JP6151692B2 - 電位作動型カルシウムチャネル機能をモジュレートするための方法及び組成物 - Google Patents
電位作動型カルシウムチャネル機能をモジュレートするための方法及び組成物 Download PDFInfo
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Description
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、ヒト電位依存的カルシウムチャネルである。本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、造血細胞で発現するヒト電位依存的カルシウムチャネルである。本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、ヒト電位依存的L型カルシウムチャネルサブユニットアルファ−1(CaV1)である。電位作動型カルシウムチャネルは、様々な細胞型で発現する。例えば、CaV1は、網膜、脾臓、胸腺、副腎、脊髄、骨髄及び骨格筋を含むいくつかの異なる組織で発現する。本発明の一態様によれば、本明細書に記載される作用物質、使用及び方法の標的タンパク質は、それらに限定されないが、造血細胞、例えば骨髄系からの細胞(単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、肥満細胞及び樹状細胞を含む)及びリンパ系からの細胞(T細胞、B細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞を含む)で発現するCaV1スプライス変異体(例えば、CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3又はCaV1.4スプライス変異体)を含む、電位作動型カルシウムチャネルである。
本発明の一の態様は、電位作動型カルシウムチャネルの発現又は活性をモジュレートする治療剤を提供する。特定の実施形態では、造血細胞で発現する電位作動型カルシウムチャネルの発現又は活性をモジュレートする治療剤が提供される。特定の実施形態では、CaV1の発現又は活性をモジュレートする治療剤(「CaV1モジュレーター」)が提供される。特定の実施形態では、治療剤はCaV1に結合してその活性をモジュレートする。特定の実施形態によれば、治療剤はCaV1タンパク質の外部ドメインを標的にし、したがって細胞の表面で作用する。適する治療剤の例には、それらに限定されないが、抗体、アプタマー、合成抗体、合成抗体代用品、ポリペプチド、ペプチド及び小分子治療薬が含まれる。一実施形態では、本発明は、「生物学的製剤」、例えば抗体、アプタマー、阻害ペプチドなどである、CaV1の活性を標的にしてモジュレートする治療剤を提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド又はベクターが、抗体、アプタマー、ポリペプチド及びペプチドなどの治療剤を発現する。
本発明の一態様は、スプライス変異体を発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する、所与の電位作動型カルシウムチャネルを標的にする作用物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、スプライス変異体を発現する細胞の活性をモジュレートする治療薬として用いるのに適する、所与のCaV1スプライス変異体を標的にする作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明の一態様は、それに限定されないがCaV1スプライス変異体を含む標的の電位作動型カルシウムチャネルを発現する造血細胞の活性をモジュレートするための治療剤の使用を提供する。
T細胞生物学でのCav1.4の生理機能を判断するために、以下の実験を実行した。
全RNA抽出及びRT−PCR。製造業者によって指示される通りにTrizol(登録商標)試薬(Invitrogen)を用いて、様々な試料から全RNAを抽出した。単離したRNAをDNアーゼIで処理して、混入DNAを除去した。全RNAの1マイクログラムを用いて、ランダムプライマー及びスーパースクリプトII(Invitrogen)で第1の鎖cDNAを合成した。組織でCav1.4を検出するために、最初のPCRをセンスプライマー(5’−CATACTGGAGGAAAGCCAGGA−3’)及びアンチセンスプライマー(5’−TGGAGTGTGTGGAGCGAGTAGA−3’)で実施した。以降のネステッドPCR増幅は、センスプライマー(5’−GACGAATGCACAAGACATGC−3’)及びアンチセンスプライマー(5’−CAAGCACAAGGTTGAGGACA−3’)で行った。Cav1.4突然変異mRNAを検出するために、第1回目のPCRをセンスプライマー(5’−CATACTGGADGGAAAGCCAGGA−3’)及びアンチセンスプライマー(5’CGTCCCTCTTCAGCAAGAGAA−3’)で実施した。第2のネステッドPCRは、センスプライマー(5’−GCCCATAACTTCGTATAATGTATGC−3’)及びアンチセンスプライマー(5’−CAAGCACAAGGTTGAGGACA−3’)で実施した。
Ca V 1.4欠損はCD4 + 及びCD8 + T細胞リンパ球減少、並びに自発的T細胞活性化をもたらす
野生型(WT)マウスでCaV1.4発現を特徴づけるために、RNA分析を実施し、胸腺、脾臓及び末梢のCD4+及びCD8+T細胞での発現を明らかにした(図1Aを参照)。発生中の及び成熟したT細胞でのCaV1.4発現を記載した以前の観察は、Cacna1f−/−マウスがT細胞表現型を提示するかどうかの調査につながった。Cacna1f−/−マウスは、終止コドンを挿入し、早期にCacna1f翻訳を終了する遺伝子ターゲッティングを通して以前に生成された(Mansergh et al., 2005)。Cacna1f−/−マウスでの遺伝子ターゲッティングを検証するために、Cacna1f−/−マウスでloxP部位を運ぶ破壊されたCaV1.4転写産物を特異的に検出する、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を実施した(図1B)。さらに、CaV1.4抗体(Ab)ブロッティングは、Cacna1f−/−の脾臓全細胞の溶解物でタンパク質喪失を明らかにした(図2A)。マウス脾細胞とWeri網膜芽細胞腫細胞との間のCaV1.4タンパク質サイズの不一致は、代替スプライシング(Kotturi and Jefferies, 2005)又は細胞型特異的翻訳後修飾の結果であるかもしれない。CaV1.4がT細胞の原形質膜に存在するかどうか確立するために、WT及びCacna1f−/−の脾臓T細胞の表面をビオチン化し、ストレプトアビジン結合ビーズ免疫沈降物をCaV1.4 Abでブロットした(図2B)。WTのT細胞でのCaV1.4サイズのバンドの特異的検出は、CaV1.4チャネルがT細胞表面に発現することを示す。
サイトゾルCa2+を測定するために指標色素を負荷され、CD44lo(ナイーヴ)又はCD44hi(記憶)CD4+及びCD8+T細胞応答の識別のためにCD4及びCD8 AbとCD44 Abで標識されたWT及びCacna1f−/−脾細胞(図5A)を、Cacna1f−/−マウスでCa2+輸送欠陥を調査するための指示されたアゴニストで刺激した。細胞内貯蔵からのCa2+放出が、原形質膜チャネルを通してCa2+流入を媒介する能力があるかどうか判断するために、脾臓T細胞をタプシガルジンで処理した(図5B)。ERのCa2+−ATPアーゼの阻害剤であるタプシガルジンは、筋形質及び小胞体にCa2+をポンプ輸送する細胞の能力を遮断し、続いて原形質膜結合Ca2+チャネルを活性化し、細胞外からのCa2+流入を引き起こすことによってサイトゾルのCa2+濃度の上昇を誘導する(Thastrup et al., 1990)。意外なことに、Cacna1f−/−CD44loCD4+T細胞は、タプシガルジン刺激の結果サイトゾルCa2+の増加の大きな低下を示し、Cacna1f−/−CD44lo及びCD44hiCD8+T細胞もそれらのWT対応物に対して著しい減少を示した(図5B)。他方、Ca2+キレート化剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の添加を通して実証されるように、CD4+及びCD8+T細胞からのCa2+流出は、CaV1.4の欠損によって損なわれないようであった。ナイーヴCD4+T細胞の間の比較と対照的に、WT及びCacna1f−/−CD44hiCD4+T細胞は非常に類似したCa2+応答を示した。合わせて、これらの観察は、SOCEのためにCaV1.4チャネルがCD44loCD4+T細胞では極めて必要とされ、CD44lo及びCD44hiCD8+T細胞ではより少ない程度で必要とされることを実証する。
CaV1.4チャネルが、T細胞の生存及び分化の制御に深く関係している経路、Ras−MAPKシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかに対処するために(Alberola-Ila and Hernandez-Hoyos, 2003)、TCR刺激後のこれらの下流エフェクターの活性化状態を測定する試験を開始した。Rasシグナル伝達については、WT及びCacna1f−/−胸腺細胞をTCR Abで刺激し、その後、Raf−1−GST融合タンパク質によるRas−GTPの沈殿によってRas活性化を評価した(図8A)。Cacna1f−/−胸腺細胞は、野生型細胞と比較して50%より少ないRas−GTPを誘導することがわかった。対照的に、ジアセイル(diaceyl)グリセロール(DAG)類似体PMAで細胞が刺激されたときの遺伝子型の間で、活性化されたRasの量はかなり同等だった。次に、TCR刺激後の指示された時間における全胸腺細胞での下流作用性のMAPキナーゼERK及びJNKの活性化の分析を実施した(図8B)。TCR架橋後のERK活性化の強度及び持続時間は、WTと比較してCacna1f−/−胸腺細胞で低減された。しかし、TCR刺激後のWTとCacna1f−/−胸腺細胞との間でのJNKリン酸化の比較は、わずかな差だけを明らかにした。対照的に、細胞遺伝子型に関係なく、PMA処理は強力なERK及びJNKリン酸化を誘導することが見出された。総合すると、これらの試験は、CaV1.4欠損がERKの活性化に選択的に影響を及ぼすことを明らかにする。ERK活性化がCacna1f−/−成熟SP胸腺細胞で影響を受けるかどうか評価するために、TCR Ab又はPMA処理による刺激の前後に、ホスホフローサイトメトリーでERK活性を評価した(図8C)。Cacna1f−/−CD4+及びCD8+SP胸腺細胞は、PMA刺激でなくTCR刺激の結果、WTと比較して低減されたERK活性化を示した。
T細胞でのCaV1.4機能の喪失が障害性のT細胞発生及び/又は末梢T細胞の維持にそれ自体寄与するかどうか判断するために、同数のT細胞枯渇WT(Thy1.1+Ly5.2+)及びCacna1f−/−(Thy1.2+Ly5.2+)骨髄が照射された類遺伝子性の(Ly5.1+)宿主に移された、骨髄移入実験を実施した。移入の1カ月後、胸腺及び脾臓でのドナー細胞頻度(Ly5.2+)の評価は、Cacna1f−/−骨髄細胞が、宿主のT細胞再構成に関するWTとの競合で非常に劣ることを明らかにした(図9A)。胸腺及び末梢でのWTドナーのCD4+及びCD8+T細胞の頻度は、それぞれCacna1f−/−のCD4+及びCD8+T細胞のそれより実質的に高かった(図9A及び9B)。さらに、CD44loとCD44hiCD4+及びCD8+T細胞集団の比の比較は、Cacna1f−/−の脾臓ドナーT細胞が、野生型のドナーT細胞に対して記憶表現型の方へ傾くことを示した(図9C)。さらに、これらの実験は、Cacna1f−/−マウスでのCacna1f−/−CD44hiT細胞の高い頻度が、リンパ球減少の結果でなく、Cacna1f−/−CD44loT細胞の維持の失敗によるものであることを示唆する。合わせて、これらの結果は、効果的なT細胞再構成のために必要である、T細胞の祖先及び/又は成熟T細胞でのCaV1.4の細胞内在性の機能を実証する。
Cacna1f−/−マウスがリンパ球減少性であること、及び残りのT細胞の大部分は活性化された表現型又は記憶表現型を有するとの知見は、CaV1.4機能がナイーヴT細胞の維持のために必須であることを示唆した。さらに、CD44発現に基づくT細胞サブセットの比較は、Cacna1f−/−マウスがWTに対してCD44loT細胞の激しい喪失を示すが、CD44hiT細胞数への影響はかなり少ないことを明らかにした(図10A及び10B)。細胞代謝回転速度がコホート間で異なるかどうか判断するために、WT及びCacna1f−/−T細胞を、アポトーシスマーカーアネキシンVで染色した(図10C)。Cacna1f−/−のCD44hiでなくCD44loT細胞は、それらのWT対応物に対して増強されたアネキシンV反応性を示した。Cacna1f−/−CD44loT細胞の表面の表現型調査は、それらが成熟しているようであり、CD62L、TCRβ及びCD69発現に関してWTのナイーヴT細胞に似ていることを示した(例えば図10Dを参照)。合わせて、これらのデータは、Cacna1f−/−マウスでのCD44loT細胞の限定された数は、少なくとも一部、それらの低下した適応度の結果であることを示唆する。
CaV1.4欠損及びIL−7Rα発現でのその同時低下が機能的に有意であるかどうか判断するために、その下流エフェクターSTAT5のリン酸化状態を追跡することによってIL−7Rシグナル伝達をモニターした(図12A)。WT及びCacna1f−/−のCD4+及びCD8+SP胸腺細胞を、IL−7の様々な用量で刺激し、ホスホ−Y647 STAT5特異的Abで染色した。Cacna1f−/−のCD4+及びCD8+SP胸腺細胞は、試験した全てのIL−7用量において、WTと比較してSTAT5リン酸化の顕著な低減を示した。次に、CaV1.4欠損がT細胞生存を促進するIL−7の能力に影響を及ぼすかどうかを調査した。WT及びCacna1f−/−のCD44loT細胞を細胞選別によって単離し、指示濃度のIL−7を有する培養に入れ、24時間後にアネキシンV染色を通してそれらの生存力を評価した(図12B)。Cacna1f−/−CD44loT細胞は、in vitroでそれらの生存を支持するためにIL−7を利用する能力において、WTよりかなり劣ることが見出された。さらに、24時間のex vivo培養のためにTCR Abでコーティングされたウェルに入れたとき、Cacna1f−/−CD44loCD4+T細胞はWTに対して低下した生存を示した(図12C)。総合すると、これらの知見は、IL−7又はTCRのいずれかのシグナル伝達の調節を通して、CaV1.4チャネルタンパク質がナイーヴT細胞の生存に影響を与えることを示唆する。
免疫応答でのCaV1.4機能の必要条件を調査するために、WT及びCacna1f−/−マウスにオボアルブミンを発現する組換え体リステリア・モノサイトゲネス(rLM−OVA)を抗原投与した。Cacna1f−/−マウスは、rLM−OVAによる抗原投与の結果、実質的に減少した数のOVA反応性CD8+T細胞を生成した(図13A及び13B)。機能的抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞の数は、WTに対してCacna1f−/−マウスで大幅に低減した(図13C及び13D)。さらに、IFN−γ生産CD8+T細胞エフェクターの総数も、Cacna1f−/−マウスで減少した(図13E)。次に、rLM−OVAに感染したWT及びCacna1f−/−マウスからの精製CD8+T細胞の細胞溶解性機能を評価した(図13F)。Cacna1f−/−マウスは、WTと比較して、抗原特異的CTLを生成する、大いに弱められた能力を示した。合わせて、これらの試験は、生産的なCD4+及びCD8+T細胞応答を開始させるために、CaV1.4が重要であることを示す。
CaVチャネルは興奮細胞でCa2+流入を制御する主要な通路であり、筋収縮、ニューロンシグナル伝達及び遺伝子転写を含む多数の過程を調節する(Feske, 2007)。しかし、リンパ球などの非興奮性細胞でのCaVチャネルの生物学的役割は、十分に規定されていない。鈍感なマウス系で観察される神経及び免疫系の欠陥の根底にあるVDCCのβ4サブユニットでの突然変異の同定は、免疫調節でのCaV機能を示唆した(Burgess et al., 1997)。さらに、β3調節サブユニット欠損マウスを記載する原稿は、TCRシグナル伝達及びCD8+T細胞ホメオスタシスをモジュレートする役割をCaVチャネルが果たすと論じた(Jha et al., 2009)。発生中及び成熟したT細胞でのL型CaV1.4チャネルの生理機能を調査するために、その孔形成α1サブユニットが欠損したマウスを分析した。この例で記載した試験は、CaV1.4チャネルがナイーヴCD4+及びCD8+T細胞の生存及び病原体特異的CD4+及びCD8+T細胞応答の生成の両方のために重要なことを示す。さらに、ナイーヴCD4+及びCD8+T細胞は、SOCE、サイトゾルCa2+のTCRによって誘導された上昇及び下流TCRシグナル伝達のために、CaV1.4機能に依存することが示された。
T細胞生存アッセイ
C57Bl/6脾細胞を、外部ドメイン特異的CaV1α1サブユニット抗体(クローンSC−32070;Santa Cruz)の有り無しのRPMI完全培地に、細胞数5×106/ウェルで96ウェル平底プレートで培養した。この抗体はCaV1.3に対して生成されたが、CaV1.4と交差反応する。図7Dに示すように、この抗体は脾細胞のCaV1.4に結合する。
T細胞増殖アッセイ
C57Bl/6脾細胞をCFSE(Invitrogen)で標識し、CaV1 Ab(クローンSC−32070;Santa Cruz)の有り無しのRPMI完全培地に細胞数5×106/ウェルで96ウェル平底プレートで培養した。10μg/mLのプレート結合CD3ε(クローン145−2C11)及び5μg/mlのプレート結合CD28(クローン37.51)抗体で細胞を活性化した。5日後に、試料をCD8(クローン53−6.7;BD Biosciences)及びCD4(クローンGK1.5;BD Biosciences)抗体で標識し、BD FACSCaliburを用いてCFSE希釈によってT細胞増殖を評価した。この実験の結果を、図15に示す。
B細胞生物学でのCav1.4の生理機能を判断するために、以下の実験を実行した。
マウス:Cacna1f−/−マウスは、以前に記載されている(Mansergh et al., 2005)。これらのマウスを、少なくとも13世代にわたってC57BL/6(CD45.2+)バックグラウンドに戻し交配した。B6.SJL−Ptprca Pep3b/BoyJ(CD45.1+)マウスを、The Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME)から得た。Canadian Council on Animal Care及びUniversity of British ColumbiaのAnimal Care Committeeによって設定されたガイドラインに従って試験を実施した。
Ca V 1.4欠損マウスは、骨髄で正常なBリンパ球発生を示す。
図22Aは、CaV1.4欠損マウスが骨髄でBリンパ球の変更されていない頻度及び数を有することを実証する。骨髄でのBリンパ球の頻度(リンパ球の百分率)及び総数は、B220抗体で標識した骨髄細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。図22Bは、CaV1.4欠損マウスは、骨髄でプリプロB細胞段階から未熟段階までの変更されていない進行を有するが、再循環成熟Bリンパ球の著しく低減された数を有することを実証する。骨髄での各Bリンパ球(B220+)サブセットの総数は、様々な抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。集団は、ハーディゲーティングスキームによって定義した:プリプロB、B220+CD43+BP−1−HSA−;プロB、B220+CD43+BP−1−HSA+;早期プリB、B220+CD43+BP−1+HSA+;後期プリB、B220+CD43−IgM−IgD−;未熟プリB、B220+CD43−IgM+IgD−;及び、再循環成熟B細胞(成熟)、B220+CD43−IgM+IgD+。**p<0.01。
図23Aは、CaV1.4欠損マウスが脾臓B細胞の低減された頻度及び数を提示することを実証する。脾臓でのBリンパ球の頻度(リンパ球の百分率)及び総数は、B220抗体で標識した脾細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。図23Bは、CaV1.4欠損マウスが、辺縁帯B細胞の劇的に低減された頻度及び数を有する脾臓B細胞サブセットの変更された百分率を提示することを実証する。脾臓での各Bリンパ球(B220+)サブセットの頻度及び総数は、指示された表面分子に対する抗体で標識した脾細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。B細胞集団は、以下の通りに定義した:移行性T1、CD93+CD23−IgMhigh IgD−/low CD21/35−/low;移行性T2、CD93+CD23+ IgMhigh IgDhigh CD21/35low;移行性T3、CD93+CD23+IgMlow IgDhigh CD21/35low;小胞I型(Fo1)、CD93−CD23+IgMlow IgDhigh CD21/35int.;小胞II型(Fo2)、CD93−/low CD23+IgMhigh IgDhigh CD21/35int.;辺縁帯前駆体(MZP)CD93−/low CD23+sIgMhigh CD1d+IgDhigh CD21/35high;及び辺縁帯(MZ)CD93−CD23−IgMhigh IgDlow CD21/35high。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001
図24は、Cav1.4欠損は、変更された腹腔B細胞コンパートメントをもたらすことを実証する。A.腹腔でのBリンパ球の頻度(リンパ球の百分率)は、B220抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。B.腹腔での各Bリンパ球(B220+)サブセットの百分率は、B220、CD11b及びCD5抗体で標識した細胞のフローサイトメトリー分析によって判断した。B細胞集団は、以下の通りに定義した:従来のB2 B細胞、B220+CD11b−;B1a B細胞、B220+CD11b+CD5+;及びB1b B細胞、B220+CD11b+CD5−。**p<0.01及び***p<0.001。
図25は、細胞内在性のCav1.4機能が、正常なB細胞発生のために必要とされることを実証する。再構成の8週後に分析された、野生型CD45.1+CD45.2+(競合者)と野生型CD45.2+(ドナー)骨髄との1:1混合物、又は野生型CD45.1+CD45.2+(競合者)とCacna1f−/−CD45.2+(ドナー)骨髄との1:1混合物を静脈内注入した、致死的に照射された類遺伝子性のCD45.1+野生型レシピエントマウスでのB細胞発生のフローサイトメトリー。結果は、骨髄(A)、脾臓(B)及び腹腔(C)での、CD45.2+ドナーリンパ球とCD45.1+CD45.2+競合者リンパ球との比で示す(+/+青四角、野生型CD45.2+ドナー対CD45.1+CD45.2+競合者細胞;−/−赤三角形、Cacna1f−/−CD45.2+ドナー対CD45.1+CD45.2+競合者細胞)。B細胞集団は、以下の通りに定義した:骨髄では、全B細胞、B220+;プロB細胞、B220+IgM−CD43+;プリB細胞、B220+IgM−CD43−;未熟B細胞、B220lowIgM+;及び再循環成熟B細胞、B220highIgM+;脾臓では、移行性T1 B細胞、B220+IgM+CD21−CD23−;移行性T2 B細胞、B220+IgM+CD21+CD23+;小胞B細胞、B220+IgMloCD21mid;及び辺縁帯B細胞、B220+IgM+CD21+CD23−;腹腔では、従来のB2 B細胞、B220+CD11b−;B1a B細胞、B220+CD11b+CD5+;及びB1b B細胞、B220+CD11b+CD5−。
図26は、CaV1.4欠損は、B細胞でのB細胞受容体及びタプシガルジンによって誘導されるCa2+応答の障害をもたらすことを実証する。野生型(+/+;青線)及びCacna1f−/−(−/−;赤線)脾細胞に細胞内Ca2+色素Fluo−4及びFuraRedを負荷し、B220抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脾臓Bリンパ球(B220+)での細胞内Ca2+レベルを、Fluo−4/FuraRedの比として経時的にプロットした。指示された時点で、脾臓のBリンパ球を、抗IgM(BCR)、イオノマイシン(Ion)又はタプシガルジン(Tg)で刺激した。細胞外Ca2+を、EGTA添加によってキレート化させた。
図27は、Cav1.4欠損は、B細胞受容体によって誘導されるミトコンドリアCa2+応答の障害をもたらすことを実証する。野生型(+/+、青線)及びCacna1f−/−(−/−、赤線)脾細胞に細胞内Ca2+色素Fluo−4及びFuraRed(A)又はミトコンドリアCa2+色素Rhod−2(B)を負荷し、B220抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脾臓Bリンパ球(B220+)での細胞内Ca2+レベルを、Fluo−4/FuraRedの比として経時的にプロットした。ミトコンドリア膜電位を破壊するためにカルボニルシアニド3−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の存在下又は不在下で、又は細胞外Ca2+をキレート化するためにEGTAの存在下又は不在下で、細胞を抗IgM(BCR)又はイオノマイシン(Ion)によって指示時点で刺激した。
図28は、CaV1.4欠損B細胞は、欠陥のあるB細胞受容体媒介活性化を示すことを実証する。野生型(+/+、青線)及びCacna1f−/−(−/−、赤線)脾細胞は刺激しないでおいた(灰色)か、指示濃度の抗IgM、抗CD40又はLPSで24時間刺激し、B220、CD69(A)及びCD86(B)抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。括弧に入れた線の上の数字は、表面マーカーを上方制御した脾臓B細胞(B220+)の百分率を表す。
図29は、CaV1.4欠損B細胞は、低減されたB細胞受容体誘導増殖を示すことを実証する。野生型(+/+、青線)及びCacna1f−/−(−/−、赤線)のCFSE標識脾細胞は刺激しないでおいた(灰色)か、指示濃度の抗IgM又はLPSで72時間刺激し、次にB220抗体で表面染色し、フローサイトメトリーによって分析した。括弧に入れた線の上の数字は、分裂細胞の百分率を表す。
図30は、Cav1.4欠損脾臓B細胞は、B細胞活性化因子(BAFF)受容体の低減された発現及びBAFFに応じたより低い生存率を示すことを実証する。A.野生型(+/+、黒色)及びCacna1f−/−(−/−、灰色)マウスからの全B220+脾臓B細胞及び脾臓B細胞サブセットでのBAFF受容体の表面発現のフローサイトメトリー分析。B細胞集団は、以下の通りに定義した:移行性T1 B細胞、B220+IgM+CD21−CD23−;移行性T2 B細胞、B220+IgM+CD21+CD23+;小胞B細胞、B220+IgMloCD21mid;及び辺縁帯B細胞、B220+IgM+CD21+CD23−。B.野生型(+/+、青線)及びCacna1f−/−(−/−、赤線)マウスからの精製脾臓B細胞を、組換え体マウスBAFFの指示濃度の存在下又は不在下で72時間培養し、次にヨウ化プロピジウムで染色した。生細胞(ヨウ化プロピジウム陰性細胞)の百分率を、フローサイトメトリーによって評価した。*p<0.05及び**p<0.01。
図31は、CaV1.4欠損マウスは、TNP−フィコール、T細胞非依存性2型抗原による免疫化の後、抗体応答の障害を発生させることを実証する。野生型(n=5)及びCacna1f−/−(n=5)マウスにTNP−フィコールを腹腔内に注入し、免疫化の後に導き出された特異的抗体のレベルをELISAによって判断した。免疫化から0日目(野生型、+/+黒線;Cacna1f−/−、−/−灰色線)及び7日目(野生型、+/+青線;Cacna1f−/−、−/−赤線)の、TNP特異的抗IgM(A)及び抗IgG3(B)抗体応答。
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Claims (26)
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- 細胞がリンパ系の造血細胞である、請求項1に記載の使用。
- 細胞がT細胞である、請求項1に記載の使用。
- 細胞の機能がT細胞成熟を含む、請求項3に記載の使用。
- 細胞の機能が抗原結合を含む、請求項3に記載の使用。
- 細胞がB細胞である、請求項1に記載の使用。
- 細胞の機能がB細胞成熟を含む、請求項6に記載の使用。
- 細胞の機能がBCRによって誘導される活性化を含む、請求項6に記載の使用。
- 作用物質が抗体である、請求項1から8までのいずれか一項に記載の使用。
- 治療剤をスクリーニングするインビトロの方法であって、
− CaV1.4スプライス変異体を発現する造血細胞を、抗体又はアプタマーである試験作用物質と接触させるステップと、
− 試験作用物質がCaV1.4スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップと
を含み、CaV1.4スプライス変異体の活性をモジュレートする試験作用物質が治療剤として同定される上記方法。 - 造血細胞がリンパ系のものである、請求項10に記載の方法。
- 試験作用物質がCaV1.4スプライス変異体の外部ドメインに結合することが可能な作用物質である、請求項10又は11に記載の方法。
- 試験作用物質が抗体である、請求項10から12までのいずれか一項に記載の方法。
- T細胞で発現するCaV1.4スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する抗体又はアプタマーである作用物質の、T細胞機能を阻害するためのインビトロでの使用。
- T細胞機能がT細胞成熟を含む、請求項14に記載の使用。
- T細胞機能が抗原結合を含む、請求項14に記載の使用。
- B細胞で発現するCaV1.4スプライス変異体の外部ドメインに特異的に結合する抗体又はアプタマーである作用物質の、B細胞機能を阻害するためのインビトロでの使用。
- B細胞機能がB細胞成熟を含む、請求項17に記載の使用。
- B細胞機能がBCRによって誘導される活性化を含む、請求項17に記載の使用。
- 作用物質が抗体である、請求項14から19までのいずれか一項に記載の使用。
- 対象において免疫応答を抑制するための医薬の製造における、抗体又はアプタマーであるCaV1.4阻害剤の使用であって、CaV1.4阻害剤がT細胞及び/又はB細胞で発現するCaV1.4スプライス変異体の外部ドメインに結合する上記使用。
- 阻害剤が抗体である、請求項21に記載の使用。
- 免疫抑制剤をスクリーニングするインビトロの方法であって、
− CaV1.4スプライス変異体を発現するT細胞及び/又はB細胞を、抗体又はアプタマーである試験作用物質と接触させるステップと、
− 試験作用物質がCaV1.4スプライス変異体の活性をモジュレートするかどうか判定するステップと
を含み、CaV1.4スプライス変異体の活性を阻害する試験作用物質が免疫抑制剤として同定される上記方法。 - 試験作用物質がCaV1.4スプライス変異体の外部ドメインに結合することが可能な作用物質である、請求項23に記載の方法。
- 試験作用物質が抗体である、請求項23又は24に記載の方法。
- 対象が自己免疫疾患を有する、請求項21に記載の使用。
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