WO2018159476A1 - 多価ワクチン - Google Patents

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WO2018159476A1
WO2018159476A1 PCT/JP2018/006633 JP2018006633W WO2018159476A1 WO 2018159476 A1 WO2018159476 A1 WO 2018159476A1 JP 2018006633 W JP2018006633 W JP 2018006633W WO 2018159476 A1 WO2018159476 A1 WO 2018159476A1
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cpe
pbs
ctb
minutes
protein
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PCT/JP2018/006633
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English (en)
French (fr)
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純 國澤
鈴木　英彦
晃司 細見
昌夫 近藤
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一般財団法人阪大微生物病研究会
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a multivalent vaccine used for prevention and / or treatment of infectious diseases.
  • Infectious diseases are not only caused by highly pathogenic pathogens, but also do not exhibit pathogenicity against normal hosts, but may also be caused by virulence on weakly resistant hosts, It has become a big problem.
  • Some vaccines against infectious diseases contain only one type of antigen, but vaccines made to contain antigens according to various types, simultaneous inoculation of antigens against a plurality of pathogens, and the like are performed. By simultaneously inoculating multiple antigens, it is possible to obtain the necessary immunity reliably and promptly, increasing the convenience of vaccine supply and reducing medical costs, etc. It is thought that it can be raised.
  • Food poisoning is one of the infectious diseases caused by food.
  • Food poisoning refers to causing symptoms such as diarrhea, vomiting, and fever by ingesting bacteria, viruses, and the like through the mouth through food.
  • food poisoning was expected to decrease as hygiene management techniques developed, many food poisoning incidents are still occurring.
  • the number of patients per case has increased and the number of incidents tends to increase.
  • a mass infection caused by pathogenic E. coli O-157 there is a risk of large-scale infection occurring in young children, elderly people, school-related facilities, and the like.
  • mass infection it is necessary to pay attention to cases where patients discharge large amounts of bacteria and viruses and cause secondary infections.
  • Clostridium perfringens is one of the causative bacteria of food poisoning. Clostridium perfringens is widely distributed in the intestinal tract of humans, animals, soil, sewage, etc., and there are many opportunities for food contamination. It is also present in human feces, and the retention rate of thermostable spore-forming Welsh bacteria varies with age and living environment, but is said to be about 6 to 40%. Since Clostridium perfringens makes spores resistant to heat, heat-resistant spores of Clostridium perfringens survive even if other bacteria are killed by cooking. In addition, the central portion of the food becomes oxygen-free and becomes a favorable state for the anaerobic bacterium Clostridium perfringens.
  • C. perfringens enterotoxin (hereinafter referred to as “CPE”) is a protein having a molecular weight of about 35 kDa and is a causative substance of infectious food poisoning caused by C. perfringens.
  • CPE is known to bind to claudin 3, 4, 6, 7, 8 and 14 of the claudin family, which is a tight junction constituent protein of cells (Fujita, K. et al., ( 2000) FEBS Letters 476, 258-261.). It is reported that claudin 4 is highly expressed on Peyer's board (Tamagawa, H. et al., (2003) Laboratory Investigation 83, 1045-1053.).
  • C-CPE CPE C-terminal fragment
  • Patent Document 1 16 amino acids at positions 304 to 319 of CPE are related to the binding between CPE and claudin 4 (Patent Document 2, Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • An object of the present invention is to provide a multivalent vaccine capable of controlling immunity against two or more microorganisms including Clostridium perfringens, and to provide a pharmaceutical composition capable of efficiently preventing and / or treating infectious diseases. .
  • a fusion antigen of C-CPE and another antigen can induce immunity against Clostridium perfringens and other microorganisms.
  • the inventors have found that a fusion antigen can be an active ingredient of a multivalent vaccine, and have completed the present invention.
  • the present invention comprises the following.
  • a multivalent vaccine characterized in that it comprises C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin and at least one antigen derived from microorganisms other than Clostridium perfringens as an active ingredient and can induce immunity against two or more microorganisms including Clostridium perfringens. .
  • 3. The multivalent vaccine according to item 1 or 2, which can induce a specific antibody against Clostridium perfringens enterotoxin. 4).
  • the multivalent vaccine according to any one of 1 to 3 above which can induce an antibody having reactivity with an antigen derived from a microorganism other than Clostridium perfringens. 5). 5. The multivalent vaccine according to any one of 1 to 4 above, wherein the C-terminal fragment of C. perfringens enterotoxin alone cannot induce a specific antibody against C. perfringens enterotoxin. 6).
  • the multivalent vaccine according to any one of 1 to 7 above for preventing and / or treating a disease or symptom caused by bacteria.
  • a pharmaceutical composition for preventing and / or treating an infectious disease comprising the multivalent vaccine according to any one of 1 to 7 above.
  • the multivalent vaccine of the present invention can induce immunity against two or more microorganisms including Clostridium perfringens in vivo.
  • the multivalent vaccine of the present invention is for preventing and / or treating diseases or symptoms caused by microorganisms, and can be used for preventing and / or treating infectious diseases.
  • FIG. 1B shows the result (FIG. 1B) which confirmed the administration schedule (FIG. 1A) of C-CPE independent, C-CPE + Alum, PspA-C-CPE, and the production ability of serum anti-C-CPE IgG antibody.
  • Example 1 Schematic diagram of CTB-C-CPE (Fig. 2A), photograph showing the presence or absence of protein in CTB, C-CPE, CTB-C-CPE by CBB staining (Fig. 2B), CTB, C-CPE, CTB-C
  • FIG. 2 is a view showing the result of confirming the GM1 binding property of CPE (FIG.
  • FIG. 5 is a view showing the result of confirming the neutralizing activity against cell death by Clostridium perfringens toxin (FIG. 5B).
  • FIG. 7B Schematic diagram of VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE (FIG. 8A), C-CPE, VT2B, FlaA, VT2B-C-CPE, and presence / absence of FlaA-C-CPE protein confirmed by CBB staining (FIG. 8B) is a diagram showing the result (FIG. 8C) of confirming claudin 4 binding property.
  • Example 4 shows the administration schedule of PBS, C-CPE + Alum, VT2B-C-CPE, and FlaA-C-CPE.
  • Example 4-2 to 4 Results of confirming the ability to produce C-CPE-specific IgG antibodies in serum when administered with PBS, C-CPE + Alum, VT2B-C-CPE, FlaA-C-CPE (FIG. 10A), and C. perfringens Results of confirming neutralizing activity against toxin (FIG. 10B), results of confirming ability to produce VT2B-specific IgG antibody in serum when PBS and VT2B-C-CPE were administered (FIG.
  • FIG. 10 shows the result of confirming the ability to produce FlaA-specific IgG antibody in serum when CPE is administered (FIG. 10D).
  • FIG. 11A Schematic diagram of CTB-VT2B-C-CPE (FIG. 11A), results of confirming the ability to produce VT2-specific IgG antibodies in serum when PBS, VT2B, CTB-VT2B-C-CPE were administered (FIG. 11B), It is a figure which shows the result (FIG. 11C) which confirmed the influence on the survival rate of a mouse
  • Example 5, Experimental example 5-1) It is a figure which shows the IgG production ability in a S.
  • FIG. 12A is a diagram showing the structure of a vaccine antigen.
  • FIG. 12B shows the experimental protocol, and
  • FIG. 12C shows the result.
  • Example 6 (Experimental example 6-1) It is a figure which shows the neutralizing activity of VT2B-C-CPE with respect to the cell death by Clostridium perfringens toxin.
  • FIG. 13A shows the experimental protocol, and
  • FIG. 13B shows the result.
  • Example 6-2 It is a figure which shows the result of having confirmed the biological defense induction effect of VT2B-C-CPE with respect to blood administration of Clostridium perfringens toxin by blood potassium concentration.
  • FIG. 14A shows the experimental protocol
  • FIG. 14B shows the result.
  • Example 6-3 It is a figure which shows the biological defense induction effect of VT2B-C-CPE with respect to blood administration of Clostridium perfringens toxin.
  • FIG. 15A shows an experimental protocol
  • FIG. 15B shows a result of mouse kinetics.
  • Example 6-3 It is a figure which shows VT2B-specific serum IgG production ability by VT2B-C-CPE.
  • FIG. 6-3 It is a figure which shows VT2B-specific serum IgG production ability by VT2B-C-CPE.
  • FIG. 16A shows the experimental protocol
  • FIG. 16B shows the result.
  • Reference Example 1 It is a figure which shows the influence to the mouse
  • FIG. 17A shows the experimental protocol
  • FIG. 17B shows the measurement result of the blood BUN amount of the renal injury marker
  • FIG. 17C shows the result of affecting the survival rate of mice.
  • the multivalent vaccine of the present invention contains two or more types of antigens as active ingredients, and can induce immunity against these types of antigens.
  • the multivalent vaccine of the present invention first contains C-CPE as an antigen, and additionally contains one or more antigens other than C-CPE.
  • the antigen other than C-CPE may be any antigen as long as it is derived from a microorganism other than C. perfringens.
  • the antigen derived from microorganisms other than Clostridium perfringens should just be contained at least 1 type, and may be contained 2 or more types and 3 or more types.
  • the multivalent vaccine in this specification can induce immunity against two or more microorganisms including Clostridium perfringens.
  • the ability to induce immunity against Clostridium perfringens includes the ability to induce specific antibodies against Clostridium perfringens toxins (for example, CPE-specific IgG antibodies in serum), and preferably antibodies that have neutralizing activity against Clostridium perfringens toxins. Including being able to be guided.
  • it can induce neutralizing activity against cell death caused by Clostridium perfringens toxin, and can induce biological defense reaction against symptoms and pathologies caused by Clostridium perfringens toxin such as diarrhea and chorionic disintegration and hyperkalemia. including.
  • Immunization against microorganisms other than Clostridium perfringens includes inducing a specific antibody against a microorganism-derived antigen or toxin (for example, the toxin-specific serum IgG antibody), preferably a neutralizing antibody. It can induce neutralizing activity against cell death caused by, and a biological defense reaction against symptoms and pathologies caused by the antigen or toxin.
  • a specific antibody against a microorganism-derived antigen or toxin for example, the toxin-specific serum IgG antibody
  • a neutralizing antibody for example, the toxin-specific serum IgG antibody
  • These immunity induction capacities can be confirmed based on the description of Examples and Experimental Examples described later. Since the multivalent vaccine in this specification exhibits these immunity induction abilities, it can be used in particular for preventing and / or treating diseases or symptoms caused by bacteria.
  • Clostridium perfringens toxin in this specification is a substance produced from Clostridium perfringens and toxic to living organisms, and is also called CPE.
  • CPE is a protein consisting of 319 amino acids represented by SEQ ID NO: 1, and a gene encoding this protein has a base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a gene encoding CPE (SEQ ID NO: 2) is registered in a known database (GenBank, etc.) as an accession number: M98037. The amino acid sequence of CPE and the base sequence of the gene encoding it are specifically shown below.
  • CPE amino acid sequence (SEQ ID NO: 1): MLSNNLNPMVFENAKEVFLISEDLKTPINITNSNSNLSDGLYVIDKGDGWILGEPSVVSSQILNPNETGTFSQSLTKSKEVSINVNFSVGFTSEFIQASVEYGFGITIGEQNTIERSVSTTAGPNEYVYYKVYATYRKYQAIRISHGNISDDGSIYKLTGIWLSKTSADSLGNIDQGSLIETGERCVLTVPSTDIEKEILDLAAATERLNLTDALNSNPAGNLYDWRSSNSYPWTQKLNLHLTITATGQKYRILASKIVDFNIYSNNFNNLVKLEQSLGDGVKDHYVDISLDAGQYVLVMKANSSYSGNYPYSILFQKF
  • CPE can be obtained by collecting and purifying from C. perfringens producing CPE.
  • a CPE expression vector can be constructed by a known gene recombination technique, introduced into an appropriate host for expression, and the recombinant protein can be recovered and purified.
  • C-CPE is a partial protein of CPE that contains the C-terminal amino acid of CPE but does not contain the N-terminal amino acid.
  • the C-CPE of the present invention has a immunity-inducing ability (for example, the ability to induce a specific antibody against CPE) as compared with a single substance by constituting a fusion with another antigen, and can exert a vaccine effect. Is. Even if C-CPE alone cannot induce immunity, it can exhibit immunity-inducing ability by forming a fusion.
  • the inability to induce immunity means, for example, that a specific antibody against CPE cannot be induced, but does not mean that it cannot be induced at all, but means that it cannot be induced substantially.
  • C-CPE is not particularly limited as long as it has immunogenicity and may or may not have the ability to bind claudin 4.
  • Immunogenicity is a property that can function as an epitope in a living body and induce an immune response (particularly production of specific antibodies). Until an antigen having immunogenicity actually exhibits immunity induction ability in the living body and exerts a vaccine effect, the invasion efficiency into the living body through the mucous membrane, the efficiency of antigen presentation in immune cells, etc. It is thought that various in vivo processes are related.
  • the present invention is characterized in that the ability to induce immunity against Clostridium perfringens in vivo can be enhanced by fusing C-CPE with other antigens.
  • a gene encoding C-CPE can be obtained by a polymerase chain reaction (PCR) method using a CPE gene as a template and an appropriate synthetic oligonucleotide primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a C-CPE expression vector is constructed by a known gene recombination technique, and this is introduced into an appropriate host, and the expressed recombinant protein is recovered and purified to obtain C-CPE. Can be obtained.
  • C-CPE is a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and includes at least the 304th to 319th amino acid sequences.
  • the size of C-CPE (number of amino acid residues) is not particularly limited, but the maximum is a protein consisting of amino acids 53 to 319, a protein consisting of amino acids 194 to 319, and 205. Examples include a protein consisting of the amino acid sequence at the 319th position, and a protein consisting of the amino acid sequence at the 304th to 319th positions, and preferably a protein consisting of the amino acid sequence at the 194th to 319th positions.
  • C-CPE may be any one that can exhibit immunity-inducing ability when it constitutes a fusion protein with another antigen, and has one or several amino acids substituted, deleted, added or inserted. Also good. Amino acid substitutions, deletions, additions or insertions may be included in the region from position 304 to position 319.
  • C-CPE does not exhibit toxicity.
  • the expression of no toxicity means that the cytotoxicity of CPE has disappeared.
  • the toxicity of CPE is known to be governed by the amino acid region on the N-terminal side of CPE.
  • C-CPE lacking amino acids from the N-terminal to the 52nd position of CPE positions 53 to 319) It has been reported that no toxicity is expressed (Non-patent Document 2). Therefore, C-CPE that does not express toxicity can be obtained by using C-CPE from which at least amino acids 1 to 52 of CPE have been deleted.
  • C-CPE having a region prior to position 52 of CPE induces mutations such as substitution, deletion, insertion, and modification in the region of positions 45 to 52 that are considered to be toxic. By doing so, it is also possible to obtain C-CPE that does not exhibit toxicity.
  • “one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted” means that substitution, deletion, addition or insertion can be performed by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis.
  • the number of amino acids preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less
  • Such a mutant protein (modified product) is not limited to a protein having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, but is a protein obtained by isolating and purifying a naturally occurring protein. May be.
  • Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, additions or insertions. Silent substitution, deletion, addition or insertion is preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These are believed not to alter the polypeptide activity according to the invention. Typically seen as conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile, exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.
  • the antigen contained in the vaccine of the present invention is not particularly limited, but is preferably a microorganism-derived antigen.
  • Microorganisms include resident microorganisms and infectious pathogens. Infectious pathogens include bacteria, viruses, parasites, or fungi that cause infectious diseases. Specifically, pathogenic E. coli (enterohemorrhagic E.
  • coli cholera
  • campylobacter pneumococci
  • shigella salmonella
  • staphylococcus pertussis
  • meningococcus cryptococcus
  • aspergillus influenza virus
  • HIV HIV
  • norovirus coronavirus
  • rotavirus adenovirus
  • herpes virus rubella virus
  • rabies virus Japanese encephalitis virus
  • Plasmodium falciparum mycoplasma, diphtheria, tetanus, hepatitis b, hepatitis B virus, RS virus, Vibrio parahaemolyticus, etc. are mentioned.
  • the microorganism-derived antigen may be any antigen that can induce immunity to the microorganism, and any antigen that can induce a microorganism-specific antibody.
  • a microorganism-derived toxin can be used as a microorganism-derived antigen.
  • the microorganism-derived antigen may be either an active ingredient contained in a vaccine known per se or an antigen developed in the future, and is not particularly limited.
  • the antigen preferably enters the living body through the mucous membrane and preferably has an immunogenicity capable of inducing immunity in the living body.
  • CT cholera toxin
  • CTB CT subunit B
  • VT2 verotoxin type 2
  • FlaA flagellar protein encoded by the FlaA gene
  • CTB, VT2B, and FlaA used in the present invention are specifically 1 or 2 in the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3, 4, and 5 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3, 4, and 5, respectively.
  • Examples thereof include proteins consisting of amino acid sequences in which several amino acids are substituted, deleted, added or inserted.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, and 5 are as described below.
  • CTB (SEQ ID NO: 3, Accession number: U25679): TPQNITDLCAEYHNTQIHTNLDKIFSYSYSLAGKREMAIITFKNGATTFQVEVPGSQHIDSQKKAIERKDTTLRIARYLTAKVELKLCVWNNKTPHAIAISMAN
  • VT2B (SEQ ID NO: 4, accession number: NP — 050540.1): MKKMFMALFFALASVNMAADCAKKGIEFSKYNEDDTFTVKVDGKEYWTRSRWNLQPLLQSAQLTGMVTSTKSESGSGSFAEVQFNND
  • FlaA (SEQ ID NO: 5, accession number: WP — 011812789. 1): MGFRINTNVAALNAKANSDLNAKSLDASLSRLSSGLRINSAADDASGMAIADSLRSQANTLGQAISNGNDALGILQTADKAMDEQLKILDTIKTKATQAAQDGQSLKTRTMLQADINKLMEELDNIANTTSFNGKQLLSGNFTNQEFQIGASSNQTVKATIGATQSSKIGVTRFETGAQSFTSGVVGLTIKNYNGIEDFKFDNVVISTSVGTGLGALAEEINKSADKTGVRATYDVKTTGVYAIKEGTTSQEFAINGVTIGKIEYKDGDGDGNGSLISAINAVKDTTGVQASKDENGKLVLTSADGRGIKITGDIGVGSGILANQKENYGRLSLV NDGRDINISGTNLSAIGMGTTDMISQSSVSLRESKGQISATNADAMGFNSYKGGGKFVFTQNVSSISAFMSAQGSGFSRGSGFSVGSGKNL
  • CTB, VT2B, and FlaA can be obtained by collecting and purifying from V. cholerae, pathogenic Escherichia coli, and Campylobacter that produce CTB, VT2B, and FlaA.
  • a CTB expression vector, VT2B expression vector, and FlaA expression vector can be constructed by a known gene recombination technique, introduced into an appropriate host for expression, and the recombinant protein can be recovered and purified.
  • C-CPE and other antigens are preferably fusions.
  • the fusion is not particularly limited as long as it includes C-CPE and other antigens integrated.
  • the fusion may contain other than C-CPE and other antigens.
  • Examples of fusions include fusion proteins of C-CPE and other antigens (also called fusion antigens), liposomes encapsulating antigens and conjugates of C-CPE, and binding of nanomaterials carrying antigens to C-CPE.
  • the fusion protein of C-CPE and other antigens is preferable.
  • a linker that binds C-CPE and another antigen can be included as a substance other than C-CPE and another antigen (see FIGS. 2 and 12).
  • Linkers can also be used to link antigens with other antigens.
  • a linker consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34 below can be used.
  • a linker consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 is preferred.
  • a fusion protein of C-CPE and another antigen can be produced by a known gene recombination technique.
  • a fusion gene hybrid gene in which a gene encoding C-CPE and a gene encoding a protein used as another antigen are artificially linked is prepared, and the fusion gene is inserted downstream of the promoter of the expression vector. It can be obtained by introducing it into a suitable host cell and expressing it.
  • the order of binding between C-CPE and other antigens is not limited, the N-terminus may be another antigen and the C-terminal side may be C-CPE, and conversely the N-terminus is C-CPE and the C-terminal side is other.
  • the base sequence information of a gene encoding a protein as another antigen can be obtained from a known database (GenBank, etc.).
  • base sequence information can be obtained by cloning a target gene using a known method and performing base sequence analysis. Based on the base sequence information thus obtained, a nucleic acid can be extracted from an organism having the target antigen, and a gene can be obtained using a known means such as PCR.
  • the fusion protein examples include a fusion product of C-CPE and an antigen derived from at least one pathogen of Vibrio cholerae, pathogenic E. coli, or Campylobacter.
  • the multivalent vaccine of the present invention is at least a bivalent vaccine, and may be a multivalent vaccine such as a trivalent vaccine or a tetravalent vaccine.
  • the vaccine of the present invention can be administered by oral administration or parenteral administration.
  • parenteral administration include intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, intranasal administration, transdermal administration, and transmucosal administration.
  • the administration site for transmucosal administration is not particularly limited, but specifically, nasal mucosa, digestive mucosa (gastrointestinal mucosa, intestinal mucosa), respiratory mucosa (pulmonary mucosa, tracheal mucosa), oral mucosa, vagina Examples include mucous membrane and ocular mucosa. Among these, nasal mucosa, digestive mucosa and oral mucosa are preferable for convenience.
  • Examples of the administration subject of the multivalent vaccine of the present invention include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cats, cows, dogs, horses, goats, and birds such as chickens.
  • the compounding amount of the fusion as an active ingredient of the multivalent vaccine of the present invention may be any amount that is effective for inducing an immune response when administered in vivo, and the type of antigen, subject of administration
  • the multivalent vaccine is administered once to several times a day, preferably once a day (primary immunization). ), Usually re-administered 2-3 weeks later (boost immunization).
  • the present invention may be formulated as a pharmaceutical composition containing a multivalent vaccine.
  • a pharmaceutical composition containing a multivalent vaccine may appropriately contain a carrier or additive usually used in a pharmaceutical composition. What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited, for example, various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption enhancers Various additives such as an agent, a lubricant, a coloring agent, a corrigent, and a fragrance are included.
  • additives include lactose, sucrose, mannitol, sodium chloride, glucose, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicate and other excipients; water, ethanol, simple syrup, glucose solution, Binding agents such as starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, gelatin, dextrin, pullulan; citric acid, anhydrous citric acid, citric acid PH adjusters such as sodium, sodium citrate dihydrate, anhydrous sodium monohydrogen phosphate, anhydrous sodium dihydrogen phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate; Disintegrating agents such as calcium, low-substituted hydroxypropylcellulose, carmellose, croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, crospovidone, polysorbate 80; other absorption promote
  • a biodegradable synthetic polymer may be used as a base for a pharmaceutical composition containing the multivalent vaccine of the present invention.
  • biodegradable synthetic polymers include polylactic acid, poly (lactic acid-glycolic acid) copolymer, polyhydroxybutyric acid, poly (hydroxybutyric acid-glycolic acid) copolymer, and mixtures thereof. It is mentioned as a typical thing. However, it is not limited to these.
  • the shape of the pharmaceutical composition containing the multivalent vaccine of the present invention is not particularly limited, and may be any of solid, liquid, semi-solid, suspension, powder, and fine particles.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for preventing and / or treating infectious diseases.
  • the infectious disease is not particularly limited as long as it can be prevented and / or treated by immunity induced by the antigen contained in the multivalent vaccine of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the purpose of preventing the onset of infectious diseases, preventing symptoms / pathological conditions associated with infectious diseases, reducing symptoms, and the like.
  • C-CPE and other antigen fusions are all linked by a linker consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34. When linking a plurality of antigens, they are bound by the linker.
  • Biomaterials. (2010) 31, 5463-5471) was replaced with KpnI (New England Biolabs: R0142), Enzyme treatment with acI (New England Biolabs: R0547) at 37 ° C. for 2 hours, followed by ligation using T4 DNA ligase (Takara: 2011A) Mixture of ligation product and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) The mixture was allowed to stand for 30 minutes on ice and heated for 42 seconds at 42 ° C. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, followed by incubation for 45 minutes at 37 ° C.
  • pET16b-PspA-C-CPE 184 was represented by SEQ ID NO: 1 as C-CPE.
  • a gene encoding the amino acid sequence at positions 184 to 319 is cloned.
  • a mixture of pET16b-PspA-C-CPE184 and BL21 (Novagen: 69450) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes. Thereafter, the entire amount was inoculated on a 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium-containing LB plate and cultured at 37 ° C. overnight. On the next day, one colony was inoculated into LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium and cultured at 37 ° C. overnight.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 10% glycerol) is added to the pellet, and 1/100 volume of the culture solution. Ultrasonic crushing was performed 3 times for 40 seconds on ice. Centrifugation was performed at 17800 ⁇ g for 15 minutes, the supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was collected.
  • the filtrate was charged in advance to HiTrap Chelating HP Columns (GE Healthcare: 17040801) in which 12 ml of 0.05 mM EDTA, 15 ml of MilliQ, 3 ml of 0.1 M NiSO 4 , 5 ml of MilliQ, and 10 ml of buffer A were passed. 10 ml of 100 mM imidazole-containing buffer A was passed through the column, the non-specific protein was washed, and then 10 ml of 500 mM imidazole was passed to extract the target protein (PspA-C-CPE). PBS (25 ml) was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • HiTrap Chelating HP Columns GE Healthcare: 17040801
  • the biotinylation of PspA-C-CPE was performed using EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (ThermoFisher: 21425), and the procedure was performed according to the protocol of the kit.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 10% glycerol) is added to the pellet, and 1/100 volume of the culture solution. Ultrasonic crushing was performed 3 times for 40 seconds on ice. Centrifugation was performed at 17800 ⁇ g for 15 minutes, the supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was collected.
  • the filtrate was charged in advance to HiTrap Chelating HP Columns (GE Healthcare: 17040801) in which 12 ml of 0.05 mM EDTA, 15 ml of MilliQ, 3 ml of 0.1 M NiSO 4 , 5 ml of MilliQ, and 10 ml of buffer A were passed. Run 10 ml of buffer A containing 100 mM imidazole through the column, wash the non-specific protein, and then wash 10 ml of 500 mM imidazole to obtain the target protein (C-CPE protein (the amino acid sequence from position 194 to position 319 of SEQ ID NO: 1). Having protein)). PBS (25 ml) was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • C-CPE protein the target protein
  • Example 1 Confirmation of production ability of serum anti-C-CPE IgG antibody As shown in FIG. 1A, 8 weeks old, sputum, BALB / c mice (CLEA Japan) once a week, twice in total, Example 1 The various proteins prepared in Comparative Example 1 were adjusted so that the amount of C-CPE was 10 ⁇ g and administered intraperitoneally.
  • C-CPE + Alum C-CPE mixed with 100 ⁇ l of Image Alum Adjuvant (Thermo: 77161) was used at room temperature for 30 minutes.
  • C-CPE protein (10 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Comparative Example 1) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and immobilized at 4 ° C. overnight. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • FIG. 1B The result is shown in FIG. 1B. It was confirmed that when PspA-C-CPE was administered, the ability to produce serum anti-C-CPE IgG antibody was remarkably higher than when C-CPE alone or C-CPE + Alum was administered. C-CPE alone has a low immunity-inducing ability, but it has been confirmed that the immunity-inducing ability is enhanced by using a fusion with another antigen.
  • Example 2 Production 1 of Fusion Protein CTB-C-CPE pNU212-CTB inaba569B (Obtained by: National University Corporation of Tokyo) as a template, PCR (forward primer: 5'-ca ggtacc acactacaata attact-3 '(SEQ ID NO: 8) (underlined is the KpnI cleavage site); reverseprase : 5′-a gaattc tattattgcccatactatattgc-3 ′ (SEQ ID NO: 9) (underlined is the EcoRI cleavage site)).
  • PCR forward primer: 5'-ca ggtacc acactacaata attact-3 '(SEQ ID NO: 8) (underlined is the KpnI cleavage site); reverseprase : 5′-a gaattc tattattgcccatactatattgc-3 ′ (SEQ ID NO: 9) (underlined is the EcoRI cleavage site
  • the PCR product and pColdII DNA (Takara: 3362) were enzymatically treated with KpnI (New England Biolabs: R0142) and EcoRI-HF (New England Biolabs: R3101) at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, ligation was performed using T4 DNA ligase (Takara: 2011A). A mixture of the ligation product and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
  • pColdII-CTB-C-CPE184 is prepared.
  • pNU212-CTB inaba569B (Obtained by: National University Corporation of Tokyo) as a template, PCR (forward primer: 5'-ca ggtacc acactacaata attact-3 '(SEQ ID NO: 8) (underlined is the KpnI cleavage site); reverseprase : 5′-ac tattaata atttgcccatactatattgcg-3 ′ (SEQ ID NO: 10) (underlined is the PacI cleavage site)).
  • the PCR product and pET16b-PspA-C-CPE184 were enzymatically treated with KpnI (New England Biolabs: R0142) and PacI (New England Biolabs: R0547) at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, ligation was performed using T4 DNA ligase (Takara: 2011A). A mixture of the ligation product and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
  • PCR forward primer: 5′-aa ggtacc acctcaaaaatattact-3 ′ (SEQ ID NO: 11) (underlined is the KpnI cleavage site); reverse primer: 5′- tat gatt -3 ′ (SEQ ID NO: 12) (underlined is the EcoRI cleavage site)).
  • the PCR product and pColdII DNA (Takara: 3362) were enzymatically treated with KpnI (New England Biolabs: R0142) and EcoRI-HF (New England Biolabs: R3101) at 37 ° C. for 2 hours.
  • ligation was performed using T4 DNA ligase (Takara: 2011A).
  • a mixture of the ligation product and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes. Subsequently, 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium (nacalai tesque: 02739-74) -containing LB plate (nacalai tesque: 20067-85) was inoculated in whole and cultured at 37 ° C. overnight.
  • pColdII-CTB-C-CPE184 Using pColdII-CTB-C-CPE184 as a template, recombination was performed using a mutageness kit (TOYOBO).
  • a mixture of the obtained plasmid and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was left on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After leaving still on ice for 3 minutes, 900 ⁇ l of SOC (Novagen: 69319) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes. Then, 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium (nacalai tesque) -containing LB plate (nacalai tesque) was inoculated in whole and cultured at 37 ° C. overnight.
  • pColdII-CTB-C-CPE194 is a cloned gene encoding the amino acid sequence from position 194 to position 319 of SEQ ID NO: 1 as C-CPE.
  • a mixture of pColdII-CTB or pColdII-CTB-C-CPE194 and Chaperone Competent Cells pG-Tf2 / BL21 (Takara: 9124) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. Thereafter, the entire amount was inoculated on an LB plate containing 100 ⁇ / ml ampicillin sodium and cultured at 37 ° C. overnight. The next day, 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium, 20 ⁇ g / ml chloramphenicol (nacalai tesque) -containing LB plate was inoculated and cultured at 37 ° C. overnight.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 10% glycerol) is added to the pellet, and 1/100 volume of the culture solution. Ultrasonic crushing was performed 3 times for 40 seconds on ice. Centrifugation was performed at 17800 ⁇ g for 15 minutes, the supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was collected.
  • the filtrate was charged in advance to HiTrap Chelating HP Columns (GE Healthcare: 17040801) in which 12 ml of 0.05 mM EDTA, 15 ml of MilliQ, 3 ml of 0.1 M NiSO 4 , 5 ml of MilliQ, and 10 ml of buffer A were passed. 10 ml of buffer A containing 100 mM imidazole was passed through the column, and after washing the non-specific protein, the target protein (CTB, CTB-C-CPE) was extracted by running 10 ml of 500 mM imidazole. PBS (25 ml) was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • HiTrap Chelating HP Columns GE Healthcare: 17040801
  • ThermoFisher NP0009
  • LDS Sample buffer ThermoFisher: NP0007
  • Electrophoresis was performed using the NuPAGE gel system (ThermoFisher). The gel was stained with CBB Stain One (Nacalai tesque: 04543-51).
  • FIG. 2A A schematic diagram of the fusion protein CTB-C-CPE obtained in Example 2 is shown in FIG. 2A. Moreover, the result of having confirmed protein by CBB dyeing
  • FITC anti-mouse IgG1 Antibody (BioLegend: 406605) diluted 200-fold with 2% NCS-PBS was seeded at 100 ⁇ l / well and allowed to react on ice for 30 minutes.
  • 7-AAD Viability Staining Solution (BioLegend: 420403) diluted 100-fold with 2% NCS-PBS was seeded at 50 ⁇ l / well and allowed to react on ice for 10 minutes. The sample after being washed once with 2% NCS-PBS was subjected to FACS analysis.
  • results for GM1 binding are shown in FIG. 2C, and results for claudin 4 binding are shown in FIG. 2D. It was confirmed that the fusion protein CTB-C-CPE has a binding property to the receptor GM1 as well as CTB alone, and a binding property to the receptor claudin 4 similarly to C-CPE alone. . That is, it was confirmed that the fusion protein CTB-C-CPE retains the same degree of binding to both CTB and C-CPE receptors.
  • Example 2-2 Confirmation of Cholera Toxin Specific Serum IgG and Fecal IgA Production Ability
  • FIG. 3 8 weeks old, sputum, BALB / C mice (CLEA Japan) were injected subcutaneously with various proteins (produced in Example 2 and Comparative Example 1) in which 20 ⁇ g of CTB and 24 ⁇ g of C-CPE were suspended in 200 ⁇ l of PBS. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • mice 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • blood was collected by collecting blood from the fundus. The collected blood was allowed to stand on ice for 30 minutes or more and then centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes to collect the supernatant (serum).
  • Cholera toxin (List Biological Laboratories: 100B) (5 ⁇ g / ml in PBS) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and solidified overnight at 4 ° C. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • Cholera toxin (List Biological Laboratories: 100B) (5 ⁇ g / ml in PBS) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and solidified overnight at 4 ° C. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, the fecal extract was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • Example 2-3 Confirmation of CT-GM1 Binding Neutralization Activity
  • 20 ⁇ g of CTB and 24 ⁇ g of C-CPE were added to 8 weeks old, sputum, BALB / c mice (CLEA, Japan) as PBS.
  • Various proteins produced in Example 2 and Comparative Example 1 suspended in 200 ⁇ l were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • Mice (Otsuka Pharmaceutical) 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • GM1 (Sigma: G7641) (5 ⁇ g / ml in PBS) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and solidified overnight at 4 ° C. On the next day, after washing 5 times with 0.05% Tween 20-PBS, 200 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, seeded with cholera toxin (List Biological Laboratories: 100B) (1.25 ng) + serum (4 ⁇ l) previously reacted at 37 ° C. for 1 hour, 2 hours Reacted.
  • cholera toxin List Biological Laboratories: 100B
  • Anti-beta subunit Cholera toxin body (abcam: ab34992) diluted 1/000 times with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS, 100 ⁇ l / well seeded And allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • Donkey anti-rabbit IgG-HRP (BioLegend: 406401) diluted 1/000 times with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS is seeded at 100 ⁇ l / well. And allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Results are shown in FIG. 4B. It was confirmed that the administration of the fusion protein CTB-C-CPE showed CT-GM1 binding neutralizing activity as well as the administration of CTB alone. That is, it was confirmed that the administration of the fusion protein CTB-C-CPE shows a vaccine effect against cholera toxin, similar to the administration of CTB alone.
  • Example 2-4 Confirmation of protective action against diarrhea induction by administration of cholera toxin
  • Various proteins prepared in Example 2 and Comparative Example 1 suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • Mice Otsuka Pharmaceutical
  • 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • mice 200 ⁇ l was orally administered to mice fasted for 24 hours or more 11 days after the final immunization. Fifteen minutes later, 25 ⁇ g of cholera toxin (List Biological Laboratories: 100B) was orally administered, and fasted and fasted until dissection. After 13 to 14 hours, the pylorus to rectum of the mouse were removed, the contents were collected, and the amount of liquid was measured.
  • cholera toxin List Biological Laboratories: 100B
  • FIG. 4C The result is shown in FIG. 4C. It was confirmed that administration of the fusion protein CTB-C-CPE can suppress diarrhea induction by administration of cholera toxin as well as administration of CTB alone. That is, it was confirmed that the administration of the fusion protein CTB-C-CPE shows a vaccine effect against cholera toxin, similar to the administration of CTB alone.
  • Example 2-5 IgG production ability in serum specific for Clostridium perfringens toxin As shown in FIG. 3, 20 ⁇ g as CTB amount and 24 ⁇ g as C-CPE amount were applied to 8-week-old mouse, BALB / c mouse (Claire Japan).
  • Various proteins produced in Example 2 and Comparative Example 1) suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • Mice (Otsuka Pharmaceutical) 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • C-CPE protein (10 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Comparative Example 1) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and immobilized at 4 ° C. overnight. The next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • Example 2-6 Confirmation of neutralizing activity against cell death by Clostridium perfringens toxin As shown in FIG. 3, 20 ⁇ g as CTB amount and 8 ⁇ g as C-CPE amount in 8 weeks old, rabbit, BALB / c mice (CLEA Japan)
  • Various proteins produced in Example 2 and Comparative Example 1) in which 24 ⁇ g was suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • Mice Otsuka Pharmaceutical 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • FIG. 5B It was confirmed that administration of the fusion protein CTB-C-CPE showed a remarkable activity of neutralizing cell death by Clostridium perfringens toxin as compared to administration of C-CPE alone. Combined with the results of Experimental Example 2-5, it was confirmed that the fusion protein CTB-C-CPE can induce an immune response against both CPE and CT.
  • Example 2--7 Confirmation of biological defense-inducing action against intestinal administration of Clostridium perfringens toxin (1) Confirmation of protective action against diarrheal symptoms
  • Various proteins prepared in Example 2 and Comparative Example 1 in which 20 ⁇ g of CTB and 24 ⁇ g of C-CPE were suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times. Mice (Otsuka Pharmaceutical) 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • Results are shown in FIGS. 6A and 6B.
  • administration of the fusion protein CTB-C-CPE caused diarrhea and villi collapse due to intestinal administration of Clostridium perfringens toxin. It was confirmed that it was suppressed.
  • Example 2-8 Confirmation of biological defense-inducing action against blood administration of Clostridium perfringens toxin
  • 20 ⁇ g C-CPE as an amount of CTB in 8-week-old mice and BALB / c mice (CLEA Japan)
  • Various proteins produced in Example 2 and Comparative Example 1) in which 24 ⁇ g was suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times.
  • Mice Otsuka Pharmaceutical 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • C. perfringens toxin Bio Tech: 01-509 (100 ⁇ g / kg) was injected into the tail vein. Thirty minutes later, the behavior of the mice was observed.
  • Example 3 Production 2 of Fusion Protein CTB-C-CPE Using pColdII-CTB-C-CPE184 as a template, recombination was performed using mutageness kit (TOYOBO).
  • pColdII-CTB-C-CPE184 10 ⁇ Buffer for iPCR, 2 mM dNTPs, 10 pmol / ⁇ l forward primer (GCTAGTGGAAATTACCCTTATTCAA (SEQ ID NO: 15)), 10 pmol / ⁇ l reverse primer PrimATGATAGATCAGA MilliQ was mixed and PCR was performed. DpnI was added to the obtained PCR product, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 1 hour.
  • a mixture of the obtained plasmid and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was left on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After leaving still on ice for 3 minutes, 900 ⁇ l of SOC (Novagen: 69319) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes. Then, 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium (nacalai tesque) -containing LB plate (nacalai tesque) was inoculated in whole and cultured at 37 ° C. overnight.
  • plasmid was extracted from the resulting Escherichia coli using miniprep (QIAGEN). The resulting plasmid was sequenced. The obtained plasmid was designated as pColdII-CTB-C-CPE Y306A.
  • PColdII-CTB-C-CPE Y306A was used as a template, and recombination was carried out using a mutageness kit (TOYOBO).
  • TOYOBO a mutageness kit
  • pColdII-CTB-C-CPE Y306A, 10 ⁇ Buffer for iPCR, 2 mM dNTPs, 10 pmol / ⁇ l forward primer (GCATTTCAAAAATTTAAGAATTT (SEQ ID NO: 17)), 10 pmol / ⁇ l reversePrimTATGATATGATPATGAT , MilliQ was mixed and PCR was performed. DpnI was added to the obtained PCR product, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 1 hour.
  • a mixture of the obtained plasmid and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was left on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After leaving still on ice for 3 minutes, 900 ⁇ l of SOC (Novagen: 69319) was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes. Then, 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium (nacalai tesque) -containing LB plate (nacalai tesque) was inoculated in whole and cultured at 37 ° C. overnight.
  • pColdII-CTB-C-CPE184 is obtained by cloning a gene encoding the amino acid sequence of positions 184 to 319 of SEQ ID NO: 1 as C-CPE, and pColdII-CTB-C-CPE Y306A / L315A is A gene encoding an amino acid sequence having two amino acid substitutions of Y306A / L315A at positions 184 to 319 of SEQ ID NO: 1 as C-CPE is cloned.
  • a mixture of pColdII-CTB-C-CPE184 or pColdII-CTB-C-CPE Y306A / L315A and Chaperone Competent Cells pG-Tf2 / BL21 (Takara: 9124) is allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. did. Thereafter, the entire amount was inoculated on a 100 ⁇ g / ml ampicillin sodium-containing LB plate and cultured at 37 ° C. overnight.
  • IPTG (0.25 mM) (nacalai test: 19742-36) was added, and the mixture was cultured with shaking at 15 ° C. for 24 hours. Centrifugation was performed at 9100 ⁇ g for 2 minutes to recover the E. coli pellet.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 10% glycerol) is added to the pellet, and 1/100 volume of the culture solution. Ultrasonic crushing was performed 3 times for 40 seconds on ice.
  • 10 ml of buffer A containing 100 mM imidazole was passed through the column, and after washing the non-specific protein, 10 ml of 500 mM imidazole was passed to extract the target protein (CTB-C-CPE, CTB-C-CPE Y306A / L315A).
  • PBS 25 ml was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • FIG. 7A A schematic diagram of the fusion protein CTB-C-CPE Y306A / L315A containing the C-CPE mutant obtained in Example 3 is shown in FIG. 7A.
  • Example 3-1 Confirmation of binding to claudin 4 L cells or mouse claudin-4-expressing L cells (source: Kyoto University) are adjusted to 3.0 ⁇ 10 5 cells / well. It seed
  • FITC anti-mouse IgG1 Antibody (BioLegend: 406605) diluted 200-fold with 2% NCS-PBS was seeded at 100 ⁇ l / well and allowed to react on ice for 30 minutes.
  • 7-AAD Viability Staining Solution (BioLegend: 420403) diluted 100-fold with 2% NCS-PBS was seeded at 50 ⁇ l / well and allowed to react on ice for 10 minutes. The sample after being washed once with 2% NCS-PBS was subjected to FACS analysis.
  • Results are shown in FIG. 7B. It was confirmed that the fusion protein CTB-C-CPE Y306A / L315A with a mutant of C-CPE causes a decrease in binding to claudin 4.
  • Example 3-2 Production ability of CTB-C-CPE-specific IgG antibody As shown in FIG. 3, 20 ⁇ g as CTB amount and 8 ⁇ g as C-CPE amount in 8 weeks old, rabbit, BALB / c mice (CLEA Japan) Various proteins (produced in Example 3) in which 24 ⁇ g was suspended in 200 ⁇ l of PBS were injected subcutaneously into mice. From one week later, various proteins prepared orally in the same manner as subcutaneous injection were orally administered once a week for a total of 3 times. Mice (Otsuka Pharmaceutical) 200 ⁇ l were orally administered to mice fasted for 12 hours or longer, and various proteins were orally administered 15 minutes later.
  • CTB-C-CPE protein (10 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Example 3) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and immobilized at 4 ° C. overnight. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the fusion protein CTB-C-CPE Y306A / L315A with the C-CPE mutant is a CTB-C-CPE-specific IgG similar to the fusion protein CTB-C-CPE with the C-CPE without the mutation introduced. It was confirmed to produce antibodies.
  • Example 4 Preparation of vaccine antigen (VT2B, FlaA, VT2B-C-CPE, FlaA-C-CPE) (1) Preparation of expression vector Using enterohaemorrhagic Escherichia coli (Escherichia coli, O-157, Sakai strain) and Campylobacter (Campylobacter jejuni, 81-176 strain) genomic DNA (source: Osaka Prefectural University) did.
  • enterohaemorrhagic Escherichia coli Esscherichia coli, O-157, Sakai strain
  • Campylobacter Campylobacter jejuni, 81-176 strain
  • verotoxin 2B subunit gene (VT2B) was subjected to PCR (forward primer: 5′-gg GGTACC atgaagaagagtgttgtggcgg-3 ′ (SEQ ID NO: 19) (underlined is the KpnI cleavage site)
  • Reverse primer 5′-gggggg GAATTC gtcatttattaactgcacttag-3 ′ (SEQ ID NO: 20) (underlined is the EcoRI cleavage site)).
  • verotoxin 2B subunit gene (VT2B) was subjected to PCR (forward primer: 5′-gg GGTACC atgaagaagatgtttggggggg-3 ′ (SEQ ID NO: 21) (underlined is the KpnI cleavage site)
  • Reverse primer 5′-gg TTAATTTAA gtcatttattaactacactactag-3 ′ (SEQ ID NO: 22) (underlined is the PacI cleavage site)).
  • Campylobacter genomic DNA was used as a template, and flagellar antigen FlaA gene (FlaA) was converted into PCR (forward primer: 5′-ggGGTACCATgggattttcgtataacaacaat-3 ′ (SEQ ID NO: 23) (underlined part is KpnI cleavage site); reverse: 5′-primer amplified by gggGTCGACctattgtataatactttaaaaactattg-3 ′ (SEQ ID NO: 24) (underlined is the SalI cleavage site)).
  • forward primer 5′-ggGGTACCATgggattttcgtataacaacaat-3 ′ (SEQ ID NO: 23) (underlined part is KpnI cleavage site); reverse: 5′-primer amplified by gggGTCGACctattgtataatactttaaaaactattg-3 ′ (SEQ ID NO: 24) (underlined is the SalI cle
  • Campylobacter genomic DNA was used as a template, and flagellar antigen FlaA gene (FlaA) was converted into PCR (forward primer: 5′-ggGGTACCATgggattttcgtataacaacaat-3 ′ (SEQ ID NO: 25) (underlined is KpnI cleavage site); reverse: 5′-primer gg TTAATTTAA ttgtataataattctaaaaattttgtct-3 ′ (SEQ ID NO: 26) (underlined is the PacI cleavage site)).
  • Each PCR product and pColdII-CTB-C-CPE194 were converted into KpnI (New England Biolabs: R0142), PacI (New England Biolabs: R0547), EcoRI (New England Biolabs: R011), and SalE37 (R011)
  • the enzyme treatment was carried out at 2 ° C. for 2 hours. Thereafter, ligation was performed using T4 DNA ligase (Takara: 2011A).
  • a mixture of the ligation product and DH5 ⁇ was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds.
  • the obtained Escherichia coli was extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN: 27104) according to the kit protocol. Plasmids were sequenced to obtain plasmids (pColdII-VT2B, pColdII-VT2B-C-CPE194, pColdII-FlaA, pColdII-FlaA-C-CPE194) into which the target gene was introduced. Next, each plasmid and pColdI (Takara, 3361) were enzymatically treated with KpnI (New England Biolabs: R0142) and SalI (New England Biolabs: R0138) at 37 ° C.
  • ligation was performed using T4 DNA ligase (Takara: 2011A).
  • a mixture of the ligation product and DH5 ⁇ (TOYOBO: DNA-903) was allowed to stand on ice for 30 minutes and heated at 42 ° C. for 42 seconds. After standing for 3 minutes on ice, SOC (Novagen: 69319) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
  • Plasmids were sequenced to obtain plasmids (pColdI-VT2B, pColdI-VT2B-C-CPE194, pColdI-FlaA, pColdI-FlaA-C-CPE194) into which the target gene was introduced.
  • pColdI-VT2B-C-CPE194 and pColdI-FlaA-C-CPE194 are obtained by cloning a gene encoding the amino acid sequence at positions 194 to 319 of SEQ ID NO: 1 as C-CPE.
  • IPTG (0.25 mM) (nacalai test: 19742-36) was added, and the mixture was cultured with shaking at 15 ° C. for 24 hours. Centrifugation was performed at 9100 ⁇ g for 2 minutes to recover the E. coli pellet.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 10% glycerol) is added to the pellet, and 1/100 volume of the culture solution. Ultrasonic crushing was performed 3 times for 40 seconds on ice.
  • 10 ml of buffer A containing 100 mM imidazole was passed through the column, and after washing the non-specific protein, 10 ml of 500 mM imidazole was passed to extract the target protein (VT2B, VT2B-C-CPE, FlaA, FlaA-C-CPE).
  • PBS 25 ml was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • ThermoFisher NP0009
  • LDS Sample buffer ThermoFisher: NP0007
  • Electrophoresis was performed using the NuPAGE gel system (ThermoFisher). The gel was stained with CBB Stain One (Nacalai tesque: 04543-51).
  • FIG. 8A A schematic diagram of the fusion proteins VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE obtained in Example 4 is shown in FIG. 8A. Moreover, the result of having confirmed protein by CBB dyeing
  • Example 4-1 Confirmation of binding to claudin 4 L cells or mouse claudin-4-expressing L cells (source: Kyoto University) were adjusted to 3.0 ⁇ 10 5 cells / well. It seed
  • FIG. 8C The result is shown in FIG. 8C. It was confirmed that the fusion proteins VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE have the ability to bind claudin 4 to the same extent as C-CPE.
  • Example 4-2 Confirmation of C-CPE-specific antibody production ability (1) Immunization method and serum collection As shown in FIG. 9, 8 weeks old, rabbit, BALB / c mice (CLEA Japan) Each time, 50 ⁇ g of each protein (C-CPE + Alum, VT2B-C-CPE, FlaA-C-CPE) prepared in Example 4 and Comparative Example 1 was intraperitoneally administered to the mice. As a control group, mice administered with PBS alone were prepared. Regarding C-CPE + Alum, C-CPE dissolved in 250 ⁇ l of PBS and an equivalent amount of Image Alum Adjuvant (Thermo: 77161) were mixed at room temperature for 30 minutes.
  • Image Alum Adjuvant Thermo: 77161
  • VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE were dissolved in 500 ⁇ l of PBS.
  • blood was collected by collecting blood from the fundus. The collected blood was allowed to stand on ice for 30 minutes or more and then centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant (serum).
  • C-CPE Antigen (C-CPE) specific ELISA C-CPE protein (5 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Comparative Example 1) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and immobilized at 4 ° C. overnight. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum diluted with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • FIG. 10A The result is shown in FIG. 10A. It was confirmed that the fusion proteins VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE exhibited a remarkable ability to produce specific antibodies against Clostridium perfringens toxins compared to C-CPE + Alum.
  • Example 4-3 Confirmation of neutralizing activity against cell death by Clostridium perfringens toxin (1) Immunization method and serum recovery As shown in FIG. Once, a total of 2 times, 50 ⁇ g of each of the various proteins (VT2B-C-CPE, FlaA-C-CPE) prepared in Example 4 was dissolved in 500 ⁇ l of PBS and administered intraperitoneally to mice. As a control group, mice administered with PBS alone were prepared. One week after the final immunization, blood was collected by collecting blood from the fundus. The collected blood was allowed to stand on ice for 30 minutes or more and then centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant (serum).
  • FIG. 10B The result is shown in FIG. 10B. It was confirmed that the fusion proteins VT2B-C-CPE and FlaA-C-CPE induce neutralizing activity against cell death caused by remarkable Clostridium perfringens toxin as compared to C-CPE alone.
  • Example 4-4 Confirmation of production ability of VT2B-specific antibody and FlaA-specific antibody (1) Immunization method and serum recovery As shown in FIG. 9, 8 weeks old, rabbit, BALB / c mouse (Claire Japan) 50 ⁇ g of each of the various proteins (VT2B-C-CPE, FlaA-C-CPE) prepared in Example 4 was dissolved in 500 ⁇ l of PBS once a week for a total of 2 times and administered intraperitoneally. As a control group, mice administered with PBS alone were prepared. One week after the final immunization, blood was collected by collecting blood from the fundus. The collected blood was allowed to stand on ice for 30 minutes or more and then centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant (serum).
  • Antigen (VT2B, FlaA) specific ELISA VT2B or FlaA protein (5 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Example 4) was seeded on a 96-well plate at 100 ⁇ l / well and immobilized at 4 ° C. overnight. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum diluted with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • FIGS. 10C and 10D The results are shown in FIGS. 10C and 10D. It was confirmed that the fusion protein VT2B-C-CPE can induce VT2-specific IgG production in serum and that the fusion protein FlaA-C-CPE can induce FlaA-specific IgG production in serum.
  • CTB-VT2B-C-CPE vaccine antigen
  • the procedure was to extract the plasmid according to the kit protocol, and the plasmid was sequenced to obtain a plasmid (pColdI-CTB-VT2B-C-CPE194) into which the target gene was introduced, pColdI-CTB-VT2B-C-CPE194 was , A gene encoding the amino acid sequence at positions 194 to 319 of SEQ ID NO: 1 as C-CPE.
  • Buffer A (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 400 mM NaCl 2 , 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol) is added to the pellet, and the amount is 1/100 of the amount of the culture solution on ice.
  • the filtrate was charged in advance to HiTrap Chelating HP Columns (GE Healthcare: 17040801) in which 12 ml of 0.05 mM EDTA, 15 ml of MilliQ, 3 ml of 0.1 M NiSO 4 , 5 ml of MilliQ, and 10 ml of buffer A were passed. 10 ml of buffer A containing 100 mM imidazole was passed through the column, and after washing the non-specific protein, the target protein (CTB-VT2B-C-CPE) was extracted by running 10 ml of 500 mM imidazole. PBS (25 ml) was allowed to flow in advance, the extracted protein was loaded onto an equilibrated PD-10 column (GE Healthcare: 17085101), and the protein buffer was replaced with PBS by flowing PBS.
  • HiTrap Chelating HP Columns GE Healthcare: 17040801
  • FIG. 11A A schematic diagram of the fusion protein CTB-VT2B-C-CPE obtained in Example 5 is shown in FIG. 11A.
  • Example 5-1 Confirmation of production ability of VT2B specific antibody (1) Immunization method and collection of serum 8 weeks old, rabbit, BALB / c mouse (CLEA Japan) once a week, 2 times in total, Examples 4 and (VT2B, CTB-VT2B-C-CPE) prepared in Example 5 were dissolved in 18 ⁇ g of VT2B in 200 ⁇ l of PBS and administered subcutaneously to mice. As a control group, mice administered with PBS alone were prepared. One week after the final immunization, blood was collected by collecting blood from the fundus. The collected blood was allowed to stand on ice for 30 minutes or more and then centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant (serum).
  • VT2B Antigen (VT2B) specific ELISA VT2B protein (5 ⁇ g / ml in PBS) (prepared in Example 4) was seeded at 100 ⁇ l / well in a 96-well plate and immobilized at 4 ° C. overnight. On the next day, 170 ⁇ l of 1% BSA-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.05% Tween 20-PBS, serum diluted with 1% BSA-0.05% Tween 20-PBS was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • FIG. 11B The result is shown in FIG. 11B. It was confirmed that the fusion protein CTB-VT2B-C-CPE can induce VT2-specific IgG production in serum to the same extent as VT2B.
  • FIG. 11C It was confirmed that the fusion protein CTB-VT2B-C-CPE increased the survival rate of mice after VT2 administration to the same extent as VT2B.
  • Example 6 Preparation of vaccine antigen (VT2B-C-CPE)
  • VT2B-C-CPE a fusion (VT2B-C-CPE) containing C-CPE and VT2B as a vaccine antigen protein was prepared (see FIG. 12A).
  • the vaccine antigen of this example was prepared by the same method as in Example 4.
  • Example 6-1 Ability to produce IgG in serum specific for Clostridium perfringens toxin
  • IgG was produced when VT2B-C-CPE shown in Example 6 was administered to mice in the same manner as in Experimental Example 2-5. Confirmed the ability.
  • Antigen protein was injected subcutaneously into mice on day 0 and day 7 according to the protocol shown in FIG. 12B, and IgG production in C. perfringens toxin-specific serum was confirmed on day 14.
  • FIG. 12C The result is shown in FIG. 12C. It was confirmed that administration of VT2B-C-CPE of Example 6 can induce significant C. perfringens toxin-specific serum IgG production as compared to administration of C-CPE alone or an antigen protein containing an Alum adjuvant. .
  • Example 6-2 Confirmation of neutralizing activity against cell death by Clostridium perfringens toxin
  • each antigen protein was immunized to mice according to the protocol shown in FIG.
  • the serum was collected, and the obtained serum was confirmed to have neutralizing activity against cell death by Clostridium perfringens toxin.
  • Results are shown in FIG. 13B. It was confirmed that the administration of VT2B-C-CPE in Example 6 induces a neutralizing activity against Vero cell death caused by remarkable Clostridium perfringens toxin as compared to C-CPE alone.
  • Results are shown in FIG. 14B.
  • Administration of VT2B-C-CPE in Example 6 suppressed the development of hyperkalemia compared to C-CPE alone.
  • each antigen protein was orally administered to mice by the same method as in Experimental Example 2-8, and one week after final immunization, C. perfringens toxin (Bio Kir: 01-509) (100 ⁇ g / kg) was injected into the tail vein. Thirty minutes later, the behavior of the mice was observed.
  • VT2B-specific Serum IgG Production Ability the ability to produce IgG when VT2B-C-CPE was administered to mice in Example 6 in the same manner as in Experimental Example 2-5 was confirmed.
  • VT2B-C-CPE was injected subcutaneously into mice on day 0 and day 7 according to the protocol shown in FIG. 16A, and VT2B-specific serum IgG production on day 14 was confirmed.
  • Results are shown in FIG. 16B. It was confirmed that administration of VT2B-C-CPE in Example 6 can induce significant VT2B-specific serum IgG production as in the case of VT2B alone administration.
  • Example 6 results are shown in FIGS. 17B and 17C.
  • VT2B-C-CPE suppressed the value of serum BUN (renal disorder marker) and increased the survival rate of mice after VT2 administration to the same extent as VT2B.
  • serum BUN renal disorder marker
  • the multivalent vaccine of the present invention can efficiently prevent and / or treat diseases or symptoms caused by bacteria, and is expected to be used for the prevention and / or treatment of infectious diseases.

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Abstract

ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導し得る多価ワクチンを提供し、感染症を効率的に予防及び／又は治療し得る医薬組成物を提供することを課題とする。ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片（Ｃ－ＣＰＥ）と、ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも１つの抗原とを有効成分とし、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導し得ることを特徴とする、多価ワクチンによる。本発明の多価ワクチンは、Ｃ－ＣＰＥと前記少なくとも１つの抗原とが融合体を構成していることにより、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫誘導能を発揮し得るものである。

Description

多価ワクチン
　本発明は、感染症の予防及び／又は治療に用いられる多価ワクチンに関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１７－３７０５６号優先権を請求する。
　感染症対策として、ワクチン接種が世界的に行われている。感染症には、病原性の強い病原体によるものだけでなく、正常な宿主に対しては病原性を発揮しないが、抵抗力の弱っている宿主で病原性を発揮して引き起こされるものもあり、大きな問題となっている。感染症に対するワクチンとしては、抗原を１種だけ含むものがあるが、種々の型に応じた抗原を含むように作られたワクチンや、複数の病原体に対する抗原の同時接種等が行われている。複数の抗原を同時に接種することにより、確実かつ早急に必要な免疫を得ることが可能となり、ワクチン供給の利便性も高まり、医療費コストの削減等にもつながることから、結果としてワクチン接種率を上昇させることができると考えられている。
　感染症には様々な感染経路があるが、食品が原因で発症する感染症に、食中毒がある。食中毒は、細菌やウイルスなどを、食品を介して口から摂取したことにより、下痢・嘔吐・発熱などの症状を引き起こすことを指す。衛生管理手法が発達するにつれて、食中毒は減少するものと予測されていたが、依然として多くの食中毒事件が発生している。近年は１件あたりの患者数が増加し、事件が大型化する傾向にある。病原性大腸菌Ｏ－１５７による集団感染事件などでは、幼少児や老人、学校関連施設などで大規模な感染が起こる危険性がある。また集団感染事件では、患者が多量の細菌やウイルスを排出し、二次的に感染症を引き起こす事例にも注意が必要である。
　ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）は食中毒の原因菌の一つである。ウエルシュ菌は、ヒト、動物の腸管内、土壌、下水などに広く分布し、食品汚染の機会が多い。またヒトの糞便中にも常在していて、耐熱性芽胞形成ウエルシュ菌の保菌率は年齢や生活環境によって異なるが、およそ６～４０％であるといわれている。ウエルシュ菌は熱に強い芽胞を作るため、加熱調理して、他の細菌が死滅してもウエルシュ菌の耐熱性の芽胞は生き残る。また、食品の中心部は酸素の無い状態になり、嫌気性菌のウエルシュ菌にとって好ましい状態になり、加熱した食品の温度が発育に適した温度まで下がると発芽して急速に増殖を始める。加熱調理後、すぐに喫食すれば、問題は起こりにくいが、特に、給食のように大量に調理した食品の場合、調理してから食事するまでの時間が長いため、増殖する危険性が高い。食品の中で大量に増殖したウエルシュ菌（１０９個以上）を食品とともに摂取すると、胃を通過し、小腸内で増殖して、菌が芽胞型に移行する際にエンテロトキシン（毒素）が産生され、その毒素の作用で下痢などの症状が起きる。
　ウエルシュ菌のエンテロトキシン（以下「ＣＰＥ」）は、分子量約３５ｋＤａのタンパク質であり、ウエルシュ菌による感染性食中毒の原因物質である。ＣＰＥは、細胞のタイトジャンクション構成タンパク質であるクローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ファミリーのクローディン３、４、６、７、８および１４と結合することが知られている（Ｆｕｊｉｔａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４７６，　２５８－２６１．）。クローディン４は、パイエル板上に高発現していることが報告されている（Ｔａｍａｇａｗａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００３）　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　８３，　１０４５－１０５３．）。ＣＰＥが各種クローディンと結合することに着目し、ＣＰＥのＣ末端断片（以下「Ｃ－ＣＰＥ」）と他の抗原との融合体を粘膜ワクチンとして使用することが提案されている（特許文献１）。またＣＰＥの第３０４位～第３１９位の１６アミノ酸が、ＣＰＥとクローディン４との結合に関連していることが開示されている（特許文献２、非特許文献１）。
　ウエルシュ菌の感染メカニズムについて研究が進められており、エンテロトキシンの応用についての報告があるものの、ウエルシュ菌に対するワクチンについての報告はほとんどない。エンテロトキシンのＣ末断片には毒性がなく、抗原性が低いことが報告されており（非特許文献２）、ウエルシュ菌に対して優れたワクチン効果を発揮し得る抗原は見出されていなかった。
国際公開第ＷＯ２０１０／０８９９４０号公報 特開２０１１－１６２４６６号公報
Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ａ．，ｅｔ　ａｌ．　（２００５）　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，　１０８，５６－６２ Ｋｏｋａｉ－Ｋｕｎ，　Ｊ．　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　２５，　Ｓｕｐｐｌ．２，１６５－１６７
　本発明は、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を制御し得る多価ワクチンを提供し、感染症を効率的に予防及び／又は治療し得る医薬組成物を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原との融合抗原が、ウエルシュ菌と他の微生物に対する免疫を誘導し得ることに着目し、当該融合抗原が多価ワクチンの有効成分となり得ることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、すなわち以下よりなる。
１．ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片と、ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも１つの抗原とを有効成分とし、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導し得ることを特徴とする、多価ワクチン。
２．有効成分が、ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片と前記少なくとも１つの抗原とが融合した融合体である、前項１に記載の多価ワクチン。
３．ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導し得る、前項１又は２に記載の多価ワクチン。
４．ウエルシュ菌以外の微生物由来の抗原に対する反応性を有する抗体を誘導し得る、前項１～３のいずれかに記載の多価ワクチン。
５．ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片が、単独では、ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導できない、前項１～４のいずれかに記載の多価ワクチン。
６．ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片が、以下から選択されるタンパク質である、前項１～５のいずれかに記載の多価ワクチン：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有しており、少なくとも第３０４位～第３１９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）（１）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を有しており、免疫原性を有するタンパク質。
７．抗原が、コレラ菌、病原性大腸菌、及びカンピロバクターからなる群から選択される病原体に由来する、前項１～６のいずれかに記載の多価ワクチン。
８．細菌に起因する疾患又は症状を予防及び／又は治療するための、前項１～７のいずれかに記載の多価ワクチン。
９．前項１～７のいずれかに記載の多価ワクチンを含有する、感染症を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
　本発明の多価ワクチンにより、生体内でウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導できる。本発明の多価ワクチンは、微生物に起因する疾患又は症状を予防及び／又は治療するためのものであり、感染症の予防及び／又は治療に用いることが可能である。
Ｃ－ＣＰＥ単独、Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍ、ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥの投与スケジュール（図１Ａ）、及び血清抗Ｃ－ＣＰＥ　ＩｇＧ抗体の産生能を確認した結果（図１Ｂ）を示す図である。（実験例１） ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥの模式図（図２Ａ）、ＣＴＢ、Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥのタンパク質の有無をＣＢＢ染色にて確認した写真（図２Ｂ）、ＣＴＢ、Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥのＧＭ１結合性を確認した結果（図２Ｃ）、及びＣＴＢ、Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥのクローディン４結合性を確認した結果（図２Ｄ）を示す図である。（実施例２、実験例２－１） ＰＢＳ、ＣＴＢ単独、Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ（混合液）の投与スケジュールを示す図である。（実験例２－２～７） ＰＢＳ、ＣＴＢ単独、Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合の、コレラ毒素特異的な血清中ＩｇＧ抗体と糞便中ＩｇＡ抗体の産生能を確認した結果（図４Ａ）、ＣＴ－ＧＭ１結合中和活性を確認した結果（図４Ｂ）、コレラ毒素投与により下痢誘導の抑制効果を確認した結果（図４Ｃ）を示す図である。（実験例２－２～４） ＰＢＳ、ＣＴＢ単独、Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ（混合液）を投与した場合の、Ｃ－ＣＰＥ特異的な血清中ＩｇＧ抗体の産生能を確認した結果（図５Ａ）、ウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性を確認した結果（図５Ｂ）を示す図である。（実験例２－５～６） ＰＢＳ、Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ（混合液）を投与した場合の、ウエルシュ菌毒素の腸管投与による下痢の抑制効果を確認した結果（図６Ａ）、及び絨毛崩壊の抑制効果を確認した結果（図６Ｂ）を示す図である。（実験例２－７） Ｃ－ＣＰＥ変異体を含むＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａの模式図（図７Ａ）、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａ、Ｃ－ＣＰＥ変異体を含まないＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥのクローディン４結合性を確認した結果（図７Ｂ）、及びＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ特異的ＩｇＧ抗体の産生能を確認した結果（図７Ｃ）を示す図である。（実施例３、実験例３－１～２）。 ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥの模式図（図８Ａ）、Ｃ－ＣＰＥ、ＶＴ２Ｂ、ＦｌａＡ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥのタンパク質の有無をＣＢＢ染色にて確認した写真（図８Ｂ）、クローディン４結合性を確認した結果（図８Ｃ）を示す図である。（実施例４、実験例４－１） ＰＢＳ、Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥの投与スケジュールを示す図である。（実験例４－２～４） ＰＢＳ、Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合の、血清中Ｃ－ＣＰＥ特異的ＩｇＧ抗体の産生能を確認した結果（図１０Ａ）、及び、血清によるウエルシュ菌毒素に対する中和活性を確認した結果（図１０Ｂ）、ＰＢＳ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合の血清中ＶＴ２Ｂ特異的ＩｇＧ抗体産生能を確認した結果（図１０Ｃ）、及びＰＢＳ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合の血清中ＦｌａＡ特異的ＩｇＧ抗体産生能を確認した結果（図１０Ｄ）を示す図である。（実験例４－２～４） ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥの模式図（図１１Ａ）、ＰＢＳ、ＶＴ２Ｂ、ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合の血清中ＶＴ２特異的ＩｇＧ抗体の産生能を確認した結果（図１１Ｂ）、及びＶＴ２投与後のマウス生存率への影響を確認した結果（図１１Ｃ）を示す図である。（実施例５、実験例５－１） ワクチン抗原（ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）と当該ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥによるウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生能を示す図である。図１２Ａはワクチン抗原の構造を示す図である。図１２Ｂは、実験プロトコールを示し、図１２Ｃは、その結果を示す図である。（実施例６）（実験例６－１） ウエルシュ菌毒素による細胞死に対するＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥの中和活性を示す図である。図１３Ａは、実験プロトコールを示し、図１３Ｂはその結果を示す図である。（実験例６－２ ウエルシュ菌毒素の血中投与に対するＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥの生体防御誘導作用を、血中カリウム濃度により確認した結果を示す図である。図１４Ａは、実験プロトコールを示し、図１４Ｂは、その結果を示す図である。（実験例６－３） ウエルシュ菌毒素の血中投与に対するＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥの生体防御誘導作用を示す図である。図１５Ａは、実験プロトコールを示し、図１５Ｂは、マウスの動態による結果を示す図である。（実験例６－３） ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥによるＶＴ２Ｂ特異的血清中ＩｇＧ産生能を示す図である。図１６Ａは、実験プロトコールを示し、図１６Ｂは、その結果を示す図である。（参考例１） ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥによるＶＴ２腹腔内投与後のマウスへの影響を示す図である。図１７Ａは、実験プロトコールを示し、図１７Ｂは、腎障害マーカーの血中ＢＵＮ量の測定結果を示し、図１７Ｃはマウスの生存率に及ぼす結果を示す図である。（参考例２）
　本発明の多価ワクチンは、２種以上の複数種の抗原を有効成分として含み、これらの複数種の抗原に対する免疫を誘導し得るものである。本発明の多価ワクチンには、抗原として、まずＣ－ＣＰＥが含まれ、加えてＣ－ＣＰＥ以外の抗原が１種以上含まれる。Ｃ－ＣＰＥ以外の抗原は、ウエルシュ菌以外の微生物由来の抗原であれば、いかなるものであってもよい。ウエルシュ菌以外の微生物由来の抗原は、少なくとも１種含まれていればよく、２種以上、３種以上含まれていてもよい。
　本明細書における多価ワクチンは、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導し得るものである。ウエルシュ菌に対する免疫を誘導し得るとは、ウエルシュ菌毒素に対する特異的抗体（例えば、血清中ＣＰＥ特異的ＩｇＧ抗体）を誘導し得ることを含み、好ましくはウエルシュ菌毒素に対する中和活性を有する抗体を誘導し得ることを含む。またウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性を誘導し得ることを含み、下痢や絨毛崩壊の抑制、高カリウム血症等のウエルシュ菌毒素により引き起こされる症状や病態に対する生体防御反応を誘導し得ることを含む。ウエルシュ菌以外の微生物に対する免疫とは、微生物由来の抗原や毒素に対する特異的抗体（例えば、当該毒素特異的血清中ＩｇＧ抗体）、好ましくは中和抗体を誘導し得ることを含み、当該抗原や毒素による細胞死に対する中和活性や、当該抗原や毒素により引き起こされる症状や病態に対する生体防御反応を誘導し得ることを含む。これらの免疫誘導能は、後述する実施例及び実験例の記載に基づき、確認できる。本明細書における多価ワクチンは、これらの免疫誘導能を発揮することから、特に細菌に起因する疾患又は症状を予防及び／又は治療するために用いることができる。
　本明細書におけるウエルシュ菌毒素は、ウエルシュ菌より産生され、生体に対して毒性を示す物質であり、ＣＰＥとも呼ばれる。ＣＰＥは、配列番号１で表わされる３１９アミノ酸からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子は配列番号２で表わされる塩基配列を有する。ＣＰＥをコードする遺伝子（配列番号２）は、アクセッション番号：Ｍ９８０３７として公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）に登録されている。ＣＰＥのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列を以下に具体的に示す。
ＣＰＥのアミノ酸配列（配列番号１）：
ＭＬＳＮＮＬＮＰＭＶＦＥＮＡＫＥＶＦＬＩＳＥＤＬＫＴＰＩＮＩＴＮＳＮＳＮＬＳＤＧＬＹＶＩＤＫＧＤＧＷＩＬＧＥＰＳＶＶＳＳＱＩＬＮＰＮＥＴＧＴＦＳＱＳＬＴＫＳＫＥＶＳＩＮＶＮＦＳＶＧＦＴＳＥＦＩＱＡＳＶＥＹＧＦＧＩＴＩＧＥＱＮＴＩＥＲＳＶＳＴＴＡＧＰＮＥＹＶＹＹＫＶＹＡＴＹＲＫＹＱＡＩＲＩＳＨＧＮＩＳＤＤＧＳＩＹＫＬＴＧＩＷＬＳＫＴＳＡＤＳＬＧＮＩＤＱＧＳＬＩＥＴＧＥＲＣＶＬＴＶＰＳＴＤＩＥＫＥＩＬＤＬＡＡＡＴＥＲＬＮＬＴＤＡＬＮＳＮＰＡＧＮＬＹＤＷＲＳＳＮＳＹＰＷＴＱＫＬＮＬＨＬＴＩＴＡＴＧＱＫＹＲＩＬＡＳＫＩＶＤＦＮＩＹＳＮＮＦＮＮＬＶＫＬＥＱＳＬＧＤＧＶＫＤＨＹＶＤＩＳＬＤＡＧＱＹＶＬＶＭＫＡＮＳＳＹＳＧＮＹＰＹＳＩＬＦＱＫＦ
ＣＰＥをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）：
ｇｔｔｔａｔａａｔａ　ｔａｔａａｔａｔｔａ　ｔｇｔｔｔａｇｔｇａ　ａａｔｔａｔｇｔｔａ　ａｔａｔａｃｔａｃｔ　ｔａｔｔｔｃｔｔｃｔ　ｔｔｔａｔａｔｔａａ　ｔｔａａｃａｔｔｔｃ　ａａｃｔｔｇａｔｃｔ　ｃｔｔｔａａｃｇｔａ　ｔａｔｃｔｃｔｔｔｔ　ａｔｔａｃｃｃａａｇ　ｃｔｔｔａａｔｔｃｃ　ｔｔｃａｇｃａｔｔａ　ａｔａｔｃａｔａａａ　ａｔｇｔｃｃａｔｇｔ　ａｇａａａｔａｔａｔ　ｔｃａａｇａｔｔａｔ　ｔａａａｇａｔａｔａ　ｔａｔｔｔｔａｔｔｔ　ａａｔａｔｔｔｔｇｔ　ｔａａｔａｃｔｔｔａ　ａｇｇａｔａｔｇｔａ　ｔｃｃａａａａｔａａ　ａａａｃｔｔｔｔａａ　ａｔａａｔａｔａｔｔ　ａｔａｔａａａａａａ　ａａｔｔａｇａａａｔ　ａａｇｇａｇａｔｇｔ　ｔａａｔｔａｔａａｔ　ａｔｇｃｔｔａｇｔａ　ａｃａａｔｔｔａａａ　ｔｃｃａａｔｇｇｔｇ　ｔｔｃｇａａａａｔｇ　ｃｔａａａｇａａｇｔ　ａｔｔｔｃｔｔａｔｔ　ｔｃｔｇａｇｇａｔｔ　ｔａａａａａｃａｃｃ　ａａｔｔａａｔａｔｔ　ａｃａａａｃｔｃｔａ　ａｃｔｃａａａｔｔｔ　ａａｇｔｇａｔｇｇａ　ｔｔａｔａｔｇｔａａ　ｔａｇａｔａａａｇｇ　ａｇａｔｇｇｔｔｇｇ　ａｔａｔｔａｇｇｇｇ　ａａｃｃｃｔｃａｇｔ　ａｇｔｔｔｃａａｇｔ　ｃａａａｔｔｃｔｔａ　ａｔｃｃｔａａｔｇａ　ａａｃａｇｇｔａｃｃ　ｔｔｔａｇｃｃａａｔ　ｃａｔｔａａｃｔａａ　ａｔｃｔａａａｇａａ　ｇｔａｔｃｔａｔａａ　ａｔｇｔａａａｔｔｔ　ｔｔｃａｇｔｔｇｇａ　ｔｔｔａｃｔｔｃｔｇ　ａａｔｔｔａｔａｃａ　ａｇｃａｔｃｔｇｔａ　ｇａａｔａｔｇｇａｔ　ｔｔｇｇａａｔａａｃ　ｔａｔａｇｇａｇａａ　ｃａａａａｔａｃａａ　ｔａｇａａａｇａｔｃ　ｔｇｔａｔｃｔａｃａ　ａｃｔｇｃｔｇｇｔｃ　ｃａａａｔｇａａｔａ　ｔｇｔａｔａｔｔａｔ　ａａｇｇｔｔｔａｔｇ　ｃａａｃｔｔａｔａｇ　ａａａｇｔａｔｃａａ　ｇｃｔａｔｔａｇａａ　ｔｔｔｃｔｃａｔｇｇ　ｔａａｔａｔｃｔｃｔ　ｇａｔｇａｔｇｇａｔ　ｃａａｔｔｔａｔａａ　ａｔｔａａｃａｇｇａ　ａｔａｔｇｇｃｔｔａ　ｇｔａａａａｃａｔｃ　ｔｇｃａｇａｔａｇｃ　ｔｔａｇｇａａａｔａ　ｔｔｇａｔｃａａｇｇ　ｔｔｃａｔｔａａｔｔ　ｇａａａｃｔｇｇｔｇ　ａａａｇａｔｇｔｇｔ　ｔｔｔａａｃａｇｔｔ　ｃｃａｔｃｔａｃａｇ　ａｔａｔａｇａａａａ　ａｇａａａｔｃｃｔｔ　ｇａｔｔｔａｇｃｔｇ　ｃｔｇｃｔａｃａｇａ　ａａｇａｔｔａａａｔ　ｔｔａａｃｔｇａｔｇ　ｃａｔｔａａａｃｔｃ　ａａａｔｃｃａｇｃｔ　ｇｇｔａａｔｔｔａｔ　ａｔｇａｔｔｇｇｃｇ　ｔｔｃｔｔｃｔａａｃ　ｔｃａｔａｃｃｃｔｔ　ｇｇａｃｔｃａａａａ　ｇｃｔｔａａｔｔｔａ　ｃａｃｔｔａａｃａａ　ｔｔａｃａｇｃｔａｃ　ｔｇｇａｃａａａａａ　ｔａｔａｇａａｔｃｔ　ｔａｇｃｔａｇｃａａ　ａａｔｔｇｔｔｇａｔ　ｔｔｔａａｔａｔｔｔ　ａｔｔｃａａａｔａａ　ｔｔｔｔａａｔａａｔ　ｃｔａｇｔｇａａａｔ　ｔａｇａａｃａｇｔｃ　ｃｔｔａｇｇｔｇａｔ　ｇｇａｇｔａａａａｇ　ａｔｃａｔｔａｔｇｔ　ｔｇａｔａｔａａｇｃ　ｔｔａｇａｔｇｃｔｇ　ｇａｃａａｔａｔｇｔ　ｔｃｔｔｇｔａａｔｇ　ａａａｇｃｔａａｔｔ　ｃａｔｃａｔａｔａｇ　ｔｇｇａａａｔｔａｃ　ｃｃｔｔａｔｔｃａａ　ｔａｔｔａｔｔｔｃａ　ａａａａｔｔｔｔａａ　ｔａｔｔｔｔａａａａ　ｔａａｔａｔａａｔｃ　ａａａｔｔａａｔｔｔ　ａｃａａａａｇａｃａ　ｇｔａｔｇｔａａｔａ　ｔｔａａａｔｔａｔｔ　ａｃａｔａｃｔｇｔｃ　ｔａａｔｔｔｔｔｔｔ　ａｔｔａｔａａｔｔｔ　ａａｔｔｔｔｔｃａｔ
　ＣＰＥは、ＣＰＥを産生するウエルシュ菌から回収、精製することにより取得できる。また、公知の遺伝子組換え技術によりＣＰＥ発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させ、組み換えタンパク質を回収、精製して取得することもできる。
　Ｃ－ＣＰＥは、ＣＰＥのＣ末端のアミノ酸を含みＮ末端のアミノ酸を含まないＣＰＥの部分タンパク質である。本発明のＣ－ＣＰＥは、他の抗原との融合体を構成することにより単独の場合と比較して免疫誘導能（例えばＣＰＥに対する特異的抗体の誘導能）が増強され、ワクチン効果を発揮できるものである。Ｃ－ＣＰＥは単独では免疫の誘導が出来ないものであっても、融合体とすることにより免疫誘導能を発揮するようになる。免疫が誘導出来ないとは、例えば、ＣＰＥに対する特異的抗体の誘導ができないことを意味するが、全く誘導できないことを意味するのではなく、実質的に誘導できないことを意味する。実質的に誘導できないとは、融合体の場合に比べて、免疫誘導能が低い場合も含む。Ｃ－ＣＰＥは免疫原性を有しているものであればよく、クローディン４との結合能を有していても、有していなくてもよい。免疫原性とは、生体内でエピトープとして機能し得、免疫応答（特に特異的抗体産生）を誘導し得る性質である。免疫原性を有する抗原が、生体内で実際に免疫誘導能を発揮し、ワクチン効果を発揮するまでには、粘膜を介した生体内への侵入効率や、免疫細胞における抗原提示の効率等の種々の生体内での過程が関連すると考えられる。本発明は、Ｃ－ＣＰＥを、他の抗原と融合させることにより、生体内においてウエルシュ菌に対する免疫誘導能を増強し得ることを特徴とするものである。
　Ｃ－ＣＰＥをコードする遺伝子はＣＰＥ遺伝子を鋳型として適当な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって取得できる。得られたＣ－ＣＰＥ遺伝子を用いて、公知の遺伝子組換え技術によりＣ－ＣＰＥ発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させた組み換えタンパク質を回収、精製してＣ－ＣＰＥを取得することができる。
　Ｃ－ＣＰＥは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の部分配列であり、少なくとも第３０４位～第３１９位のアミノ酸配列を含む。Ｃ－ＣＰＥの大きさ（アミノ酸残基数）は特に問わないが、最大では第５３位～第３１９位のアミノ酸からなるタンパク質、第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列からなるタンパク質、第２０５位～第３１９位のアミノ酸配列からなるタンパク質、最小では第３０４位～第３１９位のアミノ酸配列からなるタンパク質が例示され、好ましくは第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列からなるタンパク質である。Ｃ－ＣＰＥは他の抗原との融合タンパク質を構成した場合に免疫誘導能を発揮し得るものであればよく、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたものであってもよい。アミノ酸の置換、欠失、付加または挿入は、第３０４位～第３１９位に領域に含まれるものであってもよい。
　またＣ－ＣＰＥは、毒性を発現しないことが好ましい。毒性を発現しないとは、ＣＰＥが有する細胞毒性が消滅していることを意味する。ＣＰＥの毒性は、ＣＰＥのＮ末端側のアミノ酸領域に支配されていることが知られており、ＣＰＥのＮ末端から第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ－ＣＰＥ（第５３位～第３１９位）は毒性を発現しないことが報告されている（非特許文献２）。したがって、少なくともＣＰＥの第１位～第５２位までのアミノ酸が欠失したＣ－ＣＰＥとすることで、毒性を発現しないＣ－ＣＰＥを取得することができる。また、ＣＰＥの第５２位より前の領域を有するＣ－ＣＰＥであっても、毒性を有すると考えられる第４５位～第５２位の領域に置換、欠失、挿入、修飾等の変異を誘導することにより、毒性を発現しないＣ－ＣＰＥを取得することも可能である。
　ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、付加または挿入できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されることを意味する。このような変異タンパク質（改変体）は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
　タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する。好ましくは、サイレント置換、欠失、付加または挿入であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させないと考えられる。代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
　本発明のワクチンに含まれる抗原は特に限定されないが、微生物由来の抗原であることが好ましい。微生物には、常在微生物や感染性病原体などが含まれる。感染性病原体には、感染性疾患の原因となる細菌、ウイルス、寄生生物、または菌類などが含まれる。具体的には、病原性大腸菌（腸管出血性大腸菌）、コレラ菌、カンピロバクター、肺炎球菌、赤痢菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、百日咳菌、髄膜炎菌、クリプトコッカス、アスペルギルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）、ノロウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、熱帯熱マラリア原虫、マイコプラズマ、ジフテリア菌、破傷風菌、ｂ型インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎ウイルス、ＲＳウイルス、腸炎ビブリオ菌などが挙げられる。
　微生物由来の抗原としては、微生物に対する免疫を誘導し得るものであればよく、微生物特異的抗体を誘導し得るものであればよい。例えば、微生物由来の抗原としては、微生物由来の毒素を用いることができる。また微生物由来の抗原は、自体公知のワクチンに含まれる有効成分又は今後開発される抗原のいずれであってもよく、特に限定されない。抗原は、粘膜を介して生体内に侵入するものであり、生体内で免疫を誘導し得るような免疫原性を持つものであることが好ましい。例えば、コレラ菌についてはコレラ毒素（以下「ＣＴ」）、より具体的にはＣＴのサブユニットＢ（以下「ＣＴＢ」）、病原性大腸菌についてはベロ毒素２型（以下「ＶＴ２」）、より具体的にはＶＴ２Ｂサブユニット（以下「ＶＴ２Ｂ」）を、抗原として利用することができる。カンピロバクターについてＦｌａＡ遺伝子によりコードされる鞭毛タンパク質（以下「ＦｌａＡ」）を利用することができる。
　本発明に用いるＣＴＢ、ＶＴ２Ｂ、ＦｌａＡは、具体的にはそれぞれ配列番号３，４，５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、配列番号３，４，５で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が例示される。配列番号３，４，５のアミノ酸配列は以下に記載の通りである。
ＣＴＢ（配列番号３、アクセッション番号：Ｕ２５６７９）：
ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬＮＤＫＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫＲＥＭＡＩＩＴＦＫＮＧＡＴＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＴＥＡＫＶＥＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＨＡＩＡＡＩＳＭＡＮ
ＶＴ２Ｂ（配列番号４、アクセッション番号：ＮＰ＿０５０５４０．１）：
ＭＫＫＭＦＭＡＶＬＦＡＬＡＳＶＮＡＭＡＡＤＣＡＫＧＫＩＥＦＳＫＹＮＥＤＤＴＦＴＶＫＶＤＧＫＥＹＷＴＳＲＷＮＬＱＰＬＬＱＳＡＱＬＴＧＭＴＶＴＩＫＳＳＴＣＥＳＧＳＧＦＡＥＶＱＦＮＮＤ
ＦｌａＡ（配列番号５、アクセッション番号：ＷＰ＿０１１８１２７８９．１）：
ＭＧＦＲＩＮＴＮＶＡＡＬＮＡＫＡＮＳＤＬＮＡＫＳＬＤＡＳＬＳＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＡＤＤＡＳＧＭＡＩＡＤＳＬＲＳＱＡＮＴＬＧＱＡＩＳＮＧＮＤＡＬＧＩＬＱＴＡＤＫＡＭＤＥＱＬＫＩＬＤＴＩＫＴＫＡＴＱＡＡＱＤＧＱＳＬＫＴＲＴＭＬＱＡＤＩＮＫＬＭＥＥＬＤＮＩＡＮＴＴＳＦＮＧＫＱＬＬＳＧＮＦＴＮＱＥＦＱＩＧＡＳＳＮＱＴＶＫＡＴＩＧＡＴＱＳＳＫＩＧＶＴＲＦＥＴＧＡＱＳＦＴＳＧＶＶＧＬＴＩＫＮＹＮＧＩＥＤＦＫＦＤＮＶＶＩＳＴＳＶＧＴＧＬＧＡＬＡＥＥＩＮＫＳＡＤＫＴＧＶＲＡＴＹＤＶＫＴＴＧＶＹＡＩＫＥＧＴＴＳＱＥＦＡＩＮＧＶＴＩＧＫＩＥＹＫＤＧＤＧＮＧＳＬＩＳＡＩＮＡＶＫＤＴＴＧＶＱＡＳＫＤＥＮＧＫＬＶＬＴＳＡＤＧＲＧＩＫＩＴＧＤＩＧＶＧＳＧＩＬＡＮＱＫＥＮＹＧＲＬＳＬＶＫＮＤＧＲＤＩＮＩＳＧＴＮＬＳＡＩＧＭＧＴＴＤＭＩＳＱＳＳＶＳＬＲＥＳＫＧＱＩＳＡＴＮＡＤＡＭＧＦＮＳＹＫＧＧＧＫＦＶＦＴＱＮＶＳＳＩＳＡＦＭＳＡＱＧＳＧＦＳＲＧＳＧＦＳＶＧＳＧＫＮＬＳＶＧＬＳＱＧＩＱＩＩＳＳＡＡＳＭＳＮＴＹＶＶＳＡＧＳＧＦＳＳＧＳＧＮＳＱＦＡＡＬＫＴＴＡＡＮＴＴＤＥＴＡＧＶＴＴＬＫＧＡＭＡＶＭＤＩＡＥＴＡＩＴＮＬＤＱＩＲＡＤＩＧＳＩＱＮＱＶＴＳＴＩＮＮＩＴＶＴＱＶＮＶＫＡＡＥＳＱＩＲＤＶＤＦＡＳＥＳＡＮＹＳＫＡＮＩＬＡＱＳＧＳＹＡＭＡＱＡＮＳＳＱＱＮＶＬＲＬＬＱ
　ＣＴＢ、ＶＴ２Ｂ、ＦｌａＡは、ＣＴＢ、ＶＴ２Ｂ、ＦｌａＡを産生するコレラ菌、病原性大腸菌、カンピロバクターから回収、精製することにより取得できる。また、公知の遺伝子組換え技術によりＣＴＢ発現ベクター、ＶＴ２Ｂ発現ベクター、ＦｌａＡ発現ベクターを構築し、これを適当な宿主に導入して発現させ、組み換えタンパク質を回収、精製して取得することもできる。
　Ｃ－ＣＰＥと他の抗原は融合体であることが好ましい。融合体とは、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原とを含んで一体化されているものであればよく、その形態は限定されない。また、融合体にはＣ－ＣＰＥと他の抗原以外のものが含まれていてもよい。融合体としては、例えば、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原との融合タンパク質（融合抗原とも言う）、抗原を封入したリポソームとＣ－ＣＰＥの結合体、抗原を担持したナノマテリアルとＣ－ＣＰＥの結合体などが挙げられるが、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原との融合タンパク質が好ましい。
　Ｃ－ＣＰＥと他の抗原の融合体において、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原以外のものとして、例えばＣ－ＣＰＥと他の抗原を結合させるリンカーを含むことができる（図２、図１２参照）。リンカーは他の抗原と抗原を結合させるためにも使用することができる。リンカーとして、例えば以下の配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列からなるリンカーを使用することができる。特に配列番号３４に示すアミノ酸配列からなるリンカーが好適である。
リンカー例１（配列番号２９）（ＧＧＧＧＳ）ｎ　　 　　ｎ＝１～５
リンカー例２（配列番号３０）（ＧＧＧＧＳ）ｎＧＧ　　　ｎ＝１～５
リンカー例３（配列番号３１）（Ｇ）ｎ　　　　　　　 ｎ＝５～１０
リンカー例４（配列番号３２）（ＥＡＡＡＫ）ｎ　 　　ｎ＝１～４
リンカー例５（配列番号３３）（ＰＡ）ｎ　　　　　 　ｎ＝２～３４
リンカー例６（配列番号３４）　ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ
　Ｃ－ＣＰＥと他の抗原との融合タンパク質は、公知の遺伝子組換え技術により製造することができる。例えば、Ｃ－ＣＰＥをコードする遺伝子と他の抗原とするタンパク質をコードする遺伝子とを人工的に連結した融合遺伝子（ハイブリッド遺伝子）を作製し、当該融合遺伝子を、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより取得することができる。融合タンパク質において、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原との結合順序は限定されず、Ｎ末端が他の抗原でＣ末端側がＣ－ＣＰＥとしてもよく、逆にＮ末端がＣ－ＣＰＥでＣ末端側が他の抗原としてもよい。なお、他の抗原とするタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。また、公知の方法を用いて目的遺伝子をクローニングし、塩基配列解析を行うことで塩基配列情報を取得することができる。このようにして得られた塩基配列情報に基づいて、目的の抗原を有する生物から核酸を抽出し、ＰＣＲ等の公知の手段を用いて遺伝子を取得することができる。
　融合タンパク質としては、Ｃ－ＣＰＥと、コレラ菌、病原性大腸菌、又はカンピロバクターの少なくとも１種の病原体由来の抗原とが融合した融合体が例示される。本発明の多価ワクチンは、少なくとも二価以上のワクチンであり、三価ワクチン、四価ワクチンのような多価ワクチンであってもよい。
　本発明のワクチンは、経口投与または非経口投与より投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与などが挙げられる。経粘膜投与される場合の投与部位は、特に制限されないが、具体的には、鼻粘膜、消化器粘膜（胃腸粘膜、腸管粘膜）、呼吸器粘膜（肺粘膜、気管粘膜）、口腔粘膜、膣粘膜、眼粘膜等が挙げられる。中でも、利便性の理由で、鼻粘膜、消化器粘膜、口腔粘膜が好ましい。
　本発明の多価ワクチンの投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物やニワトリ等の鳥類などが挙げられる。
　本発明の多価ワクチンの有効成分である上記融合体の配合量については、生体内に投与されて免疫応答を誘導する効果を奏するのに有効な量であればよく、抗原の種類、投与対象の年齢や体重、投与形態、製剤の形状や剤型により異なるが、例えば、対象がヒトの場合、１日１回～数回、好ましくは１日１回、多価ワクチンが投与され（初回免疫）、通常２～３週間後に同様にして再投与される（追加免疫）。
　本発明は、多価ワクチンを含む医薬組成物として製剤化されたものであってもよい。多価ワクチンを含む医薬組成物は、有効成分としての上記融合体の他に、医薬組成物に通常使用される担体または添加剤を適宜配合してもよい。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて、適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　このような添加剤として、具体的には、乳糖、白糖、マンニトール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸塩等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、デキストリン、プルラン等の結合剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、ポリソルベート８０等の崩壊剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の他の吸収促進剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類等の滑沢剤；黄酸化鉄、黄色三二酸化鉄、三二酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素（例えば、食用青色１号等）、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；並びにアスコルビン酸、アスパルテーム、アマチャ、塩化ナトリウム、果糖、サッカリン、粉糖等の矯味剤等が例示できる。
　さらに、上記成分の他、本発明の多価ワクチンを含む医薬組成物には、基剤として生分解性合成高分子を用いてもよい。このような生分解性合成高分子としては、例えばポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸－グリコール酸）共重合体、およびこれらの混合物等が代表的なものとして挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
　本発明の多価ワクチンを含む医薬組成物は、形状については特に制限されず、固形状、液体状、半固形状、懸濁状、粉末状、微粒子状のいずれの形状であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、感染症を予防及び／又は治療するためのものである。感染症は、本発明の多価ワクチンに含まれる抗原により誘導される免疫により、予防及び／又は治療されるものであれば、特に限定されない。本発明の医薬組成物は、感染症の発症の予防、感染症に伴う症状・病態の予防、症状の軽減化等を目的として用いることができる。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例及び実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例及び実験例に限定されない。なお、以下の実施例および実験例において、Ｃ－ＣＰＥと他の抗原の融合体は、すべて配列番号３４に示すアミノ酸配列からなるリンカーで連結されている。複数の抗原を連結させる場合にも上記リンカーで結合されている。
（実施例１）融合タンパク質ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥの作製
　ＰｓｐＡ　ｃＤＮＡ（入手元：国立大学法人東京大学）を鋳型とし、ＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ａｇｇｇｔａｃｃｇａａｇａａｔｃｔｃｃｃｇｔａｇｃｃ－３’（配列番号６）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｃｔｔａａｔｔａａｔｔｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｔｔｃ－３’（配列番号７）（下線部はＰａｃＩ切断部位である）により増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＥＴ１６ｂ－ＯＶＡ－Ｃ－ＣＰＥ（入手元：国立大学法人大阪大学）（Ｋａｋｕｔａｎｉ　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．（２０１０）３１，５４６３－５４７１）をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）、ＰａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０５４７）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＥＴ１６ｂ－ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ１８４と称する。ｐＥＴ１６ｂ－ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ１８４は、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１８４位～第３１９位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
　ｐＥＴ１６ｂ－ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ１８４とＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９４５０）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２２７１１０２２）に培養液を１／１０量加え、３７℃、３時間振盪培養した。ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ，ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、さらに３７℃、３時間振盪培養した。その後、９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，及び１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭ　イミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール　１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ）を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
　ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥのビオチン化はＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：２１４２５）を用い、手順はキットのプロトコールに準じて行った。
（比較例１）Ｃ－ＣＰＥタンパク質の作製
　ｐＥＴ１６ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４（入手元：国立大学法人大阪大学）（Ｕｃｈｉｄａ　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１０）７９，１４３７－１４４４）とＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９４５０）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）１００μｌを加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２２７１１０２２）に培養液を１／１０量加え、３７℃、３時間振盪培養した。ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ）（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、さらに３７℃、３時間振盪培養した。その後、９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，及び１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭ　イミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール　１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（Ｃ－ＣＰＥタンパク質（配列番号１の第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列を有するタンパク質））を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
（実験例１）血清抗Ｃ－ＣＰＥ　ＩｇＧ抗体の産生能の確認
　図１Ａに示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回で、実施例１及び比較例１にて作製した各種タンパク質を、Ｃ－ＣＰＥ量として１０μｇとなるように調整し、腹腔内に投与した。Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍに関してはＣ－ＣＰＥにＩｍｊｅｃｔ　Ａｌｕｍ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ：７７１６１）１００μｌを混合したものを室温で３０分間混和したものを用いた。最終免疫の１週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　Ｃ－ＣＰＥタンパク質（１０μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（比較例１で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）　１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（Ｃ－ＣＰＥ　ａｌｏｎｅ：ｎ＝４，Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍ：ｎ＝４，ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝５）
　結果を図１Ｂに示す。Ｃ－ＣＰＥ単独、Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍを投与した場合に比べて、ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合は、血清抗Ｃ－ＣＰＥ　ＩｇＧ抗体の産生能が著しく高いことが確認された。Ｃ－ＣＰＥは単独では免疫誘導能が低いが、他の抗原と融合体にすることにより、免疫誘導能が高まることが確認された。
（実施例２）融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥの作製１
　ｐＮＵ２１２－ＣＴＢ　ｉｎａｂａ５６９Ｂ（入手元：国立大学法人東京大学）を鋳型とし、ＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｃａｇｇｔａｃｃａｃａｃｃｔｃａａａａｔａｔｔａｃｔ－３’（配列番号８）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ａｇａａｔｔｃｔｔａａｔｔｔｇｃｃａｔａｃｔａａｔｔｇｃ－３’（配列番号９）（下線部はＥｃｏＲＩ切断部位である））により増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＣｏｌｄＩＩ　ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ：３３６２）をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ３１０１）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢと称する。
　次に、ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４を作製する。ｐＮＵ２１２－ＣＴＢ　ｉｎａｂａ５６９Ｂ（入手元：国立大学法人東京大学）を鋳型とし、ＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｃａｇｇｔａｃｃａｃａｃｃｔｃａａａａｔａｔｔａｃｔ－３’（配列番号８）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ａｃｔｔａａｔｔａａａｔｔｔｇｃｃａｔａｃｔａａｔｔｇｃｇ－３’（配列番号１０）（下線部はＰａｃＩ切断部位である））により増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＥＴ１６ｂ－ＰｓｐＡ－Ｃ－ＣＰＥ１８４をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）、ＰａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０５４７）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＥＴ１６ｂ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４と称する。
　ｐＥＴ１６ｂ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４を鋳型とし、ＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ａａｇｇｔａｃｃａｃａｃｃｔｃａａａａｔａｔｔａｃｔ－３’（配列番号１１）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｃｇｇａａｔｔｃｔｔａａａａｔｔｔｔｔｇａａａｔ－３’（配列番号１２）（下線部はＥｃｏＲＩ切断部位である））により増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＣｏｌｄＩＩ　ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ：３３６２）をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ３１０１）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４と称する。
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４を鋳型とし、ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて組み換えを行った。ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ｉＰＣＲ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（ＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＡＧＣＴＧＣＴ（配列番号１３））、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ＣＴＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣ（配列番号１４））、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－、ＭｉｌｌｉＱを混合し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物にＤｐｎＩを加え、３７℃で１時間酵素処理を行った。その後、ＰＣＲ産物、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ、ＭｉｌｌｉＱの混合液を１６℃、１時間反応させることでライゲーションした。得られたライゲーション産物にフェノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、９９．５％　エタノール、３Ｍ　酢酸ナトリウム、グリコーゲンを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を捨て、７０％　エタノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、ペレットをＭｉｌｌｉＱに懸濁した。得られたプラスミドとＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）９００μｌを加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをシークエンス解析した。得られたプラスミドはｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１９４と称され、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢまたはｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１９４とＣｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｐＧ－Ｔｆ２／ＢＬ２１（Ｔａｋａｒａ：９１２４）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。その後、１００μ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０μｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍｌ　テトラサイクリン塩酸塩（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．６まで振盪培養した。１５℃、３０分間静置した後、ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ）（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、１５℃で２４時間振盪培養した。９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，及び１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭイミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール　１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（ＣＴＢ、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ）を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
　各種タンパク質（０．５μｇ）にＳａｍｐｌｅ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：ＮＰ０００９）、ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：ＮＰ０００７）を加え、７０℃、１０分間加温した。ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて電気泳動を行った。ゲルをＣＢＢ　Ｓｔａｉｎ　Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０４５４３－５１）で染色した。
　本実施例２にて得た融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥの模式図を図２Ａに示す。また、ＣＢＢ染色してタンパク質を確認した結果を図２Ｂに示す。ＣＢＢ染色の結果から各種タンパク質の分子量が確認でき、確かに融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥが産生されていることが確認された。
（実験例２－１）各種受容体への結合性の確認
（１）ＧＭ１結合性の確認
　ＧＭ１（Ｓｉｇｍａ：Ｇ７６４１）（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌで播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで５回洗浄後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　２００μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、実施例２及び比較例１にて作製した各種タンパク質をＣＴＢ量として１０μｇ／ｍｌとなるように調整したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－Ｈｉｓ　Ｔａｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：６５２５０１）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで５０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した（ｎ＝３）。
（２）クローディン４結合性の確認
　Ｌ細胞もしくはｍｏｕｓｅ　ｃｌａｕｄｉｎ－４発現Ｌ細胞（入手元：国立大学法人京都大学）を３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。実施例２及び比較例１にて作製した各種タンパク質をＣ－ＣＰＥ量として１０μｇ／ｍｌとなるように２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－Ｈｉｓ　Ｔａｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：６５２５０１）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、ＦＩＴＣ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４０６６０５）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で３０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４２０４０３）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１００倍希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１回洗浄後のサンプルをＦＡＣＳ解析した。
　ＧＭ１結合性に関する結果を図２Ｃに、クローディン４結合性に関する結果を図２Ｄに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥも、ＣＴＢ単独と同様に受容体ＧＭ１に対して結合性を有すること、Ｃ－ＣＰＥ単独と同様に受容体クローディン４に対して結合性を有することが確認された。すなわち、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥがＣＴＢ及びＣ－ＣＰＥのどちらの受容体に対しても同程度の結合性を保持していることが確認された。
（実験例２－２） コレラ毒素特異的血清中ＩｇＧ、糞便中ＩｇＡ産生能の確認
（１）コレラ毒素特異的血清中ＩｇＧの産生能の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　コレラ毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：１００Ｂ）（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
（２）コレラ毒素特異的糞便中ＩｇＡ産生能の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、糞便を回収し、ＰＢＳを１００ｍｇ／ｍｌとなるように加え、４℃、１０分間懸濁した。その後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（糞便抽出液）を回収した。
　コレラ毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：１００Ｂ）（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、糞便抽出液を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０４０－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
　結果を図４Ａに示す。 融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＣＴＢ単独投与と同等に、コレラ毒素特異的血清中ＩｇＧ及びコレラ毒素特異的糞便中ＩｇＡの両方を誘導し得ることが確認された。
（実験例２－３）ＣＴ－ＧＭ１結合中和活性の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　ＧＭ１（Ｓｉｇｍａ：Ｇ７６４１）（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで５回洗浄後、１％　ＢＳＡ　－ＰＢＳ　２００μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、あらかじめコレラ毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：１００Ｂ）（１．２５ｎｇ）＋血清（４μｌ）を３７℃で１時間反応させたものを播種し、２時間反応させた。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ａｎｔｉ－ｂｅｔａ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｔｏｘｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ：ａｂ３４９９２）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで２０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｄｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４０６４０１）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
　結果を図４Ｂに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＣＴＢ単独投与と同等に、ＣＴ－ＧＭ１結合中和活性を示すことが確認された。すなわち、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＣＴＢ単独投与と同等に、コレラ毒素に対するワクチン効果を示すことが確認された。
（実験例２－４）コレラ毒素投与による下痢誘導に対する防御作用の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１１日後に２４時間以上絶食したマウスにメイロン２００μｌを経口投与した。その１５分後にコレラ毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：１００Ｂ）２５μｇを経口投与し、解剖まで絶食・絶飲した。１３～１４時間後にマウスの幽門～直腸までを摘出し、内容物を回収し、その液体量を測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
　結果を図４Ｃに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＣＴＢ単独投与と同等に、コレラ毒素投与による下痢誘導を抑制し得ることが確認された。すなわち、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＣＴＢ単独投与と同等に、コレラ毒素に対するワクチン効果を示すことが確認された。
（実験例２－５）ウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生能
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　Ｃ－ＣＰＥタンパク質（１０μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（比較例１で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ　－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：　５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
　結果を図５Ａに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、Ｃ－ＣＰＥ単独投与と比較して、顕著なウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生を誘導し得ることが確認された。
（実験例２－６）ウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　Ｖｅｒｏ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ０１１１）を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、一晩接着させた。翌日、ウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（０．１μｇ）＋血清（４０μｌ）をあらかじめ３７℃で１時間反応させたものを細胞に播種し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０７５５３－１５）（１０μｌ／ｗｅｌｌ）播種し、３７℃で１時間反応させ、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝９，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝８）
　結果を 図５Ｂに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、Ｃ－ＣＰＥ単独投与と比べて、顕著なウエルシュ菌毒素による細胞死の中和活性を示すことが確認された。実験例２－５の結果と併せて、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥにより、ＣＰＥとＣＴの両方に対する免疫応答が誘導可能であることが確認された。
（実験例２－７）ウエルシュ菌毒素の腸管投与に対する生体防御誘導作用の確認
（１）下痢症状に対する防御作用の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。
　最終免疫の１週間後、あらかじめ２４時間以上絶飲・絶食させたマウスを麻酔下で腹部を開腹し、幽門から６～１８ｃｍの部分に５ｃｍ程度のループを作製した。ループにウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（１５μｇ）を注入し、腹部を縫合した。９０分後、ループを摘出し、長さ・重量を測定した。（ＰＢＳ：ｎ＝８，ＣＴＢ：ｎ＝８，Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝６，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝１３，ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝６）
（２）絨毛の崩壊に対する防御作用の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。
　最終免疫の１週間後、あらかじめ２４時間以上絶飲・絶食させたマウスを麻酔下で腹部を開腹し、幽門から６～１８ｃｍの部分に５ｃｍ程度のループを作製した。ループにウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（１５μｇ）を注入し、腹部を縫合した。９０分後、ループを摘出し、ＰＢＳで腸内を洗浄後、４％　ＰＦＡで一晩固定した。翌日、１０％　スクロースに置換し、１２時間浸した。その後、２０％　スクロースに置換し、１２時間浸した。その後、Ｏｐｔｉｍａｌ　Ｃｕｔｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ｓａｋｕｒａ－ｆｉｎｅｔｅｋ：４５８３）に包埋し、液体窒素で凍結させた。凍結ブロックをクリオスタットを用いて、６μｍの切片を作製した。切片を１０分間流水で洗浄後、ヘマトキシリンで１０分間染色した。流水で３０分間洗浄後、エオシンで３分間染色した。その後、７０％，８０％，９０％　エタノールに１０秒ずつ浸し、９９．５％　エタノールに１分間×２回浸した。その後、キシレンに１分間×３回浸した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔ　Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：ＳＰ１５－１００）を１滴滴下し、封入した。
　結果を図６Ａ及びＢに示す。Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ（ＣＴとＣ－ＣＰＥの混合）を投与した場合と比べて、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与した場合は、ウエルシュ菌毒素の腸管投与による下痢及び絨毛の崩壊が抑制されることが確認された。
（実験例２－８）ウエルシュ菌毒素の血中投与に対する生体防御誘導作用の確認
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例２及び比較例１にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。
　最終免疫の１週間後にウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（１００μｇ／ｋｇ）を尾静脈注射した。その３０分後にマウスの動態を観察した。
　その結果、Ｃ－ＣＰＥ単独、ＣＴ＋Ｃ－ＣＰＥ（ＣＴとＣ－ＣＰＥの混合）を投与した場合は、毒素の血中投与による高カリウム血症が引き起こされ、マウスはほとんど動かず、四肢のしびれ、筋力の低下が見られた。一方、融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ投与した場合は、マウスは手足を動かして運動し、四肢のしびれ、筋力の低下が抑えられたことから、高カリウム血症の発症が抑制された。
（実施例３） 融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥの作製２
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４を鋳型とし、ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて組み換えを行った。ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ｉＰＣＲ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（ＧＣＴＡＧＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡ（配列番号１５））、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡ（配列番号１６））、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－、ＭｉｌｌｉＱを混合し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物にＤｐｎＩを加え、３７℃で１時間酵素処理を行った。その後、ＰＣＲ産物、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ、ＭｉｌｌｉＱの混合液を１６℃、１時間反応させることでライゲーションした。得られたライゲーション産物にフェノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、９９．５％　エタノール、３Ｍ　酢酸ナトリウム、グリコーゲンを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を捨て、７０％　エタノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、ペレットをＭｉｌｌｉＱに懸濁した。得られたプラスミドとＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）９００μｌを加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをシークエンス解析した。得られたプラスミドをｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａとした。
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａを鋳型とし、ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて組み換えを行った。ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ｉＰＣＲ、２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（ＧＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴ（配列番号１７））、１０ｐｍｏｌ／μｌ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（ＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴ（配列番号１８））、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－、ＭｉｌｌｉＱを混合し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物にＤｐｎＩを加え、３７℃で１時間酵素処理を行った。その後、ＰＣＲ産物、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ、ＭｉｌｌｉＱの混合液を１６℃、１時間反応させることでライゲーションした。得られたライゲーション産物にフェノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、９９．５％　エタノール、３Ｍ　酢酸ナトリウム、グリコーゲンを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を捨て、７０％　エタノールを加え混和し、１７８００×ｇ、５分間遠心した。上清を回収し、ペレットをＭｉｌｌｉＱに懸濁した。得られたプラスミドとＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）９００μｌを加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをシークエンス解析した。得られたプラスミドをｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａとした。ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４は、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１８４位～第３１９位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものであり、ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａは、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１８４位～第３１９位においてＹ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａの２アミノ酸置換を有するアミノ酸配列をコードをする遺伝子をクローニングしたものである。
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１８４またはｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５ＡとＣｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｐＧ－Ｔｆ２／ＢＬ２１（Ｔａｋａｒａ：９１２４）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０μｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍｌ　テトラサイクリン塩酸塩（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．６まで振盪培養した。１５℃、３０分間静置した後、ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ）（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、１５℃で２４時間振盪培養した。９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，及び１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭ　イミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール　１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａ）を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
　本実施例３にて得た、Ｃ－ＣＰＥ変異体を含む融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａの模式図を図７Ａに示す。
（実験例３－１）クローディン４への結合性の確認
　Ｌ細胞もしくはｍｏｕｓｅ　ｃｌａｕｄｉｎ－４発現Ｌ細胞（入手元：国立大学法人京都大学）を３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。実施例３にて作製した各種タンパク質をＣ－ＣＰＥ量として１０μｇ／ｍｌとなるように２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－Ｈｉｓ　Ｔａｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：６５２５０１）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、ＦＩＴＣ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４０６６０５）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で３０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４２０４０３）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１００倍希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１回洗浄後のサンプルをＦＡＣＳ解析した。
　結果を図７Ｂに示す。Ｃ－ＣＰＥの変異体との融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａは、クローディン４への結合性の低下を引き起こすことが確認された。
（実験例３－２）ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ特異的ＩｇＧ抗体の産生能
　図３に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）にＣＴＢ量として２０μｇ，Ｃ－ＣＰＥ量として２４μｇをＰＢＳ　２００μｌに懸濁した各種タンパク質（実施例３にて作製）をマウス皮下に注射した。その１週間後からは、週１回、計３回、皮下注射と同様に調整した各種タンパク質を経口投与した。１２時間以上絶食したマウスにメイロン（大塚製薬）２００μｌを経口投与し、その１５分後に各種タンパク質を経口投与した。最終免疫の１週間後、眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間遠心し、上清（血清）を回収した。
　ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥタンパク質（１０μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（実施例３で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ：ｎ＝５，ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａ：ｎ＝５）
　結果を図７Ｃに示す。Ｃ－ＣＰＥ変異体との融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ　Ｙ３０６Ａ／Ｌ３１５Ａは、変異を導入していないＣ－ＣＰＥとの融合タンパク質ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥと同程度に、ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ特異的ＩｇＧ抗体を産生することが確認された。
（実施例４）ワクチン抗原の作製（ＶＴ２Ｂ，ＦｌａＡ，ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ）
（１）発現用ベクターの作製
　腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｏ－１５７，Ｓａｋａｉ株）およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，８１－１７６株）のゲノムＤＮＡ（入手元：公立大学法人大阪府立大学）を使用した。腸管出血性大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ベロ毒素２Ｂサブユニット遺伝子（ＶＴ２Ｂ）をＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＧＧＴＡＣＣａｔｇａａｇａａｇａｔｇｔｔｔａｔｇｇｃｇｇ－３’（配列番号１９）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇｇｇｇＧＡＡＴＴＣｇｔｃａｔｔａｔｔａａａｃｔｇｃａｃｔｔｃａｇ－３’（配列番号２０）（下線部はＥｃｏＲＩ切断部位である））により増幅した。腸管出血性大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ベロ毒素２Ｂサブユニット遺伝子（ＶＴ２Ｂ）をＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＧＧＴＡＣＣａｔｇａａｇａａｇａｔｇｔｔｔａｔｇｇｃｇｇ－３’（配列番号２１）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＴＴＡＡＴＴＡＡｇｔｃａｔｔａｔｔａａａｃｔｇｃａｃｔｔｃａｇ－３’（配列番号２２）（下線部はＰａｃＩ切断部位である））により増幅した。カンピロバクターのゲノムＤＮＡを鋳型とし、鞭毛抗原ＦｌａＡ遺伝子（ＦｌａＡ）をＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＧＧＴＡＣＣａｔｇｇｇａｔｔｔｃｇｔａｔｔａａｃａｃａａａｔ－３’（配列番号２３）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇｇＧＴＣＧＡＣｃｔａｔｔｇｔａａｔａａｔｃｔｔａａａａｃａｔｔｔｔｇ－３’（配列番号２４）（下線部はＳａｌＩ切断部位である））により増幅した。カンピロバクターのゲノムＤＮＡを鋳型とし、鞭毛抗原ＦｌａＡ遺伝子（ＦｌａＡ）をＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＧＧＴＡＣＣａｔｇｇｇａｔｔｔｃｇｔａｔｔａａｃａｃａａａｔ－３’（配列番号２５）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＴＴＡＡＴＴＡＡｔｔｇｔａａｔａａｔｃｔｔａａａａｃａｔｔｔｔｇｃｔ－３’（配列番号２６）（下線部はＰａｃＩ切断部位である））により増幅した。
　各ＰＣＲ産物およびｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１９４をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）、ＰａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０５４７）、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１０１）、ＳａｌＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１３８）、で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミド（ｐＣｏｌｄＩＩ－ＶＴ２Ｂ，ｐＣｏｌｄＩＩ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４，ｐＣｏｌｄＩＩ－ＦｌａＡ，ｐＣｏｌｄＩＩ－ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ１９４）を得た。次にプラスミドのｐＣｏｌｄＩＩからｐＣｏｌｄＩに変えるために、各プラスミドとｐＣｏｌｄＩ（Ｔａｋａｒａ，３３６１）をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）とＳａｌＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１３８）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミド（ｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２Ｂ，ｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４，ｐＣｏｌｄＩ－ＦｌａＡ，ｐＣｏｌｄＩ－ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ１９４）を得た。ｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４及びｐＣｏｌｄＩ－ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ１９４は、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
（２）各リンコンビナントタンパク質の発現と精製
　ｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２ＢもしくはｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４、ｐＣｏｌｄＩ－ＦｌａＡ、ｐＣｏｌｄＩ－ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ１９４とＣｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｐＧ－Ｔｆ２／ＢＬ２１（Ｔａｋａｒａ：９１２４）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍｌ　テトラサイクリン塩酸塩（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．６まで振盪培養した。１５℃、３０分間静置した後、ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ）（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、１５℃で２４時間振盪培養した。９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，及び１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭ　イミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール　１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（ＶＴ２Ｂ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ）を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
　各種タンパク質にＳａｍｐｌｅ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：ＮＰ０００９）、ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ：ＮＰ０００７）を加え、７０℃、１０分間加温した。ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて電気泳動を行った。ゲルをＣＢＢ　Ｓｔａｉｎ　Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０４５４３－５１）で染色した。
　本実施例４にて得た融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥの模式図を図８Ａに示す。また、ＣＢＢ染色してタンパク質を確認した結果を図８Ｂに示す。ＣＢＢ染色の結果から各種タンパク質の分子量が確認でき、確かに融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥが産生されていることが確認された。
（実験例４－１）クローディン４への結合性の確認
　Ｌ細胞もしくはｍｏｕｓｅ　ｃｌａｕｄｉｎ－４発現Ｌ細胞（入手元：国立大学法人京都大学）を３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。実施例４及び比較例１にて作製した各種タンパク質をＣ－ＣＰＥ量として１０μｇ／ｍｌとなるように２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－Ｈｉｓ　Ｔａｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：６５２５０１）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１時間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、ＦＩＴＣ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４０６６０５）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で３０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで２回洗浄後、７－ＡＡＤ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ：４２０４０３）を２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１００倍希釈したものを５０μｌ／ｗｅｌｌ播種し、氷上で１０分間反応させた。２％　ＮＣＳ－ＰＢＳで１回洗浄後のサンプルをＦＡＣＳ解析した。
　結果を図８Ｃ示す。融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥは、Ｃ－ＣＰＥと同程度にクローディン４への結合性を有することが確認された。
（実験例４－２）Ｃ－ＣＰＥ特異的抗体の産生能の確認
（１）免疫方法と血清の回収
　図９に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回、実施例４及び比較例１にて作製した各種タンパク質（Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍ、ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ）各５０μｇをマウスの腹腔内に投与した。対照群としてＰＢＳのみを投与したマウスを用意した。Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍに関してはＰＢＳ　２５０μｌに溶解したＣ－ＣＰＥと等量のＩｍｊｅｃｔ　Ａｌｕｍ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ：７７１６１）を室温で３０分間混和したものを用いた。ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥとＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥはＰＢＳ　５００μｌに溶解したものを用いた。最終免疫の１週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間，４℃で遠心分離し、上清（血清）を回収した。
（２）抗原（Ｃ－ＣＰＥ）特異的ＥＬＩＳＡ
　Ｃ－ＣＰＥタンパク質（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（比較例１で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで希釈した血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（各群：ｎ＝３）
　結果を図１０Ａ示す。融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥは、Ｃ－ＣＰＥ＋Ａｌｕｍと比べて、顕著なウエルシュ菌毒素に対する特異的抗体産生能を発揮することが確認された。
（実験例４－３）ウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性の確認
（１）免疫方法と血清の回収
　図９に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回、実施例４にて作製した各種タンパク質（ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ）各５０μｇをＰＢＳ　５００μｌに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。対照群としてＰＢＳのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の１週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間，４℃で遠心分離し、上清（血清）を回収した。
（２）ウエルシュ菌毒素による細胞死の中和活性の確認
　Ｖｅｒｏ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ０１１１）を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、一晩接着させた。翌日、ウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（０．１μｇ）＋血清（４０μｌ）をあらかじめ３７℃で１時間反応させたものを細胞に播種し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０７５５３－１５）（１０μｌ／ｗｅｌｌ）播種し、３７℃で１時間反応させ、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（各群：ｎ＝３）
　結果を図１０Ｂに示す。融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ，ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥは、Ｃ－ＣＰＥ単独と比べて、顕著なウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性を誘導することが確認された。
（実験例４－４）ＶＴ２Ｂ特異的抗体及びＦｌａＡ特異的抗体の産生能の確認
（１）免疫方法と血清の回収
　図９に示す通り、８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回、実施例４にて作製した各種タンパク質（ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ、ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥ）各５０μｇをＰＢＳ　５００μｌに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。対照群としてＰＢＳのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の１週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間，４℃で遠心分離し、上清（血清）を回収した。
（２）抗原（ＶＴ２Ｂ，ＦｌａＡ）特異的ＥＬＩＳＡ
　ＶＴ２ＢもしくはＦｌａＡタンパク質（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（実施例４で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで希釈した血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（各群：ｎ＝３）
　結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに示す。融合タンパク質ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥが血清中ＶＴ２特異的ＩｇＧ産生を誘導し得ること，融合タンパク質ＦｌａＡ－Ｃ－ＣＰＥが血清中ＦｌａＡ特異的ＩｇＧ産生を誘導し得ることが確認された。 
（実施例５）ワクチン抗原（ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）の作製
（１）ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ発現用ベクターの作製
　ｐＣｏｌｄＩＩ－ＣＴＢ－Ｃ－ＣＰＥ１９４を鋳型とし、コレラ毒素のＢサブユニット遺伝子（ＣＴＢ）をＰＣＲ（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇｇＧＡＧＣＴＣａｃａｃｃｔｃａａａａｔａｔｔａｃｔｇａｔｔｔｇｔ－３’（配列番号２７）（下線部はＳａｃＩ切断部位である）；ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ｇｇＧＧＴＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ　ａｔｔｔｇｃｃａｔａｃｔａａｔｔｇｃｇｇｃａａｔ－３’（配列番号２８）（下線部はＫｐｎＩ切断部位である）により増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＣｏｌｄＩ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４をＫｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１４２）とＳａｌＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｒ０１３８）で３７℃、２時間酵素処理した。その後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ：２０１１Ａ）を用い、ライゲーションを行った。ライゲーション産物とＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡ－９０３）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。氷上で３分間静置後、ＳＯＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ：６９３１９）を加え、３７℃で４５分間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：０２７３９－７４）含有ＬＢプレート（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６７－８５）に全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：２００６６－９５）にコロニーを１つ植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌をＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ：２７１０４）を用い、手順はキットプロトコールに従いプラスミドを抽出した。プラスミドをシークエンス解析し、目的の遺伝子が導入されているプラスミド（ｐＣｏｌｄＩ－ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４）を得た。ｐＣｏｌｄＩ－ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４は、Ｃ－ＣＰＥとして配列番号１の第１９４位～第３１９位のアミノ酸配列をコードする遺伝子をクローニングしたものである。
（２）各リンコンビナントタンパク質の発現と精製
　ｐＣｏｌｄＩ－ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ１９４とＣｈａｐｅｒｏｎｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｐＧ－Ｔｆ２／ＢＬ２１（Ｔａｋａｒａ：９１２４）の混合液を氷上で３０分間静置し、４２℃、４２秒間加熱した。その後、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢプレートに全量播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１００μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５ｎｇ／ｍｌ　テトラサイクリン塩酸塩（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）含有ＬＢ培地（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）にコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．４～０．６まで振盪培養した。１５℃、３０分間静置した後、ＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ）（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ：１９７４２－３６）を加え、１５℃で２４時間振盪培養した。９１００×ｇ，２分間遠心し、大腸菌ペレットを回収した。ペレットにｂｕｆｆｅｒ　Ａ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，４００ｍＭ　ＮａＣｌ２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を培養液量の１／１００量加え、氷上で４０秒間×３回超音波破砕を行った。１７８００×ｇ，１５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターに通し、ろ液を回収した。あらかじめ、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　１２ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　１５ｍｌ，０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　３ｍｌ，ＭｉｌｌｉＱ　５ｍｌ，ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　１０ｍｌを流したＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０４０８０１）にろ液を充填した。カラムに１００ｍＭ　イミダゾール含有ｂｕｆｆｅｒ　Ａを１０ｍｌ流し、非特異的なタンパク質を洗浄後、５００ｍＭ　イミダゾール１０ｍｌを流すことで目的タンパク質（ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）を抽出した。あらかじめＰＢＳ　２５ｍｌを流し、平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：１７０８５１０１）に抽出タンパク質を充填し、ＰＢＳを流し込むことでタンパク質のバッファーをＰＢＳに置換した。
　本実施例５にて得た融合タンパク質ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥの模式図を図１１Ａに示す。
（実験例５－１）ＶＴ２Ｂ特異的抗体の産生能の確認
（１）免疫方法と血清の回収
　８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回、実施例４及び実施例５にて作製した（ＶＴ２Ｂ，ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）を、ＶＴ２Ｂ量として１８μｇ、ＰＢＳ　２００μｌに溶解し、マウスの皮下に投与した。対照群としてＰＢＳのみを投与したマウスを用意した。最終免疫の１週間後に眼底採血により血液を回収した。回収した血液は３０分以上氷上で静置後、３０００×ｇ，１０分間、４℃で遠心分離し、上清（血清）を回収した。
（２）抗原（ＶＴ２Ｂ）特異的ＥＬＩＳＡ
　ＶＴ２Ｂタンパク質（５μｇ／ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）（実施例４で作製）を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、４℃で一晩固相化した。翌日、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１７０μｌを加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで希釈した血清を加え、室温で２時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０３１－０５）を１％　ＢＳＡ－０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで４０００倍希釈したものを１００μｌ／ｗｅｌｌ播種し、室温で１時間静置した。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０－ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：５０－７６－１１）１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で２分間発色させた。０．５Ｎ　ＨＣｌ　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、反応停止後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。（各群：ｎ＝３）
　結果を図１１Ｂに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥが、ＶＴ２Ｂと同程度に、血清中ＶＴ２特異的ＩｇＧ産生を誘導し得ることが確認された。
（実験例５－２）ＶＴ２腹腔内投与後のマウスの生存率への影響の確認
（１）免疫方法とＶＴ２の投与
　８週齢、♀、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に週１回、計２回、実施例４及び実施例５にて作製した各種タンパク質（ＶＴ２Ｂ，ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）をＶＴ２Ｂ量として１８μｇをＰＢＳ　２００μｌに溶解し、マウスの皮下に投与した。対照群としてＰＢＳのみを投与したマウスを用意した。最終免疫１０日後にＶＴ２（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，ＳＴＸ－２）１ｎｇをＰＢＳ　５００μｌに溶解し、マウスの腹腔内に投与した。ＶＴ２投与から１週間、１日に２回（朝と夜）、マウスを観察した。（各群：ｎ＝３）
　結果を図１１Ｃに示す。融合タンパク質ＣＴＢ－ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥが、ＶＴ２Ｂと同程度に、ＶＴ２投与後のマウスの生存率を上昇させることが確認された。
（実施例６）ワクチン抗原の作製（ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）
　本実施例では、ワクチン抗原タンパク質としてＣ－ＣＰＥとＶＴ２Ｂを含む融合体（ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ）を作製した（図１２Ａ参照）。本実施例のワクチン抗原は、実施例４と同手法により作製した。
（実験例６－１）ウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生能
　本実験例では、実施例６に示すＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥを実験例２－５と同手法によりマウスに投与したときのＩｇＧ産生能を確認した。抗原タンパク質は、図１２Ｂに示すプロトコールに従い０日目及び７日目のマウス皮下に注射し、１４日目でのウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生を確認した。
　結果を図１２Ｃに示す。実施例６のＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、Ｃ－ＣＰＥ単独投与や、Ａｌｕｍアジュバントを含む抗原タンパク質と比較して、顕著なウエルシュ菌毒素特異的血清中ＩｇＧ産生を誘導し得ることが確認された。
（実験例６－２）ウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性の確認
　本実験例では、実験例４－３と同手法により、図１３Ａに示すプロトコールに従い、各抗原タンパク質をマウスに免疫投与して血清を回収し、得られた血清についてウエルシュ菌毒素による細胞死に対する中和活性を確認した。
　結果を図１３Ｂに示す。実施例６のＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、Ｃ－ＣＰＥ単独と比べて、顕著なウエルシュ菌毒素によるＶｅｒｏ細胞死に対する中和活性を誘導することが確認された。
（実験例６－３）ウエルシュ菌毒素の血中投与に対する生体防御誘導作用の確認
　本実験例では、実験例２－６と同手法により、図１４Ａに示すプロトコールに従い、各抗原タンパク質をマウス皮下投与による免疫を行い、１７日目にウエルシュ菌毒素、Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（１００μｇ／ｋｇ）を尾静脈注射し、血中のカリウム量を測定した。
　結果を図１４Ｂに示す。実施例６のＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、Ｃ－ＣＰＥ単独に比べて、高カリウム血症の発症が抑制された。
　さらに実験例２－８と同手法により各抗原タンパク質をマウスに経口投与し、最終免疫の１週間後にウエルシュ菌毒素（Ｂｉｏ　ａｃａｄｅｍｉａ：０１－５０９）（１００μｇ／ｋｇ）を尾静脈注射した。その３０分後にマウスの動態を観察した。
　結果を図１５に示す。抗原タンパク質がＣ－ＣＰＥ単独の場合は、毒素の血中投与による高カリウム血症が引き起こされ、マウスはほとんど動かず、四肢のしびれ、筋力の低下が見られた。一方、実施例６のＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥを投与した場合は、マウスは手足を動かして運動し、四肢のしびれ、筋力の低下が抑えられたことから、高カリウム血症の発症が抑制された。
（参考例１）ＶＴ２Ｂ特異的血清中ＩｇＧ産生能
　本参考例では、実施例６にＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥを実験例２－５と同手法によりマウスに投与したときのＩｇＧ産生能を確認した。ＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥは、図１６Ａに示すプロトコールに従い０日目及び７日目のマウス皮下に注射し、１４日目でのＶＴ２Ｂ特異的血清中ＩｇＧ産生を確認した。
　結果を図１６Ｂに示す。実施例６のＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥ投与により、ＶＴ２Ｂ単独投与と同様に顕著なＶＴ２Ｂ特異的血清中ＩｇＧ産生を誘導し得ることが確認された。
（参考例２）ＶＴ２皮下内投与後のマウスへの影響の確認
　本参考例では、図１７Ａのプロトコールに従い各抗原タンパク質をマウス皮下に注射し、最終免疫１０日後にＶＴ２（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，ＳＴＸ－２）１ｎｇをＰＢＳ　５００μｌに溶解し、マウスの皮下内に投与したときのマウスへの影響を確認した。ＶＴ２投与から１週間、１日に２回（朝と夜）、マウスを観察した。
　結果を図１７Ｂおよび１７Ｃに示す。実施例６にＶＴ２Ｂ－Ｃ－ＣＰＥが、ＶＴ２Ｂと同程度に、血清中のＢＵＮ（腎障害マーカー）の値を抑制し、ＶＴ２投与後のマウスの生存率を上昇させることが確認された。
　以上詳述したように、本発明の多価ワクチンを投与することにより、Ｃ－ＣＰＥ単独に比べて顕著にウエルシュ菌に対する免疫を誘導することができ、また同時にウエルシュ菌以外の少なくとも１種以上の病原体に対する免疫を誘導することができる。本発明の多価ワクチンは、効率的に細菌に起因する疾患又は症状を予防及び／又は治療することのできるものであり、感染症の予防及び／又は治療に用いることが期待される。

Claims (9)

  1. ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片と、ウエルシュ菌以外の微生物由来の少なくとも１つの抗原とを有効成分とし、ウエルシュ菌を含む２種以上の微生物に対する免疫を誘導し得ることを特徴とする、多価ワクチン。
  2. 有効成分が、ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片と前記少なくとも１つの抗原とが融合した融合体である、請求項１に記載の多価ワクチン。
  3. ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導し得る、請求項１又は２に記載の多価ワクチン。
  4. ウエルシュ菌以外の微生物由来の抗原に対する反応性を有する抗体を誘導し得る、請求項１～３のいずれかに記載の多価ワクチン。
  5. ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片が、単独では、ウエルシュ菌エンテロトキシンに対する特異的抗体を誘導できない、請求項１～４のいずれかに記載の多価ワクチン。
  6. ウエルシュ菌エンテロトキシンのＣ末端断片が、以下から選択されるタンパク質である、請求項１～５のいずれかに記載の多価ワクチン：
    （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有しており、少なくとも第３０４位～第３１９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （２）（１）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を有しており、免疫原性を有するタンパク質。
  7. 抗原が、コレラ菌、病原性大腸菌、及びカンピロバクターからなる群から選択される病原体に由来する、請求項１～６のいずれかに記載の多価ワクチン。
  8. 細菌に起因する疾患又は症状を予防及び／又は治療するための、請求項１～７のいずれかに記載の多価ワクチン。
  9. 請求項１～７のいずれかに記載の多価ワクチンを含有する、感染症を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
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