(nacalai tesque)含有LB培地(nacalai tesque)にコロニーを植菌し、37℃でOD600=0.4~0.6まで振盪培養した。15℃、30分間静置した後、IPTG(0.25mM)(nacalai tesque:19742-36)を加え、15℃で24時間振盪培養した。9100×g,2分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにbuffer A(10mM Tris-HCl[pH8.0],400mM NaCl2,5mM MgCl2,0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,1mM 2-mercaptoethanol,10% glycerol)を培養液量の1/100量加え、氷上で40秒間×3回超音波破砕を行った。17800×g,15分間遠心し、上清を0.45μmフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、0.05mM EDTA 12ml,MilliQ 15ml,0.1M NiSO4 3ml,MilliQ 5ml,buffer A 10mlを流したHiTrap Chelating HP Columns(GE Healthcare:17040801)にろ液を充填した。カラムに100mM イミダゾール含有buffer Aを10ml流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、500mM イミダゾール10mlを流すことで目的タンパク質(CTB-VT2B-C-CPE)を抽出した。あらかじめPBS 25mlを流し、平衡化したPD-10カラム(GE Healthcare:17085101)に抽出タンパク質を充填し、PBSを流し込むことでタンパク質のバッファーをPBSに置換した。
(1)免疫方法と血清の回収
8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回、実施例4及び実施例5にて作製した(VT2B,CTB-VT2B-C-CPE)を、VT2B量として18μg、PBS 200μlに溶解し、マウスの皮下に投与した。対照群としてPBSのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の1週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は30分以上氷上で静置後、3000×g,10分間、4℃で遠心分離し、上清(血清)を回収した。
VT2Bタンパク質(5μg/ml in PBS)(実施例4で作製)を96well plateに100μl/well播種し、4℃で一晩固相化した。翌日、1% BSA-PBS 170μlを加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで希釈した血清を加え、室温で2時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、Goat anti-mouse IgG-HRP(Sourthern Biotech:1031-05)を1% BSA-0.05% Tween 20-PBSで4000倍希釈したものを100μl/well播種し、室温で1時間静置した。0.05% Tween 20-PBSで3回洗浄後、TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories:50-76-11)100μl/wellを加え、室温で2分間発色させた。0.5N HCl 50μl/wellを加え、反応停止後、OD450nmを測定した。(各群:n=3)
(1)免疫方法とVT2の投与
8週齢、♀、BALB/cマウス(日本クレア)に週1回、計2回、実施例4及び実施例5にて作製した各種タンパク質(VT2B,CTB-VT2B-C-CPE)をVT2B量として18μgをPBS 200μlに溶解し、マウスの皮下に投与した。対照群としてPBSのみを投与したマウスを用意した。最終免疫10日後にVT2(Toxin Technology Inc.,STX-2)1ngをPBS 500μlに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。VT2投与から1週間、1日に2回(朝と夜)、マウスを観察した。(各群:n=3)
本実施例では、ワクチン抗原タンパク質としてC-CPEとVT2Bを含む融合体(VT2B-C-CPE)を作製した(図12A参照)。本実施例のワクチン抗原は、実施例4と同手法により作製した。
本実験例では、実施例6に示すVT2B-C-CPEを実験例2-5と同手法によりマウスに投与したときのIgG産生能を確認した。抗原タンパク質は、図12Bに示すプロトコールに従い0日目及び7日目のマウス皮下に注射し、14日目でのウエルシュ菌毒素特異的血清中IgG産生を確認した。
本実験例では、実験例4-3と同手法により、図13Aに示すプロトコールに従い、各抗原タンパク質をマウスに免疫投与して血清を回収し、得られた血清についてウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性を確認した。
本実験例では、実験例2-6と同手法により、図14Aに示すプロトコールに従い、各抗原タンパク質をマウス皮下投与による免疫を行い、17日目にウエルシュ菌毒素、Bio academia:01-509)(100μg/kg)を尾静脈注射し、血中のカリウム量を測定した。
本参考例では、実施例6にVT2B-C-CPEを実験例2-5と同手法によりマウスに投与したときのIgG産生能を確認した。VT2B-C-CPEは、図16Aに示すプロトコールに従い0日目及び7日目のマウス皮下に注射し、14日目でのVT2B特異的血清中IgG産生を確認した。
本参考例では、図17Aのプロトコールに従い各抗原タンパク質をマウス皮下に注射し、最終免疫10日後にVT2(Toxin Technology Inc.,STX-2)1ngをPBS 500μlに溶解し、マウスの皮下内に投与したときのマウスへの影響を確認した。VT2投与から1週間、1日に2回(朝と夜)、マウスを観察した。
Claims (3)
- ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片と、ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも1つの抗原との融合体を有効成分とする多価ワクチンであり、
前記ウエルシュ菌エンテロトキシンのC末端断片が、以下の(1)及び(2)から選択されるいずれかのタンパク質であり、
前記ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも1つの抗原が、コレラ菌のCTB、病原性大腸菌のVT2B、及びカンピロバクターのFlaAから選択される抗原であることを特徴とする、多価ワクチン:
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列の部分配列を有しており、少なくとも第304位~第319位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2)(1)のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を有しており、免疫原性を有するタンパク質。 - 少なくともウエルシュ菌に起因する疾患又は症状を予防及び/又は治療するための、請求項1に記載の多価ワクチン。
- 請求項1又は2に記載の多価ワクチンを含有する、少なくともウエルシュ菌に起因する感染症を予防及び/又は治療するための医薬組成物。
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