WO2017138660A1 - 免疫機能の検査方法、がん患者の選別方法、がんの治療効果予測方法、細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤、がん治療薬の効果のモニタリング方法 - Google Patents

免疫機能の検査方法、がん患者の選別方法、がんの治療効果予測方法、細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤、がん治療薬の効果のモニタリング方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for examining immune function, a method for screening cancer patients, a method for predicting the therapeutic effect of cancer, an agent for increasing intracellular calcium ion concentration, and selective effector memory (EM) and effector (eff) in tumor tissue.
  • the present invention relates to a method for monitoring the effects of a function improver and a cancer therapeutic agent.
  • this method requires a culture period of 1 to 2 weeks, it does not necessarily reflect the real-time lymphocyte function in the patient.
  • the process of stimulating culture with an antigenic peptide often induces nonspecific lymphocyte proliferation and often gives false positive results.
  • Patent Document 1 discloses that metformin has an effect enhancing action of a chemotherapeutic agent, but it is shown in the Examples that metformin itself does not have a therapeutic effect on cancer.
  • Non-Patent Document 1 discloses the mechanism of action of metformin, which is a therapeutic agent for type 2 diabetes. *
  • Non-patent document 2 suggests that metformin has an anticancer effect.
  • Patent Document 2 discloses that a biguanide antidiabetic drug containing metformin improves the function of immune exhausted CD8 + T cells.
  • the main object of the present invention is to provide a technique effective for activation and evaluation of the immune system.
  • the inventor has the following immunological function testing method, cancer patient screening method, cancer therapeutic effect prediction method, intracellular calcium ion concentration increasing agent, effector memory (EM) and effector (eff) in tumor tissue It is intended to provide a method for monitoring the effects of selective function improvers and cancer therapeutic agents.
  • Item 1 Peripheral blood of a human subject is collected, and after applying an immunostimulant, the transition of calcium ion concentration in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or CD8 T cells is examined.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • combination therapy of at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin and another cancer therapeutic agent A method for screening cancer patients to which a combination therapy of at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin and another cancer therapeutic agent is applied as a cancer patient to be performed.
  • Item 3. Item 3. The method for selecting a patient according to Item 2, wherein the other cancer therapeutic agent is an anti-PD-1 antibody, aspirin, statin, curcumin, berberine, royal jelly or propolis.
  • Item 4 A method for predicting the therapeutic effect on a cancer patient of a combination therapy of at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin and another cancer therapeutic agent, comprising the following steps (1) to (2): (1) Evaluate whether intracellular calcium ion concentration increases transiently or continuously when mononuclear cells (PBMC) contained in peripheral blood collected from cancer patients are immunostimulated And (2) when the intracellular calcium ion concentration of PBMC at the time of immune stimulation rises transiently and then falls rapidly, at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin, and metformin and other The process of predicting that a combination therapy of cancer drugs is likely to have a therapeutic effect.
  • PBMC mononuclear cells
  • a method for treating cancer patients comprising the following steps (1) to (2): (1) Evaluate whether intracellular calcium ion concentration increases transiently or continuously when mononuclear cells (PBMC) contained in peripheral blood collected from cancer patients are immunostimulated Process, (2) At least one selected from the group consisting of phenformin, buformin, and metformin and other cancer therapeutic agents when the intracellular calcium ion concentration of PBMC at the time of immune stimulation decreases transiently and then decreases rapidly (3) from the group consisting of phenformin, buformin, and metformin to predict that the combination therapy is likely to have a therapeutic effect, and (3) patients predicted to have a high therapeutic effect in step (2) Administering at least one selected as well as other cancer therapeutic agents. Item 6.
  • PBMC mononuclear cells
  • An agent for increasing intracellular calcium ion concentration in CD8 T cells by immunostimulation comprising at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin.
  • Item 7. The agent for increasing the intracellular calcium ion concentration of CD8 T cells by immunostimulation according to Item 6, which selectively increases the intracellular calcium ion concentration of CD8 T cells in the tumor tissue.
  • Item 8 A selective function enhancer for effector memory (EM) and effector (eff) in tumor tissue, comprising at least one member selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin.
  • Item 9 A cancer therapeutic agent administered to a cancer patient having a glucose concentration in a tumor tissue of 0.5 to 1.5 mM, comprising at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin.
  • a method for monitoring the effect of a cancer therapeutic agent comprising the following steps 1) to 3): Step 1) Separating intratumoral lymphocytes from cancer tissue, Step 2) Analyzing the glucose transporter (Glut1) expression level of the isolated tumor infiltrating lymphocytes, and Step 3) Cancer treatment that has already been administered to the cancer patient based on the analyzed expression level of Glut1 A step of determining / evaluating whether or not the drug is effective (where the cancer tissue is extracted from a cancer patient after administration of the cancer therapeutic agent).
  • Item 11 Item 10. The method for monitoring the effect of a cancer therapeutic agent according to Item 9, wherein the cancer therapeutic agent is selected from the group consisting of a cancer vaccine, an immune checkpoint inhibitor, phenformin, buformin, and metformin.
  • Item 12 The method for monitoring the effect of a cancer therapeutic agent according to Item 10 or 11, wherein the Glut1 expression level is analyzed by a flow cytometer.
  • Item 13. The method for monitoring the effect of the cancer therapeutic agent according to any one of Items 10 to 12, wherein the tumor infiltrating lymphocytes are CD8 T cells.
  • Item 14. Any one of Items 10 to 13, wherein the step 3 comprises culturing the isolated tumor infiltrating lymphocytes in a medium having a glucose concentration of 0.1 mM or more for 2 hours or more, and then analyzing a glucose transporter (Glut1) expression level.
  • Glut1 glucose transporter
  • Cancer is confined to a part of the body and there are a small number of immune cells in the tumor tissue, but even if peripheral blood is collected, immune cells that have come into contact with the cancer are diluted significantly to normal values or Although it seems to show a close figure, in fact, it was shown that the immune cells in the peripheral blood of cancer patients are totally impaired, including antigens not related to cancer. Decreased immune cell function is promoted by radiation therapy, aging, genetic factors, a biased diet, lack of sleep, etc., but measuring the intracellular calcium concentration of peripheral blood immune cells improves the overall immune status. It will be easy to evaluate.
  • phenformin, buformin and metformin preferably a combination therapy of these and other cancer therapeutic agents such as anti-PD-1 antibody is applied.
  • the intracellular calcium ion concentration of PBMC including CD8 T cells when receiving immune stimulation is considerably lower than that of healthy subjects. It leads to success. Since the calcium ion concentration does not significantly exceed the level of healthy individuals, side effects such as inflammation and allergies due to excessive activation of the immune system are not a problem.
  • At least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin and an anti-PD-1 antibody each greatly increase the number of immune cells (eff and EM) required for complete remission of the cancer, and Among the three cytokines (IL-2, TNF ⁇ , IFN ⁇ ), it is possible to selectively increase the proportion of CD8 T cells that are highly active in producing two or more cytokines and that can produce one or less cytokines. The number rather decreases. As a result, immunity against cancer cells can be significantly increased. Furthermore, when at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin is combined with an anti-PD-1 antibody, the number of immune cells can be increased synergistically.
  • Effector T cells (eff) and effector memory T cells (EM) are important for cancer immunotherapy, and central memory T cells (CM) are not important unless a cancer vaccine is applied.
  • the present invention that selectively increases the number and function of EM and EM is effective for improving the therapeutic results of cancer immunotherapy.
  • a tumor tissue having a glucose concentration as low as 1 mM is known and the immune function is activated even in such a low glucose environment, a cancer having such a low glucose state cancer Particularly suitable for patient treatment.
  • the monitoring of the effect of a cancer drug is performed by administering a cancer drug to a cancer patient, then removing the tumor tissue from the cancer patient and separating the tumor-infiltrating lymphocytes (particularly tumor-infiltrating CD8T) from the removed cancer tissue.
  • (Lymphocyte) glucose transporter expression level can be examined to determine whether the cancer drug is effective or to evaluate the effectiveness of the cancer drug.
  • CM central memory T cells
  • EM effector memory T cells
  • eff effector T
  • 2-NBDG effector memory T cells
  • peripheral blood immune cells peripheral blood immune cells (mononuclear cells (PBMC), especially CD8 T cells)
  • PBMC peripheral blood immune cells
  • an immunostimulant such as PMA (phorbol myristate acetate) or ionomycin
  • the immune cells of healthy individuals gradually increase the intracellular calcium concentration for 50 to 150 seconds, and the necessary cytokines It can be released and it can be seen that normal immune function can be maintained.
  • the immune cells of cancer patients are stimulated with an immunostimulant, the intracellular calcium concentration increases transiently, but then rapidly decreases.
  • the intracellular calcium concentration can be determined by staining with an anti-CD8 antibody, Fluo4, FuraRed, and measuring with a flow cytometer after washing.
  • the intracellular calcium concentration can be determined by staining with an anti-CD8 antibody, Fluo4, FuraRed, and measuring with a flow cytometer after washing.
  • Examples of immune cells for evaluating the expression level of glucose transporter include tumor infiltrating lymphocytes, preferably tumor infiltrating CD8T lymphocytes.
  • Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) unlike tumor tissues, have a sufficiently high blood glucose concentration, so the expression level of the glucose transporter is already high and is not suitable for this test.
  • the expression level of the glucose transporter can be determined by staining with an anti-glucose transporter antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD8 antibody, etc., and analyzing with a flow cytometer after washing.
  • cancer therapeutic agents that can be used in combination with the biguanide antidiabetic agents phenformin, buformin, and metformin are not particularly limited.
  • immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 antibodies, aspirin, statins , Curcumin, berberine, royal jelly, propolis, cancer vaccine and the like, and anti-PD-1 antibody and aspirin are more preferable.
  • an anticancer drug with an elevated glucose transporter is also included in the cancer therapeutics that can be used in combination.
  • the cancer therapeutic agent subject to the monitoring method of the present invention may be only one type, or a combination (concomitant drug) of two or more types of cancer therapeutic agents.
  • the cancer therapeutic agent that is the target of the monitoring method is not particularly limited as long as it is a cancer therapeutic agent that acts on the immune system, for example, single administration of a biguanide antidiabetic such as phenformin, buformin, metformin, or Combination of phenformin, buformin or metformin and at least one selected from the group consisting of immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 antibodies, aspirin, statins, curcumin, berberine, royal jelly, propolis, cancer vaccine And a combination drug of an anti-PD-1 antibody and a biguanide antidiabetic drug and a combination drug of aspirin and a biguanide antidiabetic drug are preferable.
  • cancer therapeutic agents to be selected may be administered in combination with appropriate pharmaceutical carriers, or may be administered in combination with different formulations.
  • Combinations and separate preparations may be oral or parenteral, and examples include tablets, capsules, powders, inhalants, liquids, drinks, injections, suppositories and the like. Such preparations may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers. It can also be administered as a suspension.
  • solid preparations such as tablets, pills, powders, granules, and fine granules, for example, sodium bicarbonate, calcium carbonate, starch, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose and other carriers, calcium stearate, stearic acid
  • additives such as magnesium and glycerin
  • enteric coatings are sprayed by spraying organic solvents or water solutions of enteric substances such as cellulose acetate phthalate, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, polyvinyl alcohol phthalate, styrene-maleic anhydride copolymer, methacrylic acid-methyl methacrylate copolymer, etc.
  • enteric preparation can contain other auxiliary agents, fragrances, stabilizers or preservatives which are usually used as necessary.
  • cancer therapeutic agents can activate the immune function, but are more effective for patients with a decreased immune function. Therefore, when cancer chemotherapy is performed using the biguanide antidiabetic drugs phenformin, buformin, metformin and other cancer drugs, the intracellular calcium concentration does not increase much due to immune stimulation of peripheral blood immune cells, It can be expected to be effective for cancer patients whose immune function has declined.
  • phenformin When phenformin is used as an anti-diabetic drug, side effects such as lactic acidosis are problematic, but when used for cancer treatment, side effects are not a problem because there are a dosing period and a drug holiday.
  • the biguanide antidiabetic drugs phenformin, buformin, and metformin can increase the calcium concentration in CD8 T cells when immune stimulation is performed (FIG. 1).
  • immune stimulation is not performed, the intracellular calcium concentration does not change regardless of the presence or absence of a biguanide antidiabetic agent.
  • the immune system is not significantly activated as compared with a healthy person. That is, biguanide antidiabetics have the effect of increasing the potential ability to increase calcium levels when the immune system needs to work.
  • CD8 T cells present in tumor tissue is lower than that in lymph nodes (LN) and hardly increased by immunostimulation, but in the presence of biguanide antidiabetic drugs phenformin, buformin, and metformin Then, the calcium concentration in CD8 T cells can be greatly increased in response to immune stimulation (FIG. 1).
  • the dosage of phenformin, buformin, and metformin, which are biguanide antidiabetic drugs necessary for this purpose, is about 100 to 150 mg for adult phenformin and buformin, and about 500 to 2250 mg for metformin.
  • the biguanide antidiabetics phenformin, buformin, and metformin can enhance the uptake of effector (eff) and effector memory (EM) sugars that may be present locally in tumor tissues and are present in secondary lymphoid tissues
  • eff effector
  • EM effector memory
  • CM central memory
  • the dosage of phenformin and buformin, which are biguanide anti-diabetic drugs necessary for eff and EM activation, is about 100 to 150 mg per day for adults, and the dosage of metformin is about 500 to 2250 mg per day for adults.
  • the tumor tissue has a glucose concentration of about 1 mM or less (Cell 162: 1217-1228, 2015).
  • the biguanide antidiabetic drugs phenformin, buformin, and metformin cannot promote the cytokine production ability of CD8 T cells when the glucose concentration in the tumor tissue is 0.1 mM. It is possible to promote the cytokine production performance of CD8 T cells at 1 mM, which is similar to the glucose concentration of CD8 T cells, increase the activity of CD8 T cells in malnourished tumor tissues, and kill cancer cells.
  • phenformin, buformin, and metformin which are biguanide antidiabetics, can be used to treat tumor tissue having a glucose concentration of about 0.5 to 1.5 mM, preferably about 0.8 to 1.2 mM, and particularly preferably about 1 mM. It is useful as a cancer treatment for cancer patients.
  • the dosage of other cancer therapeutic agents can be appropriately selected based on the clinically used dose.
  • Monitoring of a cancer drug can be performed by the following steps 1) to 3). Step 1) Separating intratumoral lymphocytes from cancer tissue, Step 2) Analyzing the glucose transporter (Glut1) expression level of the isolated tumor infiltrating lymphocytes, and Step 3) Cancer treatment that has already been administered to the cancer patient based on the analyzed expression level of Glut1 A step of determining / evaluating whether or not the drug is effective (where the cancer tissue is extracted from a cancer patient after administration of the cancer therapeutic agent).
  • Step 1) Separating intratumoral lymphocytes from cancer tissue Step 2) Analyzing the glucose transporter (Glut1) expression level of the isolated tumor infiltrating lymphocytes, and Step 3) Cancer treatment that has already been administered to the cancer patient based on the analyzed expression level of Glut1
  • a step of determining / evaluating whether or not the drug is effective where the cancer tissue is extracted from a cancer patient after administration of the cancer therapeutic agent).
  • monitoring of cancer therapeutic agents can be performed by detecting the production amounts of three types of cytokines (IL-2, TNF ⁇ , IFN ⁇ ), detection of the production amounts of these cytokines is complicated. Since the present inventor has found that the glucose transporter (Glut1) expression level correlates with the production amounts of three kinds of cytokines, the cancer therapeutic agent is monitored by detecting the glucose transporter (Glut1) expression level. be able to. The removal of cancer tissue may be performed by surgery or by biopsy. The analysis of the glucose transporter (Glut1) expression level is preferably performed after culturing tumor-infiltrating lymphocytes separated from cancer patients in a medium having a glucose concentration of 0.1 mM or more for 2 hours or more.
  • Glut1 expression level is not necessarily high in tumor-infiltrating lymphocytes immediately after separation from a cancer patient, and the Glut1 expression level is increased by culturing in a medium having a glucose concentration of 0.1 mM or more, thereby facilitating analysis of the Glut1 expression level. be able to.
  • the glucose concentration in the medium is about 0.1 mM or more, preferably about 1 mM or more, more preferably about 5 mM or more, further preferably about 5 to 25 mM, particularly preferably about 10 to 25 mM, particularly about 15 to 25 mM.
  • the culture time is 1 hour or longer, preferably 2 hours or longer, more preferably 2 to 24 hours, further preferably about 3 to 12 hours, particularly preferably about 4 to 8 hours. The culture time is set so that the Glut1 expression level is high, and may be shorter when the glucose concentration is high, and longer culture is desirable when the glucose concentration is low.
  • the administration period of the cancer therapeutic agent to be monitored may be one day or longer, and is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 50 days, preferably 2 to 30 days.
  • lymphocytes obtained from tumor tissues particularly CD8 T cells, can be preferably used.
  • Cancer drugs that are evaluated for therapeutic effects include cancer vaccines, immune checkpoint inhibitors, phenformin, buformin, and metformin.
  • cancers to be treated with cancer therapeutic agents include solid cancers with low glucose concentration, such as melanoma, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder / bile duct cancer, Examples include biliary tract cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer and the like.
  • CD8 T cells Although the number of CD8 T cells is very small in the local cancer area, phenformin, buformin, metformin, and anti-PD-1 antibodies, which are biguanide antidiabetics, all greatly increase the number of CD8 T cells in the local cancer area. be able to. Furthermore, when the biguanide antidiabetic drugs phenformin, buformin, metformin and anti-PD-1 antibody are used in combination, not only can the number of CD8 T cells be increased, but also two cytokines (IL-2, TNF ⁇ , IFN ⁇ ) 2 The proportion of CD8 T cells producing more than a species can be greatly increased.
  • IL-2, TNF ⁇ , IFN ⁇ two cytokines
  • the dosage of phenformin and buformin, which are biguanide antidiabetics for obtaining such effects, is about 100 to 150 mg per day for adults, and the dosage of metformin is about 500 to 2250 mg.
  • Anti-PD-1 antibody The dose per adult is about 2 mg / kg.
  • the present invention further provides the following inventions.
  • An agent for increasing the number of CD8 T cells in tumor tissue comprising an anti-PD-1 antibody as an active ingredient and administered in combination with at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin.
  • a combination of at least one selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody and phenformin, buformin and metformin for increasing the number of CD8 T cells in tumor tissue.
  • An agent for increasing the number of CD8 T cells in a tumor tissue containing at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin for use in combination with an anti-PD-1 antibody.
  • An agent for increasing the number of CD8 T cells in a tumor tissue containing an anti-PD-1 antibody for use in combination with at least one selected from the group consisting of phenformin, buformin and metformin is used in combination.
  • Example 1 2 ⁇ 10 5 MO-5 (OVA-expressing B16 melanoma cell line) was transplanted intradermally into C57BL / 6 mice, and oral administration of 5 mg / ml metformin was started 7 days after transplantation by free drinking. On day 7 after the start of administration (14 days after transplantation), lymph node (LN) and tumor tissue (Tumor) were excised, and lymph node lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes were collected. The cells were washed with FCS ( ⁇ ) RPMI and then stained with anti-mouse CD3 antibody BV510, anti-mouse CD8 antibody APC-Cy7, 1 ⁇ M Fluo4, 1 ⁇ M Fura Red for 30 minutes at 37 ° C.
  • FCS ⁇
  • the cells were washed with FCS ( ⁇ ) RPMI kept at 37 ° C., and after washing, the background of intracellular calcium ions was measured with a flow cytometer for 30 seconds.
  • stimulation with 100 ng / ml PMA and 5 ⁇ M ionomycin was performed, and an increase in calcium ion in mouse CD8 T cells due to stimulation was measured (FIG. 1).
  • the intracellular calcium concentration in the metformin non-administered group ( ⁇ ) hardly increased by PMA / ionomycin stimulation, but in the metformin administered group (+), the intracellular calcium concentration increased by PMA / ionomycin stimulation. It was confirmed to rise.
  • Lymph nodes have high intracellular calcium levels even before PMA / ionomycin stimulation, and both the metformin administration group (+) and the non-administration group ( ⁇ ) increased intracellular calcium concentration due to PMA / ionomycin stimulation. Although it increased, the degree was larger in the metformin administration group (+).
  • metformin has an effect of increasing intracellular calcium concentration by immune stimulation, and that the action is particularly remarkable in CD8 T cells in tumor tissue.
  • Example 2 Detection of memory traits of antigen-specific tumor-infiltrating CD8 T cells and evaluation of glucose uptake in each cell fraction 2x10 5 MO-5 was transplanted intradermally into C57BL / 6 mice, and 5 mg by free drinking 7 days after transplantation Oral administration of / ml metformin was started. The tumor tissue was excised 7 days after the start of administration (14 days after transplantation), and tumor infiltrating lymphocytes were separated.
  • the cells were washed with 0.1% BSA / PBS, anti-mouse CD8 antibody APC-Cy7, anti-mouse CD62L antibody BV421, anti-mouse CD44 antibody PerCP, anti-mouse KLRG1 antibody APC, and 400 ⁇ M 2-NBDG (2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-d-glucose) was stained for 30 minutes at 4 ° C.
  • FIG. 2 Washed with 0.1% BSA / PBS and analyzed the frequency of antigen-specific tumor-infiltrating CD8 T cells, memory traits (CD44, CD62L, KLRG1) and deoxyglucose (2-NBDG) uptake in each cell fraction using a flow cytometer (FIG. 2).
  • metformin increases the number and proportion of effectors (eff) and effector memories (EM) and activates the glycolytic system with respect to the memory traits of tumor-infiltrating CD8 T cells. It has been found that the glycolysis system is inactivated by decreasing the number and proportion of memory.
  • Example 3 1x10 6 after thawing human PBMC (human peripheral blood mononuclear cells) cryopreserved from healthy people and cancer patients, washed with FCS (-) RPMI PBMC were stained with anti-human CD8 antibody APC-Cy7, 1 ⁇ M Fluo4, 1 ⁇ M Fura Red for 30 minutes at 37 ° C. After staining, the cells were washed with FCS ( ⁇ ) RPMI kept at 37 ° C., and after washing, the background of intracellular calcium ions was measured with a flow cytometer for 30 seconds.
  • Human PBMC can be easily measured by collecting peripheral blood, and metformin, or the combined effect of metformin and other drugs, is high in the cancer patient type of FIG. 3, but not in healthy individuals. Patients can be selected by measuring the calcium concentration of human PBMC. This result is unexpected because peripheral blood is thought to have a very low proportion of mononuclear cells in contact with cancer cells.
  • Example 4 The cryopreserved human PBMC of a cancer patient was thawed, cultured for 6 hours in the presence of FCS ( ⁇ ) RPMI 10 ⁇ M metformin, separated after culture, and washed with FCS ( ⁇ ) Glc ( ⁇ ) RPMI. After washing, the cells were stimulated with 50 ng / ml PMA and 2 ⁇ M ionomycin in the presence of 1 ⁇ M monensin for 6 hours using RPMI containing 0.1, 1, 10 mM Glc.
  • CD8 T cells producing three cytokines depend on the glucose concentration, and are the lowest at 0.1 mM, and there is no difference depending on the presence or absence of metformin, but the glucose concentration is 1 mM. In this case, it was revealed that the number of CD8 T cells producing three cytokines (IL-2, TNF ⁇ , IFN ⁇ ) by metformin was significantly increased.
  • Example 5 Tumor transplantation experiment (phenformin, aspirin treatment) OVA-expressing B16 melanoma cell line MO5 (2.5 ⁇ 10 5 ) was inoculated intradermally on the back of C57BL / 6 mice.
  • Four groups of 5 mice were prepared, including an untreated group (C), aspirin alone, phenformin (Phen) alone, and a combination of aspirin and phenformin starting 10 days after tumor cell inoculation.
  • Phenformin is a biguanide drug similar to metformin. Phenformin was given as a diet containing 0.5% from the 10th day after tumor cell inoculation. In addition, the food was replaced with normal food every 4 days.
  • the phenformin-containing diet was given only from the 10th day to the 14th day and from the 18th day to the 22nd day. Normal diets without phenformin were given between days 14-18 and 22-26.
  • the reason for selecting such an administration method is that phenformin daily administration results in death of mice due to side effects.
  • mice were given as food to stop drinking water.
  • Example 6 Intradermal injection of 2 x 10 6 tumors (MethA) into BALB / c at 8 weeks of age, followed by continuous intake of metformin (5 mg / mL) with free drinking from day 7, 3 days after treatment (day 10) and 6 days later On day 13, tumor infiltrating T cells (TIL) were isolated and stained with anti-CD8 antibody and anti-glucose transporter (Glut1) antibody. In addition, the cells were stimulated for 6 hours in the presence of PMA / Ionomycin / Monencin, stained with anti-CD8 antibody and anti-glucose transporter (Glut1) antibody, and analyzed with a flow cytometer. The results are shown in FIG. Although the expression of Glut1 tended to increase by PMA stimulation, a clear increase in the Glut1-positive population was observed in the group to which metformin had been administered in advance, including PMA stimulation (-).
  • Example 7 The multifunctionality of the Glut1-positive population in FIG. 6 was analyzed. Multifunctional CD8 T cells are the most powerful effector T cells.
  • TIL tumor-infiltrating T cells
  • Example 8 Eight-week-old BALB / c mice were injected intradermally with MethA (2 x 10 6 ) syngeneic tumors, and metformin (5 mg / mL) and N-acetylcysteine (NAC, 10 mg / mL) were administered from day 7 Started. Three days after treatment, tumor-infiltrating T cells (TIL) were isolated and cultured at 37 ° C for 0, 1, 3, and 6 hours, and then stained with various antibodies such as CD3, CD8, and glucose transporter (Glut1). Analysis was performed with a cytometer (FIG. 8).
  • TIL tumor-infiltrating T cells
  • CD8TIL immediately after separation from the tumor, GLUT-1 expression was stained with antibodies immediately after separation according to previous methods, and analyzed by a flow cytometer. Is difficult to detect. However, as shown by the arrows in FIG. 8, it was found that detection was possible by culturing in vitro for 3 to 6 hours. That is, in CD8TIL of a mouse that had been administered with metformin, a very high level of GLUT-1 expression was observed after 6 hours of culture. On the other hand, no increase in GLUT-1 expression was observed in the metformin non-administered group.
  • GLUT-1 is a receptor for glucose uptake
  • an increase in the expression of GLUT-1 in the cell membrane means an increase in glycolysis. Since the increase in cytoplasmic calcium ion concentration associated with T cell activation is maintained by enhanced glycolysis, the increase in GLUT-1 expression in this case can be considered synonymous with the increase in cytoplasmic calcium ion concentration.
  • Example 9 Syngeneic tumor MethA (2 x 10 6 ) was injected intradermally into 8-week-old BALB / c mice, and metformin (5 mg / mL) was started on day 7.
  • Tumor infiltrating T cells (TIL) 3 days after treatment
  • TIL Tumor infiltrating T cells
  • Glut1 glucose transporter
  • CD8TIL isolated from the tumor showed increased expression of GLUT-1 by culturing in vitro for 6 hours, which was found to be proportional to the glucose concentration in the culture medium.
  • the highest level of Glut-1 was observed at 6.1 mM glucose, ideally 25 mM.
  • Glucose at 25 mM is comparable to the glucose concentration in normal culture.
  • CD8TILT expressed Glut-1 even at a glucose concentration of 0.1 mM0.1 comparable to the glucose concentration in the tumor.
  • a glucose concentration of 0.1 mM is comparable to the glucose concentration in the tumor. Therefore, it is speculated that by administration of metformin, the glycolytic system of CD8TIL is enhanced even within the tumor and can attack the tumor.
  • CD8TIL-glut-1 when no glucose is present (glucose concentration 0 mM), CD8TIL-glut-1 is not expressed.
  • CD8TIL isolated from metformin-treated mice was significantly increased in Glut-1 expression after 6 hours of in vitro culture, which was found to be proportional to the glucose concentration in the culture medium. . It was found that the highest increase in Glut-1 expression was observed when the glucose concentration in the culture was 6.1 mM or more and 25 mM.
  • CD8TIL tumor-infiltrating CD8T cells
  • This method ie, the method of observing the expression level of Glut-1 with a flow cytometer after culturing CD8TIL in the presence of 25 mMmglucose for 6 hours is excellent in that it can detect the presence or absence of glycolytic system elevation of CD8TIL very easily and sensitively. It can be concluded that this is an inspection method.
  • This method is not limited to metformin, but is considered to be a universal method that can monitor the effects of any cancer immunotherapy, such as cancer vaccines and immune checkpoint inhibitors.
  • Tumor infiltrating lymphocyte (TIL) collection and culture protocol Tumor mass (3-4mm diameter) was removed from cancer patients by biopsy, etc., and mechanically disrupted with Medimachine (manufactured by ASONE Corporation) for 2 minutes. Collect and centrifuge at 1200 rpm for 5-10 minutes. Then, discard the supernatant and prepare the cell solution in RPMI medium (fetal calf serum may agglutinate so do not enter here) so that the concentration becomes 5 ⁇ 10 5 / mL. Add 5 ⁇ 10 5 cells / mL / well to the cells and incubate for 6 hours. After 6 hours, the cells are collected and transferred to a process of staining with antibodies.
  • Medimachine manufactured by ASONE Corporation
  • Example 11 In patients with stage I cancer, stage IIa cancer, and stage IV cancer, changes in calcium concentration enhancement due to PMA stimulation before and after metformin administration were measured.
  • Human PBMC human peripheral blood mononuclear cells
  • PMA human peripheral blood mononuclear cells
  • peripheral blood mononuclear cells PBMC
  • 1x10 6 lymphocytes were isolated at 37 ° C in the presence of 1 ⁇ g / ml anti-human CD8 antibody and 1 ⁇ M Fluo4 / FuraRed. Incubated for 30 minutes. Then, it is washed with AIM-V medium. After washing, AIM-V was added, and unstimulated (pre-stimulated) lymphocytes were captured by FACSCanto II for 20 seconds to capture baseline data. Thereafter, 100 ng / ml PMA / 2 ⁇ M ionomycin was added to stimulate, and immediately taken in by FACSCantoII and taken as post-stimulation data. Thereby, a waveform corresponding to the cytoplasmic calcium concentration was detected.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Example 12 Tumor transplantation experiment (Met, aspirin, abashimib and two drugs) OVA-expressing B16 melanoma cell line MO5 (2.5 ⁇ 10 5 ) was inoculated intradermally on the back of C57BL / 6 mice. Seven days after tumor cell inoculation, metformin (0.5%) was given to the mice by diet, aspirin (600 ⁇ g / mL) by free drinking, and abashimib (15 mg / kg) by intraperitoneal administration every other day. The results are shown in FIG. After the start of these treatments, the major axis and minor axis of the tumor on the sixth day were measured, and the tumor volume (mm 3 ) was calculated. It can be seen that the combined use of metformin and aspirin, or the combined use of metformin and abashimib has a higher tumor suppressing effect than the single agent.
  • Example 13 Tumor transplantation experiment (combination of 3 drugs, anti-PD-1 antibody, Met, aspirin) 3LL cells (2.0 ⁇ 10 5 ) were inoculated intradermally on the back of C57BL / 6 mice.
  • Metformin (0.5%) was treated with feed and aspirin (600 ⁇ g / mL) with free drinking. After the treatment was started, the major axis and minor axis of the tumor were measured, and the tumor volume (mm 3 ) was calculated. The results are shown in FIG. The combination of aspirin was found to increase the tumor suppressive effect of anti-PD-1 antibody + metformin.
  • Example 14 Tumor transplantation experiment (triple combination, anti-PD-1 antibody, Met, NDGA) 3LL cells (2.0 ⁇ 10 5 ) were inoculated intradermally on the back of C57BL / 6 mice. Five days after tumor cell inoculation, anti-PD-1 antibody (10 mg / kg) was administered intraperitoneally every 6 days after the first dose, so that the total was 4 times. Metformin and NDGA (Nordihydroguaiaretic acid) were treated with metformin (0.5%) feed or metformin (0.5%) and NDGA (0.1%) mixed feed. After the treatment was started, the major axis and minor axis of the tumor were measured, and the tumor volume (mm 3 ) was calculated. Survival was also observed. The results are shown in FIG. The combination of NDGA was found to increase the tumor suppressive effect of anti-PD-1 antibody + metformin and prolong survival.
  • Example 15 Tumor transplantation experiment (4,5 combined use) OVA-expressing B16 melanoma cell line MO5 (2.5 ⁇ 10 5 ) was inoculated intradermally on the back of C57BL / 6 mice. Seven days after tumor cell inoculation, metformin (0.5%) and NDGA (0.1%) were treated with mixed feed and aspirin (600 ⁇ g / mL) with free drinking. Furthermore, anti-PD-1 antibody (10 mg / kg) was administered by intraperitoneal administration every 6 days after the first administration, so that a total of 4 treatments were made. Abashimib (15 mg / kg) was administered intraperitoneally every 2 days after the first dose until the end of measurement.

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Abstract

本発明は、ヒト被験者の末梢血を採取し、免疫刺激剤を適用後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度の推移を検査し、免疫刺激剤の適用後に一過性にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇し、その後刺激前の状態に戻る場合に全身の免疫機能が低下していると判断し、免疫刺激剤の適用後にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇基調にある場合に全身の免疫機能は正常であると判断される、免疫機能の検査方法に関する。

Description

免疫機能の検査方法、がん患者の選別方法、がんの治療効果予測方法、細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤、がん治療薬の効果のモニタリング方法
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１６年２月１２日に出願された日本国特許出願第２０１６－２４３６３号明細書及び２０１６年１０月１８日に出願された日本国特許出願第２０１６－２０４２８４号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
　本発明は、免疫機能の検査方法、がん患者の選別方法、がんの治療効果予測方法、細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤、がん治療薬の効果のモニタリング方法に関する。
　がん免疫療法を適用するには、事前に免疫能を知る必要がある。
　末梢血リンパ球を抗原ペプチドで刺激培養し、１～２週間後に増えてきたリンパ球の癌細胞に対する細胞傷害活性を測定する、或いは、刺激に用いたペプチドで再刺激を行い、ＩＦＮγ産生を測定していた。
　しかしながら、このような方法では、１～２週間の培養期間が必要になるので、必ずしも患者体内のリアルタイムのリンパ球機能を反映しない。抗原ペプチドで刺激培養する過程は、時に非特異的なリンパ球増殖を誘発し、擬陽性の結果を示す場合が多々ある。
　特許文献１は、メトホルミンが化学療法剤の効果増強作用を有することを開示しているが、メトホルミン自身はがんの治療効果を有しないことが実施例で示されている。
　非特許文献１は、２型糖尿病治療薬であるメトホルミンの作用メカニズムを開示する。　　　
　非特許文献２は、メトホルミンが抗がん作用を有することを示唆している。
　特許文献２は、メトホルミンを含むビグアニド系抗糖尿病薬が免疫疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善することを開示する。
特表2013-503171 特開2014-214093
Nature 439, 682-687 (2006) J Exp Clin Med 2012; 4(3): 140-144
　本発明は、免疫系の賦活及び評価に有効な技術を提供することを主な目的とする。
　本発明者は、以下の免疫機能の検査方法、がん患者の選別方法、がんの治療効果予測方法、細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤、がん治療薬の効果のモニタリング方法を提供するものである。
　項１．　ヒト被験者の末梢血を採取し、免疫刺激剤を適用後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度の推移を検査し、免疫刺激剤の適用後に一過性にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇し、その後刺激前の状態に戻る場合に全身の免疫機能が低下していると判断し、免疫刺激剤の適用後にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇基調にある場合に全身の免疫機能は正常であると判断される、免疫機能の検査方法。
　項２．　項１の検査方法で全身の免疫機能が低下していると判断されたがん患者を、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法を行うがん患者として選別、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法を適用するがん患者の選別方法。
　項３．　他のがん治療薬が、抗ＰＤ－１抗体、アスピリン、スタチン、クルクミン、ベルベリン、ロイヤルゼリー又はプロポリスである、項２に記載の患者の選別方法。
　項４．　下記工程（１）～（２）を含む、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法のがん患者に対する治療効果を予測する方法：
　（１）がん患者から採取された末梢血に含まれる単核球（ＰＢＭＣ）を免疫刺激したときに細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇するか、持続的に上昇するかを評価する工程、及び
　（２）免疫刺激時のＰＢＭＣの細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇した後速やかに下降する場合、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法が治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
　項５．　下記工程（１）～（２）を含む、がん患者の治療方法：
　（１）がん患者から採取された末梢血に含まれる単核球（ＰＢＭＣ）を免疫刺激したときに細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇するか、持続的に上昇するかを評価する工程、
　（２）免疫刺激時のＰＢＭＣの細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇した後速やかに下降する場合、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法が治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
　（３）工程（２）において治療効果を示す可能性が高いと予測した患者に、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種並びに他のがん治療薬を投与する工程。
　項６．　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、免疫刺激によるＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤。
　項７．　腫瘍組織内のＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を選択的に上昇させる、項６に記載の免疫刺激によるＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤。
　項８．　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤。
　項９．　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍組織内のグルコース濃度が０．５～１．５ｍＭであるがん患者に投与されるがん治療薬。
　項１０．　以下の工程１）～工程３）を含む、がん治療薬の効果のモニタリング方法：
工程１）がん組織から腫瘍内リンパ球を分離する工程、
工程２）分離された腫瘍浸潤リンパ球のグルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを解析する工程、及び
工程３）解析されたＧｌｕｔ１の発現レベルに基づき、がん患者に既に投与していたがん治療薬が有効か否かを判定／評価する工程
（ここで、がん組織は、がん治療薬を投与後にがん患者から摘出されたものである。）。
　項１１．　がん治療薬が、がんワクチン、免疫チェックポイント阻害薬、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる、項９に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
　項１２．　Ｇｌｕｔ１発現レベルをフローサイトメーターにより解析する、項１０又は１１に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
　項１３．　腫瘍浸潤リンパ球がＣＤ８Ｔ細胞である、項１０～１２のいずれか１項に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
　項１４．　工程３が、分離された腫瘍浸潤リンパ球を２時間以上、０．１ｍＭ以上のグルコース濃度の培地中で培養し、その後グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを解析する、項１０～１３のいずれか１項に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
　がんは、体内の一部に限局し、腫瘍組織内には少数の免疫細胞は存在するものの、末梢血を採取してもがんに接触した免疫細胞は大幅に希釈されて正常値又はそれに近い数値を示すと思われるが、実際には、がん患者の末梢血の免疫細胞はがんと関係のない抗原を含めて全体的に機能低下していることが示された。免疫細胞の機能低下は、放射線治療、加齢、遺伝的要因、偏った食生活、睡眠不足などにより促進されるが、末梢血免疫細胞の細胞内カルシウム濃度を測定することで全身の免疫状態が簡単に評価できることになる。また、全身の免疫状態の評価により、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種、好ましくはこれらと他のがん治療薬、例えば抗ＰＤ－１抗体の併用療法を適用するがん患者を選別することができる。
　また、がん患者において、免疫刺激を受けたときのＣＤ８Ｔ細胞を含むＰＢＭＣの細胞内カルシウムイオン濃度は健常者と比較してかなり低いので、免疫刺激時のカルシウムイオン濃度を上げることは免疫療法の成功に繋がる。カルシウムイオン濃度は、健常人のレベルを有意に超えることはないので、免疫系の過剰な活性化による炎症、アレルギー等の副作用は問題にならない。
　がん細胞数は常に増加しているので、その増加よりもがん細胞を死滅させる速度が上回ることががんの完全緩解に必要である。フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と抗ＰＤ－１抗体は、各々がんの完全緩解に必要とされる免疫細胞（ｅｆｆとＥＭ）の数を大きく増大し、かつ、３つのサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）のうち２種以上のサイトカイン産生能が高く活性なＣＤ８Ｔ細胞の割合を選択的に増加させることができ、１種以下のサイトカインを産生するＣＤ８Ｔ細胞の数はむしろ減少する。その結果、がん細胞に対する免疫力を格段に高めることができる。さらに、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と抗ＰＤ－１抗体を組み合わせると免疫細胞数を相乗的に増加できる。
　がんの免疫療法にはエフェクターＴ細胞（ｅｆｆ）とエフェクター・メモリーＴ細胞（ＥＭ）が重要であり、セントラル・メモリーＴ細胞（ＣＭ）は癌ワクチン等を施工しない限りは重要ではないので、ｅｆｆとＥＭの数及び機能を選択的に増加させる本発明は、がんの免疫療法の治療成績を上げるために有効である。
　さらに、グルコース濃度は、１ｍＭ程度の低濃度である腫瘍組織が知られており、このような低グルコース環境下でも免疫機能が賦活されるので、このような低グルコース状態のがんを有するがん患者の治療に特に適している。
　がん治療薬の効果のモニタリングは、がん治療薬をがん患者に投与した後に、がん患者から腫瘍組織を摘出し、摘出したがん組織から分離した腫瘍浸潤リンパ球(特に腫瘍浸潤CD8Tリンパ球)のグルコーストランスポーター発現レベルを調べ、がん治療薬が有効か否かを判定もしくはがん治療薬の有効性を評価して実行することができる。
マウス腫瘍浸潤リンパ球における細胞内カルシウムイオン検出。 抗原特異的腫瘍浸潤CD8 T細胞のメモリー形質の検出および各細胞分画におけるグルコース取り込みの評価。中央図において、セントラル・メモリーＴ細胞（ＣＭ）エフェクター・メモリーＴ細胞（ＥＭ）及びエフェクターＴ（ｅｆｆ）を示す。右図において、エフェクター・メモリーＴ細胞（ＥＭ）とエフェクターＴ細胞（ｅｆｆ）とが、2-NBDGを取り込んでいることが分かる。 ヒト末梢血単核球における細胞内カルシウムイオン検出。 低グルコース下でのヒトCD8 T細胞における多機能性解析。末梢血リンパ球（PBMC）w/o 10μMメトホルミンを6時間培養した。次いで、洗浄後、各グルコース濃度で12時間培養した。最後の6時間はPMA刺激の下で培養した。培養後、細胞内サイトカインを抗体で染色し、FACS解析を行なった。がん患者末梢血CD8T細胞は、予めメトホルミンで処理することにより、1.0mMという 低濃度のグルコース環境下でも、その多機能性の回復が認められる。 がんの縮小に対するフェンホルミンとアスピリンの併用効果。 メトホルミン投与による腫瘍浸潤CD8T細胞のグルコーストランスポーター（Glut1）の発現増加。メトホルミン投与により、腫瘍浸潤CD8T細胞のグルコーストランスポーター（Glut1）の発現が増加する。 Glut1を発現するCD8T細胞の多機能性。左図より、Glut1陽性の細胞集団の多くは多機能性を有することが分かる。右図より、単位腫瘍あたりのGlut1陽性でかつ多機能性を有する集団はメトホルミン投与群で増加することが分かる。以上より、Glut1を発現するCD8T細胞は、IFNγ, TNFα, IL-2を同時に産生できる多機能性を有する細胞集団であることが分かる。 Glut1発現の経時変化 グルコース濃度を変化させたときのGlut1発現 メトホルミンによるがん患者末梢血CD8T細胞のカルシウム濃度上昇。 併用療法の効果の検証結果。 併用療法の効果の検証結果。 併用療法の効果の検証結果。 併用療法の効果の検証結果。
　末梢血免疫細胞（単核球（ＰＢＭＣ）、特にＣＤ８Ｔ細胞）の細胞内カルシウム濃度のベースラインは健常人とがん患者でほぼ同じくらいである。一方、ＰＭＡ（フォルボールミリスチン酸アセテート）、イオノマイシン(ionomycin)などの免疫刺激剤を用いて刺激すると、健常人の免疫細胞は細胞内カルシウム濃度が５０～１５０秒間緩やかに上昇し、必要なサイトカインを放出することができ、正常な免疫機能を維持できていることが分かる。一方、がん患者の免疫細胞は免疫刺激剤を用いて刺激すると一過性に細胞内カルシウム濃度が上昇するが、その後速やかに低下する。このことは、がん患者を含む免疫機能が低下したヒトは、腫瘍組織だけでなく、全身の免疫系が機能低下を起こしている。免疫機能は、がんの保有、加齢、放射線治療、過度の過労、睡眠不足、ストレスなどで低下することがあり、本発明の免疫機能の評価方法は、このような可能性のある全ての被験者が対象になり、健康状態のチェック、免疫機能に関係するがん治療薬のモニタリングに有用である。また、がんが再発すれば全身の免疫機能が低下することが予測され、がんの再発のマーカーとしても利用され得る。
　カルシウム濃度を測定する末梢血の免疫細胞としては、単核球（ＰＢＭＣ）もしくはＣＤ８Ｔ細胞が挙げられる。これら細胞内のカルシウム濃度は、抗ＣＤ８抗体、Ｆｌｕｏ４，ＦｕｒａＲｅｄを用いて染色し、洗浄後フローサイトメータで測定することにより決定できる。これら細胞内のカルシウム濃度は、抗ＣＤ８抗体、Ｆｌｕｏ４，ＦｕｒａＲｅｄを用いて染色し、洗浄後フローサイトメータで測定することにより決定できる。
　グルコーストランスポーターの発現レベルを評価する免疫細胞としては、腫瘍浸潤リンパ球が挙げられ、好ましくは腫瘍浸潤CD8Tリンパ球が挙げられる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、腫瘍組織と異なり血中グルコース濃度は十分に高いため既にグルコーストランスポーターの発現レベルは高く、本検査には向かない。グルコーストランスポーターの発現レベルは、抗グルコーストランスポーター抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体などを用いて染色し、洗浄後フローサイトメーターで解析することにより決定できる。
　本発明において、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンと併用可能ながん治療薬としては、特に限定されないが、例えば抗ＰＤ－１抗体などの免疫チェックポイント阻害薬、アスピリン、スタチン類、クルクミン、ベルベリン、ロイヤルゼリー、プロポリス、がんワクチンなどが挙げられ、抗ＰＤ－１抗体、アスピリンがより好ましい。さらにグルコーストランスポーターが上昇する抗がん剤も併用可能ながん治療薬に含まれる。
　本発明のモニタリング方法の対象となるがん治療薬としては、1種のみであってもよく、２種以上のがん治療薬の組み合わせ(併用薬)であってもよい。モニタリング方法の対象となるがん治療薬としては、免疫系に作用するがん治療薬であれば特に限定されないが、例えばフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンなどのビグアニド系抗糖尿病薬の単独投与、或いは、フェンホルミン、ブホルミン又はメトホルミンと、抗ＰＤ－１抗体などの免疫チェックポイント阻害薬、アスピリン、スタチン類、クルクミン、ベルベリン、ロイヤルゼリー、プロポリス、がんワクチンからなる群から選択される少なくとも１種の併用薬などが挙げられ、抗ＰＤ－１抗体とビグアニド系抗糖尿病薬の併用薬、アスピリンとビグアニド系抗糖尿病薬の併用薬が好ましい。
　本発明において、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンと、抗ＰＤ－１抗体などの免疫チェックポイント阻害薬、アスピリン、スタチン類、クルクミン、ベルベリン、ロイヤルゼリー、プロポリス、がんワクチンから選択される他のがん治療薬は、適切な製剤用担体とともに合剤を作製して投与してもよく、別々の製剤を組み合わせて投与してもよい。合剤および別々の製剤は、経口剤でも非経口剤でもよく、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、吸入剤、液剤、ドリンク剤、注射剤、坐剤などが挙げられる。このような製剤にはさらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤のような補助剤を加えてもよい。また懸濁剤として投与することも可能である。
　また錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等の固形製剤を調製するには、例えば重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース等の担体、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、グリセリン等の添加剤を加えて常法により行うことができる。またセルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアルコールフタレート、スチレン－無水マレイン酸共重合体、メタクリル酸－メタクリル酸メチル共重合体等の腸溶性物質の有機溶媒あるいは水中溶液を吹き付けて、腸溶性被膜を施して、腸溶性製剤として製剤化することもできる。薬学上許容しうる担体には、その他通常、必要により用いられる補助剤、芳香剤、安定剤又は防腐剤を含むことができる。
　上記のようながん治療薬は、免疫機能を賦活することができるが、免疫機能が低下している患者により有効である。従って、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンと他のがん治療薬を用いてがん化学療法を行う場合、末梢血免疫細胞の免疫刺激により細胞内カルシウム濃度があまり上がらない、免疫機能が低下したがん患者に有効であると予測できる。
　フェンホルミンは、抗糖尿病薬として使用される場合には乳酸アシドーシスなどの副作用が問題となるが、がん治療に用いる場合には、投薬期間と休薬期間があるので副作用は問題にならない。
　ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンは、免疫刺激を行ったときのＣＤ８Ｔ細胞中のカルシウム濃度を上昇させることができる(図１)。免疫刺激を行わない場合には、ビグアニド系抗糖尿病薬の有無にかかわらず細胞内のカルシウム濃度は変化しない。また、健常人よりも免疫系を有意に活性化することはない。すなわち、ビグアニド系抗糖尿病薬は、免疫系が働く必要があるときにカルシウム濃度を上昇させる潜在的な能力を高める作用がある。腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）に存在するＣＤ８Ｔ細胞中のカルシウム濃度はリンパ節（ＬＮ）よりもさらに低く、免疫刺激よってもほとんど上昇しないが、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンの存在下では、免疫刺激に応じてＣＤ８Ｔ細胞中のカルシウム濃度を大きく上昇させることができる(図１)。このために必要なビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンの投与量は、成人１日当たりフェンホルミン、ブホルミンでは100～150ｍｇ程度、またメトホルミンは、500～2250ｍｇ程度である。
　ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンは、腫瘍組織の局所に存在し得るエフェクター（ｅｆｆ）とエフェクター・メモリー（ＥＭ）の糖の取り込みを高めることができ、二次リンパ組織に存在し、がん細胞を直接攻撃しないセントラル・メモリー（ＣＭ）の糖の取り込みは促進しない。すなわち、がんの排除に必要なＴ細胞（ｅｆｆとＥＭ）を効率的に活性化することができ、特に、ビグアニド系抗糖尿病薬で処理しない場合、腫瘍組織にはほとんど存在せず、がん細胞を排除する能力が高いエフェクター（ｅｆｆ）の数及び割合を大幅に高めることができる。ｅｆｆとＥＭの活性化に必要なビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミンの投与量は、成人１日当たり100～150ｍｇ程度、メトホルミンの投与量は、成人１日当たり500～2250ｍｇ程度である。
　腫瘍組織では、グルコース濃度が１ｍＭ程度あるいはそれ以下であることが知られている（Cell 162:1217-1228, 2015）。図４に示すように、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンは、腫瘍組織中のグルコース濃度が０．１ｍＭではＣＤ８Ｔ細胞のサイトカイン産生能を促進することができず、腫瘍組織中のグルコース濃度と同程度の１ｍＭでＣＤ８Ｔ細胞のサイトカイン産性能を促進することができ、栄養不良の腫瘍組織でＣＤ８Ｔ細胞の活性を高め、がん細胞を殺すことができる。したがって、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンは、グルコース濃度が、０．５～１．５ｍＭ程度、好ましくは０．８～１．２ｍＭ程度、特に好ましくは１ｍＭ程度の腫瘍組織を有するがん患者に対するがん治療薬として有用である。
　本発明において他のがん治療薬を組み合わせて等よする場合、他のがん治療薬の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。
　がん治療薬のモニタリングは、以下の工程１）～３）により行うことができる。
工程１）がん組織から腫瘍内リンパ球を分離する工程、
工程２）分離された腫瘍浸潤リンパ球のグルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを解析する工程、及び
工程３）解析されたＧｌｕｔ１の発現レベルに基づき、がん患者に既に投与していたがん治療薬が有効か否かを判定／評価する工程
（ここで、がん組織は、がん治療薬を投与後にがん患者から摘出されたものである。）。
　がん治療薬のモニタリングは、３種のサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）の産生量を検出することで実行できるが、これらのサイトカインの産生量の検出は煩雑である。本発明者は、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルが３種のサイトカインの産生量と相関することを見出したので、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを検出することでがん治療薬をモニタリングすることができる。がん組織の摘出は、手術により行ってもよく、バイオプシーなどにより行ってもよい。グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルの解析は、がん患者から分離した腫瘍浸潤リンパ球をグルコース濃度が０．１ｍＭ以上の培地で２時間以上培養後に行うことが望ましい。がん患者からの分離直後の腫瘍浸潤リンパ球ではＧｌｕｔ１発現レベルが必ずしも高くなく、グルコース濃度が０．１ｍＭ以上の培地で培養することによりＧｌｕｔ１発現レベルを高め、Ｇｌｕｔ１発現レベルの解析を容易にすることができる。培地中のグルコース濃度は、０．１ｍＭ程度以上、好ましくは１ｍＭ程度以上、より好ましく５ｍＭ程度以上、さらに好ましく５～２５ｍＭ程度、特に好ましく１０～２５ｍＭ程度、特に１５～２５ｍＭ程度である。培養時間は、１時間以上、好ましくは２時間以上、より好ましく２～２４時間、さらに好ましく３～１２時間程度、特に好ましく４～８時間程度である。培養時間はＧｌｕｔ１発現レベルが高くなるように設定され、グルコース濃度が高い場合にはより短くてもよく、グルコース濃度が低い場合にはより長時間の培養が望ましい。
　モニタリング対象のがん治療薬の投与期間は１日以上であればよく、特に限定されないが、例えば１～５０日、好ましくは２～３０日が挙げられる。
　免疫細胞は、腫瘍組織から得られたリンパ球特にＣＤ８Ｔ細胞が好ましく使用できる。
　治療効果の評価対象となるがん治療薬としては、がんワクチン、免疫チェックポイント阻害薬、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンが挙げられる。
　がん治療薬の治療対象のがんとしては、グルコース濃度が低い固形がんが挙げられ、例えばメラノーマ、頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌などが挙げられる。
　がん局所にはＣＤ８Ｔ細胞の数は非常に少ないが、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミン及び抗ＰＤ－１抗体は、いずれもがん局所でのＣＤ８Ｔ細胞の数を大きく増やすことができる。さらに、ビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンと抗ＰＤ－１抗体を併用すると、さらにＣＤ８Ｔ細胞の数を増大できるだけでなく、３つのサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）の２種以上を産生するＣＤ８Ｔ細胞の割合を非常に高めることができる。このような効果を得るためのビグアニド系抗糖尿病薬であるフェンホルミン、ブホルミンの投与量は、成人１日当たり100～150ｍｇ程度、メトホルミンの投与量は、500～2250ｍｇ程度であり、抗ＰＤ－１抗体の投与量は、成人１回当たりの投与量は2 mg/kg程度である。
　本発明は、さらに以下の発明を提供するものである。
・抗ＰＤ－１抗体を有効成分として含み、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と組み合わせて投与することを特徴とする、腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞数増加剤。
・腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞数を増加するための抗ＰＤ－１抗体とフェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種の組み合わせ。
・抗ＰＤ－１抗体と併用するための、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞数増加剤。
・フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と併用するための、抗ＰＤ－１抗体を含む腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞数増加剤。
・抗ＰＤ－１抗体とフェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を併用することを記載した腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞数を増加するための手順書。
　本発明は以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
実施例１
　2x105 MO-5（OVA発現B16メラノーマ細胞株）をC57BL/6マウスに皮内移植し、移植7日後に自由飲水により5 mg/mlメトホルミンの経口投与を開始した。投与開始後7日目（移植後14日目）にリンパ節(LN)及び腫瘍組織(Tumor)を切除し、リンパ節のリンパ球及び腫瘍浸潤リンパ球を回収した。細胞をFCS(-)RPMIで洗浄後、抗マウスCD3抗体BV510、抗マウスCD8抗体APC-Cy7、1 μM Fluo4、1 μM Fura Redで30分、37℃で染色した。染色後、37℃で保温したFCS(-)RPMIで洗浄し、洗浄後フローサイトメーターにより細胞内カルシウムイオンのバックグラウンドを30秒間測定した。バックグラウンド測定後、ただちに100 ng/ml PMAおよび5 μM ionomycinにより刺激し、刺激によるマウスCD8 T細胞内のカルシウムイオンの上昇を測定した(図１)。腫瘍組織(Tumor)では、メトホルミン非投与群（－）にはPMA/ ionomycin刺激によっても細胞内カルシウム濃度はほとんど上昇しないが、メトホルミン投与群（＋）ではPMA/ ionomycin刺激により細胞内カルシウム濃度は大きく上昇することが確認された。
　リンパ節(TN)では、PMA/ ionomycin刺激前でもある程度高い細胞内カルシウムレベルを有し、メトホルミン投与群（＋）と非投与群（－）のいずれもPMA/ ionomycin刺激により細胞内カルシウム濃度は大きく上昇するが、その程度はメトホルミン投与群（＋）の方が大きかった。
　図１の結果から、メトホルミンは、免疫刺激により細胞内カルシウム濃度を高める作用があり、特に腫瘍組織内のＣＤ８Ｔ細胞でその作用が顕著であることが明らかになった。
実施例２
抗原特異的腫瘍浸潤CD8 T細胞のメモリー形質の検出および各細胞分画におけるグルコース取り込みの評価
　2x105 MO-5をC57BL/6マウスに皮内に移植し、移植後7日後に自由飲水により5 mg/mlメトホルミンの経口投与を開始した。投与開始後7日目（移植後14日目）に腫瘍組織を切除し、腫瘍浸潤リンパ球を分離した。分離後、0.1%BSA/PBSで洗浄し、抗マウスCD8抗体APC-Cy7、抗マウスCD62L抗体BV421、抗マウスCD44抗体PerCP、抗マウスKLRG1抗体APC、および400 μM 2-NBDG（2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino]-2-deoxy-d-glucose）を30分、4℃で染色した。0.1%BSA/PBSで洗浄し、フローサイトメーターにより抗原特異的腫瘍浸潤CD8 T細胞の頻度、メモリー形質（CD44, CD62L, KLRG1）および各細胞分画におけるデオキシグルコース（2-NBDG）の取り込みを解析した（図２）。図２に示すように、メトホルミンは、腫瘍浸潤CD8 T細胞のメモリー形質に関し、エフェクター（ｅｆｆ）とエフェクター・メモリー（ＥＭ）の数及び割合を増加して解糖系を活性化させるが、セントラル・メモリーの数を及び割合を減少して解糖系を不活性化させることが明らかになった。
実施例３
　健常人とがん患者の凍結保存されたヒトPBMC（ヒト末梢血単核球）を解凍し、FCS(-)RPMIで洗浄後、1x106 　PBMCを抗ヒトCD8抗体APC-Cy7、1 μM Fluo4、1 μM Fura Redで30分、37℃で染色した。染色後、37℃で保温したFCS(-)RPMIで洗浄し、洗浄後フローサイトメーターにより細胞内カルシウムイオンのバックグラウンドを30秒間測定した。バックグラウンド測定後、ただちに100 ng/ml PMAおよび5 μM イオノマイシンにより刺激し、刺激によるヒトCD8 T細胞内のカルシウムイオンの上昇を測定した。結果を図３に示す。健常人とがん患者のPBMCのPMA／イオノマイシンによる刺激前のレベルと刺激直後の上昇については、差異はないが、その後の経過は、健常人では持続的に上昇し、がん患者では急速に下降する点で大きく異なる。
　ヒトPBMCは、末梢血の採血により容易に測定でき、メトホルミン、或いはメトホルミンと他の薬剤との併用効果は、図３のがん患者のタイプの場合に高く、健常人の場合には高くないので、ヒトPBMCのカルシウム濃度を測定することで患者を選別することができる。末梢血は、がん細胞と接触している単核球の割合は非常に低いと考えられるので、この結果は予想外である。
　また、ヒトPBMCのカルシウム濃度ががん患者のタイプだと再発の可能性が高いか再発しており、健常人のタイプだと再発の可能性が低いなどの評価をすることが可能である。
実施例４
　がん患者の凍結保存されたヒトPBMCを解凍し、FCS(-)RPMI 10 μMメトホルミン存在下で6時間培養し、培養後分離し、FCS(-)Glc(-)RPMIで洗浄した。洗浄後、0.1、1、10 mM Glcの含有したRPMIを用いて、1 μM モネンシン存在下で50 ng/ml PMAおよび2 μM イオノマイシンにより6時間刺激培養した。細胞を分離し、抗ヒトCD8抗体APC-Cy7で細胞表面分子を染色し、細胞透過処理を行い、抗ヒトIL-2 抗体APCおよび、抗ヒトTNFα抗体BV510、抗マウスIFNγ抗体FITCにより細胞内サイトカインを染色し、フローサイトメーターにより解析した(図４)。３つのサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）を産生しているＣＤ８Ｔ細胞は、グルコース濃度に依存し、グルコース濃度が０．１ｍＭでは最も低く、メトホルミンの有無により差異はないが、グルコース濃度が１ｍＭの場合には、メトホルミンにより３つのサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）を産生しているＣＤ８Ｔ細胞の数は有意に上昇することが明らかになった。
　低栄養の腫瘍組織ではグルコース濃度が１ｍＭ程度であることが知られているので、メトホルミンは、このような低栄養の腫瘍組織でのＣＤ８Ｔ細胞の多機能性の回復が認められた。
実施例５
腫瘍移植実験(フェンホルミン,アスピリン処置)
　OVA発現B16メラノーマ細胞株MO5 (2.5×105) をC57BL/6マウスの背部に皮内接種した。一群５匹のマウスで、未処置の群（C）をはじめ、腫瘍細胞接種10 日後からアスピリン単独、フェンホルミン（Phen）単独、アスピリンとフェンホルミンの併用投与群の４群を作製した。フェンホルミンは、メトホルミンと同様ビグアナイド系の薬物である。フェンホルミンは、腫瘍細胞接種10 日目から0.5%含有食餌として与えた。さらに4 日ごとに餌を通常の餌と交換した。即ち、10日目から14日目、18日目から22日目のみフェンホルミン含有食餌を与えた。 14日目から18日目と22日目から26日目の間はフェンホルミンを含まない通常の食餌を与えた。このような投与法を選択した理由は、フェンホルミンの連日投与では副作用によりマウスの死亡例が出るからである。また、フェンホルミンは自由飲水で与えた場合、マウスは水を飲まなくなるために食餌として与えた。
　一方、アスピリン(600μg/mL) は、自由飲水によって処置し、飲水は10日目から継続的に行った。フェンホルミン単独でも強い腫瘍増殖抑制効果が認められるが、アスピリンとの併用により効果が増強した（図５）。
実施例６
　8週齢のBALB/c に腫瘍(MethA) 2 x 106個を皮内注射し、day7からメトホルミン(5 mg/mL) を自由飲水によって継続摂取させ,治療後3日（day10）および6 日後（day13）に腫瘍浸潤 T 細胞(TIL)を分離し, 抗CD8抗体、抗グルコーストランスポーター(Glut1) 抗体で染色した。また、PMA/Ionomycin/Monencin存在下で6 時間刺激培養後に抗CD8抗体、抗グルコーストランスポーター(Glut1) 抗体で染色し、フローサイトメーターにより解析した。結果を図６に示す。PMA刺激によりGlut1の発現は増加する傾向にあるものの、PMA刺激(-)を含め、あらかじめメトホルミンを投与しておいた群ではGlut1陽性集団の明らかな増加が認められた。
実施例７
　図６におけるGlut1陽性集団の多機能性について解析を行った。多機能性のあるCD8T細胞は、最も強力なエフェクターT細胞である。
　8週齢のBALB/c に腫瘍(MethA) 2 x 106個を皮内注射し,day 7からメトホルミン(5 mg/mL) を自由飲水によって継続摂取させ, 治療後3日（day10）および6 日後（day13）に腫瘍浸潤 T 細胞(TIL)を分離し, PMA/Ionomycin/Monencin存在下で6 時間刺激培養後に抗CD8抗体、抗グルコーストランスポーター(Glut1) 抗体、および細胞内サイトカイン(IL-2/TNFα/IFNγ) の各種抗体で染色しフローサイトメーターにより解析した。その結果、Glut1陽性集団では多機能性を有するものが多く認められた(図７)。この比率はメトホルミン服用により増加する。これらの事実から、腫瘍浸潤CD8T細胞のGlut1発現をフローサイトメーターでみることにより、多機能性検査を行わなくてもその免疫状態を推測することができる。また、メトホルミン投与などのある免疫治療を行い、その結果CD8T細胞のGlut1発現が増加すれば、「免疫効果がある」という判定を下すことも可能である。
実施例８
　8週齢のBALB/cマウスに同系腫瘍 MethA（2 x 106個）を皮内注射し,day7からメトホルミン(5 mg/mL), N-アセチルシステイン(NAC,10 mg/mL) の投与を開始した。治療3日後に腫瘍浸潤 T 細胞(TIL)を分離し、37 ℃で0,1,3,6 時間培養を行い, その後, CD3,CD8,グルコーストランスポーター(Glut1)の各種抗体で染色し,フローサイトメーターにより解析した(図８)。
　結果）腫瘍から分離直後のCD8TILはGLUT-1の発現はこれまでの方法によれば、分離後即座に抗体で染色しフローサイトメーターで解析する手法が用いられたが、その方法ではGlut-1の検出は難しい。しかしながら、図8の矢印で示すように３時間ないし６時間in vitroで培養することにより検出が可能になることが判明した。即ち、メトホルミン投与しておいたマウスのCD8TILでは、６時間培養により非常に高いレベルのGLUT-1発現が見られるようになった。一方、メトホルミン非投与群ではGLUT-1発現上昇は見られない。
　以上より、CD8TIL のin vitro 3～6時間培養によるGLUT-1発現上昇の有無はメトホルミン効果の有無を予測できるモニタリング法になりうることが判明した。GLUT-1はグルコース取込みの受容体であり、GLUT-1の細胞膜における発現上昇は解糖系亢進を意味する。T細胞活性化に伴う細胞質カルシウムイオン濃度の上昇は、解糖系亢進により維持されるため、この場合のGLUT-1発現上昇は細胞質カルシウムイオン濃度上昇と同義と考えることができる。
　また、GLUT-1発現上昇はメトホルミン投与と同時に抗酸化剤であるNアセチルシステイン（NAC）を投与することにより、有意に抑制された。従って、CD8TILの解糖系亢進（即ちGLUT-1の発現上昇）という現象は、活性酸素（reactive oxygen species; ROS）に依存すると考えられる。
実施例９
　8週齢のBALB/cマウスに同系腫瘍 MethA（2 x 106個）を皮内注射し, day7からメトホルミン(5 mg/mL)の投与を開始した. 治療3日後に腫瘍浸潤 T 細胞(TIL)を分離し、グルコース濃度 0, 0.1, 1.2, 6.1, 12.5, 25 mM の培養液下で 37 ℃,0,1,3,6 時間培養を行い, その後, CD3,CD8,グルコーストランスポーター(Glut1)の各種抗体で染色し,フローサイトメーターにより解析した（図９）。
　結果）腫瘍から分離後のCD8TILはin vitroで6時間培養することによりGLUT-1の発現上昇を認めるが、これは培養液中のグルコース濃度に比例することがわかった。とりわけ、グルコース6.1mM、理想的には25mM において最も高いレベルのGlut-1 が観察された。グルコース25mM とは通常の培養液中のグルコール濃度に匹敵する。
　また、腫瘍内におけるグルコース濃度に匹敵するグルコース濃度0.1mM でも14.3%のCD8TIL がGlut-1 を発現した。グルコース濃度0.1mM は、腫瘍内におけるグルコース濃度に匹敵する。従って、メトホルミン投与により、腫瘍内でもCD8TIL は解糖系が亢進し、腫瘍を攻撃できることが推測される。
　一方で全くグルコースが存在しない場合（グルコース濃度0mM）は、CD8TIL のGlut-1は発現しない。メトホルミン投与しておいたマウスから分離したCD8TILは、６時間in vitro培養することにより有意にGlut-1の発現が上昇してくるが、これは培養液中のグルコース濃度に比例することがわかった。培養液中グルコース濃度は、6.1mM以上、25mMにおいて最も高いGlut-1の発現上昇が見られることがわかった。
　腫瘍浸潤CD8T 細胞（CD8TIL）のエフェクター機能は、その解糖系亢進の有無に依存することがこれまでの研究から明らかにされている。しかしながら、CD8TIL の代謝状況を解析することは非常に困難であった。 本手法、即ちCD8TIL を25mM グルコース存在下で6 時間培養した後にGlut-1 の発現レベルをフローサイトメーターで観察する手法は、CD8TIL の解糖系上昇の有無を極めて簡便かつ鋭敏に検出できる優れた検査法であると結論できる。この手法はメトホルミンに限らず、例えばがんワクチンや免疫チェックポイント阻害薬など、あらゆるがん免疫療法の効果をモニタリングできる普遍的な手法であると考えられる。
実施例１０
腫瘍浸潤リンパ球（TIL） 回収と培養プロトコル
　バイオプシー等によりがん患者から腫瘍塊（3～4mm径）を摘出し, Medimachine（アズワン株式会社製）にて機械的に２分間破砕後, 細胞液を回収し, 1200rpm, 5～10 分間遠心する。その後, 上清を捨てて, RPMI培養液にて(牛胎児血清は凝集を生じる場合があるのでここでは入れない), 5×105 /mL となるように細胞液を調製し, 24 well plateに5×105 /mL/well の細胞数を入れて６時間培養する。６時間後に細胞を回収し、抗体で染色する過程に移行する。
実施例１１
　ステージ Iのがん患者、ステージIIaのがん患者及びステージIVのがん患者において、メトホルミンの投与前後におけるPMA刺激によるカルシウム濃度亢進の変化を測定した。メトホルミンの投与前及び図示した投与スケジュールによるメトホルミン投与後にヒトPBMC（ヒト末梢血単核球）を採取し、実施例３と同様にして100 ng/ml PMAおよび5 μM イオノマイシンにより刺激し、刺激によるヒトCD8 T細胞内のカルシウムイオンの上昇を測定した。具体的には、末梢血から比重分離法により末梢血単核球(PBMC)を分離し、1x106 個のリンパ球を 1 μg/ml 抗ヒトCD8抗体および1 μM Fluo4/FuraRed存在下で37℃30分間インキュベートした。その後、AIM-V培地により洗浄する。洗浄後AIM-Vを加え、未刺激（刺激前）のリンパ球を20秒間FACSCantoIIにより取り込みベースライン・データを取り込んだ。その後、100 ng/ml PMA/ 2 μM ionomycinを加えて刺激を入れ、直ちにFACSCantoIIにより取り込み、刺激後のデータとして取り込んだ。これにより細胞質カルシウム濃度に応じた波形を検出した。
　結果を図１０に示す。ステージ I, IIa, IVのいずれにおいてもメトホルミンとの培養によりPMA刺激によるカルシウム濃度亢進が認められる。同時に行ったサイトカイン多機能性の上昇と同様の結果となった。
実施例１２
腫瘍移植実験(Met,アスピリン,アバシミブ及び２剤併用)
　OVA発現B16メラノーマ細胞株MO5 (2.5×105) をC57BL/6マウスの背部に皮内接種した。腫瘍細胞接種7 日後にメトホルミン(0.5%)は飼料によって、アスピリン(600μg/mL)は自由飲水によって、アバシミブ(15 mg/kg)は隔日腹腔内投与によってマウスに与えた。
　結果を図１１に示す。これらの処置開始後、６日目の腫瘍の長径、短径を計測し、腫瘍の体積（mm3）を算出した。メトホルミンとアスピリンの併用、あるいはメトホルミンとアバシミブの併用は、単剤よりも腫瘍抑制効果が高いことが分かる。
実施例１３
腫瘍移植実験(3剤併用,抗PD-1抗体, Met, アスピリン)
　3LL 細胞(2.0×105) をC57BL/6マウスの背部に皮内接種した。腫瘍細胞接種5 日後に抗PD-1抗体 (10 mg/kg) を腹腔内投与によって1 回目投与後も6 日ごとに投与し合計4 回となるよう処置をした。メトホルミン(0.5%)は飼料によって、アスピリン(600μg/mL)は自由飲水によって処置をした。処置開始後、腫瘍の長径、短径を計測し、腫瘍の体積（mm3）を算出した。
　結果を図１２に示す。アスピリンの併用は、抗PD-1抗体＋メトホルミンの腫瘍抑制効果を高めることが分かった。
実施例１４
腫瘍移植実験(3剤併用,抗PD-1抗体, Met, NDGA)
　3LL 細胞(2.0×105) をC57BL/6マウスの背部に皮内接種した。腫瘍細胞接種5 日後に抗PD-1抗体 (10 mg/kg) を腹腔内投与によって1 回目投与後も6 日ごとに投与し合計4 回となるよう処置をした。また、メトホルミンとNDGA (Nordihydroguaiaretic acid)はメトホルミン(0.5%)飼料あるいはメトホルミン(0.5%)とNDGA(0.1%) 混合飼料によって処置をした。処置開始後、腫瘍の長径、短径を計測し、腫瘍の体積（mm3）を算出した。また、生存期間を観察した。
　結果を図１３に示す。NDGAの併用は、抗PD-1抗体＋メトホルミンの腫瘍抑制効果を高め、生存期間を延長することが分かった。
実施例１５
腫瘍移植実験(4,5剤併用)
　OVA発現B16メラノーマ細胞株MO5 (2.5×105) をC57BL/6マウスの背部に皮内接種した。腫瘍細胞接種7 日後にメトホルミン(0.5%)とNDGA(0.1%) は混合飼料によってそしてアスピリン(600μg/mL)は自由飲水によって処置をした。さらに抗PD-1抗体 (10 mg/kg) は腹腔内投与によって1 回目投与後も6 日ごとに投与し合計4 回となるよう処置をした。またアバシミブ(15 mg/kg)は腹腔内投与によって1 回目投与後も2 日ごとに計測終了日まで処置を行った。処置開始後、腫瘍の長径、短径を計測し、腫瘍の体積（mm3）を算出した。また、生存期間を観察した。
　結果を図１４に示す。メトホルミン＋NDGA＋アスピリン＋アバシミブは、腫瘍増大を強く抑制し、生存期間を延長することが分かった。また、メトホルミン＋NDGA＋アスピリン＋アバシミブ＋抗PD-1抗体は、さらに強く腫瘍増大を強く抑制し、生存期間を延長（５匹中２匹は腫瘍の完全退縮をみた）することが分かった。

Claims (14)

  1. 　ヒト被験者の末梢血を採取し、免疫刺激剤を適用後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度の推移を検査し、免疫刺激剤の適用後に一過性にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇し、その後刺激前の状態に戻る場合に全身の免疫機能が低下していると判断し、免疫刺激剤の適用後にＰＢＭＣ又はＣＤ８Ｔ細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇基調にある場合に全身の免疫機能は正常であると判断される、免疫機能の検査方法。
  2. 　請求項１の検査方法で全身の免疫機能が低下していると判断されたがん患者に対してフェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法を行う、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法を適用するがん患者の選別方法。
  3. 　他のがん治療薬が、抗ＰＤ－１抗体、アスピリン、スタチン、クルクミン、ベルベリン、ロイヤルゼリー又はプロポリスである、請求項２に記載の患者の選別方法。
  4. 　下記工程（１）～（２）を含む、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法のがん患者に対する治療効果を予測する方法：
    　（１）がん患者から採取された末梢血に含まれる単核球（ＰＢＭＣ）を免疫刺激したときに細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇するか、持続的に上昇するかを評価する工程、及び
    　（２）免疫刺激時のＰＢＭＣの細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇した後速やかに下降する場合、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法が治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
  5. 　下記工程（１）～（２）を含む、がん患者の治療方法：
    　（１）がん患者から採取された末梢血に含まれる単核球（ＰＢＭＣ）を免疫刺激したときに細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇するか、持続的に上昇するかを評価する工程、
    　（２）免疫刺激時のＰＢＭＣの細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇した後速やかに下降する場合、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種と他のがん治療薬の併用療法が治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
    　（３）工程（２）において治療効果を示す可能性が高いと予測した患者に、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種並びに他のがん治療薬を投与する工程。
  6. 　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、免疫刺激によるＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤。
  7. 　腫瘍組織内のＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を選択的に上昇させる、請求項６に記載の免疫刺激によるＣＤ８Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤。
  8. 　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍組織におけるエフェクター・メモリー（ＥＭ）とエフェクター（ｅｆｆ）の選択的機能向上剤。
  9. 　フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍組織内のグルコース濃度が０．５～１．５ｍＭであるがん患者に投与されるがん治療薬。
  10. 　以下の工程１）～工程３）を含む、がん治療薬の効果のモニタリング方法：
    　工程１）がん組織から腫瘍内リンパ球を分離する工程、
    　工程２）分離された腫瘍浸潤リンパ球のグルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを解析する工程、
    　工程３）解析されたＧｌｕｔ１の発現レベルに基づき、がん患者に既に投与していたがん治療薬が有効か否かを判定／評価する工程
    （ここで、がん組織は、がん治療薬を投与後にがん患者から摘出されたものである。）。
  11. 　がん治療薬が、がんワクチン、免疫チェックポイント阻害薬、フェンホルミン、ブホルミン及びメトホルミンからなる群から選ばれる、請求項９に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
  12. 　Ｇｌｕｔ１発現レベルをフローサイトメーターにより解析する、請求項１０又は１１に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
  13. 　腫瘍浸潤リンパ球がＣＤ８Ｔ細胞である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
  14. 　工程３が、分離された腫瘍浸潤リンパ球を２時間以上、０．１ｍＭ以上のグルコース濃度の培地中で培養し、その後グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）発現レベルを解析する、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のがん治療薬の効果のモニタリング方法。
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