CN103957936B - 用于调控电压门控钙通道功能的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供靶向电压门控钙通道的治疗剂和包含所述治疗剂的组合物，以及所述药剂和组合物用以调控表达所述电压门控钙通道的造血细胞的功能的用途。本发明还提供筛选药剂的方法，所述药剂靶向给定电压门控钙通道且适用于作为治疗剂用以调控表达所述经靶向电压门控钙通道的细胞的活性。所述药剂可为(例如)能够结合到所述靶电压门控钙通道的胞外结构域且因此能够调控所述钙通道的功能的抗体、适体、肽或小分子。

Description

用于调控电压门控钙通道功能的方法和组合物

技术领域

本发明涉及治疗剂领域，且具体来说涉及调控造血细胞中的电压门控钙通道(Ca_V)功能的治疗剂和其筛选方法。

背景技术

钙(Ca²⁺)离子在几乎所有细胞类型中充当通用的第二信使。电压门控钙(Ca_V)通道在各种细胞类型中引导Ca²⁺且由包含成孔α1亚单元以及至少α2-亚单元、δ-亚单元、γ-亚单元和β-亚单元的复合物组成。现在已知Ca_V通道存在于许多不是传统上认为可应激的细胞中，包括各种造血细胞。

在哺乳动物中，已基于电生理学和药理学性质将10个Ca_V家族成员分成5个类别(L、P或Q、N、R、T)，每一者可能服务于不同的细胞信号传导途径。

已经对L型(长时程)Ca_V通道在小鼠和人类T细胞中的表达和功能进行了描述(库特瑞(Kotturi)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278：46949-46960(2003)；库特瑞和杰弗里斯(Jefferies)，分子免疫学(Mol.Immunol.)42：1461-1474(2005))。已知L型Ca_V通道的四种亚型：Ca_V1.1、Ca_V1.2、Ca_V1.3和Ca_V1.4。已报导各种造血细胞中的L型Ca_V通道(关于评论，参见铃木(Suzuki)等人，分子免疫学(Molec.Immunol.)47：640-648(2010))。

已经鉴别出Ca_V1.4(一种由Cacnalf编码的α1Ca²⁺通道亚单元)在啮齿动物和人类的视网膜、脾脏、胸腺、肾上腺、脊髓、骨髓、骨骼肌和T细胞中表达(巴杜(Badou)等人，美国国家科学院院刊(PNASUSA)103：15529-15534(2006)；杰哈(Jha)等人，自然.免疫学(Nat.Immunol.)10：1275-1282(2009)；库特瑞等人，2003，如前所述；库特瑞和杰弗里斯，2005，如前所述；麦克洛瑞(McRory)等人，神经科学杂志(J.Neurosci.)24：1707-1718(2004))。

已知钙信号传导在获得性免疫中起到重要作用。还不清楚调节持续的Ca²⁺进入T细胞的质膜通道的特性和数量(库特瑞等人，药物科学趋势(TrendsPharmacol.Sci.)27：360-367(2006))。一种已经充分表征的进入机制是通过Ca²⁺释放激活钙(CRAC)通道(欧.奥拉(Oh-hora)，免疫学评论(Immunol.Rev.)231：210-224(2009))。在淋巴细胞中操作的其它候选质膜Ca²⁺通道包括P2X受体、瞬时受体电位(TRP)阳离子通道、TRP辣椒素通道、TRP麦勒他汀(melastatin)通道和电压依赖性Ca²⁺通道(VDCC)。

已在人类T淋巴细胞中鉴别出Ca_V1.4钙通道的两种剪接变体(库特瑞和杰弗里斯，2005，如前所述)。已经描述初始型CD8⁺T淋巴细胞在缺少Ca_V通道的β3亚单元下的缺陷性存活且此缺陷与Ca_V1.4亚单元的耗尽相关联(杰哈等人，2009，如前所述)。

提供此背景信息是出于使申请者所认定的已知信息与本发明具有可能的相关性的目的。任何在前的信息均不应被理解为或者解释为对抗本发明的现有技术。

发明内容

本发明的目标是提供用于调控电压门控钙通道功能的方法和组合物。根据本发明的一个方面，提供用于调控表达电压门控钙通道的细胞的功能的方法，其包含使所述细胞与特异性结合到所述电压门控钙通道的药剂接触，其中所述药剂到所述电压门控钙通道的结合调控所述通道的活性且其中所述细胞是造血细胞。

根据本发明的另一方面，提供用于调控表达Ca_V1剪接变体的细胞的活性的方法，其包含使所述细胞与特异性结合到所述Ca_V1剪接变体的胞外结构域的药剂接触，其中所述药剂到所述Ca_V1剪接变体的结合调控所述Ca_V1剪接变体的活性且其中所述细胞是造血细胞。

根据本发明的另一方面，提供调控个体中的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的电压门控钙通道调控剂，其中所述调控剂结合到在造血细胞中表达的电压门控钙通道。

根据本发明的另一方面，提供调控个体中的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的Ca_V1调控剂，其中所述Ca_V1调控剂结合到在造血细胞中表达的Ca_V1剪接变体的胞外结构域。

根据本发明的另一方面，提供筛选治疗剂的方法，其包含以下步骤：使表达电压门控钙通道的造血细胞与测试药剂接触，以及测定所述测试药剂是否调控所述通道的活性，其中将调控所述通道的活性的测试药剂鉴别为治疗剂。

根据本发明的另一方面，提供筛选治疗剂的方法，其包含以下步骤：使表达Ca_V1剪接变体的造血细胞与测试药剂接触，以及测定所述测试药剂是否调控所述Ca_V1剪接变体的活性，其中将调控所述Ca_V1剪接变体的活性的测试药剂鉴别为治疗剂。

根据本发明的另一方面，提供特异性结合到在造血细胞(包括淋巴或骨髓系的细胞)中表达的电压门控钙通道的胞外结构域以调控细胞功能的药剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供特异性结合到在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域以调控T细胞功能的药剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供阻抑个体中的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的Ca_V1.4抑制剂，其中所述Ca_V1.4抑制剂结合到在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域。

根据本发明的另一方面，提供特异性结合到在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域以调控B细胞功能的药剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供阻抑个体中的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的Ca_V1.4抑制剂，其中所述Ca_V1.4抑制剂结合到在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域。

根据本发明的另一方面，提供筛选免疫阻抑剂的方法，其包含以下步骤：使表达Ca_V1.4剪接变体的T细胞与测试药剂接触，以及测定所述测试药剂是否调控所述Ca_V1.4剪接变体的活性，其中将抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性的测试药剂鉴别为免疫阻抑剂。

根据本发明的另一方面，提供筛选免疫阻抑剂的方法，其包含以下步骤：使表达Ca_V1.4剪接变体的B细胞与测试药剂接触，以及测定所述测试药剂是否调控所述Ca_V1.4剪接变体的活性，其中将抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性的测试药剂鉴别为免疫阻抑剂。

根据本发明的另一方面，提供调控个体中的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的电压门控钙通道调控剂，其中所述调控剂结合到在造血细胞中表达的电压门控钙通道。

附图说明

在下文说明详细中参照随附图，本发明的这些和其它特征将变得更显而易见。

图1.CacnalfmRNA的表达。(A)野生型CacnalfmRNA在淋巴组织以及CD4⁺和CD8⁺T细胞中的表达的检测。(B)通过RT-PCR分析证实Cacnalf基因的破坏，在Cacnalf^-/-(-/-)的Cacnalf胸腺转录物内检测到loxP位点(靶向盒)，而在野生型(+/+)小鼠中未检测到。通过RT-PCR检测S15转录物用作样品加载对照。

图2.Ca_V1.4缺乏导致细微胸腺发育缺陷、CD4⁺和CD8⁺T细胞淋巴细胞减少以及自发的T细胞免疫激活。(A)WT(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)脾细胞的全细胞提取物中的Ca_V1.4蛋白的免疫墨点分析。使用Weri视网膜母细胞瘤细胞作为Ca_V1.4-表达阳性对照。提供GAPDHAb染色作为样品加载的对照。(B)将WT和Cacnalf^-/-脾T细胞上的表面蛋白生物素化并利用抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒进行免疫沉淀。相等量的蛋白质利用Ca_V1.4Ab进行墨点分析。同一墨点上的非特异性低分子大小条带用于证实等量加载。(C)Cacnalf^厂胸腺表达减少部分的成熟SP胸腺细胞，通过针对TCRβ^hi和CD24^lo细胞的电子门控所测定(百分数展示在等值线图上的矩形门内)。(D)Ca_V1.4缺乏使CD4⁺对CD8⁺SP胸腺细胞的比例减小。(E)WT(n＝6)和突变(n＝7)小鼠中存在的各种胸腺亚群的丰度是通过用CD4和CD8Ab染色来测定。(F)Cacnalf^-/-小鼠的外周淋巴器官(包括脾脏、淋巴结(LN)和血液)显示CD4⁺对CD8⁺T细胞的异常比率。在密度图内展示每一象限内驻留的细胞的百分数。(G)Cacnalf^-/-小鼠的脾脏与WT相比展现极大地减少的T细胞(n≥6)和B细胞(n＝3)数量。y轴为对数标尺。(H)急性激活和T细胞记忆的脾Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞表达标志物。误差棒代表SD。^**p＜0.01。

图3.标志物在胸腺细胞群上的表达。在野生型(灰色阴影)和Cacnalf^-/-(细黑色线)DP和成熟(TCRβ^hi)SP胸腺细胞亚群上表达的CD44、CD62L、TCRβ和CD69的数量。

图4.Cacnalf^-/-(-/-)小鼠的淋巴结(轴向淋巴结、臂淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结的集合)与相比野生型(+/+)展现极大地减少的T细胞(n≥6)和B细胞(n＝3)细胞构成。误差棒代表SD。^**p＜0.01；^***p＜0.001。

图5.Cav1.4是初始型T细胞的TCR和毒胡萝卜内酯诱导的胞质内游离Ca²⁺的升高二者非常必需的。将WT(+/+；红色线)和Cacnalf^-/-(-/-；蓝色线)脾细胞加载Ca²⁺指示剂染料富洛4(Fluo-4)和富拉红(Fura-Red)，进行表面染色并悬浮于RPMI中。为最小化染料加载样品中的变化的影响，将细胞内Ca²⁺量以富洛4/富拉红(FL-1/FL-3)随时间的中值比绘制曲线。(A)用于辨别CD44^lo和CD44^hiCD4⁺以及CD8⁺T细胞的电子门控(框区)指示于等值线图内。(B)脾细胞用毒胡萝卜内酯(Tg)刺激并通过在所指示时间点添加的EGTA螯合细胞外Ca²⁺。(C)在所指示时间(由箭头标示)下将用生物素化TCRAb预涂布的脾T细胞用抗生蛋白链菌素(SA)或离子霉素(Im)处理。(D)在不存在游离细胞外Ca²⁺下执行TCR刺激。向细胞悬浮液中添加足够的EGTA(0.5mM)以螯合RPMI中的细胞外Ca²⁺(约0.4mMCa²⁺)，此阻断细胞摄取。

图6.Ca_V1.4是在Ca²⁺限制期间TCR诱导的胞质内游离Ca²⁺的升高所必需的。(A)将加载有钙指示剂染料富洛4和富拉红并悬浮于RPMI中的野生型(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)胸腺细胞(总体)在存在足以螯合RPMI中存在的Ca²⁺(约0.4mM)的细胞外EGTA(0.5mM)或不存在细胞外EGTA下用毒胡萝卜内酯(thapsigargin，Thapsi)刺激。为最小化染料加载样品中的变化的影响，细胞溶质Ca²⁺的量以FL-1/FL-3随时间的比率绘制曲线。在所指示时间点下，在刺激的中途添加细胞外Ca²⁺(0.5mM)或EGTA(0.5mM)。(B)将经CD4和CD8Ab染色用于辨别胸腺亚群的富洛4/富拉红标记的胸腺细胞在存在和不存在细胞外EGTA(0.5mM)下用TCRAb激活。在第二次刺激的中途时，将细胞外Ca²⁺(0.5mM)或离子霉素(1μg/mL)添加到样品中。

图7.L型Ca_V1.4通道调介Ca²⁺进入穿过初始型T细胞的质膜。(A)呈现在TCR激活后针对WT(+/+，n＝7)和Cacnalf^-/-(-/-；n＝5)CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞记录的样品的内向钡电流迹线。细胞以500ms阶跃脉冲从-80mV的保持电位去极化到+10mV。虚线指示电流测量的基线。(B)在+10mV下在WT与Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺以及CD8⁺T细胞之间的电流密度比较。将每一细胞的电流值正规化成电容值。(C)在+10mV下在未经处理的WTCD44^loT细胞(CD4⁺T细胞，n＝8；CD8⁺T细胞，n＝8)与那些利用胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元Ab(CD4⁺T细胞：n＝7；CD8⁺T细胞，n＝6)预处理的细胞之间的电流密度比较。(D)胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元Ab免疫沉淀Ca_V1.4。利用胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元Ab对WT和Cacnalf^-/-脾细胞提取物执行免疫沉淀，随后用Ca_V1.4特异性Ab进行墨点分析(参见实验程序)。同一墨点上的非特异性低分子大小条带用于验证等量加载。(E和F)利用斜坡脉冲方案获得WTCD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞在TCR激活后的样品I-V关系。出于显示目的，已将电流迹线经滤波到1kHz。(E)中的顶部插图展示在200ms内从-80mV的保持电位跨越-130mV到70mV的范围的斜坡脉冲方案。(E)和(F)中的实线指示全细胞I-V关系利用修改的玻尔兹曼方程(Boltzmannequation)I＝G(V-E_rev)/(1+exp((V_a-V)/S))的拟合，其中I是峰值电流幅值，G是最大的斜率电导，V是测试电位，E_rev是反转电位，V_a是半激活电位，且S是斜率因子。(E)和(F)中的底部插图代表从WTCD44^loCD4⁺(n＝5)和CD8⁺(n＝5)T细胞获得的经正规化I-V关系的平均值。(G和H)利用上述斜坡脉冲方案测定Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺(n＝6)和CD8⁺(n＝6)T细胞的样品I-V关系。误差棒代表SEM。^*p＜0.05。

图8.Ca_V1.4功能调节Ras-ERK激活和NFAT动员。(A)利用RAF-1-GST拉下实验(pull-downassay)测量WT(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)胸腺细胞在用TCRAb或DAG类似物PMA刺激后的经激活Ras。将全细胞溶解产物(WCL)针对总Ras进行免疫墨点分析以验证等量蛋白质表达。(B)总体胸腺细胞用TCRAb刺激达所指示时期。通过免疫墨点法测量ERK和JNKMAP激酶的磷酸化。利用奥德赛(Odyssey)软件量化条带强度并计算磷酸-ERK2/ERK2、磷酸-JNK1/JNK1的比率。未经刺激的WT胸腺细胞任意地给定1的分数。(C)为评价特定胸腺亚群中的ERK信号传导，经由流式细胞术测定WT和Cacnalf^-/-胸腺细胞在用TCRAb或PMA处理来刺激达2分钟之后的ERK激活。未经刺激(灰色)、经TCR刺激(黑色)和经PMA处理(粗体)细胞的平均荧光强度(MFI)展示在每一柱状图内。(D)将来自WT和Cacnalf^-/-小鼠的胸腺细胞与CD3和CD28Ab或仅培养基一起培育16小时。在核和细胞质碎片和全细胞溶解产物(WCL)上执行NFATc1的免疫墨点法。检测磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)或组蛋白脱乙酰基酶-1(HDAC1)作为加载对照。对条带强度进行量化并如上计算比率。

图9.T细胞对Ca_V1.4功能的固有需求是正常T细胞内稳态所需的。将经辐照的受体宿主(Thy1.2⁺Ly5.1⁺)用Cacnalf^-/-(-/-；Thy1.2⁺Ly5.2⁺)和野生型(+/+；Thy1.1⁺Ly5.2⁺)骨髓以1∶1比率重构。(A)评价Ly5.2⁺细胞在胸腺和脾脏中的起源(顶部图板)。与野生型细胞(Thy1.1门)相比，Cacnalf^-/-细胞(Thy1.2门)展示受体小鼠的存活降低。使用Thy1标志物，鉴别供体淋巴细胞并测定CD4⁺和CD8⁺T细胞的相对比例(中间和底部图板)。在密度图内展示每一象限内驻留的细胞的百分数。(B)供体野生型T细胞对骨髓转移1个月后的宿主小鼠的胸腺、脾脏中存在的突变T细胞的百分数(n＝5)。误差棒代表SD。^***p＜0.001。(C)展示供体淋巴细胞群中的CD44^lo以及CD44^hiCD4⁺和CD8⁺T细胞的相对比例。在密度图内展示每一象限内驻留的细胞的百分数。

图10.Ca_V1.4是初始型T细胞内稳态的重要调节剂。(A)CD44在来自WT(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)小鼠的脾CD4⁺TCRβ⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞上的表达。(B)Cacnalf^-/-小鼠展现CD44^loCD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞的明显减少。(C)Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞展示自发性细胞凋亡的比率增加。(D)CD62L在CD44^loCD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞上的表达。(E)Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞表达减小量的IL-7Ra。(F)由CD44^loCD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞表达的Bcl-2是通过细胞内流式细胞术测量。误差棒代表SD。

图11.(A)Cacnalf^-/-(-/-)CD4⁺TCRβ^hi和CD8⁺TCRβ^hiSP胸腺细胞相对于野生型(+/+)展示自发性细胞凋亡的比率增加。展示在所指示门内存在的细胞的百分数。(B)野生型(灰色阴影)和Cacnalf^-/-(细黑色线)CD4⁺TCRβ^hi和CD8⁺TCRβ^hiSP胸腺细胞上的CD127的量。在柱状图内展示野生型(顶部)和突变群(底部)的平均荧光强度。

图12.Ca_V1.4促进存活信号传导和内稳态诱导的T细胞扩增。(A)将WT(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)胸腺细胞用所指示浓度的IL-7刺激5分钟且随后针对磷酸化STAT5的能力进行评价。通过流式细胞术测定磷酸-STAT5阳性成熟CD4⁺和CD8⁺SP胸腺细胞的频率。(B)通过细胞分选纯化WT(Thy1.1⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.1^-)初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞(如图5A中所示的以电子方式门控(CD44^lo))，以1∶1∶1∶1比率混合并与所指示浓度的IL-7一起培育。培育24小时之后，通过用偶联到Alexa647的膜联蛋白(Annexin)V染色来测定细胞存活。(C)将WT和突变初始型T细胞分离，准备，并如(B)中一样培养，只是用TCRAb而非IL-7刺激。离体培养24小时后评价生存力。(DF)将来自WT(Thy1.1⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.1^-)小鼠的初始型T细胞纯化，以1∶1∶1∶1比率混合，经CFSE标记，并共同注射到Rag1^-/-宿主中。(D)展示注射之前WT和Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞的百分数。(E)CFSE稀释指示转移T细胞的增殖。点图内的框区域指示由自身-MHC分子和IL-7(内稳态)驱动的增殖。(F)柱状图指示WT和突变供体CD4⁺和CD8⁺T细胞的内稳态增殖。

图13.Ca_V1.4是最优化抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫应答非常必需的。用重组单核细胞增多性利斯特菌(L.monocytogenes)-OVA转染后7天，将WT(+/+)和Cacnalf^-/-(-/-)小鼠处死并评价抗原特异性T细胞免疫应答。(A)在密度图内展示CD8⁺T细胞群中CD44⁺H-2K^b-OVA四聚体⁺细胞的百分数。(B)代表抗原特异性CD44⁺CD8⁺T细胞的平均数(n＝3)。(C和D)将来自感染小鼠的脾细胞用MHCI类(OVA_257-264)和MHCII类(LLO_190-201)-限制肽刺激且随后针对IFN-γ分泌进行分析。为测定能够分泌IFN-γ的T细胞的频率，脾细胞单独地仅用TCRAb刺激。密度图内的数值代表分泌IFN-γ的CD4⁺或CD8⁺T细胞的百分数。(E)累积数据指示WT和Cacnalf^-/-小鼠(n＝3)中抗原特异性产生IFN-γ的T细胞的平均数。(F)将来自感染小鼠的脾脏的CD8⁺T细胞纯化并与未经处理或经OVA_257-264肽脉冲处理的⁵¹Cr标记的RMA-S靶一起培育。误差棒代表SD。^*p＝0.05；^***p＜0.001。

图14.Ca_V1利用阻断抗体进行抑制使细胞存活减小。将C57Bl/6脾细胞在有(+Ca_V1)或没有(-Ca_V1)Ca_V1抗体的情况下培育。24小时之后，通过用膜联蛋白V染色评价生存力。将存活指数计算为膜联蛋白V阴性细胞对膜联蛋白V阳性细胞的比率。误差棒代表SD。^*p＜0.05；^**p＜0.01。

图15.Ca_V1利用阻断抗体进行抑制使得CD8⁺和CD4⁺T细胞增殖减小。C57Bl/6脾细胞用CFSE标记并利用板结合CD3ε(20μg/ml)和CD28(5μg/ml)抗体在有(+Ca_V1)或没有(-Ca_V1)Ca_V1抗体的情况下激活5天。通过CFSE稀释评价增殖。数值代表增殖细胞百分数。

图16呈现人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1F(Ca_V1.4)(基因库(GenBank)登录号NP_005174)的氨基酸序列。

图17呈现人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1F剪接变体(Ca_V1.4a)的核苷酸序列。

图18呈现人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1F剪接变体(Ca_V1.4b)的核苷酸序列。

图19呈现(A)Ca_V1.4a剪接变体和(B)Ca_V1.4b剪接变体的预计膜拓扑的示意性表示。

图20呈现人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1F剪接变体(Ca_V1.4a)的氨基酸序列。

图21呈现人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1F剪接变体(Ca_V1.4b)的氨基酸序列。

图22.Ca_V1.4缺乏的小鼠展示骨髓中正常B淋巴细胞发育。

图23.Ca_V1.4缺乏的小鼠展示改变的脾B淋巴细胞成熟。

图24.Cav1.4缺乏导致改变的腹膜腔B细胞区室。

图25.细胞固有的Cav1.4功能是正常B细胞发育所必需的。

图26.Ca_V1.4缺乏导致B细胞中受损的B细胞受体和毒胡萝卜内酯诱导的Ca²⁺应答。

图27.Cav1.4缺乏导致受损的B细胞受体诱导的线粒体Ca²⁺应答。

图28.Ca_V1.4缺乏的B细胞展示缺陷性B细胞受体介导的激活。

图29.Ca_V1.4缺乏的B细胞展示减少的B细胞受体诱导的增殖。

图30.Cav1.4缺乏的脾B细胞展示B细胞激活因子(BAFF)受体的减少的表达和响应BAFF的较低的存活率。

图31.Ca_V1.4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(Ficoll)(一种T细胞非依赖性2型抗原)免疫后产生受损的抗体应答。

具体实施方式

本发明涉及本文所描述的以下发现：调控电压门控钙通道(例如L型钙通道α1亚单元(Ca_V1))的活性和/或表达可修饰表达所述通道的细胞的活性。由于不同的细胞类型表达不同类型的电压门控钙通道，因此药剂可经设计以靶向由所关注的细胞类型表达的电压门控钙通道且可用于特定地调控这些细胞的活性。举例来说，由于不同的细胞类型表达Ca_V1的不同亚型和剪接形式，因此药剂可经设计以靶向由所关注的细胞类型表达的剪接变体且可用于特定地调控这些细胞的活性。

电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1通道)可利用结合到钙通道的胞外结构域的药剂靶向以调控所述钙通道的功能，且因此修饰表达所述通道的细胞的活性。因此，在某些实施例中，本发明提供靶向电压门控钙通道的胞外结构域的药剂和所述药剂用以调控表达电压门控钙通道的细胞的功能的用途。举例来说，在某些实施例中，本发明提供靶向Ca_V1剪接变体的胞外结构域的药剂和所述药剂用以调控表达所靶向剪接变体的细胞的功能的用途。本发明的某些实施例还提供筛选药剂的方法，所述药剂靶向给定电压门控钙通道且适于作为治疗剂用以调控表达所述钙通道的细胞的活性。举例来说，在本发明的某些实施例中提供筛选药剂的方法，所述药剂靶向给定Ca_V1剪接变体(“Ca_V1调控剂”)且适于作为治疗剂用以调控表达所靶向剪接变体的细胞的活性。药剂可为(例如)能够结合到所述靶电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1剪接变体)的胞外结构域且因此调控所述钙通道的功能的抗体、适体或小分子。在某些实施例中，所述方法、用途和组合物涉及在造血细胞(例如T细胞、B细胞、肥大细胞和/或自然杀伤细胞)中表达的电压门控钙通道。在某些实施例中，所述方法、用途和组合物涉及在造血细胞(例如T细胞和/或B细胞)中表达的Ca_V1剪接变体。

以实例的方式，在某些实施例中，本发明提供靶向在T细胞中表达的Ca_V1剪接变体(例如Ca_V1.4)的胞外结构域的药剂和此药剂用于调控T细胞活性的用途。在其它实施例中，本发明提供靶向在B细胞中表达的Ca_V1剪接变体(例如Ca_V1.4)的胞外结构域的药剂和此药剂用于调控B细胞的活性的用途。

靶向在一种或一种以上类型的造血细胞(包括(但不限于)淋巴细胞(B细胞、T细胞和自然杀伤细胞)、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)中表达的电压门控钙通道且抑制所述通道的活性的药剂可用作(例如)免疫阻抑剂，所述免疫阻抑剂已发现在(例如)在治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险和在治疗其它需要阻抑免疫系统的病症(例如治疗过敏)中的应用。举例来说，靶向在T细胞和/或B细胞中表达的Ca_V1剪接变体的胞外结构域且抑制所述通道的活性的药剂可用作(例如)免疫阻抑剂，所述免疫阻抑剂已发现在(例如)治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险和在治疗其它需要阻抑免疫系统的病症中的应用。在另一实例中，靶向并抑制在肥大细胞中表达的电压门控钙通道的药剂可抑制肥大细胞脱粒且因此可用于治疗过敏。

在某些其它实施例中，提供用以刺激电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1通道)的活性的药剂和方法。所述药剂和方法可用于治疗癌症和/或治疗免疫阻抑。

在某些其它实施例中，提供增加或降低电压门控通道在细胞中的表达的药剂和方法。举例来说，可使用表达电压门控通道(包括(但不限于)Ca_V1通道)的多核苷酸和包含这些多核苷酸的载体用以增加Ca_V1通道的表达。

或者，可使用对电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1通道)表达反义寡核苷酸特异性的多核苷酸用以降低所述通道的表达。

定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解含义相同的含义。

本文参照Ca_V1剪接变体所使用的术语“抗体”是指特异性结合到Ca_V1剪接变体或以免疫方式与其反应的免疫球蛋白分子(或其组合)，且其包括抗体的多克隆、单克隆、基因改造和以其它方式修饰的形式，包括(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、异源偶联抗体(例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)、单链Fv抗体(scFv)、至少含有免疫球蛋白的足以将特异性抗原结合赋予Ca_V1剪接变体的部分的多肽和抗体的抗原结合片段。抗体片段包括蛋白水解抗体片段(例如F(ab′)2片段、Fab′片段、Fab′-SH片段、Fab片段、Fv和rIgG)、重组抗体片段(例如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、双抗体和三抗体)、互补性决定区(CDR)片段，骆驼抗体(参见(例如)美国专利第6,015,695号；第6,005,079号；第5,874,541号；第5,840,526号；第5,800,988号；和第5,759,808号)和由软骨和硬骨鱼类产生的抗体以及其分离的结合结构域(参见(例如)国际专利申请公开案第WO03014161号)。

本文所用的术语“嵌合抗体”是指包含来自一种宿主物种的所有或一部分的可变区连接到来自另一宿主物种的恒定区的至少一部分的多肽。

本文所用的术语“人源化抗体”是指包含人类抗体的经修饰可变区的多肽，其中所述可变区的一部分已经来自非人类物种的对应序列取代且其中所述经修饰可变区连接到人类抗体的恒定区的至少一部分。在一个实施例中，所述可变区的所述部分是所有或一部分的互补性决定区(CDR)。所述术语还包括通过将非人类抗体的可变区或一个或一个以上CDR用异源蛋白剪接产生的杂交抗体，无论物种起源、蛋白质类型、免疫球蛋白类别或亚类的名称如何，只要杂交抗体展现所要的生物活性(即，特异性结合Ca_V1蛋白质的能力)即可。

本文所用的术语“双特异性抗体”是指包含具有针对一个抗原位点的特异性的第一臂和具有针对不同的抗原位点的特异性的第二臂的抗体，即，双功能抗体具有双重特异性。

本文所用的术语“抑制”意指降低或阻止给定活性或功能。根据本发明的某些实施例，当在药剂的存在下产生的活性或功能的水平与在不存在所述药剂下的所述水平相比降低至少10％时，那么认为所述药剂抑制所述活性或功能。在一些实施例中，当在药剂的存在下产生的活性或功能的水平与在不存在所述药剂下的所述水平相比降低至少20％(例如至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％或至少80％)时，那么认为所述药剂抑制所述活性或功能。

术语“疗法”和“治疗”在本文中可互换使用，是指所执行具有改良个体的状态的目的的干预。改良可为主观的或客观的且涉及改善与所治疗疾病相关联的症状、预防所治疗疾病的发展或改变所治疗疾病的病理。因此，术语疗法和治疗以最广泛意义使用，且包括预防(预防性)、缓解、减少和治愈处于各个阶段的疾病。所述术语也涵盖预防个体的状态的恶化。因此，需要疗法/治疗的个体包括那些已经患有疾病的个体以及那些易于或处于发展疾病的个体和那些打算预防疾病的个体。

术语“改善”包括阻止、预防、降低或改良所治疗疾病或病症的症状、征象和特征中的一者或一者以上，无论是暂时地还是长期的。

本文所用的术语“个体”和“患者”是指需要治疗的动物，例如哺乳动物或人类。

本文所用的术语“约”是指从给定值变化大约+/-10％。应了解，无论是否特别指出，此变化总是包括在本文所提供的任何给定值中。

当在本文中介词“一(a或an)”与术语“包含”组合使用时，介词“一”的使用可意指“一个”，但也与“一个或一个以上”、“至少一个”和“一个或一个以上”的意义一致。

本文所用的词语“包含(comprising)”(和其语法变异，例如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(和其语法变异，例如“have”和“has”)、“包括(including)”(和其语法变异，例如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(和其语法变异，例如“contains”和“contain”)是包括式的和开放式的且并不排除额外的、未列举的元件或方法步骤。

预期本文所讨论的任一实施例均可根据本发明的任一方法、用途或组合物来实施，且反之亦然。另外，可使用本发明的组合物来实现本发明的方法和用途。

电压门控钙通道

根据本发明的实施例，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是人类电压依赖性钙通道。根据本发明的某些实施例，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是在造血细胞中表达的人类电压依赖性钙通道。根据本发明的某些实施例，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是人类电压依赖性L型钙通道亚单元α-1(Ca_V1)。电压门控钙通道表达于各种细胞类型中。举例来说，Ca_V1表达于许多不同的组织中，包括视网膜、脾脏、胸腺、肾上腺、脊髓、骨髓和骨骼肌。根据本发明的一个方面，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是在造血细胞(例如来自骨髓系的细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板、肥大细胞和树突细胞)和来自淋巴系的细胞(包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞))中表达的电压门控钙通道，包括(但不限于)Ca_V1剪接变体(例如，Ca_V1.1、Ca_V1.2、Ca_V1.3或Ca_V1.4剪接变体)。

各种电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1的亚型(Ca_V1.1、Ca_V1.2、Ca_V1.3和Ca_V1.4))的氨基酸序列已在所属领域中已知且可从基因库和文献中获得，这些蛋白质的各种剪接形式的氨基酸序列也如此。

举例来说，Ca_V1.4的视网膜形式在基因库中以登录号NP_005174列为参考序列(图16)。已经鉴别出此蛋白质的各种剪接形式，包括Ca_V1.4a和Ca_V1.4b，这些是在T细胞中表达的(库特瑞和杰弗里斯，2005，分子免疫学42：1461-1474)。Ca_V1.4a和Ca_V1.4b的序列在本文中分别作为图20和21提供(还参见图17和18，其分别提供Ca_V1.4a和Ca_V1.4b的核苷酸序列)。

如果在所关注的细胞类型中表达的电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1剪接变体)的序列还是未知的，那么可通过所属领域中已知和各种一般文章中所描述的方法容易地测定(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：ALaboratoryManual)，第3版，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，2001；奥苏贝尔(Ausubel)等人，最新分产生物学实验指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，威立约翰(J.Wiley＆Sons)，纽约(NewYork，NY)，1992(和2000年的增刊)；奥苏贝尔等人，精编分子生物学实验指南：最新分子生物学实验指南的方法汇编(ShortProtocolsinMolecularBiology：ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology)，第4版，威立约翰(Wiley＆Sons)，1999)。举例来说，可使用标准技术从携载所关注的细胞类型的组织产生cDNA文库。或者，可从各个商业供应商(例如克隆技术(Clontech)，加利福尼亚州帕罗奥多(PaloAlto，Ca.)；英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，Ca.))中的一者获得cDNA文库。编码电压门控钙通道(包括(但不限于)所关注的Ca_V1亚型)的序列可通过所属领域中已知的方法分离，例如通过利用PCR扩增和测序技术，例如涉及使用PCR或嵌套式PCR使用来自3’和5’端的共用引物扩增转录物的深度测序。

在某些实施例中，涵盖使用启迪(Illumina)DNA测序技术(启迪公司，加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego，Ca.))来鉴别在所关注的细胞类型中表达的电压门控钙通道，包括(但不限于)Ca_V1剪接变体。此技术提供经由有效且基于目标群的策略用于评价剪接变化的高通量、成本有效的途径。

根据本发明的一个方面，治疗剂靶向Ca_V1剪接变体的胞外结构域。已经预测Ca_V1的拓扑(包括鉴别胞外结构域)(参见(例如)库特瑞等人，(2006)，如前所述和铃木等人，(2010)，如前所述)。

已经鉴别出Ca_V1的某些剪接变体的胞外结构域。举例来说，已经提出的剪接变体Ca_V1.4a和Ca_V1.4b的通道拓扑(库特瑞和杰弗里斯(2005)如前所述)且展示于图19A和B中。

需要时，可通过标准预测计算方法鉴别所选剪接变体的胞外结构域(参见(例如)考利甘(Coligan)等人，最新分子生物学实验指南，约翰威立，纽约)。或者，可通过各种表面映射技术鉴别胞外结构域，例如通过将抗体能够结合到表达Ca_V1剪接变体的未透性化细胞针对来自Ca_V1剪接变体的肽文库进行比较以测定由抗体结合的肽表位，由此鉴别在细胞的表面处发现的剪接变体的序列。

在本发明的某些实施例中，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是在淋巴系的造血细胞(包括T细胞、B细胞和NK细胞)中表达的Ca_V1剪接变体。在一些实施例中，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是在造血细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体。在一些实施例中，用于本文所描述的药剂、用途和方法的靶蛋白是在淋巴系的造血细胞(包括T细胞、B细胞和NK细胞)中表达的Ca_V1.4剪接变体。

治疗剂

本发明的一个方面提供调控电压门控钙通道的表达或活性的治疗剂。在某些实施例中，提供调控在造血细胞中表达的电压门控钙通道的表达或活性的治疗剂。在某些实施例中，提供调控Ca_V1(“Ca_V1调控剂”)的表达或活性的治疗剂。在某些实施例中，治疗剂结合到Ca_V1并调控其活性。根据某些实施例，治疗剂靶向Ca_V1蛋白的胞外结构域且因此作用于细胞的表面处。适宜治疗剂的实例包括(但不限于)抗体、适体、合成抗体、合成抗体取代物、多肽、肽和小分子治疗剂。在一个实施例中，本发明提供靶向Ca_V1并调控其活性且为“生物制剂”的治疗剂，例如抗体、适体、抑制肽等。在一个实施例中，多核苷酸或载体表达治疗剂，例如抗体、适体、多肽和肽。

在本发明的某些实施例中，治疗剂是抑制电压门控钙通道的活性的药剂。在本发明的某些实施例中，治疗剂是抑制Ca_V1的活性的药剂(“Ca_V1抑制剂”)。这些药剂可结合到Ca_V1并抑制其活性。在本发明的某些实施例中，治疗剂是激活电压门控钙通道的活性的药剂。在一些实施例中，治疗剂是激活Ca_V1的活性的药剂(“Ca_V1激活剂”)。这些药剂可结合到Ca_V1并激活其活性。

在本发明的某些实施例中，治疗剂是选择性结合靶电压门控钙通道的抗体。在本发明的某些实施例中，治疗剂是选择性结合靶Ca_V1剪接变体的抗体。抗体可选择性结合靶Ca_V1剪接变体的胞外结构域。本文所用的术语“选择性结合”是指一种化合物到另一种化合物(例如，抗体到Ca_V1蛋白)的特异性结合，其中如通过标准分析(例如，免疫分析)所测量，结合水平统计学上明显高于分析的背景对照。举例来说，当执行免疫分析时，对照可包括仅含有抗体的反应孔/试管(例如，在不存在靶蛋白下)，其中将抗体在不存在靶蛋白下的反应性(例如，非特异性结合到孔/试管)的量视为背景。

结合可使用所属领域的各种方法标准来测量，包括(但不限于)西方墨点法(Westernblot)、免疫墨点、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(MA)、免疫沉淀法、表面等离子体共振、化学发光法、荧光偏振法、磷光法、免疫组织化学分析、基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱、微细胞计量术、微阵列、显微术、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术。

特异性结合到电压门控钙通道(例如Ca_V1剪接变体)的抗体可通过所属领域已知的各种标准方法来产生。例如，多克隆抗体可通过将Ca_V1剪接变体或其片段投与给适宜的宿主动物(例如兔、小鼠、大鼠等)以诱导产生含有特定针对所投与蛋白质的多克隆抗体的血清来产生。如果需要增加免疫应答，则可视宿主物种而定使用所属领域中已知的各种佐剂，且包括(但不限于)弗氏(Freund)佐剂(完全和不完全)、矿物胶(氢氧化铝、表面活性物质(例如溶血卵磷脂)、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔戚血蓝素(keyholelimpethemocyanin)、二硝基苯酚、BCG(卡介苗，bacilleCalmette-Guerin)和短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)。

单克隆抗体可通过(例如)使用杂交瘤、重组或噬菌体显示技术或其组合来制备。举例来说，单克隆抗体可使用杂交瘤技术来产生，例如在哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratoryManual)，(冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，第2版，1988)；哈默林(Hammerling)等人，在单克隆抗体和T细胞杂交瘤(MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas)563-681(爱思维尔(Elsevier)，纽约(N.Y.)，1981)中所教示的那些。

以实例的方式，小鼠可利用Ca_V1剪接变体或其片段或表达Ca_V1剪接变体或片段的细胞进行免疫。一旦(例如)通过检测特异性针对Ca_V1剪接变体或片段的抗体在小鼠血清中检测到免疫应答，即可收获小鼠脾脏并分离脾细胞。接着通过熟知的技术将脾细胞融合到适宜骨髓瘤细胞。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。接着通过所属领域中已知的方法针对分泌能够结合Ca_V1剪接变体或片段的抗体的细胞分析杂交瘤克隆。一般含有高水平的抗体的腹水可通过将小鼠用阳性杂交瘤克隆。

识别电压门控钙通道(例如Ca_V1剪接变体)的特异性表位的抗体片段可通过已知技术产生。举例来说，可通过使用诸如木瓜蛋白酶(用以产生Fab片段)或胃蛋白酶(用以产生F(ab′)2片段)等酶来使免疫球蛋白分子溶蛋白性裂解来产生Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。

举例来说，抗体也可使用所属领域中已知的各种噬菌体显示方法来产生。在噬菌体显示方法中，功能抗体结构域显示于噬菌体粒子的表面上，所述噬菌体粒子携带编码其的多核苷酸序列。此噬菌体可用于显示从谱型或组合抗体文库(例如人类或鼠可动物)表达的抗原结合结构域。表达结合Ca_V1剪接变体的抗原结合结构域的噬菌体可使用(例如)经标记蛋白或结合或捕获到固体表面或珠粒的片段或蛋白质或片段利用Ca_V1剪接变体或其片段来选择或鉴别。这些方法中所用的噬菌体通常是包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域与Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域重组融合成噬菌体基因III蛋白或基因VIII蛋白。可使用的噬菌体显示方法的实例包括(例如)那些描述于以下中者：布林克曼(Brinkman)等人，免疫法杂志(J.Immunol.Methods)182：41-50(1995)；艾姆斯(Ames)等人，免疫法杂志184：177-186(1995)；凯特波勒(Kettleborough)等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：952-958(1994)；帕斯(Persic)等人，基因(Gene)1879-18(1997)；波顿(Burton)等人，免疫学进展(AdvancesinImmunology)57：191-280(1994)；国际专利申请案第PCT/GB91/01134号；国际专利申请公开案第WO90/02809号；第WO91/10737号、第WO92/01047号、第WO92/18619号、第WO93/11236号、第WO95/15982号和第WO95/20401号；以及美国专利第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号和第5,969,108号。

噬菌体选择之后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生全抗体(包括人类抗体)或所要抗原结合片段，并表达于适当的宿主细胞中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。举例来说，以重组方式产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术描述于国际专利申请公开案第WO92/22324号；马利纳克斯(Mullinax)等人，生物技术(BioTechniques)12(6)：864-869(1992)；沙怀(Sawai)等人，美国生殖免疫学杂志(AJRI)34：26-34(1995)；和贝特尔(Better)等人，科学(Science)240：1041-1043(1988)中。

可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利第4,946,778号和第5,258,498号；休斯顿(Huston)等人，酶学方法(MethodsinEnzymology)203：46-88(1991)；舒(Shu)等人，国家科学院院刊(PNAS)90：7995-7999(1993)；和斯卡拉(Skerra)等人，科学240：1038-1040(1988)中描述的那些。

产生嵌合抗体的方法已为所属领域得知。举例来说，参见莫里森(Morrison)，科学229：1202(1985)；奥伊(Oi)等人，生物技术4：214(1986)；吉利斯(Gillies)等人，免疫法杂志125：191-202(1989)和美国专利第5,807，715号、第4,816,567号和第4,816,397号。

人类化抗体是来自非人类物种抗体的抗体分子，所述非人类物种抗体结合具有来自所述非人类物种的一个或一个以上互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所要抗原。通常，人类框架区中的框架残基将由来自CDR供体抗体的对应残基取代，以改变、优选改良到靶蛋白或蛋白质片段。这些框架取代通过所属领域中熟知的方法来鉴别，例如通过对CDR和框架残基之间的相互作用进行建模以鉴别对结合重要的框架残基并进行序列比较以鉴别具体位置处的不寻常框架残基(参见(例如)美国专利第5,585,089号和赖希曼(Riechmann)等人，自然(Nature)332：323(1988))。抗体可使用所属领域中已知的各种技术来人源化，例如CDR移植(国际专利申请公开案第WO91/09967号和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶饰或表面重塑(帕德兰(Padlan)，分子免疫(MolecularImmunology)28(4/5)：489-498(1991)；斯图德尼奇卡(Studnicka)等人，蛋白质工程(ProteinEngineering)7(6)：805-814(1994)和洛古斯卡(Roguska)等人，国家科学院院刊91：969-973(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。

完全的人类抗体是特别为人类患者的治疗性治疗所需的。人类抗体可通过各种所属领域中已知的方法来制造，包括上述使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体显示方法。还参见美国专利第4,444,887号和第4,716,111号、和国际专利申请公开案第WO98/46645号、第WO98/50433号、第WO98/24893号、第WO98/16654号、第WO96/34096号、第WO96/33735号和第WO91/10741号。

人类抗体也可使用不能表达功能内源性免疫球蛋白但可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。举例来说，人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机地或通过同源性重组引入到小鼠胚胎干细胞中。或者，除人类重链和轻链基因以外，可将人类可变区、恒定区和多变区引入到小鼠胚胎干细胞中。借助人类免疫球蛋白基因座通过同源性重组的引入可使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时无功能。具体来说，JH区的纯合性缺失阻止内源性抗体产生。使经修饰胚胎干细胞扩展并微注射到胚泡中以产生嵌合子小鼠。接着使嵌合子小鼠繁殖以产生表达人类抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常方式利用Ca_V1剪接变体或其片段进行免疫。可使用常规杂交瘤技术从经免疫的转基因小鼠获得针对Ca_V1剪接变体或片段的单克隆抗体。转基因小鼠携载的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此技术可以产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于产生人类抗体的此技术的综述，参见(例如)朗伯格(Lonberg)和胡萨尔(Huszar)，国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)13：65-93(1995)。关于用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的此技术和和用于产生此抗体的方案的详细讨论，参见(例如)国际专利申请公开案第WO98/24893号、第WO92/01047号、第WO96/34096号和第WO96/33735号；欧洲专利第0598877号；美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号和第5,939,598号。另外，可雇佣诸如安根尼克斯公司(Abgenix，Inc.)(加利福尼亚州费利蒙市(Freemont，Ca.))和奥沙普秦(Genpharm)(加利福尼亚州圣荷西(SanJose，Ca.))等公司使用类似于上述的技术来提供针对所选蛋白质的人类抗体。

也可使用称为“引导选择”的技术产生识别所选表位的完全人类抗体。在此方法中，使用所选非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于引导识别同一表位的完全人类抗体的选择(参见杰斯普(Jespers)等人，生物技术(Bio/technology)12：899-903(1988))。

在一些实施例中，本发明涵盖的抗体包括以其它分子不阻止抗体结合到其靶蛋白的方式将所述其它分子共价附着到抗体修饰的衍生物。以实例的方式，抗体衍生物可包括已通过(例如)以下修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生、溶蛋白性裂解或连接到细胞配位体或其它蛋白质。在一些实施例中也涵盖包含包括一个或一个以上非典型氨基酸的抗体的衍生物。

在本发明的某些实施例中，治疗剂是选择性结合Ca_V1剪接变体的胞外结构域的适体。适体可选择性结合Ca_V1剪接变体的胞外结构域。适体包括采取特异性序列依赖性形状且以高亲和性和特异性结合到靶蛋白的单链核酸分子(例如DNA或RNA)。适体的长度通常为100个核苷酸或更少，例如长度为75个核苷酸或更少或50个核苷酸或更少(例如介于约10个与约100个核苷酸之间，或介于约10个与约50个核苷酸之间)。在一些实施例中，适体可为镜像适体(也称为SPIEGELMER^TM)。镜像适体是高亲和性L-对映体核酸(例如，L-核糖或L-2′-脱氧核糖单元)，其与D-寡核苷酸(例如，适体)相比显示高抗酶促降解性。适体和镜像适体的靶结合性质是从寡核苷酸的随机池开始通过活体外选择过程来设计，如(例如)沃特扎卡(Wlotzka)等人，国家科学院院刊99(13)：8898-90(2002)中所描述。

在一些实施例中，适体可为肽适体。肽适体包括在两个末端附着到蛋白质骨架的肽环(例如，其特异性针对Ca_V1剪接变体)。此双重结构约束极大地使肽适体的结合亲和性增加到与那些抗体结合水平相当的水平。可变环长度通常在约8个与约20个氨基酸之间(例如，在约8个与约15个或约8个与约12个氨基酸之间)，且所述骨架是适宜的稳定、可溶、小且无毒的蛋白质。适宜蛋白质的实例包括(但不限于)硫氧化还原蛋白-A、胱抑素(stefin)A三重突变体、绿色荧光蛋白、水蛭抑制剂C(eglinC)或细胞转录因子Sp1。肽适体选择可使用不同的系统进行，例如酵母双杂交系统(例如，Gal4酵母双杂交系统)或LexA相互作用陷阱系统。

在一些实施例中，治疗剂是合成抗体或合成抗体取代物，其二者均可通过所属领域中已知的方法来制备(参见(例如)西度(Sidhu)和费尔乌斯(Fellouse)，自然化学生物学(NatureChemicalBiology)2：682-688(2006))。合成抗体取代物一般是基于肽。

在某些实施例中，治疗剂是结合肽，其可如所属领域中已知可通过(例如)噬菌体显示或酵母双杂交技术来鉴别。

本发明的一些实施例提供为小分子的治疗剂，其可(例如)通过筛选市售组合文库或天然产物文库来获得。

治疗剂可使用标准技术针对其靶向Ca_V1并调控其活性的能力来测试，例如那些在下文中在标题为“筛选治疗剂的方法”的章节中所描述的技术。

本发明的某些实施例提供靶向在淋巴系或骨髓系的造血细胞(例如，B细胞、T细胞或NK细胞)中表达的电压门控钙通道的电压门控钙通道调控剂。本发明的一个实施例提供靶向在淋巴系的造血细胞(例如，B细胞、T细胞或NK细胞)中表达的Ca_V1剪接变体的Ca_V1调控剂。这些调控剂靶向Ca_V1剪接变体的胞外结构域。在某些实施例中，这些治疗剂是Ca_V1抑制剂且发现可用作免疫阻抑剂。在某些其它实施例中，这些治疗剂是在肥大细胞上表达的电压门控钙通道的抑制剂且发现可用于治疗过敏中。

在一些实施例中，本发明提供靶向在淋巴系的造血细胞(例如，B细胞、T细胞或NK细胞)中表达的Ca_V1.4剪接变体的Ca_V1调控剂。这些调控剂可靶向Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域。在某些实施例中，这些治疗剂是Ca_V1.4抑制剂且发现可用作免疫阻抑剂。

还提供医药组合物，其包含结合到Ca_V1并调控其活性的治疗剂和一种或一种以上医药上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。如果需要，其它活性试剂可包括在组合物中。这些其它活性试剂可包括(例如)其它已知免疫调控化合物。此些组合物经调配用于投与给动物，包括人类。医药组合物可经调配用于通过各种途径投与。举例来说，组合物可经调配用于经口、局部、直肠或不经肠投与或用于通过吸入或喷雾投与。本文所用的术语不经肠包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、鞘内、胸骨内注射或输注技术。

用于通过各种途径投与的各种医药组合物和制备医药组合物的方法已为所属领域已知且描述于(例如)“雷明顿：药学科学与实践(Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy)”(原名“雷明顿医药科学(RemingtonsPharmaceuticalSciences)”)；真纳罗A.(Gennaro，A.)，利平科特.威廉斯.威尔金斯出版公司(Lippincott，Williams＆Wilkins)，宾夕法尼亚州费城(Philidelphia，PA)(2000)。

筛选治疗剂的方法

本发明的一个方面提供筛选靶向给定电压门控钙通道的药剂的方法，所述药剂适于作为治疗剂用以调控表达剪接变体的细胞的活性。在本发明的某些实施例中提供筛选靶向给定Ca_V1剪接变体的药剂的方法，所述药剂适于作为治疗剂用以调控表达剪接变体的细胞的活性。

一般来说，筛选方法包含使表达所关注的电压门控钙通道(例如所关注的Ca_V1剪接形式)的造血细胞与候选治疗剂接触，并测定所述候选治疗剂是否调控钙通道的活性。适当细胞包括(例如)肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞、血小板、树突细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。

在某些实施例中，所述方法进一步包含鉴别在所关注的靶细胞或组织中表达的Ca_V1剪接变体的一个初始步骤或多个步骤。此可如(例如)在以上章节“Ca_V1剪接变体”中所描述的来实现。在一些实施例中，方法还包含鉴别可由候选治疗剂靶向的所选剪接变体的胞外结构域的步骤，也如以上章节“Ca_V1剪接变体”中所描述。

Ca_V1剪接变体的活性的调控可(例如)以钙通道活性的水平或细胞功能的水平来评价。

在某些实施例中，筛选方法包含评价候选化合物调控钙通道活性的能力。在一些实施例中，方法包含评价候选化合物抑制钙通道活性的能力。

钙通道活性可使用所属领域中已知的用于评价进入细胞中或跨越细胞膜的钙通量的各种方法来测定，例如通过电压钳电生理方法(具体来说，全细胞“膜片钳”分析)和基于荧光的分析。

对于电压钳电生理记录，用玻璃微量移液管破坏细胞膜以使移液管腔与细胞质连接。此方式可测量质膜两端的膜电位。当钙通道被激活且钙跨越膜进入细胞时，膜电位改变且借助此方法测量此改变。“膜片钳”分析描述于(例如)莫尔纳(Molnár)和希克曼(Hickman)，膜片钳方法和实验指南(Patch-clampmethodsandprotocols)，胡马纳出版社(HumanaPress)(2007)。

基于荧光的分析可用于测量细胞中钙浓度的增加。简单地说，将细胞与可跨越质膜并驻留在细胞的细胞质中的钙敏感染料(例如，富洛4或富拉红，从英杰生命科技公司(InvitrogenLifeTechnologies)购得)一起培育。当允许钙跨越膜进入细胞的钙通道被激活时，钙将结合所述染料并改变其荧光性质。例如，荧光中的富洛4染料将增加，同时荧光中的富拉红染料将降低。可测量染料荧光性质的变化并将其与胞质钙浓度或钙通量的增加相关联。基于荧光的分析方法描述于(例如)琼(June)和莫尔(Moore)，通过流式细胞术测量细胞内离子(MeasurementofIntracellularIonsbyFlowCytometry).最新免疫学实验指南(CurrentProtocolsinImmunology).5.5.1-5.5.20(2004))。

此外，可利用各种市售试剂盒来测量钙通量且了用于本发明方法中，例如富洛4Direct^TM钙分析试剂盒(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和BD^TM钙分析试剂盒(BD生物科学(BioSciences))。

钙通量相对于对照的实质变化指示候选药剂调控Ca_V1剪接变体的钙通道活性。对照可为指示未用候选药剂处理的样品(例如细胞)中的钙通量的已知值。举例来说，与对照相比，钙通道活性降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％指示候选药剂抑制钙通道活性，且因此候选药剂是Ca_V1活性的抑制剂。与此相反，与对照相比，钙通道活性增加(例如)至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％指示候选药剂激活钙通道活性，且因此候选药剂是Ca_V1活性的激活剂。

适当的功能分析可由所属领域的技术人员考虑所涉及的细胞类型容易地测定。举例来说，细胞存活、细胞增殖、细胞分化和/或细胞激活可通过标准技术来评价。举例来说，转录因子(例如NFkB或NFAT)的诱导、细胞因子分泌或溶细胞能力可使用所属领域已知技术来评价。评价各种造血细胞的免疫功能的适宜分析已为所属领域得知。

实施此些分析的方法已为所属领域熟知(参见(例如)精编最新免疫学实验指南：最新免疫学实验指南的方法汇编(ShortCurrentProtocolsinImmunology：ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinImmunology)，2005，约翰威立出版公司(JohnWiley＆SonsInc.)新泽西州(NewJersey)；肥大细胞：方法和实验指南(MastCells：MethodsandProtocols)，克里希纳斯瓦米(Krishnaswamy)和智(Chi)，2005，胡马纳出版社；和嗜中性粒细胞方法和实验指南系列：分子生物学方法(NeutrophilMethodsandProtocolsSeries：MethodsinMolecularBiology)，第412期，奎恩(Quinn)等人(编辑)2007，胡马纳出版社)。

在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为电压门控钙通道活性的抑制剂的候选化合物。在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为Ca_V1活性的抑制剂的候选化合物。在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为Ca_V1.4活性的调控剂的候选化合物。在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为Ca_V1.4活性的抑制剂的候选化合物。

在本发明的一些实施例中，筛选方法包含使表达所关注的Ca_V1剪接变体的B细胞、T细胞、胸腺细胞或脾细胞与候选治疗剂接触并评价所述候选药剂抑制钙通道活性的能力。根据此实施例，可将抑制钙通道活性的候选药剂选择为适宜作为免疫阻抑剂的治疗剂。

在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为Ca_V1活性的刺激剂的候选化合物。在本发明的某些实施例中，方法包含鉴别为Ca_V1.4活性的刺激剂的候选化合物。

在本发明的一些实施例中，筛选方法包含使表达所关注的Ca_V1剪接变体的B细胞、T细胞、胸腺细胞或脾细胞与候选治疗剂并评价所述候选药剂刺激钙通道活性的能力。

治疗剂的用途

本发明的一个方面提供治疗剂用以调控表达所靶向电压门控钙通道(包括(但不限于)Ca_V1剪接变体)的造血细胞的活性的用途。

在某些实施例中，治疗剂靶向在淋巴系的造血细胞中表达的电压门控钙通道且可用于调控免疫功能。在某些实施例中，治疗剂靶向在淋巴系的造血细胞中表达的Ca_V1剪接变体且可用于调控免疫功能。在一些实施例中，治疗剂抑制在淋巴系的造血细胞中表达的电压门控钙通道的活性且可用于阻抑免疫应答(例如以治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险)。在一些实施例中，治疗剂抑制Ca_V1剪接变体的活性且可用于阻抑免疫应答(例如以治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险)。在一些实施例中，治疗剂抑制Ca_V1.4剪接变体的活性且可用于阻抑免疫应答(例如以治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险)。

在某些实施例中，治疗剂靶向在骨髓系的造血细胞中表达的电压门控钙通道且可用于调控免疫功能。

在一些实施例中，治疗剂增加在造血细胞中表达的电压门控钙通道的活性且可用于增加免疫应答(例如，在免疫受损的个体中)。在一些实施例中，治疗剂增加Ca_V1剪接变体的活性且可用于增加免疫应答(例如，在免疫受损的个体中)。在一些实施例中，治疗剂增加Ca_V1.4剪接变体的活性且可用于增加免疫应答。

在一些实施例中，治疗剂靶向在T细胞中表达的电压门控钙通道且因此可用于调控T细胞活性。在一些实施例中，治疗剂靶向在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体且因此可用于调控T细胞活性。某些实施例提供靶向在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的治疗剂用以抑制T细胞到抗原的结合的用途。一些实施例提供靶向在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的治疗剂抑制T细胞成熟的用途。此些治疗剂具有用作(例如)免疫阻抑剂的应用，其可用于治疗自体免疫疾病、降低移植排斥的风险以及用于治疗其它需要阻抑免疫系统的病症。

在一些实施例中，治疗剂靶向在B细胞中表达的电压门控钙通道且因此可用于调控B细胞活性。在一些实施例中，治疗剂靶向在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体且因此可用于调控B细胞活性。某些实施例提供靶向在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的治疗剂用以抑制BCR介导的激活和/或BCR诱导的增殖的用途。一些实施例提供靶向在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的治疗剂用于抑制B细胞成熟的用途。此些治疗剂具有用作(例如)免疫阻抑剂的应用，其可用于治疗自体免疫疾病或消弱抗体应答的产生以及用于治疗其它需要阻抑免疫系统的病症。

可根据本发明的某些实施例治疗的自体免疫疾病的实例包括(但不限于)发炎性(类风湿性)关节炎、乔本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、恶性贫血(perniciousanemia)、发炎性肠病(克罗恩氏病(Crohn’sdisease)和溃疡性结肠炎)、干癣、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、I型糖尿病、全身性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、薛格连氏综合症(Sjogren’ssyndrome)、多发性硬化、重症肌无力、莱特尔综合症(Reiter’ssyndrome)和格雷夫斯氏病(Grave’sdisease)。可针对这些疾病中的任一者来测量应答的临床测量。举例来说，可使用疼痛的减小、组织(例如，关节)炎症的减小、改良的组织(例如，肾)功能或改良的消化食物的能力作为成功的免疫阻抑的指示剂。

某些实施例涵盖投与靶向在造血细胞中表达的电压门控钙通道的治疗剂连同已知消炎剂或免疫阻抑剂。某些实施例涵盖投与靶向T细胞Ca_V1.4剪接变体的治疗剂连同已知消炎剂或免疫阻抑剂。某些实施例涵盖投与靶向B细胞Ca_V1.4剪接变体的治疗剂连同已知消炎剂或免疫阻抑剂。免疫阻抑剂的实例包括非类固醇消炎剂(例如双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、氟比洛芬(nurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)、奈普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、塞来昔布(celecoxib)或罗非昔布(rofecoxib))、类固醇类(例如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、强的松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)或曲安西龙(triamcinolone)和免疫阻抑剂(例如环孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、麦考酚酸(mycophenolicacid)或雷帕霉素(sirolimus))。其它实例包括生物应答修饰剂(例如肯尼列(Kineret)(阿那白滞素(anakinra))、恩利(Enbrel)(依那西普(etanercept))或瑞米凯德(Remicade)(英利昔单抗(infliximab)))、缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)(例如阿拉瓦(Arava)(来氟米特(leflunomide)))、海尔根(Hyalgan)(玻尿酸)和欣维可(Synvisc)(海兰(hylan)G-F20)。

本发明的某些实施例提供增加在造血细胞中表达的电压门控钙通道(例如Ca_V1剪接变体)的活性的治疗剂用以在免疫受损的个体中的增加免疫应答的用途，例如用于治疗或预防免疫受损的个体的机会性感染。免疫受损的个体更易于受到机会性感染，例如病毒、真菌、原生动物或细菌感染、朊病毒病(priondisease)和某些赘生物。那些可视为免疫受损者包括(但不限于)患有AIDS(或HIV阳性)的个体、患有严重的综合性免疫缺陷症(SCID)、糖尿病的个体、已进行移植且服用免疫阻抑剂的个体和那些接受针对癌症的化学疗法者。免疫受损个体还包括患有大多数形式的癌症(除了皮肤癌以外)、镰状细胞性贫血，囊性纤维化的个体、那些没有脾脏的个体、患有肾终末期疾病(透析)的个体和那些在过去一年通过药丸或注射频繁服用皮质类固醇的个体。患有严重的肝、肺或心脏疾病个个体也可是免疫受损的。

为更好的理解本文所述本发明，陈述以下实例。应了解，这些实例打算描述本发明的说明性实施例且并不打算以任何方式限制本发明的范围。

实例

实例1：CA_V1.4钙通道调节T细胞受体信号传导和初始型T细胞内稳态

实施以下实验以测定Ca_V1.4在T细胞生物学中的生理功能。

实验方法：

总RNA提取和RT-PCR.总RNA是使用Trizol试剂(英杰公司)按制造商的指示从各种样品中提取。经分离的RNA用DNaseI处理以移除受污染的DNA。使用1微克的总RNA利用随机引物和superscriptII(英杰公司)来合成第一链cDNA。为检测组织中的Cav1.4，利用同义引物(5′-CATACTGGAGGAAAGCCAGGA-3′)和反义引物(5′-TGGAGTGTGTGGAGCGAGTAGA-3′)来执行初始PCR。利用同义引物(5′-GACGAATGCACAAGACATGC-3′)和反义引物(5′-CAAGCACAAGGTTGAGGACA-3′)实施随后的嵌套式PCR扩增。为检测Cav1.4突变的mRNA，利用同义引物(5’-CATACTGGADGGAAAGCCAGGA-3’)和反义引物(5’CGTCCCTCTTCAGCAAGAGAA-3’)执行第一轮PCR。利用同义引物(5’-GCCCATAACTTCGTATAATGTATGC-3’)和反义引物(5’-CAAGCACAAGGTTGAGGACA-3’)执行第二嵌套式PCR。

抗体(Ab).针对CD3e(2C11)、CD4(GK1.5)、CD8a(53-6.7)、CD8b(53.58)、TCRβ(H57-597)、CD19(ebio1D3)、CD24(M1/69)、CD25(PC61.5)、CD44(IM7)、CD62L(MEL-14)、CD69(H1.2F3)、CD127(A7R34)、Thy1.1(HIS51)、Thy1.2(53-2.1)、CD45.2(104)、PD-1(J43)、PD-L1(MIH5)和CCR7(EBI-1)用于流式细胞术的单克隆抗体是从易生物科学公司(eBioscience)购得。使用以下抗体用于免疫墨点法：兔多克隆抗Ca_V1.4(麦克洛瑞等人，2004)、抗磷酸-p44和p42MAPK(9101，细胞信号传导公司(CellSignaling))、抗ERK2(sc-154，圣克鲁兹(SantaCruz))、抗磷酸-JNK(9251，细胞信号传导公司)、抗JNK(9252，细胞信号传导公司)、抗-NFATc1(7A6，赛默飞世尔科技(ThermoScientific))、抗-GAPDH(MAB374，日本化工(Chemicon))和抗-HDAC1(10E2，圣克鲁兹)。

骨髓转移试验.骨髓(BM)细胞是从Thy1.1野生型(Thy1.1⁺CD45.2⁺)或Cacnalf^-/-(Thy1.2⁺CD45.2⁺)小鼠的股骨提取物制得。成熟T细胞用生物素化Thy1.1或抗Thy1.2Ab染色且随后用抗生蛋白链菌素连接的免疫磁珠(Dynabeads)(英杰公司)使其耗尽。接着将野生型和突变BM细胞50∶50混合，然后静脉内转移到经亚致死辐照(1000拉德(rad))CD45.1⁺宿主(Thy1.2⁺CD45.1⁺)中。在继承性转移后30天回收来自脾脏和胸腺的细胞；Thy1.1、Thy1.2和CD45.2是用于辨别野生型和突变供体细胞的基础。

小鼠.将先前已描述的Cacnalf^-/-小鼠(曼瑟(Mansergh)等人，2005)在C57BL/6J(B6)背景上培育至少13代。B6、B6.PL-Thy1^a/Cy(Thy1.1⁺)、B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ(Ly5.1⁺)和B6.Rag1^-/^-均是从杰克逊实验室(JacksonLaboratory)(缅因州巴港(BarHarbor，ME))获得。所有研究均遵循英属哥伦比亚大学动物实验委员会(UniversityofBritishColumbia’sAnimalCareCommittee)和加拿大动物保护协会(theCanadianCouncilonAnimalCare)二者设定的指导方针。

流式细胞术.所有Ab培育均在冰上实施。膜联蛋白V-PE(BD生物科学)、抗Bcl-2(3F11；BD生物科学)和同种型对照Ab染色是如先前所述实施(普若艾陶(Priatel)等人，2000，2006)。数据利用FACScan或FACSCalibur和CellQuest软件(BD生物科学)或LSRII和FACSDiVa软件(BD生物科学)进行采集。数据利用Flowjo软件(翠丝塔公司(Treestar，Inc))进行分析。

Ca²⁺通量分析.将存于含有2％FCS的HBSS(汉克氏平衡盐溶液(Hank’sbalancedsaltsolution))中的脾细胞或胸腺细胞(10⁷个细胞/mL)用1μM富洛4、2μM富拉红和0.02％普流尼克(所有均来自英杰公司)在室温下标记45分钟。洗涤之后，将细胞在冰上用CD44-APC、CD8-APC-eFluor780(易生物科学公司)和CD4-PEAb染色达20分钟。将样品悬浮于RPMI(含有约0.4mMCa²⁺)中并在37℃下预热15分钟。如先前所述执行毒胡萝卜内酯(1μM)和离子霉素(1μg/mL)刺激以及反向添加游离细胞外Ca²⁺(0.5mM)(刘(Liu)等人，1998)。通过补充含有0.5mMEGTA的RPMI培养基实施细胞外Ca²⁺的螯合。为了TCR刺激，通过添加20μg/mL抗生蛋白链菌素来激活经5μg/mL生物素化CD3εAb(克隆145-2C11；易生物科学公司)预涂布的脾细胞。在BDLSRII流式细胞仪上利用FACSDiva软件或在BDFACSCalibur上利用CellQuest软件采集Ca²⁺通量数据并利用Flowjo(翠丝塔公司)针对所指示T细胞子集进行电子门控并绘制富洛4/富拉红比率对时间的曲线来进行分析。

电生理分析.将从WT和Cacnalf^-/-小鼠的淋巴结和脾脏产生的单细胞悬浮液用CD44(IM7)、CD4(GK1.5)和CD8a(53-6.7)Ab染色，且随后利用BDFACSAria分离CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞。由于绝大部分(＞99％)分选出的CD44^loT细胞为CD62L^hi，因此将其视为初始型。如针对Ca²⁺通量分析所述实行TCR刺激。对于Ca²⁺通道阻断试验，将细胞与特异性针对Ca_V1.3和Ca_V1.4的胞外结构域的Ab(圣克鲁兹；sc-32070)一起预培育。在具有pClamp10软件的Axopatch200B放大器(阿克森仪器(AxonInstruments))上实施全细胞膜片钳记录和分析。膜片电极是从薄壁硼硅酸盐玻璃(世界精密仪器(WorldPrecisionInstruments))在水平微量移液管牵拉仪(萨特仪器(SutterInstruments))上拉制。当电极充满细胞内溶液时，具有4-8MΩ的电阻。在全细胞记录期间使用模拟能力补偿和80％串联电阻补偿。对于单脉冲记录，将细胞从-80mV的保持电位以10s间隔去极化到+10mV并使用P/4漏电减法程序。在将峰值电流幅值正规化到对应细胞电容值时，呈现电流密度。为获得I-V关系，使用从-130mV到70mV的200ms斜坡脉冲方案以及-80mV保持电位和P/4漏电减法程序。数据是以50kHz取样且以10kHz滤波并在室温(20℃-22℃)下执行全细胞记录。细胞外溶液含有100mMBaCl₂、10mMHEPES，利用NaOH调节到pH7.4。移液管中所用的细胞内溶液含有140mMTEA-Cl、5mMEGTA、10mMHEPES、1mMMgATP₂，利用TEA-OH调节到pH7.4。

磷酸流式细胞术信号传导.胸腺细胞在刺激之前在含有10mMHEPES的HBSS中培育30分钟。如上所述将细胞刺激达所指示时间，用2％甲醛固定10分钟、通过离心沉降并在-20℃下在90％甲醇中透性化过夜。为测定STAT5磷酸化，将透性化细胞用偶联到AlexaFluor647(BD生物科学)的抗STAT5(pY649)mAb、抗CD8α-PE和抗CD4-PE-Cy7于室温下处理1小时。如所述执行ERK活性的流式细胞测量(普若艾陶等人，2002)。

免疫墨点法.为检测Ca_V1.4，通过免疫墨点法分析脾细胞。或者，利用EasySep小鼠T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司(StemCellTechnologies，Inc.))从脾细胞制剂分离T细胞。分离膜蛋白并在免疫墨点法之前如先前所报告将样品之间的蛋白质量正规化(伍达德(Woodard)等人，2008)。利用Alexa680偶联抗兔IgGAb(Li-Cor生物科学)检测一级Ab的结合。利用奥德赛红外成象系统(Li-Cor生物科学)使蛋白质条带可视化。利用奥德赛软件量化信号强度。对于信号传导分析，通过TCR刺激(如上)将胸腺细胞激活达所指示时间。作为激活的阳性对照，将胸腺细胞在37℃下与100ng/mLPMA一起培育10分钟。如先前所述评价Ras活性(戴维(David)等人，2005)。通过免疫墨点法检测磷酸化和总ERK和JNK。磷酸化的倍数增加表示为总蛋白质的比率且正规化为未经刺激野生型对照。

NFAT动员分析.制备来自WT或Cacnalf^-/-小鼠的胸腺的单细胞悬浮液并利用板结合CD3ε(145-2C11)Ab(10μg/ml)和可溶性CD28(1μg/ml)或仅培养基培育16小时。将全细胞在RIPA缓冲液中细胞溶解达10分钟。细胞核和细胞质部分利用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂盒(赛默飞世尔科技)制备并通过免疫墨点法分析。如上所述检测一级Ab的结合。激活的倍数增加表示为适当加载对照的比率并正规化为未经激活的野生型对照。

初始型T细胞存活分析.如上述在电生理分析中所述分选WT(Thy1.1⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.2⁺)CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞。将经纯化WT和突变初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞以相等比率(1∶1∶1∶1)混合并以200,000个总细胞/孔在96孔平底板中培养。将细胞用所指示剂量的mIL-7(易生物科学公司)处理或在预涂布有10μg/mLCD3(145-2C11)Ab的孔中培养。24小时后，通过利用CD8和Thy1.1Ab标记样品、在室温下与膜联蛋白V-Alexa647(南方生物科技(SouthernBiotech))一起在含有Ca²⁺的缓冲液中培育15分钟且随后在BDFACSCalibur上采集数据来测定生存力。

继承性转移试验.对于初始型T细胞转移，如上述在电生理分析中所述分选WT(Thy1.1⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.2⁺)CD44^loCD4和CD8T细胞，以1∶1∶1∶1比率混合，利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(英杰公司)进行荧光标记并共同注入Rag1^-/-宿主中。转移后1周，将脾细胞分离并利用相关Ab染色用于辨别供体WT和突变T细胞。

细菌感染和抗原特异性T细胞的检测.小鼠以静脉内方式(i.v.)利用约10⁴个菌落形成单位(CFU)的rLM-OVA(表达单核细胞增多性利斯特菌的卵白蛋白)进行感染。脾细胞用CD8α(53-6.7)和CD44(IM7)Ab和H-2K^b-OVA四聚体(iTagMHC四聚体，贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))进行染色。如所述执行细胞内细胞因子染色和细胞毒性分析(普若艾陶等人，2007)。

统计学分析.对于大多数分析，统计显著性是利用未配对司徒登氏t检验(Student’sttest)来测定。对于电生理分析，通过具有无重复的双因素设计的ANOVA检验测量统计显著性。

结果：

Ca_V1.4缺乏导致CD4⁺和CD8⁺T细胞淋巴细胞减少和自发的T细胞激活

为表征Ca_V1.4在野生型(WT)小鼠中的表达，执行RNA分析并揭示在胸腺、脾脏和外周CD4⁺和CD8⁺T细胞中的表达(参见图1A)。先前描述Ca_V1.4在正发育的和成熟T细胞中表达的观察结果引起了Cacnalf^-/-小鼠是否显示T细胞表型的调查研究。已预先通过基因靶向、插入终止密码子并提前终止Cacnalf翻译(曼瑟等人，2005)产生Cacnalf^-/-小鼠。为验证Cacnalf^-/-小鼠中的基因靶向，执行逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)，以检测Cacnalf^-/-小鼠中特异性携载loxP位点的经破坏Ca_V1.4转录物(图1B)。另外，Ca_V1.4抗体(Ab)墨点法揭示Cacnalf^-/-脾全细胞溶解产物中的蛋白质损失(图2A)。小鼠脾细胞与Weri视网膜母细胞瘤细胞之前的Ca_V1.4蛋白质大小差异可是由于择性剪接(库特瑞和杰弗里斯，2005)或细胞类型特异性翻译后修饰的缘故。为确立Ca_V1.4是否在T细胞质膜处，将WT和Cacnalf^-/-脾T细胞表面生物素化并利用Ca_V1.4Ab对抗生蛋白链菌素偶联珠粒免疫沉淀进行墨点分析(图2B)。特定地在WTT细胞中检测到Ca_V1.4大小条带证明Ca_V1.4通道在T细胞表面处表达。

缺少功能性Ca_V1.4通道的胸腺细胞的分析揭示到T细胞成熟的变化次数。在Cacnalf^-/-胸腺中CD4⁺对CD8⁺单阳性(SP)胸腺细胞的比率稍微朝向CD8⁺系偏移(图2C)，且成熟胸腺细胞(称为CD24^loTCRβ^hi)的比率相对于WT减少(图2D)。Ca_V1.4缺乏对T细胞发育的影响也反映在成熟CD4⁺SP胸腺细胞的数量降低50％、而CD8⁺SP胸腺细胞的数量在很大程度上无变化上(图2E)。然而，各种成熟和激活标志物在Cacnalf^-/-双阳性(DP)和TCRβ⁺SP亚群上的表达近似平行于WT，此表示类似数量的TCRβ、CD44、CD69和CD62L(图3)。总体来说，这些发现暗示Ca_V1.4功能促进阳性选择，具体来说CD4⁺SP系的分化。

外周淋巴区室(包括脾脏、淋巴结(LN)和外周血液)的检查揭示，Cacnalf^-/-相对于WT小鼠展现降低的CD4⁺T细胞的频率和减小的CD4⁺对CD8⁺T细胞的比率(图2F)。此外，基于脾脏(图2G)和LN(图4)细胞回收，发现Cacnalf^-/-小鼠对于CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞子集存在显著地淋巴细胞减少。而且，在Cacnalf^-/-小鼠中外周CD4⁺T细胞的损失比CD8⁺T细胞更加明显。与Cacnalf^-/-T细胞数量的下降相关联，CD4⁺TCRβ⁺和CD8⁺TCRβ⁺T细胞二者展示自发的急性T细胞激活的迹象，此表示增加数量的CD44、CD122和程序性死亡(PD)-1和减少的CD62L(图2H)。总之，这些发现阐明，Ca_V1.4依赖性Ca²⁺信号传导对于初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞内稳态和静止是必要的。

Ca_V1.4是TCR诱导的和贮存池操作的胞质内游离Ca²⁺的升高非常需要的

将加载有指示剂染料用于测量细胞溶质Ca²⁺且经CD4和CD8Ab加CD44Ab标记用于辨别CD44^lo(初始型)或CD44^hi(记忆型)CD4⁺和CD8⁺T细胞应答(图5A)的WT和Cacnalf^-/-脾细胞用所指示激动剂刺激以研究Cacnalf^-/-小鼠中的Ca²⁺输送不足。为测定来自细胞内贮存池的Ca²⁺释放是否胜任经由质膜通道调节Ca²⁺流入，将脾T细胞用毒胡萝卜内酯处理(图5B)。毒胡萝卜内酯(ER的Ca²⁺-ATPase的抑制剂)通过阻断细胞将Ca²⁺泵送到肌质网和内质网中诱导细胞溶质Ca²⁺浓度的升高且其次激活质膜结合的Ca²⁺通道，此触发Ca²⁺自细胞外部的进入(瑟斯托普(Thastrup)等人，1990)。明显地，展现极大地减小的Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺T细胞当毒胡萝卜内酯刺激时细胞溶质Ca²⁺增加，而Cacnalf^-/-CD44^lo和CD44^hiCD8⁺T细胞相对于其WT对应物也展示明显减小(图5B)。另一方面，来自CD4⁺和CD8⁺T细胞的Ca²⁺流出看来并非因Ca_V1.4缺乏而有所损害，如通过添加Ca²⁺螯合剂乙二醇四乙酸(EGTA)所阐明。与初始型CD4⁺T细胞之间的比较相比，WT和Cacnalf^-/-CD44^hiCD4⁺T细胞显示极为相似的Ca²⁺应答。总之，这些观察结果阐明，Ca_V1.4通道是CD44^loCD4⁺T细胞中的SOCE非常需要的且在CD44^lo和CD44^hiCD8⁺T细胞中的SOCE的需要程度较小。

为研究Ca_V1.4通道是否可以调节TCR信号传导，将经生物素化CD3Ab预涂布的WT和突变脾细胞通过抗生蛋白链菌素(SA)添加来激活。在WTT细胞中，TCR交联诱导细胞溶质Ca²⁺浓度迅速升高且保持升高达持续时间(图5C)。与对于毒胡萝卜内酯处理观察到的应答自相矛盾，Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞二者对TCR刺激的应答极弱，无论其表面CD44表型如何。差异性CD4⁺和CD8⁺T细胞Ca_V1.4功能依赖于针对毒胡萝卜内酯而非TCR应答的基础尚不清楚(图5B)。另外，Cacnalf^-/-T细胞、具体来说CD44^loCD4⁺T细胞子集当用离子霉素处理时与WT相比实现极大减小的峰值Ca²⁺浓度。离子霉素经由其离子载体性质增加细胞溶质Ca²⁺浓度，释放细胞内Ca²⁺贮存池且随后刺激质膜Ca²⁺通道开放和来自细胞外部的Ca²⁺流入(摩尔根(Morgan)和雅各布(Jacob)，1994)。离子霉素应答在Cacnalf^-/-T细胞中被极大地削弱的发现暗示，Ca_V1.4功能有助于细胞内Ca²⁺的储存或对于Ca²⁺从细胞内贮存池释放之后其输入来说是至关重要的。

为测定Ca_V1.4是否介导上述涉及Ca²⁺应答的过程中的一者或两者，当细胞外Ca²⁺由EGTA螯合时(防止Ca²⁺摄入且由此移除来自细胞内贮存池的Ca²⁺释放)，在TCR刺激之后监测Ca²⁺应答。在TCR接合之后在EGTA存在下所观察到短暂细胞溶质Ca²⁺的升高发现相对于WT在Cacnalf^-/-T细胞中有所降低(图5D)。此外，充足的细胞外Ca²⁺(促使跨越质膜的Ca²⁺流入)导致WTT细胞中显著性细胞溶质Ca²⁺潮涌，而Cacnalf^-/-T细胞的增加明显较小。另外，已发现Ca_V1.4还在胸腺细胞中起作用且当在不存在细胞外Ca²⁺下执行TCR刺激时，对于细胞溶质Ca²⁺升高甚为重要(图6)。

为验证Ca_V1.4调节Ca²⁺进入细胞中，在TCR刺激之后通过在膜片钳试验中采用钡(Ba²⁺)作为载体监测通道电流。用作Ca²⁺模拟物的Ba²⁺提供许多关键益处，因为其通过以下扩大电流：(1)以更高电导通过Ca²⁺通道、(2)有效地阻断钾通道和(3)降低与Ca^斗流入相关联的二次信号转导。利用单扫描方案从-80mV到+10mV来表征Cacnalf^+/+和Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞中的Ca²⁺电流。TCR交联之后在WT中检测到电流但在突变T细胞中未检测到(图7A和7B)。为测定L型通道在质膜处是否起作用，将在存在或不存在胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元Ab下的TCR诱导的内向电流进行比较。已发现将Ab添加到WTCD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞阻断在TCR刺激之后观察到的内向电流(图7C)。此外，利用对照山羊Ab进行处理未揭示对内向电流的任何效应。为验证胞外结构域Ca_V1α1亚单元Ab是否识别Ca_V1.4，将WT和Cacnalf^-/-脾细胞提取物与胞外结构域Ca_V1α1亚单元Ab一起培育且疫沉淀利用Ca_V1.4Ab进行墨点分析(图7D)。特别地在WT中检测到Ca_V1.4条带而在Cacnalf^-/-细胞中未检测到支持当TCR接合时Ca_V1.4充当Ca²⁺流入的导管的结论。

为进一步表征在WT和Cacnalf^-/-T细胞中TCR诱导的Ca²⁺电流的类型，使用斜坡脉冲方案以在TCR交联时测量I-V曲线(图7E和7F)。I-V关系的峰值电压(V_max)对于WTCD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞来说分别为16.3±5.2mV(n＝5)和24.4±3.3mV(n＝5)。从经修改的玻耳兹曼(Boltzmann)拟合获得的半激活电位(V_a)对于CD4⁺T细胞为-0.2±4.7mV(n＝5)且对于CD8⁺T细胞为1.3±3.5mV(n＝5)。这些V_a值与检查在异源系统中表达的L型Ca_V1.4通道的特性的先前报道相当(鲍曼(Baumann)等人，2004；麦克洛瑞等人，2004)。相比之下，Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞不响应斜坡脉冲展示任何内向电流(图7G和7H)。总体来说，这些数据暗示，Ca_V1.4是通过TCR信号传导来操作且其可在正发育的和初始型T细胞中用来补充细胞内Ca²⁺贮存池。

Ca_V1.4功能调节Ras-ERK激活和NFAT动员

为论述Ca_V1.4通道是否影响Ras-MAPK信号传导(在很大程度上涉及控制T细胞存活和分化的途径)(阿尔贝罗拉-伊拉(Alberola-Ila)和埃尔南德斯-霍约什(Hernández-Hoyos)，2003)，开始研究以测量在TCR刺激之后这些下游效应子的激活状态。对于Ras信号传导，将WT和Cacnalf^-/-胸腺细胞用TCRAb刺激且随后通过利用Raf-1-GST融合蛋白使Ras-GTP沉淀来评价Ras激活(图8A)。已发现，Cacnalf^-/-胸腺细胞诱导比野生型细胞少50％的Ras-GTP。相比之下，当细胞用二酰基甘油(DAG)类似物PMA刺激时，在各基因型之间经激活Ras的量相当类似。接下来，在TCR刺激后所指示时间下在所有胸腺细胞中实施下游作用MAP激酶ERK和JNK的激活分析(图8B)。在Cacnalf^-/-胸腺细胞中相对于WT在TCR交联后ERK激活的强度和持续时间减小。然而，在TCR刺激时WT和Cacnalf^-/-胸腺细胞之间的JNK磷酸化的比较揭示仅存在边缘差异。相比之下，发现PMA处理引发强ERK和JNK磷酸化，而无论细胞基因型如何。总体来说，这些研究揭示Ca_V1.4缺乏选择性地影响ERK的激活。为评价在Cacnalf^-/-成熟SP胸腺细胞中ERK激活是否受影响，在用TCRAb刺激或PMA处理之前和之后利用磷酸-流式细胞术评价ERK活性(图8C)。在TCR刺激时Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺SP胸腺细胞相对于WT展现减小的ERK激活，而在PMA刺激时未展现。

NFAT蛋白质(胸腺细胞发育和T细胞分化的关键调节剂)经磷酸化且主要驻留在静止T细胞的细胞质中(欧.奥拉，2009)。当T细胞受体刺激时，Ca²⁺信号诱导丝氨酸-苏氨酸磷酸酶钙神经素的激活，此催化NFAT去磷酸化并触发其随后易位到细胞核。为测定在TCR接合之后不足的Ca²⁺释放是否影响Cacnalf^-/-胸腺细胞中的NFAT易位和激活，检查WT和Cacnalf^-/-胸腺细胞的细胞溶质和细胞核部分中的NFATc1量(图8D)。发现Cacnalf^-/-胸腺细胞与WT细胞相比具有较少的细胞核NFATc1。总之，这些试验阐明，Ca_V1.4依赖性Ca²⁺进入调节NFAT和ERK途径的激活。

T细胞固有的Ca_V1.4功能是正常T细胞内稳态所需要的

为测定在T细胞自身中Ca_V1.4功能的损失是否有助于受损的T细胞发育和/或外周T细胞维持，执行骨髓转移试验，其中将相等数量的T细胞耗尽的WT(Thy1.1⁺Ly5.2⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.2⁺Ly5.2⁺)骨髓转移到经辐照同基因型(Ly5.1⁺)宿主中。转移后1个月，胸腺和脾脏中供体细胞频率(Ly5.2⁺)的评价揭示对于宿主的T细胞重构，Cacnalf^-/-骨髓细胞与WT的竞争极差(图9A)。胸腺和外周中WT供体CD4⁺和CD8⁺T细胞的频率实质上分别高于Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞的频率(图9A和9B)。此外，CD44^lo对CD44^hiCD4⁺和CD8⁺T细胞群的比率的比较展示，Cacnalf^-/-脾供体T细胞相对于野生型供体T细胞朝向记忆表型偏移(图9C)。另外，这些试验暗示，Cacnalf^-/-小鼠中Cacnalf^-/-CD44^hiT细胞的提高的频率并不是由于淋巴细胞减少的缘故，而是由于不能维持Cacnalf^-/-CD44^loT细胞。总之，这些结果阐明，T细胞原粒子和/或成熟T细胞中Ca_V1.4的细胞固有的功能是有效的T细胞重构所需的。

Ca_V1.4是初始型T细胞内稳态的重要调节剂

Cacnalf^-/-小鼠的淋巴细胞减少且大多数残留T细胞具有经激活或记忆表型的发现暗示，Ca_V1.4功能是初始型T细胞维持所必需的。另外，T细胞子集基于CD44表达的比较揭示，Cacnalf^-/-小鼠相对于WT展现CD44^loT细胞的严重损失，而CD44^hiT细胞数量受影响非常小(图10A和10B)。为测定各群组之间细胞更新率是否有差异，将WT和Cacnalf^-/-T细胞用细胞凋亡标志物膜联蛋白V染色(图10C)。Cacnalf^-/-CD44^lo相对于其WT对应物显示增强的膜联蛋白V反应性，而CD44^hiT细胞未显示。Cacnalf^-/-CD44^loT细胞的表面表型检查展示，其看起来成熟了，其相对于CD62L、TCRβ和CD69表达类似WT初始型T细胞(参见(例如)图10D)。总之，这些数据暗示，Cacnalf^-/-小鼠中CD44^loT细胞的有限数量至少部分地是由于其降低的适应性的缘故。

通过IL-7受体(IL-7R)(IL-7Rα(CD127)与共有γ-链(CD132)的异二聚体)的信号传导在初始型T细胞内稳态中起到管控作用，且在小鼠和人类二者中IL-7或IL-7R的损失导致T细胞淋巴细胞减少和严重的免疫缺乏(苏赫(Surh)和斯普林特(Sprent)，2008)。因此，研究IL-7R在Cacnalf^-/-CD44^loT细胞中的表达(图10E)。发现Cacnalf^-/-CD44^loT细胞仅表达WTCD127量的约50％，但是表达WTCD132。WT和Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺TCRβ⁺SP胸腺细胞之间膜联蛋白V的反应性和IL-7R的分析揭示与上文针对外周CD44^loT细胞的比较所指出的类似的发现(图11)。尽管CD127表达减小，但Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞显示WT数量的促存活蛋白Bcl-2(图10F)。这些发现暗示，Ca_V1.4可部分地通过CD127调节影响初始型T细胞适应性。

Ca_V1.4促使存活信号传导和内稳态诱导的T细胞扩增

为测定Ca_V1.4缺乏和其在IL-7Rα表达中的伴随减少功能上是否显著，通过追踪其下游效应子STAT5的磷酸化状态来监测IL-7R信号传导(图12A)。将WT和Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺SP胸腺细胞用各个剂量的IL-7刺激并用磷酸-Y647STAT5特异性Ab进行染色。Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺SP胸腺细胞展示与WT相比，在所测试的所有IL-7剂量下STAT5磷酸化均明显减小。然后，研究Ca_V1.4缺乏是否影响IL-7促使T细胞存活的能力。通过细胞分选来分离WT和Cacnalf^-/-CD44^loT细胞并将置于具有所指示浓度的IL-7的培养基中，并在24小时后经由膜联蛋白V染色评价其生存力(图12B)。发现Cacnalf^-/-CD44^loT细胞远不能像WT那样利用IL-7来维持其活体外存活。另外，当置于TCRAb涂布的孔中离体培养24小时，Cacnalf^-/-CD44^loCD4⁺T细胞相对于WT展现减小的存活(图12C)。总体来说，这些发现暗示，Ca_V1.4通道蛋白通过IL-7或TCR信号传导的调节影响初始型T细胞存活。

初始型T细胞区室的大小受IL-7和自身肽-主要组织相容性复合体(MHC)分子二者的可用性的限制(苏赫和斯普林特，2008)。为检查Cacnalf^-/-CD44^loT细胞在活体内的增殖可能性，将WT(Thy1.1⁺)和Cacnalf^-/-(Thy1.2⁺)CD44^loCD4⁺和CD8⁺T细胞纯化，以1∶1∶1∶1比率混合在一起，用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)进行标记并共同注入先天性淋巴细胞减少的Rag1^-/-宿主中(图12D)。在活体内驻留7天之后，回收供体T细胞并经由CFSE稀释评价细胞增殖(图12E)。通过使用同基因型标志物Thy1.1，已发现所回收供体WT细胞的比例远大于Cacnalf^-/-细胞。通过对可能响应来自IL-7和自身肽-MHC分子的诱因的供体T细胞进行电子门控(凯佩尔(Kieper)等人，2005)，发现Cacnalf^-/-CD4⁺和CD8⁺T细胞经历比WTCD4⁺和CD8⁺T细胞少的细胞分裂(图12F)。总体来说，这些研究暗示细胞固有的Ca_V1.4功能对于T细胞适当响应内稳态和存活诱因是至关重要的。

Ca_V1.4功能是功能性CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫应答必需的

为研究在免疫应答中Ca_V1.4功能的需求，将WT和Cacnalf^-/-小鼠用表达重组单核细胞增多性利斯特菌的卵白蛋白(rLM-OVA)进行攻击。Cacnalf^-/-小鼠当用rLM-OVA进行攻击时产生实质上降低数量的OVA反应性CD8⁺T细胞(图13A和13B)。功能性抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞的数目在Cacnalf^-/-小鼠中相对于WT显著减少(图13C和13D)。另外，在Cacnalf^-/-小鼠中生产IFN-γ的CD8⁺T细胞效应子的总数目也减少(图13E)。接着，评估来自rLM-OVA感染WT和Cacnalf^-/-小鼠的纯化CD8⁺T细胞的细胞溶解功能(图13F)。Cacnalf^-/-小鼠相对于WT展现产生抗原特异性CTL的能力极大地消弱。总之，这些研究展示，Ca_V1.4对于增加生产性CD4⁺和CD8⁺T细胞应答是至关重要的。

讨论：

Ca_V通道是控制可兴奋细胞中Ca²⁺进入的主要通道且调节许多过程，包括肌肉收缩、神经信号传输和基因转录(范思凯(Feske)，2007)。然而，Ca_V通道在非可兴奋细胞(例如淋巴细胞)中的生物作用界定较不充分。鉴别出构成在昏睡小鼠品系中观察到的神经和免疫系统缺陷的起因的VDCC的β4亚单元中的突变与免疫调节中的Ca_V功能有关(伯吉斯(Burgess)等人，1997)。另外，描述β3调节亚单元缺乏的小鼠的手稿已认为Ca_V通道在调控TCR信号传导和CD8⁺T细胞内稳态中起作用(杰哈等人，2009)。为研究L型Ca_V1.4通道在发育中和成熟T细胞中的生理功能，分析其成孔α1亚单元缺乏的小鼠。此实例中所描述的研究指示，Ca_V1.4通道对于初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞的存活和病原体特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞相应的产生二者均至关重要。此外，初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞展示SOCE、TCR诱导的细胞溶质Ca²⁺的升高和下游TCR信号转导而言均依赖于Ca_V1.4功能。

Cacnalf^-/-小鼠的分析揭示，发育和分化的各个阶段的T细胞对于调介Ca²⁺应答展示对Ca_V1.4的不同相对依赖性。举例来说，Cacnalf^-/-SP胸腺细胞相对于WT在TCR或毒胡萝卜内酯诱导的胞质内游离Ca²⁺的升高方面展现比当比较外周初始型和记忆型WT和Cacnalf^-/-T细胞时所观察到的较适度的降低。

Ca_V1.4通道可通过对RasGRP1(Ras-鸟苷酸交换因子)的效应调节Ras-ERK级联。RasGRP1的两个“EF手臂”结构域通过结合Ca²⁺、决定其细胞定位和Ras-ERK信号传导的持续时间起作用(特谢罗(Teixeiro)和丹尼尔斯(Daniels)，2010)。另外，Ca_V1.4的损失影响TCR信号转导的发现暗示，Cacnalf^-/-小鼠中的中心或外周耐受将受损。尽管还未执行利用Cacnalf^-/-TCR转基因小鼠的阴性选择研究，但Cacnalf^-/-小鼠中的脾调节T(Treg)细胞(定义为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺细胞)的数目为WT中的Treg细胞的50％(Cacnalf^-/-＝0.84±0.23×10⁶对WT＝1.75±0.44×10⁶)。然而，很可能胸腺中自体反应性T细胞的删除或其在外周中调节T细胞的阻抑均未受Ca_V1.4缺乏干扰，因为在C57BL/6背景上培育13代的Cacnalf^-/-小鼠看起来健康，所检查的各个组织中没有任何整体组织学异常，且保持淋巴细胞减少。

Ca_V1.4对于初始型CD4⁺和CD8⁺T细胞内稳态是至关重要的发现暗示，通道调控其存活所需的信号：在IL-7暴露之后当其与自身肽-MHC分子和IL-7R信号传导接触时TCR信号传导(苏赫和斯普林特，2005)。先前工作已暗示树突细胞上的MHC分子的初始型T细胞TCR识别触发其存活所需的小的Ca²⁺应答(勒维(Revy)等人，2001)。因此，我们假设与自身抗原的低亲和性TCR相互作用也许作为TCR信号传导的直接结果或通过与STIM1的相互作用诱导初始型T细胞打开Ca_V1.4通道(帕克(Park)等人，2010；王(Wang)等人，2010)。显然，已发现Ca_V1.4以及Ca_V1.3具有低激活阈值，对于其激活不需要强烈的去极化(里普斯科姆(Lipscombe)等人，2004)。Ca_V1.4介导的来自细胞外部的Ca²⁺流入可能诱导信号传导级联以及有助于对于TCR存活信号传导至关重要的细胞内Ca²⁺贮存池的强力填充。我们怀疑有至少两个辅助因素可有助于Cacnalf^-/-T细胞在刺激时所观察到的Ca²⁺释放缺陷：(1)降低的ERCa²⁺贮存池，其导致减小的SOCE和(2)减小的通过CRAC通道的内向Ca²⁺通量，其协作而损害Ca²⁺依赖性信号传导。显然，低级别TCR信号传导和初始型T细胞内稳态已展示依赖于RasGRP1(普若艾陶等人，2002)。总之，这些数据暗示，由淋巴表达的Ca_V1.4通道控制的Ca²⁺电流影响初始型T细胞的生存力且可是保存表达TCR的不同谱型的初始型T细胞群所必需的。

实例2：利用阻断抗体抑制CA_V1减小CD8⁺和CD4⁺T细胞的存活

T细胞存活分析

将C57Bl/6脾细胞在96孔平底板中以5×10⁶个细胞/孔在RPMI完全培养基中在有或没有胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元抗体(克隆SC-32070；圣克鲁兹)下培养。此抗体是针对Ca_V1.3产生，但与Ca_V1.4交叉反应。如图7D中所示，此抗体结合脾细胞中的Ca_V1.4。

24小时后，通过以下测定生存力：将样品用CD8(克隆53-6.7；BD生物科学)和CD4(克隆GK1.5；BD生物科学)抗体标记，与膜联蛋白V-Alexa647(英杰公司)在含Ca²⁺的缓冲液中在室温下培育15分钟且随后在BDFACSCalibur上采集数据。此实验的结果提供于图14中。

如实例1中所述，缺少Ca_V1.4蛋白的CD4⁺和CD8⁺T细胞在外周中展现减小的存活。为验证抑制Ca_V1.4功能导致降低的T细胞适应性，将脾细胞在有或没有胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元抗体下培育。如图14中所示，在阻断抗体存在下，CD4⁺和CD8⁺T细胞显示增强的膜联蛋白V反应性，此指示增加的细胞凋亡。因此，此实例证实Ca_V1.4通道有助于初始型T细胞维持且利用阻断抗体抑制Ca_V1.4功能损害T细胞存活。

实例3：利用阻断抗体抑制CA_V1减小CD8⁺和CD4⁺T细胞增殖.

T细胞增殖分析

C57Bl/6脾细胞经CFSE(英杰公司)标记并在96孔平底板中以5×10⁶个细胞/孔在RPMI完全培养基中在有或没有Ca_V1Ab(克隆SC-32070；圣克鲁兹)下培养。将细胞用10μg/mL板结合CD3ε(克隆145-2C11)和5μg/ml板结合CD28(克隆37.51)抗体激活。5天后，将样品用CD8(克隆53-6.7；BD生物科学)和CD4(克隆GK1.5；BD生物科学)抗体标记并通过CFSE稀释使用BDFACSCalibur评价T细胞增殖。此实验的结果提供于图15中。

如实例1中所示，缺少Ca_V1.4蛋白质减小CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖可能性。为证实细胞表面Ca_V1.4的抑制影响T细胞分裂，将经CFSE标记的脾细胞通过TCR利用板结合CD3和可溶性CD28抗体激活并在有或没有胞外结构域特异性Ca_V1α1亚单元抗体下培育。如图15中所示，在阻断抗体存在下，发现CD4⁺和CD8⁺T细胞经历较少的细胞分裂。此实例阐明利用阻断抗体抑制Ca_V1.4功能减小TCR激活之后的T细胞增殖。

实例4：CA_V1.4钙通道在B淋巴细胞中的作用.

实施以下试验以测定Ca_V1.4在B细胞生物学中的生理功能。

实验方法：

小鼠：先前已描述Cacnalf-/-小鼠(曼瑟等人，2005)。将这些小鼠与C57BL/6(CD45.2+)背景回交达至少13代。从杰克逊实验室(缅因州巴港)获得B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ(CD45.1+)小鼠。根据加拿大动物保护协会和英属哥伦比亚大学动物实验委员会(theAnimalCareCommitteeoftheUniversityofBritishColumbia)设定的指导方针执行研究。

流式细胞术：为研究B细胞发育，制备骨髓、脾脏和腹膜腔灌洗液的单细胞悬浮液且在红细胞溶解后，将细胞在冰上利用各种抗体对细胞表面标志物染色30分钟用于鉴别特定B细胞子集，如图中所指示。为评价BAFF受体的表面表达，将脾细胞用BAFF受体、B220、IgM、CD21和CD23抗体进行表面染色。使用BD^TMLSRII流式细胞仪(BD生物科学)利用FACSDiva^TM软件采集数据并利用FlowJo软件(翠丝塔)进行分析。

脾B细胞纯化和活体外刺激：对于原代鼠类B细胞纯化，从野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾脏制备单细胞悬浮液。红细胞溶解之后，使用EasySep小鼠B细胞富集试剂盒(干细胞技术公司)根据制造商说明书阴性选择B淋巴细胞。然后将已通过流式细胞进行分析通常＞90％B220+的经纯化脾B淋巴细胞重新悬浮于补充有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、50μMβ-巯基乙醇、10mMHEPES和100U/mL盘尼西林(penicillin)、100μg/ml链霉素(streptomycin)的RPMI1640(英杰公司)中。为评价当刺激时表面激活标志物的表达水平，脾B细胞未经刺激或经F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgM(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))、抗小鼠CD40(易生物科学)或脂多糖(LPS，因沃唯真(Invivogen))以所指示浓度刺激。24小时之后，细胞用B220、CD69和CD86抗体染色并通过流式细胞进行分析。

对于增殖分析，将经纯化的B淋巴细胞用2uM羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE，分子探针公司(MolecularProbes))染色并在存在或不存在所指示浓度的抗IgM或LPS下培养。72小时后，通过流式细胞进行分析CFSE稀释。

为评价当BAFF刺激时B细胞的存活，将经纯化脾B细胞在存在或不存在所指示浓度的重组小鼠BAFF(R＆D系统)下培养72小时。利用碘化丙啶(propidiumiodide)(分子探针公司)染色之后，通过流式细胞术评价活细胞的百分数。使用BD^TMLSRII流式细胞仪(BD生物科学)利用FACSDiva^TM软件采集数据并利用FlowJo软件(翠丝塔)进行分析。

骨髓嵌合体：将来自CD45.2+野生型或Cacnalf-/-小鼠的供体骨髓与来自CD45.1+CD45.2+同基因型野生型小鼠的竞争骨髓以1∶1的比率混合。将每小鼠总共3×10⁶个骨髓细胞静脉内注射到经历1,100拉德γ辐照的受体CD45.1+野生型小鼠中。重构后8周，收集脾脏、骨髓和腹膜腔细胞用于分析。

细胞质和线粒体Ca²⁺测量：为研究Ca_V1.4在B细胞Ca²⁺通量中的参与，在室温下将来自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾细胞加载存于含有2％FBS的HBSS中的细胞内钙染料富洛4和富拉红(分子探针公司)达45分钟。洗涤之后，细胞在冰上用B220抗体表面染色达30分钟。将样品悬浮于RPMI中并在刺激之前在37℃下预热15分钟。在所指示时间点下将细胞用30μg/mLF(ab′)2片段山羊抗小鼠IgM(杰克逊免疫研究公司)、1μM毒胡萝卜内酯(分子探针公司)或1μg/mL离子霉素(西格玛公司(Sigma))刺激。通过添加乙二醇四乙酸(EGTA)实施细胞外Ca²⁺的螯合。将脾B淋巴细胞(B220+)中的细胞内Ca²⁺水平以富洛4/富拉红随时间的比率绘制曲线。为评价Cav1.4缺乏是否导致线粒体钙摄入的变化，将来自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠的脾细胞加载罗德2(Rhod-2)(分子探针公司)(线粒体Ca²⁺指示剂)并通过流式细胞进行分析。罗德2在加载到细胞中之前被还原为二氢罗德2，其已展示改良细胞溶质和线粒体局部化之间的辨别。罗德2标记的细胞然后用B220抗体染色并如上文所指示在存在或不存在用以破坏线粒体膜电位的羰基氰基3-氯苯腙(carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone，CCCP，分子探针公司)或用以螯合细胞外Ca2⁺的EGTA下进行刺激。在来自野生型C57BL/6或Cacnalf-/-小鼠加载有细胞内钙染料富洛4和富拉红的脾细胞中实施平行试验以评价细胞内和线粒体钙水平变化之间的关系。在BD^TMLSRII流式细胞仪上使用FACSDiva^TM软件采集数据并利用Flowjo(翠丝塔)分析。

TNP-聚蔗糖免疫：为引起T细胞非依赖性2型抗体应答，将年龄和性别匹配的C57BL/6和Cacnalf-/-小鼠腹腔内注射50μg2，4，6-三硝基苯酚(TNP)-氨基乙基羧甲基(AECM)-蔗聚糖(生物研究技术公司(BiosearchTechnologies))。在免疫之前且在注射之后7天收集血清并通过酶联免疫吸附分析(ELISA)进行分析。ELISA板在4℃下用TNP-BSA涂布过夜，洗涤并用1％(vol/vol)BSA在37℃下封阻1小时。然后添加血清样品的连续稀释液并在37℃下培育1小时。将板洗涤之后，添加辣根过氧化物酶偶联抗小鼠IgM或抗小鼠IgG3(南方生物科技)并在37℃下再培育1小时，随后与SureBlueReserve四甲基联苯胺底物溶液(KPL)反应并在450nm下测量吸光度。

统计学分析。利用GraphpadPrism软件使用双尾未配对司徒登氏t检验计算统计显著性。将p＜0.05的值视为显著。数据表示为平均值±SD。

结果

Ca_V1.4缺乏的小鼠在骨髓中展示正常B淋巴细胞发育。

图22A阐明，Ca_V1.4缺乏的小鼠在骨髓中的B淋巴细胞的频率和数目未改变。通过经B220抗体标记的骨髓细胞的流式细胞分析来测定骨髓中的B淋巴细胞的频率(淋巴细胞的百分数)和总数。图22B阐明，Ca_V1.4缺乏的小鼠从前祖B细胞(pre-pro-Bcell)阶段到未成熟阶段具有未改变的进展，但骨髓中的再循环成熟B淋巴细胞的数目有明显减少。骨髓中每一B淋巴细胞(B220+)子集的总数是通过经各种抗体标记的细胞的流式细胞分析来测定。根据哈迪门控方案(Hardygatingscheme)定义各群：前祖B细胞，B220+CD43+BP-1-HSA-；祖B细胞，B220+CD43+BP-1-HSA+；早期前B细胞，B220+CD43+BP-1+HSA+；晚期前B细胞，B220+CD43-IgM-IgD-；未成熟前B细胞，B220+CD43-IgM+IgD-；和再循环成熟B细胞(成熟)，B220+CD43-IgM+IgD+。^**p＜0.01。

Ca_V1.4缺乏的小鼠展示改变的脾B淋巴细胞成熟。

图23A阐明Ca_V1.4缺乏的小鼠展现减小的脾B细胞的频率和数目。通过经B220抗体标记的脾细胞的流式细胞分析来测定脾脏中的B淋巴细胞的频率(淋巴细胞的百分数)和总数。图23B阐明，Ca_V1.4缺乏的小鼠展现改变的脾B细胞子集的百分数，其中边缘区B细胞的频率和数目显著减小。通过经针对所指示表面分子的抗体标记的脾细胞的流式细胞分析来测定脾脏中每一B淋巴细胞(B220+)子集的的频率和总数。B细胞群定义如下：过渡期T1，CD93+CD23-IgMhighIgD-/lowCD21/35-/low；过渡期T2，CD93+CD23+IgMhighIgDhighCD21/35low；过渡期T3，CD93+CD23+IgMlowIgDhighCD21/35low；滤泡型I(Fo1)，CD93-CD23+IgMlowIgDhighCD21/35int.；滤泡型II(Fo2)，CD93-/lowCD23+IgMhighIgDhighCD21/35int.；边缘区前体(MZP)CD93-/lowCD23+sIgMhighCD1d+IgDhighCD21/35high；和边缘区(MZ)CD93-CD23-IgMhighIgDlowCD21/35high。^*p＜0.05，^**p＜0.01和^***p＜0.001。

Cav1.4缺乏导致改变的腹膜腔B细胞区室。

图24阐明Cav1.4缺乏导致改变的腹膜腔B细胞区室。A.通过经B220抗体标记的细胞的流式细胞分析来测定腹膜腔中B淋巴细胞的频率(淋巴细胞的百分数)。B.通过经B220、CD11b和CD5抗体标记的细胞的流式细胞分析来测定腹膜腔中每一B淋巴细胞(B220+)子集的百分数。B细胞群定义如下：常规B2B细胞，B220+CD11b-；B1aB细胞，B220+CD11b+CD5+；和B1bB细胞，B220+CD11b+CD5-。^**p＜0.01和^***p＜0.001。

细胞固有的Cav1.4功能是正常B细胞发育所需的。

图25阐明细胞固有的Cav1.4功能是正常B细胞发育所需的。重构后8周分析静脉内注射野生型CD45.1+CD45.2+(竞争者)加野生型CD45.2+(供体)骨髓或野生型CD45.1+CD45.2+(竞争者)加Cacnalf-/-CD45.2+(供体)骨髓的1∶1混合物的经致死辐照的同基因型CD45.1+野生型受体小鼠的B细胞发育的流式细胞术。结果表示为骨髓(A)、脾脏(B)和腹膜腔(C)中CD45.2+供体淋巴细胞对CD45.1+CD45.2+竞争者淋巴细胞的比率(+/+蓝色正方形，野生型CD45.2+供体对CD45.1+CD45.2+竞争者细胞；-/-红色三角形，Cacnalf-/-CD45.2+供体对CD45.1+CD45.2+竞争者细胞)。B细胞群定义如下：在骨髓中，总B细胞，B220+；祖B细胞，B220+IgM-CD43+；前B细胞，B220+IgM-CD43-；未成熟B细胞，B220lowIgM+；和再循环成熟B细胞，B220highIgM+；在脾脏中，过渡期T1B细胞，B220⁺IgM⁺CD21^-CD23^-；过渡期T2B细胞，B220⁺IgM⁺CD21⁺CD23⁺；滤泡B细胞，B220⁺IgM^loCD21^mid；和边缘区B细胞，B220⁺IgM⁺CD21⁺CD23^-；且在腹膜腔中，常规B2B细胞，B220+CD11b-；B1aB细胞，B220+CD11b+CD5+；且B1bB细胞，B220+CD11b+CD5-。

Ca_V1.4缺乏导致B细胞中受损的B细胞受体和毒胡萝卜内酯诱导的Ca²⁺应答。

图26阐明Ca_V1.4缺乏导致B细胞中受损的B细胞受体和毒胡萝卜内酯诱导的Ca²⁺应答。将野生型(+/+，蓝色线)和Cacnalf-/-(-/-，红色线)脾细胞加载细胞内Ca²⁺染料富洛4和富拉红，利用B220抗体进行表面染色并通过流式细胞进行分析。将脾B淋巴细胞(B220+)中的细胞内Ca²⁺水平以富洛4/富拉红随时间的比率绘制曲线。将脾B淋巴细胞用抗IgM(BCR)、离子霉素(Ion)或毒胡萝卜内酯(Tg)在所指示时间点下刺激。通过EGTA添加螯合细胞外Ca²⁺。

Cav1.4缺乏导致受损的B细胞受体诱导的线粒体Ca²⁺应答。

图27阐明Cav1.4缺乏导致受损的B细胞受体诱导的线粒体Ca²⁺应答。将野生型(+/+，蓝色线)和Cacnalf-/-(-/-，红色线)脾细胞加载细胞内Ca²⁺染料富洛4和富拉红(A)或线粒体Ca²⁺染料罗德2(B)，利用B220抗体进行表面染色并通过流式细胞进行分析。将脾B淋巴细胞(B220+)中的细胞内Ca²⁺水平以富洛4/富拉红随时间的比率绘制曲线。将细胞用抗IgM(BCR)或离子霉素(Ion)在所指示时间点下在存在或不存在用以破坏线粒体膜电位的羰基氰基3-氯苯腙或用以螯合细胞外Ca2⁺的EGTA下进行刺激。

Ca_V1.4缺乏的B细胞展示缺陷性B细胞受体介导的激活。

图28阐明Ca_V1.4缺乏的B细胞展示缺陷性B细胞受体介导的激活。野生型(+/+，蓝色线)和Cacnalf-/-(-/-，红色线)脾细胞未经刺激(灰色)或经抗IgM、抗CD40或LPS以所指示浓度刺激24小时，利用B220、CD69(A)和CD86(B)抗体进行表面染色并通过流式细胞进行分析。划分线之上的数值代表表面标志物上调的脾B细胞(B220+)的百分数。

Ca_V1.4缺乏的B细胞展示减小的B细胞受体诱导的增殖。

图29阐明Ca_V1.4缺乏的B细胞展示减小的B细胞受体诱导的增殖。野生型(+/+，蓝色线)和Cacnalf-/-(-/-，红色线)经CFSE标记的脾细胞未经刺激(灰色)或经抗IgM或LPS以所指示浓度刺激72小时且然后利用B220抗体进行表面染色并通过流式细胞进行分析。划分线之上的数值代表分裂细胞的百分数。

Cav1.4缺乏的脾B细胞响应BAFF展示减小B细胞激活因子(BAFF)受体的表达和较低的存活率。

图30阐明Cav1.4缺乏的脾B细胞响应BAFF展示减小B细胞激活因子(BAFF)受体的表达和较低的存活率。A.来自野生型(+/+，黑色)和Cacnalf-/-(-/-，灰色)小鼠的总B220+脾B细胞和脾B细胞子集中的BAFF受体的表面表达的流式细胞分析。B细胞群定义如下：过渡期T1B细胞，B220⁺IgM⁺CD21^-CD23^-；过渡期T2B细胞，B220⁺IgM⁺CD21⁺CD23⁺；滤泡B细胞，B220⁺IgM^1oCD21^mid；和边缘区B细胞，B220⁺IgM⁺CD21⁺CD23^-。B.将来自野生型(+/+，蓝色线)和Cacnalf-/-(-/-，红色线)小鼠的经纯化脾B细胞在存在或不存在所指示浓度的重组小鼠BAFF下培养72小时且然后用碘化丙啶染色。通过流式细胞术评价活细胞(碘化丙啶阴性细胞)的百分数。^*p＜0.05和^**p＜0.01。

Ca_V1.4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(T细胞非依赖性2型抗原)免疫之后产生受损的抗体应答。

图31阐明Ca_V1.4缺乏的小鼠在用TNP-聚蔗糖(T细胞非依赖性2型抗原)免疫之后产生受损的抗体应答。野生型(n＝5)和Cacnalf-/-(n＝5)小鼠腹腔内注射TNP-聚蔗糖并通过ELISA测定免疫后所引发的特异性抗体的水平。在第0天(野生型，+/+黑色线；Cacnalf-/-，-/-灰色线)和免疫后第7天(野生型，+/+蓝色线；Cacnalf-/-，-/-红色线)的TNP特异性抗IgM(A)和抗IgG3(B)抗体应答。

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说明书中所引用的所有专利、公开案(包括公开的专利申请案)的揭示内容和数据库条目明确地以其整体引用的方式并入本文中，并入的程度好像每一所述个别专利、公开案和数据库条目均明确并个别地指示以引用的方式并入一般。

尽管已参照某些特定实施例描述本发明，但本发明的各种修改对所属领域的技术人员将显而易见，而不背离本发明的精神和范围。对所属领域的技术人员将显而易见的所有这些修改均打算包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (24)

1.一种特异性结合到Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域的药剂在制备用于调控表达所述Ca_V1.4剪接变体的细胞的功能的药物中的用途，其中所述药剂到所述Ca_V1.4剪接变体的结合抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性且其中所述细胞是T细胞或B细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述T细胞的所述功能包含T细胞成熟。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述T细胞的所述功能包含抗原结合。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述B细胞的所述功能包含B细胞成熟。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述B细胞的所述功能包含BCR诱导的激活。

6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的用途，其中所述药剂是抗体或适体。

7.一种Ca_V1.4抑制剂在制备用于调控个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述Ca_V1.4抑制剂结合到在T细胞或B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述Ca_V1.4抑制剂是抗体或适体。

9.一种筛选用于调控免疫应答的治疗剂的体外方法，其包含以下步骤：

使表达Ca_V1.4剪接变体的T细胞或B细胞与测试药剂接触，以及

测定所述测试药剂是否抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性，

其中将抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性的测试药剂鉴别为治疗剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述测试药剂是能够结合到所述Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域的药剂。

11.根据权利要求9或10中任一权利要求所述的方法，其中所述药剂是抗体或适体。

12.一种特异性结合到在T细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域的Ca_V1.4抑制剂在制备用于抑制T细胞功能的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述T细胞功能包含T细胞成熟。

14.根据权利要求12所述的用途，其中所述T细胞功能包含抗原结合。

15.一种特异性结合到在B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域的Ca_V1.4抑制剂在制备用于抑制B细胞功能的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述B细胞功能包含B细胞成熟。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述B细胞功能包含BCR诱导的激活。

18.根据权利要求12到17中任一权利要求所述的用途，其中所述Ca_V1.4抑制剂是抗体或适体。

19.一种Ca_V1.4抑制剂在制备用于抑制个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述Ca_V1.4抑制剂结合到在T细胞和/或B细胞中表达的Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述Ca_V1.4抑制剂是抗体或适体。

21.根据权利要求19所述的用途，其中所述个体具有自体免疫疾病。

22.一种筛选免疫阻抑剂的体外方法，其包含以下步骤：

使表达Ca_V1.4剪接变体的T细胞和/或B细胞与测试药剂接触，以及

测定所述测试药剂是否抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性，

其中将抑制所述Ca_V1.4剪接变体的活性的测试药剂鉴别为免疫阻抑剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述测试药剂是能够结合到所述Ca_V1.4剪接变体的胞外结构域的药剂。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述药剂是抗体或适体。