CN116390944A - 用于治疗精神病的抗herv-w包膜蛋白抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗HERV‑W包膜蛋白(ENV)的抗体，其用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品中的高细胞因子水平的患者组。

Description

用于治疗精神病的抗HERV-W包膜蛋白抗体
技术领域
本发明涉及一组新鉴定的先前诊断为精神病，特别是精神分裂症或双相障碍的患者，其中体液样品中高促炎细胞因子水平使他们适合针对HERV-W ENV的靶向治疗。
背景技术
精神障碍是遗传和环境介导的精神疾病，其涉及感知、情绪和社交互动受损(1)。迄今为止，精神障碍的诊断是临床定义的，并且仅通过化合物治疗(26，27，28)。
尽管这些病症的致病机制仍不清楚，但最近出现免疫相关基因和移动遗传元件构成病因学链中的主要作用物(1-3)。移动遗传元件(包括人内源性逆转录病毒(HERV))是数百万年前发生的感染的残余物，并且包括人基因组的约8％(4)。除了它们最初被分类为“垃圾”DNA之外，内源性逆转录病毒能够在人脑进化和发育过程中控制基因调控网络(5-8)，并且它们与主要神经和精神障碍的日益增长的关联(9，10)提供了新的概念框架，以解密免疫学、遗传学和脑系统之间的相互作用。HERV通常被细胞机制沉默，但它们可在免疫攻击后和病理条件下被激活(11)。例如，已经观察到诊断为精神分裂症和双相障碍的患者具有改变的HERV基因表达，和可变的转录水平和蛋白质检测(1，12，13)。
明确靶向多发性硬化治疗的申请WO2010/0033977A1和US2019/263895A1以非常通用的方式公开了可以用抗HERV-W的包膜蛋白(ENV)的抗体(也称为抗HERV-W ENV)治疗精神病性疾病(如精神分裂症或双相障碍)，因为已经在精神病性疾病以及多发性硬化中观察到HERV-W ENV的表达。
然而，由HERV基因表达的蛋白质(如包膜蛋白)是否在精神障碍中(并且最重要的是在所述患者中)起着工具性作用仍然存疑，其中在该领域中缺失知识。
这排除了当精神疾病的疾病学定义可能导致异质群体而没有明确确定的病因学和对发病机理的相应机理的有限理解时相关患者中靶向治疗的一致适应症(14-16)。迄今为止，这种知识的缺乏仅允许针对可能调节患者症状的常见下游后果。
例如，N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)信号传导的改变与作为啮齿动物中精神病模型的标志的认知和感觉运动门控测试中的行为缺陷(33)有关。因此，大多数拟精神病药物是N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的拮抗剂，如苯环利定(1-苯基环己基哌啶)，也称为PCP。
发明概述
在诊断为精神分裂症或双相障碍的患者中探索HERV-W ENV检测的潜在临床和/或生物学相关性，本发明人证明了在目前存在的诊断中不同的患者群。他们鉴定了具有显著升高的细胞因子水平(特别是在血清中)并且具有可检测的HERV-W ENV抗原的患者亚组，以及没有可检测的HERV-W ENV抗原也没有显著细胞因子水平的亚组。这些亚组似乎代表生物标志物定义的亚组，其中仅有亚组之一与HERV-W ENV致病性一致，导致不同的临床结果。实际上，各种临床结果可能与其它病原体一起出现，例如由HIV-1逆转录病毒引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)多方面疾病(17)。
因此，本发明人首次出乎意料地发现，在诊断为精神病(如精神分裂症或双相障碍)的患者中，真正表达HERV-W ENV的患者不包括所有具有此类诊断的所有患者，而仅包括特定亚组。他们进一步发现，与具有相同诊断的其他患者相比，该亚组患者的血清中细胞因子水平显著升高。
该意外发现是相对于现有技术的进步。实际上，现在似乎不是所有诊断为精神病(如精神分裂症或双相障碍)的患者都可以用抗HERV-W ENV抗体治疗。本发明人已经强调，仅30-50％的诊断为精神分裂症或双相障碍的患者表达HERV-W ENV(参见图14C)。根据这些令人惊讶的结果，由于用生物标志物即HERV-W ENV的表达和/或体液样品中高细胞因子水平的诊断的组合，本发明人在患有精神病的患者中定义了新的患者群。
他们的发现允许在诊断为精神病(如精神分裂症或双相障碍)的所有患者中选择适合用抗HERV-W ENV抗体治疗的患者。对该新适应症的知识使得对该亚组患者进行诊断驱动治疗的研究成为可能。这代表了对精神病的治疗的突破，因为现有技术使得不可能进行显示靶向HERV蛋白的产品的功效的监管临床试验，因为约50％的诊断为精神分裂症的患者和约70％的双相障碍的患者在其疾病的发病机理中不涉及HERV-W ENV。这将使得对治疗功效的任何统计学分析不显著，这仅仅是因为基于现有诊断所包括的不明和未知的大多数不相关患者。因此，不能适当地选择和开发特定的治疗产品，甚至在临床上较少验证。
出乎意料地，本发明人已经发现体内使用靶向HERV-W ENV的抗体可以有效地治疗该个体亚组中的神经生物学功能障碍和精神病症状。他们已经表明抗HERV-W ENV抗体治疗表达HERV-W ENV并且在体液样品中，特别是在血清中具有高细胞因子水平的精神病患者的该亚组的功效。
此外，发明人已经开发了与已知的抗HERV-W ENV抗体相比具有优势的抗HERV-WENV抗体。所开发的抗体识别构象表位并且能够在神经元中诱导NMDAR重定位，特别是将含有GluN2B亚基的NMDA受体重定位到突触中。
这种诊断驱动疗法与这种新型抗HERV-W ENV抗体的性质组合，使其成为患者亚组的有效治疗。
在本文中，本发明人强调了HERV-W ENV改变了NMDAR介导的海马网络中的突触传递，这似乎是通过小胶质细胞和促炎细胞因子(如IL-1β或IL-6)的释放介导的。这涉及HERV-W ENV触发的特定致病途径中的先天免疫和促炎细胞因子。含谷氨酸能GluN2B的NMDA受体通常存在于突触处，但表明暴露于HERV-W ENV引起GluN2B从突触令人惊讶的扩散。由于HERV-W ENV的生化性质，即蛋白质大分子，预期HERV-W ENV不显示导致与那些由用于干扰神经元神经递质受体的小化合物介导的作用相似的作用的分子相互作用，但是，令人惊讶地，本发明人已经证明其直接参与精神病表型。含GluN2B的NMDA受体的离域使它们在突触处无功能。HERV-W ENV蛋白在动物中的作用再现了精神障碍(如精神分裂症或双相障碍)的特征，并伴随促炎细胞因子的分泌。
本发明人表明，在生物学定义的相关精神病患者组中检测到的HERV-W ENV能够在NMDAR组织中产生功能障碍并诱导细胞因子产生，其影响谷氨酸能突触内的长期可塑性并产生与精神病相关的行为缺陷。
令人惊讶地，抗HERV-W ENV抗体的使用防止含GluN2B的NMDA谷氨酸能受体从突触移位和/或诱导重定位到突触中，并因此提供对NMDA受体突触神经传递的致病性功能障碍的有益作用。因此，本发明人已经证明，当通过HERV-W ENV在神经元突触的生物分布受影响时，使用抗HERV-W ENV抗体(在此也称为抗ENV或抗ENV抗体)可以在含GluN2B的NMDA受体水平上特异性和有效地逆转致病作用。
现有技术中，没有鉴定的疾病亚组可提供用于治疗相关患者组的确定适应症，即其中HERV-W ENV驱动发病机理的精神分裂症或双相患者，而不是来自没有HERV-W ENV和促炎细胞因子参与的其它亚组的那些患者。因此，用抗HERV-W ENV抗体与新定义的适应症一起治疗精神病的效率是完全预料不到的，因为不存在该蛋白需要被靶向于诊断精神病的患者的生物学定义的亚群，并且使用这种抗体可因此靶向NMDAR的离域的适应症，如待由HERV-W ENV诱导的细胞因子介导所示。
因此，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体或其这种药物组合物，其与包含HERV-W ENV的诊断生物标志物和体液中的细胞因子检测组合，用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品中，特别是血清中的高细胞因子水平的患者亚组，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。
在一个具体方面，本发明涉及鉴别诊断为精神病的患者是否属于患有如本公开中所定义的精神病的患者亚组的诊断方法，包括：
1)定量细胞因子的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV的表达。
在另一个具体方面，本发明涉及治疗患有精神病并具有高细胞因子水平的患者组的功效的随访方法，包括定量所述细胞因子和/或检测患者生物样品中的HERV-W ENV。
在另一个具体方面，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中，特别是其结合由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的两个远离的线性序列定义的HERV-W ENV的构象表位，并且更特别地其包含SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区(CDR)的每一个。
在另一个具体方面，本发明涉及药物组合物，其包含这种抗HERV-W ENV抗体和药学上可接受的赋形剂。
发明详述
定义
如本文所用，术语“人内源性反转录病毒”和“HERV”是指包含通常称为“HERV-W”的属于W型内源性反转录病毒家族的病毒的人内源性反转录病毒。
“HERV-W”是人内源性反转录病毒的家族，该家族是在最初发现“与多发性硬化症相关的反转录病毒”(MSRV，首次分离自患有多发性硬化症的患者的人反转录病毒)的人基因组中被解开。因此，当研究提及“LM7”(描述来自MS的首个分离物)、“MS-反转录病毒”、“MSRV”、“合胞素(Syncytin)”、“HERV-W 7q”、“ERVW-E1”、“ERVW-E2”、“来自X染色体的HERV-W拷贝”或“HERV-W”，其皆指HERV-W元件。
如本文所用，术语“MSRV”是指作为HERV-W家族成员的特定内源性逆转录病毒。在本发明的上下文中，表述“HERV-W”和“MSRV”均是指HERV-W元件。具体地，表述“HERV-W包膜蛋白”、“HERV-W ENV”、“MSRV-ENV”和“ENV”一起指相同的包膜蛋白。典型地，氨基酸序列中可能的少数变化不会阻止用于HERV-W ENV相关精神病的治疗用途的特异性抗ENV抗体的结合。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”如本文所用意指逆转、减轻、抑制该术语适用的疾病或病症的一种或多种症状的进展。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语“抗体”应被广义地理解并且不仅涵盖免疫球蛋白分子，而且涵盖抗体片段以及抗体衍生物。在具体实施方案中，抗体是抗HERV-W ENV，并且在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中的抗体。在一个具体实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:1-6所示的所有6个CDR。
如本文所用，表述“抗体片段”是指模拟高变区，例如CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的这种抗体的一部分。根据本发明的抗体片段保留了所述抗体的结合亲和力和特异性。这种片段是所述抗体的功能等同物，它们与所述抗体结合基本相同的表位。抗体片段的实例包括但不限于重链、轻链、VL、VH、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2。
如本文所用，表述“抗体衍生物”是指与至少一个不同于天然序列的序列(例如，另一物种的接头序列......)融合的本发明抗体的片段，优选包括所述抗体的六个CDR，所述衍生物具有与本发明抗体相当的对HERV-W ENV的结合亲和力和特异性。根据本发明的衍生物保留了所述抗体的结合亲和力和特异性。这种衍生物是所述抗体的功能等同物，它们与所述抗体结合基本相同的表位。抗体衍生物的实例包括但不限于scFv、(scFv)2和双抗。
在天然抗体中，两条重链(HC)通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链(LC)连接。有两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。
典型地，轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原表位特异性的结合位点。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原表位之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基组成。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自每一个重链和轻链V区的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指包含以下的抗体：来自任何物种，优选小鼠的抗体的VH结构域和VL结构域，以及人抗体的CH结构域和CL结构域。
根据本发明，术语“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区的抗体，但保留来自任何物种，优选小鼠的抗体的CDR。
术语“Fab”表示具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中通过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中，约一半的H链的N末端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。
如本文所用，术语“F(ab')2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中通过用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中，其比通过铰链区的二硫键结合的Fab略大。
如本文所用，术语“Fab'”是指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得。
表述“单链Fv”或“scFv”是指多肽，其是共价连接的VH::VL异二聚体，并且通常由包括通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因的基因融合物表达。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或者可以通过肽接头偶联单价scFv产生，例如二价sc(Fv)2。
术语“双抗”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。
如本文所用，表述“本发明的抗体”是指针对(即，特异性结合)HERV-W包膜蛋白(HERV-W ENV)，优选针对W型人内源性逆转录病毒家族(HERV-W)的HERV-W ENV蛋白，更优选针对MSRV的包膜蛋白，更优选针对MSRV的包膜蛋白的胞外结构域的抗体。在一个实施方案中，根据本发明的抗体是抗HERV-W ENV并在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中的抗体。本发明的抗体典型地结合构象表位。
特别地，本发明的抗体结合由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的两个远离的线性序列定义的构象表位。
优选地，本发明的抗体包含SEQ ID NO：1-6所示的所有6个CDR。
在本发明的含义内，表述“抗-ENV抗体”，“抗HERV-W ENV抗体”、“针对HERV-W ENV的抗体”和“靶向HERV-W ENV的抗体”无差别地使用并且是等同的。
如本文所用，术语“生物样品”如本文所用是指出于体外评估目的而获得的任何生物样品。在本发明中，样品或患者样品可以包括任何体液或疾病特异性组织和病变。体液的实例包括血液、乳头抽吸液、尿液、唾液、滑液和脑脊液(CSF)。特别地，血液样品可以是血清或血浆。
抗HERV W ENV抗体和诊断生物标志物用于治疗精神病的用途
本发明涉及诊断为精神病的患者的诊断驱动的治疗性治疗，已经对所述患者测试了显示体液样品中高细胞因子水平和/或体液样品中HERV-W ENV表达的生物标志物，并且进一步用抗HERV-W包膜蛋白的抗体(抗HERV-W ENV抗体)治疗。
具体地，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病并在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清或血浆中具有高细胞因子水平的患者组。
具体地，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品，特别是血液样品，更特别是血清或血浆中的高细胞因子水平的患者组。
在本公开中，表述“患者组”、“患者亚组”和“患者群”无差别地使用并且是等同的。
患有精神病的患者是具有精神病症状或诊断为精神病的患者。
换言之，诊断患有精神病的患者是患有具有精神病症状的精神病并由执业医师临床诊断的患者。
特别地，所述精神病选自下组：精神分裂症、双相障碍、分裂情感性精神病和精神分裂症样障碍。这些病理学是根据DSM IV或V分类或根据精神病的适当分类(25-28)定义的。精神疾病的诊断，特别是这种精神病的诊断，是执业医师熟知的。更特别地，所述精神病是精神分裂症或双相障碍。
在本公开中，“具有高细胞因子水平”是指“已经被测试具有高细胞因子水平”或“特征在于高细胞因子水平”。
本文所用的“高细胞因子水平”或“高的细胞因子水平”或“升高的细胞因子水平”是指所述细胞因子在患者组中的水平显著高于健康人的水平。例如，高细胞因子水平是血清中IL-6高于0.5pg/ml，血清中IL-1β高于0.05pg/ml，血清中TNF-α高于1.25pg/ml的细胞因子水平。值得注意的是，本公开中引用的细胞因子的阈值随用于其剂量和其灵敏度(真阳性的比例)和其特异性(真阴性的比例)的试剂盒、抗体、技术、方案、装置和平台而变化。所呈现的值仅仅是指示性的，并且应当根据制造商的说明来修改它们，或用针对健康个体的给定平台来评估它们。换言之，这意味着患者组中所述细胞因子水平显著高于所述细胞因子的正常水平。该正常值由试剂盒供应商给出和/或可以由一组健康个体(确认没有任何可能的开始或进行中的感染或炎症)测定。本领域技术人员完全知晓如何根据市场上可获得的不同技术、方案和设备来测量和测定给定细胞因子的这种阈值或正常水平。
该定义适用于本公开中引用的特异性细胞因子(例如IL-6、IL-1β和TNF-α)的高水平。
典型地，在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清或血浆中测量细胞因子水平。
在本公开中，所述细胞因子特别是促炎细胞因子。更具体地，所述促炎细胞因子选自下组：IL-6、IL-1β和TNF-α。
因此，在一个具体实施方案中，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病且在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清中具有高细胞因子水平的患者组，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。
在一个具体实施方案中，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品，特别是血液样品，更特别是血清中的高细胞因子水平的患者组，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。
在一个具体实施方案中，所述精神病是精神分裂症，并且所述体液样品中具有高水平的细胞因子优选是IL-6。
在一个具体实施方案中，所述精神病是双相障碍，并且所述体液样品中具有高水平的细胞因子优选是IL-1β。在一个更具体的实施方案中，所述诊断为双相障碍并且在体液样品中具有高水平的IL-1β的患者组还在体液样品中具有高水平的TNF-α。
在具体实施方案中，在所述患者组中检测到HERV-W ENV。由于呈现高细胞因子水平的患者亚组对应于表达HERV-W ENV的患者亚组，HERV-W ENV的检测不是强制性的并且可以是任选的。特别地，在生物样品中检测HERV-W ENV。更特别地，在血液样品中，更特别地在血清或血浆中检测HERV-W ENV。用抗HERV-W ENV抗体(如根据本公开的抗HERV-W ENV抗体)检测HERV-W ENV。
HERV-W ENV的表达可以通过按照下文所述条件检测HERV-WDNA、RNA、抗原或蛋白质来表征。
HERV-W家族是在首次从患有多发性硬化的患者分离的人逆转录病毒MSRV之后发现的(18-20)。HERV-W ENV表达的鉴定是本领域普通技术人员熟知的。相关疾病或综合征定义为相应患者中存在(i)优选在体液(血液、脑脊液、尿液…)中检测到的特异性HERV-W RNA或抗原，(ii)来自具有病变或功能障碍的器官的细胞或组织中升高的DNA或RNA拷贝数，(iii)参与疾病或临床综合征过程的细胞或组织中的特异性MSRV/HERV-W蛋白或抗原，或(iv)患有疾病或表达临床综合征的个体的体液中的HERV-W蛋白或抗原(参见国际申请WO2019201908A1－Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomericform ofHERV-W envelope protein)。已经描述了具有各种技术条件和靶标的此类检测测定的实例(21-23)。所有这些检测条件排除生理HERV-W拷贝，合胞素-1在正常和生理条件下，即在妊娠期间表达时的检测(24)。
特别地，在本公开中，HERV-W ENV的表达通过检测样品中的蛋白质HERV-W ENV来进行。对于这种检测，可以使用抗HERV-WENV抗体。更特别地，所述抗HERV-W ENV抗体可以是本申请中描述的抗体。
另外，它可以是鼠抗体，其包含：
-如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区(VL)；和
-如SEQ ID NO：8所示的重链可变区(VH)。
上述轻和重可变区公开于表1中：
表1：鼠抗体的轻链和重链可变区
Figure BDA0004113873100000121
在该实施方案中，精神病也可称为“HERV-W ENV相关精神病”。在患有精神病的患者中，所述患者组则是患有精神病的患者组，其在体液样品中具有高细胞因子水平，特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α，并且其中已经例如按照上述条件通过检测HERV-W DNA、RNA、抗原或蛋白质来检测HERV-W ENV。在具体实施方案中，本发明适用于患有精神病的患者组，其中HERV-W ENV的检测特征在于检测HERV-W DNA、RNA、抗原或蛋白质和/或在体液样品中具有高细胞因子水平。
因此，在一个具体实施方案中，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病并且在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清或血浆中具有高细胞因子水平，和/或在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清或血浆中检测到HERV-W ENV表达的患者组。
在一个具体实施方案中，本发明涉及抗HERV-W ENV抗体，其用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品中，特别是血液样品中，更特别是血清或血浆中的高细胞因子水平，和/或在体液样品中，特别是血液样品中，更特别是血清或血浆中检测到HERV-W ENV表达的患者组。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗上述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗HERV-W ENV抗体诱导神经元中NMDA受体，特别是含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中。
这意味着所述抗HERV-W ENV抗体能够逆转NMDAR从神经元突触的扩散，同时通过小胶质细胞产生细胞因子，其中这些神经受体可以恢复正常的功能活性。这特别涉及含谷氨酸能GluN2B的NMDA受体。事实上，如实施例2所示，HERV-W ENV通过诱导NMDAR从生理相关突触区域离域而导致NMDAR功能活性的丧失。含GluN2B的NMDA受体从突触向突触后区室(即在突触外的神经元膜区域中)的特定扩散导致精神障碍的特征性症状。
典型地，实施例2教导了如何鉴定抗HERV-W抗体对海马神经元中含GluN2B的NMDA受体从突触后区室重定位到突触的治疗活性。动物海马广泛用于神经学，因为它们构成研究精神障碍的动物细胞模型，并且它们对应于易于接近的脑区域。
由于海马体中的神经元就其全局突触功能和就其对神经递质受体的突触定位的需要而言等同于在其它脑区域中发现的神经元，因此对海马神经元进行的观察被外推至其它脑区域中的神经元。因此，尽管涉及不同精神病病理的脑区域可能不同，但对海马体的神经元所进行的当前观察代表位于其它脑区域的神经元。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗上述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗体结合HERV-W ENV。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗上述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗体结合HERV-W ENV的构象表位。更特别地，所述构象表位由SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示的两个远离的线性序列定义。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗上述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR的每一个。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗上述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗体在神经元中诱导NMDA受体，特别是含有GluN2B亚基的NMDA受体重定位到突触中，并且其中所述抗体包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR的每一个。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗如上所述患者组的抗HERV-W ENV抗体，其中所述抗体在神经元中诱导NMDA受体，特别是含有GluN2B亚单位的NMDA受体重定位到突触中，其中所述抗体特异性结合由SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的两个远离的线性序列定义的构象表位，并且包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR的每一个。
在一个具体实施方案中，用于治疗上述患者组的所述抗HERV-W抗体是单克隆抗体或人源化单克隆抗体。更具体地，所述抗体是IgG，例如IgG1或IgG4。更特别地，它是人源化IgG4单克隆抗体或IgG1单克隆抗体。
在一个具体实施方案中，用于治疗上述患者组的所述抗HERV-W抗体包含：
－轻链，其中可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO:1所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:2所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:3所示的CDR-L3的3个CDR的每一个；和
－重链，其中可变区(VH)包含如SEQ ID NO:4所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:6所示的CDR-H3的3个CDR的每一个。
它也可以是上述抗HERV-W抗体的片段或衍生物，选自下组：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、双抗。
鉴别诊断为精神病的患者亚组的诊断方法
本发明还涉及鉴别诊断为精神病的患者是否属于患有如本公开中所定义的精神病的患者亚组的诊断方法，包括：
1)定量细胞因子的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV的表达。
特别地，所述细胞因子是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。
特别地，精神病选自下组：精神分裂症、双相障碍、分裂情感性精神病和精神分裂症样障碍。
例如，当患者被诊断为精神分裂症时，优选定量IL-6的水平。例如，当患者被诊断为双相障碍时，优选定量IL-1β的水平。在双相障碍的情况下，另外还可以定量TNF-α的水平。
典型地，在体液样品中，特别是在血液样品中，更特别是在血清或血浆中定量细胞因子的水平。
如果患者在体液样品中呈现所述细胞因子的高水平，这意味着所述患者属于患有精神病并且特征在于体液样品中高细胞因子水平，并且特征还在于表达HERV-W ENV的患者亚组。
上文给出的“高细胞因子水平”的定义也适用于此。
用于检测HERV-W ENV的方法的实例先前在本公开中给出。特别地，HERV-W ENV的表达通过检测生物样品中的蛋白质HERV-WENV来进行。对于这种检测，可以使用抗HERV-WENV抗体。更特别地，所述抗HERV-W ENV抗体可以是本申请中描述的抗体。
另外，它可以是鼠抗体，其包含：
-如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区(VL)；和
-如SEQ ID NO：8所示的重链可变区(VH)。
在本公开中，在生物样品中，特别是在体液样品(如血液样品)中，更特别是在血清或血浆中检测HERV-W ENV。
因为呈现高细胞因子水平的患者亚组对应于表达HERV-W ENV的患者亚组，即其中检测到HERV-W ENV的患者亚组，因此鉴定患有精神病的该患者亚组不需要定量细胞因子水平和检测HERV-WENV。因此，仅分析这些参数之一就足够了。
因此，在一个具体实施方案中，本申请涉及鉴定诊断为精神病的患者是否属于患有精神病并且其特征在于体液样品中高细胞因子水平的患者亚组的诊断方法，所述方法包括：
1)定量特别是血液样品中，更特别是血清中的细胞因子水平，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，如IL-6、IL-1β和/或TNF-α；和
2)任选地，检测HERV-W ENV的表达。
本发明还涉及鼠抗体，包含：
－如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区(VL)；和
－如SEQ ID NO：8所示的重链可变区(VH)。
所述鼠抗体包含SEQ ID NO：1-6的CDR。
本发明还涉及检测生物样品，特别是体液样品(如血液样品)，更特别是血清或血浆中的HERV-W ENV的试剂盒，其包含如本公开中所述的抗HERV-W ENV。
特别地，其包含抗HERV-W ENV，所述抗HERV-W ENV包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的CDR的每一个。
更特别地，其包含抗HERV-W ENV，所述抗HERV-W ENV包含：
－轻链，其中可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO:1所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:2所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:3所示的CDR-L3的3个CDR的每一个；和
－重链，其中可变区(VH)包含如SEQ ID NO:4所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:6所示的CDR-H3的3个CDR的每一个。
所述试剂盒还可以包含鼠抗体，所述鼠抗体包含：
-如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区(VL)；和
-如SEQ ID NO：8所示的重链可变区(VH)。
根据本发明的治疗方法和监测方法
在另一个方面，本发明还涉及用于治疗诊断为精神病(如精神分裂症或双相障碍)并且在体液样品中具有高细胞因子水平的患者组的方法，其包括向所述患者施用有效量的抗HERV-W ENV抗体，特别是如本公开中所述的抗HERV-W ENV抗体。
特别地，本发明涉及用于治疗诊断为精神病(如精神分裂症或双相障碍)的患者组的方法，并且所述精神病的特征在于：
-体液样品中的高细胞因子水平，和/或
-在体液样品中检测到的HERV-W ENV的表达，
包括向所述患者施用有效量的抗HERV-W ENV抗体，特别是如本公开中所述的抗体。
另一方面，本发明还涉及抗HERV-W ENV抗体(如本公开中所述的抗体)在制备用于治疗诊断为精神病并在体液样品中具有高细胞因子水平的患者组的药物中的用途。
特别地，本发明还涉及抗HERV-W ENV抗体(如本公开中所述的抗体)在制备用于治疗诊断为特征在于以下的精神病的患者组的药物中的用途：
-体液样品中的高细胞因子水平，和/或
-在体液样品中检测到的HERV-W ENV的表达。
本发明还涉及用于治疗诊断为精神病并且特征在于以下的患者组的方法：
－体液样品中的高细胞因子水平，和/或
－在体液样品中检测到的HERV-W ENV的表达，
包括向所述患者施用有效量的抗HERV-W ENV抗体，特别是包含SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR的每一个的抗HERV-WENV抗体。
上述所有实施方案适用于本发明的这些其它方面。
特别地，本发明还涉及治疗诊断为精神病的患者的方法，包括以下步骤：
1)定量细胞因子的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV的表达。
特别地，所述细胞因子是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。特别地，在血液样品中，更特别地在血清或血浆中定量所述细胞因子的水平。为了定量细胞因子的水平，可以使用所述细胞因子的一种或多种特异性生物标志物。为了检测HERV-W ENV的表达，可以使用抗HERV-W ENV抗体，如本申请中公开的抗体。在生物样品中，特别是在体液样品如血液样品中，更特别是在血清或血浆中检测HERV-W ENV。
如果所述步骤1显示体液样品中高细胞因子水平和/或如果所述步骤2显示检测到HERV-W ENV，则本发明的方法另外包括向所述患者提供如本公开中所述的抗体的步骤。应注意，优选首先进行步骤1。在该实施方案中，当步骤1显示体液样品中高细胞因子水平时，步骤2可以是任选的。
为了确定“高细胞因子水平”，上文给出的“高细胞因子水平”的定义也适用于此。
然后，可以使用与患者相关的细胞因子的特异性生物标志物或抗HERV-W ENV抗体(如本申请中公开的抗体)建立随访。
在一个具体实施方案中，本发明还涉及治疗诊断为精神分裂症的患者的方法，其包括以下步骤：
1)定量IL-6的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV的表达。
如果所述步骤1显示高IL-6水平和/或如果所述步骤2显示检测到HERV-W ENV，则本发明的方法另外包括向所述患者提供本发明的抗体的步骤。
在一个具体实施方案中，本发明还涉及治疗诊断为双相障碍的患者的方法，其包括以下步骤：
1)定量IL-1β的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV的表达；
3)任选地，定量TNF-α的水平。
如果所述步骤1显示高IL-1β水平和/或如果所述步骤2显示检测到HERV-W ENV，并且任选地步骤3显示高TNF-α水平，则本发明的方法另外包括向所述患者提供本发明的抗体的步骤。
本发明还涉及监测诊断为精神病并在体液样品中具有高细胞因子水平的患者对治疗的应答的方法，所述方法包括以下步骤：
1)定量细胞因子的水平；和/或
2)检测HERV-W ENV蛋白。
特别地，所述细胞因子是促炎细胞因子，更特别是IL-6、IL-1β和/或TNF-α。特别地，在血液样品中，更特别地在血清或血浆中定量细胞因子的水平。为了定量细胞因子的水平，可以使用所述细胞因子的一种或多种特异性生物标志物。为了检测HERV-W ENV的表达，可以使用如本申请中所述的抗HERV-W ENV抗体。在生物样品中，特别是在体液样品(如血液样品)中，更特别是在血清或血浆中检测HERV-W ENV。例如，如果精神病是精神分裂症，则所述细胞因子优选是IL-6。例如，如果所述精神病是双相障碍，则所述细胞因子优选地是IL-1β，并且任选地另外优选地是TNF-α。
患者中细胞因子水平的降低和/或HERV-W ENV蛋白的降低是治疗功效的指标。此外，可以进行患者的行为研究和/或临床评定量表以分析患者的一般状态的改进，从而确认治疗的功效和/或使其剂量适应患者。
典型地，在本申请中，检测和/或定量的步骤可以根据本领域技术人员公知的常规技术进行。典型地，所述步骤包括将生物样品(如患者的体液样品)与选择性试剂(如探针、引物、配体或抗体)接触，从而检测样品中最初目标核酸或蛋白质的存在。
抗HERV-W ENV抗体
本发明还涉及抗HERV-W ENV并在神经元中诱导NMDAR，特别是含有GluN2B亚基的NMDA受体重定位到突触中的抗体。
神经元中存在两种主要的NMDA受体亚型(也称为NMDAR)。含GluN2A亚基的NMDAR称为含GluN2A的NMDA受体(GluN2A-NMDAR)，并且含GluN2B亚基的NMDAR称为含GluN2B的NMDA受体(GluN2B-NMDAR)。
本发明还涉及结合HERV-W ENV的构象表位的抗HERV-WENV抗体。
术语“构象”与术语“线性”相反。在本发明中，这意味着表位被看作是两个分开的和远离的线性氨基酸序列，它们在经典表位作图方案中被相同的单克隆抗体明显检测到，其中重叠的肽覆盖蛋白质的一级氨基酸序列。当蛋白质折叠成特定的三维形状时，形成构象表位，该三维形状将这两个远离的氨基酸序列呈现为连续的氨基酸序列，因此作为由接头序列组成的单一独特表位靶向。
优选地，抗HERV-W ENV抗体结合由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义的HERV-W ENV的构象表位。
本领域普通技术人员熟知如何产生与由其氨基酸序列定义的特定表位结合的抗体(29)。
本发明进一步涉及包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的每个互补决定区(CDR)的抗体。
本发明还涉及抗HERV-W ENV抗体，其在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中，并且其包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区(CDR)的每一个。
本发明还涉及抗HERV-W ENV抗体，其在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中，并且其结合由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义的HERV-WENV的构象表位。
本发明还涉及结合HERV-W ENV的构象表位的抗HERV-WENV抗体，所述HERV-W ENV的构象表位由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义，并且包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区(CDR)的每一个。
本发明还涉及结合HERV-W ENV的构象表位的抗HERV-WENV抗体，所述HERV-W ENV的构象表位由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义，并且包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区(CDR)的每一个，并且其在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含：
－轻链，其中可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO:1所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:2所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:3所示的CDR-L3的3个CDR的每一个；和
－重链，其中可变区(VH)包含如SEQ ID NO:4所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:6所示的CDR-H3的3个CDR的每一个。
上述互补决定区(CDR)公开于表2中：
表2：根据本发明的抗体的CDR结构域
结构域 SEQ ID NO: 序列
CDR-L1 1 KSLLHSKGITY
CDR-L2 2 QMS
CDR-L3 3 AQNLELPWT
CDR-H1 4 GYSFTSYW
CDR-H2 5 IYPGKSDTS
CDR-H3 6 TRTVYAMDY
在一个实施方案中，本发明涉及上述抗体的片段或衍生物，其选自下组：Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、双抗。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体。本发明的单克隆抗体为单价、双价、多价、单特异性或双特异性。在另一个实施方案中，针对HERV-W ENV的抗体是结合片段或缀合物。例如，本发明的抗体可与生长抑制剂、细胞毒性剂、或前药活化酶缀合。
本发明的抗体的氨基酸修饰的另一类型可用于改变抗体的原始糖基化模式。“改变”是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个不存在于该抗体的糖基化位点。抗体的糖基化典型地是N-连接。“N-连接”是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任一者的存在产生可能的糖基化位点。通过改变氨基酸序列容易完成对抗体添加糖基化位点，从而其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。
在具体实施方案中，根据本发明的抗HERV-W ENV抗体是单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
优选地，所述抗HERV-W ENV抗体是IgG，特别是IgG1或IgG4，优选IgG4。
更优选地，本发明的抗体是人源化单克隆抗体，更优选人源化IgG4单克隆抗体或人源化IgG1单克隆抗体。
所述人源化抗体可通过获得编码CDR结构域的核酸序列来制备：将其插入用于动物细胞的表达载体，所述载体具有编码与人抗体相同的重链恒定区和与人抗体相同的轻链恒定区的基因，并通过将表达载体引入动物细胞来表达该表达载体。人源化抗体表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于分别载体的类型或者是两个基因存在于相同载体的类型(串联型)。就人源化抗体表达载体建构的容易性、引入动物细胞的容易性、以及在动物细胞中抗体H和L链的表达水平之间的平衡而言，更优选串联型的人源化抗体表达载体。串联型的人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93、pEE18等。基于常规重组DNA和基因转染技术的用于制备人源化抗体的方法是本领域众所皆知的。可用本领域已知的各种技术将抗体人源化，包括例如CDR-接枝、镶面(veneering)或表面重修(resurfacing)、和链替换(chain shuffling)。用于制备这种抗体的一般重组DNA技术也是已知的。
因此，本发明的一个实施方案涉及单克隆人源化抗体，其包含：
-轻链，其中可变结构域包含如SEQ ID NO：1所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：2所示的CDR-L2和如SEQ ID NO：3所示的CDR-L3的3个CDR的每一个；和
-重链，其中可变结构域包含如SEQ ID NO：4所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：5所示的CDR-H2和如SEQ ID NO：6所示的CDR-H3的3个CDR的每一个。
本发明还涉及用于治疗用途或用作药物的上述抗HERV-W ENV抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及针对HERV-W ENV并在神经元中诱导含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中的抗体，其用作药物以用于治疗用途。
在一个实施方案中，本发明涉及用作药物以用于治疗用途的针对HERV-W ENV的抗体，其中所述抗体结合由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义的HERV-W ENV的构象表位。
在一个实施方案中，本发明涉及用作药物以用于治疗用途的抗HERV-W ENV的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区(CDR)的每一个。
这三个实施方案可以彼此组合。
药物组合物
本发明的另一个目的涉及药物组合物，其包含如上所述的抗HERV-W ENV的抗体或其片段或衍生物，以及药学上可接受的赋形剂。特别地，药物组合物包含有效量的所述抗体。
本发明还涉及如前所述用于治疗患有精神病并在体液样品中具有高细胞因子水平的患者组的这种药物组合物。
如上所述的本发明的任一治疗剂可与药学上可接受的赋形剂、和任选的缓释基质(例如生物可降解聚合物)组合以形成治疗组合物。
“药学上”或“药学上可接受”是指如有需要当向哺乳动物，尤其是人类施用时，不会产生副作用、过敏或其他不适当反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何形式的配制辅助剂。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和给药方案当然取决于待治疗的病况、疾病严重性、患者的年龄、重量及性别等。
本发明的药物组合物可配制为用于局部、口服、鼻内、眼内、静脉内、鞘内(直接在脑脊液中)/肌肉内或皮下施用等。
优选地，此药物组合物含有媒介，其对于能够被注射的制剂是药学上可接受的。这些特别可以是等渗的、灭菌的盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或为干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，其视情况当添加灭菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。
施用剂量可随各种参数来调整，特别是随所用的施用模式、相关病理学或所需治疗持续时间来调整。
为了制备药物组合物，可将有效量的针对HERV-W ENV的抗体或其片段或衍生物溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质。
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的灭菌粉末。在所有情况下，此形式必须是无菌的且必须是存在可容易注射程度的流动。其在制造及储存的条件下必须是稳定的，且必须保存防止微生物(诸如细菌及真菌)的污染作用。
可在与表面活性剂(例如羟基丙基纤维素)适当混合的水中制备呈游离碱或药理学上可接受的盐类的活性化合物的溶液。也可在甘油和油中制备分散液。在储存及使用的平常条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
在配制时，以与剂量制剂相容的方式且以治疗有效的量施用溶液。该制剂容易以各种剂型施用，诸如上述可注射溶液的形式，但也可使用药物释放胶囊等。
优选地，本发明的针对HERV-W ENV的抗体可在其溶解、储存及向患者注射的缓冲液中配制。优选地，该缓冲液包含20mM组氨酸、5％蔗糖、和0.01％聚山梨醇酯20。
对于水溶液的肠胃外施用，例如溶液可被适当地缓冲且用充分的盐水或葡萄糖首先使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内施用。就此点而论，鉴于本文的公开，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解于1ml的等渗NaCl溶液，也可添加至1000ml的皮下灌注液体或在提议的输注位点注射(参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据待治疗患者的病况，必然会发生剂量上的一些变动。无论如何，负责施用的人将决定对个别患者适当的剂量。
在优选实施方案中，将本发明的抗体配制成通过静脉内或通过鞘内注射施用。
附图说明
在所有图例和附图中，“Cont.”是指对照。
图1：来自诊断为精神分裂症或双相障碍并具有可检测的HERV-W ENV(ENV)蛋白(阳性抗原血)的患者的血清诱导神经递质失调(NMDAR特异性减少和突触扩散)，其具有由重组ENV证明的相同特征，其可以被抗HERV-W ENV抗体逆转或预防。
(A和B)来自精神病患者(阴性，n＝5)的包膜阳性(阳性，n＝6)血清样品中白介素-1β水平的增加。*P＝0.043，Student's t检验。(C)15分钟血清-样品孵育后培养的网络和转染的神经元的代表性图像。比例尺，顶部/底部＝30/10μm。(D)ENV-阳性血清样品特异性地减少GluN1簇区域(插图)。GluA1-SEP(n＝57/43神经元阴性/阳性)，GluN1-SEP(n＝56/61)，多巴胺1-CFP(n＝54/61)和GABAγ2-SEP(n＝59/68)。比例尺＝1μm和插图0.3μm。*P＝0.048，Student's t检验。(E和F)在5分钟重组包膜蛋白(ENV)或媒介物(Cont.)暴露后，脊中记录的NMDAR介导的Ca2+迹线，点表示检测到的瞬时。D-AP5(50μM)阻断所有瞬时。比例尺＝1μm。(F)空白(n＝47/5脊/神经元)、Cont.(n＝92/7)、ENV:0.5μg/ml(n＝87/6),1.0μg/ml(n＝114/9)和10μg/ml(n＝18/1)的Ca2+－瞬变比。(G)Cont.(n＝4神经元)或ENV(1μg/ml，n＝6)施用之前(pre)和之后5min的代表性NMDA迹线和平均峰值振幅。(H)在Cont.或ENV(1μg/ml)暴露之后5min的GluN2A-和GluN2B-NMDAR-QD复合物在突触后密度(PSD)的代表性轨迹。比例尺＝1μm。(I)ENV诱导含GluN2B的NMDAR受体表面扩散的特异性增加，主要在突触区域。将数据标准化为各神经元的预暴露。GluN2A:额外突触:Cont.n＝(300/4轨迹/神经元)ENV(n＝445/5),突触:Cont.(n＝176/4),ENV(n＝200/5).GluN2B:额外突触:Cont.(n＝819/10),ENV(n＝727/10),突触:Cont.(n＝670/10),ENV(n＝792/10).*P＝0.0319和***P<0.0001,Mann-Whitney检验。(J)(I)中突触数据的均方位移(MSD)。(K)共施用抗HERV-W ENV单克隆抗体消除ENV效应，Cont.(n＝407/7),ENV(n＝484/6)。条和点是平均值±SEM。
图2：神经胶质细胞参与ENV诱导的谷氨酸能紊乱。
(a)无神经胶质的神经元培养物(黄色)神经元(MAP-2阳性)和(品红色)神经胶质(GFAP和Iba1阳性)的代表性图像。比例尺＝50μm。(b)载体(Cont.,n＝295/7轨迹/神经元)或ENV(1μg/ml，n＝377/6)暴露5分钟后，无神经胶质的培养物中的GluN2B突触扩散。(右)均方位移(MSD)。(c)Cont.或ENV暴露后在TLR-4中和-Ab存在下GluN2B突触扩散。Cont.(n＝163/5),ENV(1μg/ml,n＝276/6)，(右)MSD。比例尺＝1μm。(d)ENV(10μg/ml)暴露5分钟后检测培养基中的细胞因子释放，(n＝5个培养物)*P＝0.037,0.026,0.026,**P＝0.009,0.009，配对Student检验。(e，f)ENV(1μg/ml)加αTNF-α,αIL-6(1μg/ml)存在下GluN2B突触扩散阻断Ab或IL-1受体拮抗剂(IL-1ra,250ng/ml).Cont.(媒介物,n＝579/6),ENV(n＝352/6),ENV+αTNF-α(n＝461/5),ENV+αIL-6(n＝404/4),ENV+IL-1ra(n＝365/7)。***P<0,0001和0.006，Kruskal-Wallis检验后进行Dunn多重比较。(f)E中数据的MSD，包括Cont.+IL-1ra(n＝176/7)。(g)在无神经胶质的海马培养物中，暴露于IL-1β5分钟后GluN2B表面扩散增加。Cont.(n＝423/7),IL-1β(1ng/ml,n＝480/7).***P<0,0001,Mann-Whitney检验。将数据(平均值±SEM)归一化为各神经元的预暴露。
图3：与ENV相比，GluN2B对LPS刺激和多种小胶质细胞活化的应答。
(A)LPS(1μg/ml)刺激5分钟后，混合的无神经胶质的培养物中突触GluN2B-NMDAR扩散系数增加。混合培养物：生理盐水(Cont.)n＝340/6(轨迹/神经元)，LPS(0.01μg/ml)n＝281/5,LPS(0.1μg/ml)n＝329/5,LPS(1μg/ml)n＝446/6。无神经胶质培养物：Cont.n＝547/4,LPS(1μg/ml)n＝312/4。在添加Cont.或LPS之前，将数据标准化至基线条件，对于每个个体神经元±SEM。***P＝0,0004,Kruskal-Wallis检验后进行Dunn多重比较。(B)24hLPS刺激后的GluN2B-NMDAR突触扩散。Cont.n＝990/27,ENV n＝606/32。数据表示中位数±25-75％四分位数间距(IQR)，***P<0,0001,Mann-Whitney检验。(C)LPS(1μg/ml)或ENV(1μg/ml)暴露后24小时Iba1阳性小胶质细胞的代表性图像。比例尺＝10μm。(D)混合培养物中的小胶质细胞面积(μm2)的定量，空白(Cont.)n＝1420(细胞),ENV n＝1279和LPS n＝1763.***P<0,0001。来自Kruskal-Wallis检验的***P<0.0001，随后是Dunn多重比较。(E)(顶部)小胶质细胞形态相对于转化指数(TI)的图示。(底部)TI值<3的三种条件下的TI累积分数定义为变形细胞。注意与Cont.(70％)和ENV(71％)相比，LPS刺激(56％)后阿米巴样细胞百分比的变化。
图4：突触GluN2B对ENV的应答
(A)不同剂量ENV应用后5min突触GluN2B-NMDAR扩散系数。将所示数据标准化至基线，对于每个单独神经元，在添加媒介物(Cont.)或包膜蛋白(ENV)之前，平均值±SEM。Cont.n＝164/19(轨迹/神经元),ENV 0.5μg/ml,n＝90/7,ENV(1μg/ml),n＝805/13,ENV(10μg/ml),n＝140/7。Kruskal-Wallis检验，然后以Dunn多重比较，***P<0.0001。(B)来自单个神经元(圆圈)的突触GluN2B-NMDAR轨迹的中值扩散系数。显示基线(术前)和媒介物(Cont.n＝16/12神经元/培养物)或ENV(1μg/ml，n＝17/13)添加后5min的配对数据。*P＝0.038，双尾配对t检验。(C)热失活废除ENV效应。热失活媒介物(Cont.,n＝563/7)或ENV(n＝443/6)。(右)突触数据的均方位移(MSD)。(D)共施用河豚毒素(TTX，1μM)和ENV不会消除ENV效应(Cont.,n＝181/3)或ENV(n＝182/4)。显示的数据是标准化为每个单独神经元的前提条件的扩散系数，平均值±SEM。
图5：GluN2B对延长的ENV暴露的应答和ENV特异性作用被抗HERV-W ENV抗体中和。
(A)响应24hENV暴露的含GluN2B的NMDAR受体表面迁移率的特异性增加。GluN2A:Cont.n＝382/15(轨迹/神经元),ENV(0.5μg/ml)n＝147/6,ENV(1.0μg/ml)n＝277/13.GluN2B:Cont.n＝612/22,ENV(0.5μg/ml)n＝485/19,ENV(1.0μg/ml)n＝600/18,抗HERV-W ENV Ab(N.Ab)n＝204/14.***P＝0.0004，Kruskal-Wallis检验后进行Dunn多重比较。(B)(A)中数据的均方位移(MSD)。(C)24小时ENV暴露后GluN2A-和GluN2B-NMDAR的突触外表面扩散。GluN2A:Cont.n＝2214/28(轨迹/神经元场)ENV n＝1670/31,GluN2B:Cont.n＝3882/65,ENV n＝3872/51.**P＝0.0029，Mann-Whitney检验。值代表突触中值扩散系数±25-75％四分位间范围(IQR)。
图6：HERV-W ENV(ENV)诱导谷氨酸能网络活性和突触作用的改变。
(A)实验设置。比例尺＝10μm。(B)长期(24h)暴露于ENV后NMDAR介导的Ca2+瞬时频率的增加由IL-1ra共暴露调节。Cont.(n＝103/8脊/神经元),Cont.+IL-1ra(n＝110/7),ENV(n＝79/10),ENV+IL-1ra(n＝111/7).**P＝0.0055和***P<0.0001，双向ANOVA，随后是Bonferroni多重比较。(C)长期Cont.和ENV暴露后两个实例神经元上3个脊的Ca2+瞬时检测(点)和相关时间(阴影区域)。(D)24h Cont.或ENV暴露后平均脊瞬时相关特征相关图和(右)定量图。***P<0.0001，Mann-Whitney检验。(E)共转染神经元的实验设置和代表性图像。比例尺＝300和40μm。(F)来自Cont.(空载体)ENV(phCMV-MSRV ENV)转染的细胞(与或不与IL-1ra组合)的相关图和定量图。Cont.n＝(118/8),Cont.+IL-1ra(n＝151/8),ENV(n＝166/8),ENV+IL-1ra(n＝154/8),***P<0.0001和**P＝0.0052，Mann-Whitney检验。(G)突触区域中的表面GluA1-SEP(Homer 1c)。比例尺＝5和1μm。(G(底部)和H)延长的ENV暴露后的突触GluA1荧光强度，Cont.(n＝1071/25,脊/神经元场)和ENV(n＝728/21),***P<0.001，Kolmogorov-Smirnov检验。(I)基线(-5min)和化学LTP(cLTP)诱导后的活时移图像以及(右)cLTP诱导后突触GluA1-SEP荧光演变实例，针对Cont.和ENV归一化至基线。比例尺＝1μm。(J)单个脊cLTP后和基线(前)之间的GluA1-SEP强度比。Box-and-whisker图(10-90百分位)，其中Cont.无cLTP(n＝621/13),cLTP(n＝902/12),ENV无cLTP(n＝461/17),cLTP(n＝472/14)。*P＝0.0233，***P<0.0001，Mann-Whitney检验。如果没有提及其他数据，则数据表示平均值±SEM。
图7：MSRV-ENV在电穿孔细胞中的表达，细胞活力和GluN2在海马突触体部分中的表达。
(A)在P7来自GFP-电穿孔动物的海马CA1区的冠状切片，针对谷氨酰胺合成酶(GS)或离子化钙结合衔接分子1(Iba1)共染色。比例尺＝10μm。(B)来自P7电穿孔动物的海马CA1区中凋亡细胞检测(TUNEL)的代表性图像。比例尺＝1mm和200μm。(C)定量不同区域的阳性细胞/mm2。值代表平均值±SEM，n＝3只动物/组。(D)亚细胞分级的蛋白质印迹分析。与H相比，NMDA受体(GluN2A/2B)和突触后密度蛋白(PSD-95)在P2和突触体级分中富集，而观察到神经胶质(GFAP)的耗尽。(E)来自突触体的代表性化学发光迹线在WESTM-装置上针对GluN2(A+B)和PSD-95进行探测。
图8：DNA插入对体重发育和行为表现的影响
(A)与天然动物(n＝17-31只动物/组)相比，电穿孔动物的正常体重增加。(B)Env-大鼠没有表现出作为在开放场中心花费的时间测量的焦虑样行为的改变(n＝16)。(C)DNA负载对脉冲前抑制(PPI)应答没有影响(Cont.n＝11,Cont.+空载体n＝14)。(D)氯氮平(12mg/kg)改进Env动物(n＝12)的PPI应答。(E)使用任一Cont.IgG或GluN1-Ab(Cont.IgG n＝12,GluN1 n＝11)的交联方案后对照动物的PPI应答。数值为平均值±SEM。
图9：海马细胞中的选择性HERV-W ENV(ENV)插入诱导大鼠中与精神病相关的突触NMDA改变和行为。
(A)在出生后第(P)1天电穿孔的示意图。(B和C)海马插入基因分布的代表性图像。比例尺＝1mm，插图＝100μm。(D)来自CA1区域的phCMV-MSRV ENV表达细胞。比例尺＝20μm。(E)行为研究序列：适应性(Adapt.)/开放场，前脉冲抑制(PPI)和NMDAR拮抗剂(MK-801)挑战。(F)电穿孔后70天的插入基因表达(GFP)的印迹。(G)ENV-海马突触体中GluN2(A+B)/PSD-95比率的降低。*P＝0.012,Mann Whitney检验。点是个体动物和条代表平均值。(H)基线移动和环境适应测量为20分钟内移动的距离(cm)。值代表平均值±SEM。(I)ENV动物中MK-801(0.3mg/kg)诱导的快速移动增加。值代表平均值±SEM，*P和**P(黑线)，RM双因素ANOVA，Fisher's LSD事后分析(n＝9-11只大鼠/组)。(J)ENV表达损害PPI惊吓应答。*P＝0.0180和**P＝0.0019，双向ANOVA，随后是Bonferroni多重比较检验。(右)氯氮平(12mg/kg)恢复破坏的PPI应答。(K)实验设计，(右)海马内注射位点。(L)GluN1 x-连接后ENV动物中的PPI表现。*P＝0.0195,**P＝0.0093对未加权平均值进行单因素ANOVA校正，随后是Tukey's多重比较检验。点是个体动物且线代表平均值。
图10：新生儿ENV表达调节谷氨酸能突触成熟并且是精神病样行为所必需的，这可以通过体内注射HERV-W ENV中和抗体来逆转。
(A)海马组织的亚细胞分级。注意与初始匀浆相比，PMDA受体(由GluN2A表示)和突触后密度蛋白(PSD-95)在P2-和突触小体(突触蛋白富集的)级分中的富集，以及相同级分中的神经胶质(GFAP)的耗尽。(B)P7插入基因分布的代表性图像。比例尺＝1mm。(C)海马插入基因在～P65表达。(D)ENV暴露倾向于影响突触中GluN2A/PSD-95亚基的稳定化(P7,Cont.vs ENV,P＝0.06)，后者保持恒定。相互作用：F(1,29)＝8.69，双向ANOVA，Bonferroni多重比较检验，*P＝0.021，***P＝0.0004。(E)GluN2B/PSD-95表达在两个年龄都不受ENV影响。相互作用：F(1,29)＝2.46,P＝0.13，双向ANOVA，Bonferroni多重比较检验，***P<0.0001，(n＝8-9只动物/组)。条为平均值±SEM。(F)在P7，ENV-动物表现出增加的GluN2A-IL-1R相互作用。IL-1R的免疫沉淀(IP)，*P＝0.0462，Student's t检验(n＝5-7只动物/组)。(G)GluA2/PSD-95表达在成年动物中增加，**P＝0.0098，Students t检验(n＝6-9只动物/组)。(H)与Cont.和来自P7和P65大鼠的ENV相比，PSD-95表达相似。(I)早期产后治疗方案，在P4、8和12用ENV中和-Ab(30mg/kg)(i.p.注射)。(J)治疗改进ENV-动物PPI应答，*P＝0.037，单向ANOVA，Tukey's多重比较检验。点是个体动物且条代表平均值。
图11：具有ENVW2.3抗体-VL区的CDR序列的功能性蛋白质结构
(A)线性肽序列以CDR序列(CDR1、CDR2和CDR3)的指示表示。(B)根据PommiéC etal.,2004.Journal of Molecular Recognition,17,17-32；IMGT(免疫球蛋白或抗体、T细胞受体、MH、免疫球蛋白超家族IgSF和MhSF的国际免疫遗传学信息系统)。
图12：具有ENVW2.3抗体-VH区的CDR序列的功能性蛋白质结构
(A)线性肽序列以CDR序列(CDR4、CDR5和CDR6)的指示表示。(B)根据PommiéC etal.,2004.Journal ofMolecular Recognition,17,17-32；IMGT(免疫球蛋白或抗体、T细胞受体、MH、免疫球蛋白超家族IgSF和MhSF的国际免疫遗传学信息系统)。
图13：具有ENVW2.3固定位点的HERV-W/MSRV-ENV氨基酸序列用黑色实线(位点1)和灰色实线(位点2)加下划线。
MSRV-ENV蛋白的三级构象诱导以彼此对接的黑色实线和灰色实线加下划线的序列(位点1和位点2)。这产生由ENVW2.3抗体识别的构象表位。用虚线加下划线的序列对应于包含在形成ENVW2.3表位的位点1和位点2之间但不被抗体识别的氨基酸。
图14：血清中的HERV-W ENV表达和炎性细胞因子定义精神分裂症和双相障碍的亚组。
(a)健康对照(HC)、精神分裂症(SZ)病例和双相障碍(BP)病例中针对HERV-W ENV抗原血症为阳性(HERV-Wpos)或阴性(HERV-Wneg)的百分比。嵌入的数字代表受试者的数量。**p<0.01和***p<0.001，基于卡方检验，反映了HC和SZ或BP病例之间的显著差异。(b)两步聚类分析揭示了聚类分层的预测重要性和聚类特征的总结。聚类分析揭示了两个主要的簇(CL1和CL2)，其基于HERV-W阳性和血清细胞因子而分离。CL2受试者是HERV-Wpos且显示血清细胞因子水平增加，而CL1受试者是HERV-Wneg且血清细胞因子没有明显变化。(c)HC、SZ和BP受试者跨CL1和CL2的分布(百分比，％)。括号中的数字表示每个簇中受试者的数量。(d)HC受试者、SZ病例亚组(SZ/CL1和SZ/CL2)和BP病例亚组(BP/CL1和BP/CL2)的白介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α的血清水平。*p<0.01，**p<0.01和***p<0.001，基于单因素ANOVA后多重比较的Tukey事后检验。条表示平均值+/-S.E.M.。
图15：精神分裂症和双相障碍病例的不同亚组显示出不同的临床特征。
聚类分析揭示了两个主要的簇(CL1和CL2)，它们是基于HERV-W阳性和血清细胞因子分离的(参见图14)。CL2受试者是HERV-Wpos并且显示血清细胞因子水平增加，而CL1受试者是HERV-Wneg并且血清细胞因子没有明显变化(参见图14)。(a)SZ病例亚组(SZ/CL1和SZ/CL2)和BP病例亚组(BP/CL1和BP/CL2)的疾病发作年龄(岁)。**p<0.01，基于双向ANOVA后的多重比较的Tukey事后检验。(b)SZ病例亚组(SZ/CL1和SZ/CL2)和BP病例亚组(BP/CL1和BP/CL2)的Montgomery-Asberg抑郁评定量表[MADRS]评分和青年躁狂评定量表[YMRS]评分。*p<0.05，针对双向ANOVA之后的多重比较的Tukey's事后检验。(c)SZ病例亚组(SZ/CL1和SZ/CL2)和BP病例亚组(BP/CL1和BP/CL2)的阳性和阴性综合征量表[PANSS]评分(阳性、阴性和一般症状)评分。*p<0.05和***p<0.001，反映了SZ和BP受试者之间的显著差异，无论亚组分类如何，基于双向ANOVA。(d)SZ病例亚组(SZ/CL1和SZ/CL2)中的每日氯丙嗪[CPZ]当量。*p<0.05，基于tow-tailed t检验。所有值是均值+/-S.E.M.。
具体实施方式
实施例1-3的材料和方法
研究设计。
我们设计该研究以确定HERV-W衍生的包膜蛋白(ENV)是否可在已知的谷氨酸能(即NMDAR)发育性神经精神障碍中起作用。我们首先显示受体的离子移变功能(NMDAR拮抗剂与精神病样作用有关)在ENV暴露后是完整的，而相反，NMDAR-GluN2B亚型的表面扩散对ENV敏感。重组ENV缓冲液用作对照，且此外，热灭活和用特异性ENV-抗体中和证明涉及HERV-W ENV。在单颗粒跟踪实验开始时，一方面通过参考来自实验室的先前研究来确定样本大小，另一方面，以0.6-0.8的功率因数和0.5的α来计算(Power&Sample SizeCalculator,Statistical Solutions,LLC)，在我们的条件下，根据样本的SD，将其转换为4-13个细胞/条件。对于所有类型的实验，每种条件使用最少3个独立的培养物。随机选择培养物，并在整个活体成像实验中交替实验条件，实验者在除去非特异性轨迹期间对条件不知情，而所有其它分析在全自动基础上进行。免疫细胞化学表明重要突触GluN2A/2BNMDAR-亚基平衡的表达受到影响。所有涉及免疫组化/免疫细胞化学的分析都是盲法进行的。我们通过添加碘化丙啶并观察ENV暴露后的健康细胞体控制了ENV在我们的神经元网络中没有诱导毒性。我们接下来测量了整体NMDAR-介导的活性，以及NMDAR-依赖性长期突触增强(LTP)，并观察到ENV处理的培养物中钙频率的增加和cLTP诱导的消除。在化学LTP实验中，基线期间单个突触中GluAlSEP强度的10％以上的变化被认为是不稳定的，并且因此该脊被排除，对于钙成像，在D-APV应用后具有多于2个钙爆发的脊被认为是非NMDAR并被排除。然后，我们用含有HERV-W ENV的质粒转染神经元培养物并观察到类似的结果。具有空载体的质粒用作对照。然后，我们询问特定的ENV表达是否会影响动物的行为。为此，我们在出生后第0天的大鼠幼仔的海马体中表达ENV，并研究其对一系列行为研究的影响。我们通过评估TUNEL染色的细胞和动物的体重增加来控制细胞毒性，并且通过免疫组化和蛋白质印迹分析来确认ENV表达的存在和程度。在对照动物中使用GFP和另外的空载体的表达。对于行为研究，12只动物的预定最小样本量基于先前的研究。在我们的手中，使用了PPI中13-18只动物的样本量，其对应于0.6-0.75的功率因数和0.5的α，并且在x连锁和MK-801实验中，11只动物的样本量分别对应于0.55和<0.8的功率因数。将来自同窝的大鼠幼仔以随机方式分配到不同的实验组，并且在每个行为测试日对各组进行伪随机。如预先确定，PPI响应于预脉冲的增强和在MK-801攻击测试中，刻板行为用作排除标准。在动物研究期间，实验者对动物状况不知情，因为在收集完整的数据集之后，在实验结束时在完全自动化的基础上进行所有分析。当我们在几个行为试验中观察到缺陷时，我们然后研究动物的海马NMDAR表达，以便将我们的体外数据与这些观察结果的可能的潜在原因联系起来。每种条件用9只动物进行蛋白质表达研究，并且重复2-3次。通过在发育期间特异性中和ENV，我们观察到行为应答的明显改进。数据显示在海马中的HERV-WENV表达诱导行为缺陷并在发育期间调节突触NMDAR成熟。
用ELISA检测7名神经精神病患者血清中ENV的表达。来自6个没有已知脑病的个体的血清样品用作对照，并且样品大小基于样品的可获得性。在中试实验中，我们用我们的血清样品刺激用含有主要神经递质受体(AMPA、NMDA、多巴胺和GABA)的质粒转染的神经元网络，并观察到含有ENV的血清特异性诱导NMDAR改变。
ELISA多重化
使用Milliplex Map Kit(RECYTMAG-65K,Millipore)检查细胞因子水平。根据制造商的建议处理载体(对照)或ENV(10μg/ml)施用后5min收集的来自3种不同培养物的培养基，并在BioplexTM MAGPIX读数器(BioRad,Hercules,USA)上使用Luminex xPONENT软件获得平均荧光强度。将数据标准化为每个实验中的对照。
包膜蛋白.
重组ENV(548aa的全长MSRV包膜蛋白；ENV pV14；GenBank accessionno.AF331500)由PX’Therapeutics(Grenoble,France)根据(GeNeuro Geneva,Switzerland)的质量控制说明书生产。通过Mustang Q Acrodisc抛光批次，然后在0.22μm过滤器Stericup(Merck,Darmstadt,Germany)上过滤来除去内毒素。使用的ENV批次的内毒素水平为13.6-92.3EU/ml，如通过鲎变形细胞溶解物试验所测量。100℃ 30min热灭活后，通过观察结果排除内毒素对我们结果的影响。
受体表面扩散实验.
用突触后标志物Homer 1c-DsRed以7div转染神经元。用针对GluN2A或GluN2B亚基的胞外表位的抗体(Alomone Labs,Jerusalem,Israel,Table S3)以11-14div在37℃下孵育10分钟后实现NMDAR的高分辨率单分子追踪。用Quantum dots(QDs)655(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)在具有1％ BSA的培养基(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)中孵育10分钟后，使用EMCCD相机(Evolve,Photometric,Tuscon,USA)在Nikon eclipse Ti落射荧光显微镜上以50ms的采集时间对选定的目标区域(ROI)(具有Homer-1c表达神经元)进行成像500个连续帧。使用MetaMorph软件进行采集(v.7.7.11.0,Molecular Devices,Sunnyvale,USA)。使用MSD(t)＝<r2>(t)＝4Dt，由均方位移(MSD)对时间函数的前四个点的线性拟合计算每个轨迹的瞬时扩散系数(D)。为了测定单个QD复合物的分布，获得帧堆叠，并且在突触信号的二值化之后，将复合物自动定位到突触(包括周围2个像素的Homer-1c阳性区域)和突触外区室中。计算每堆突触位置相对于总量的百分比，并从每组中排除两个最高deltas(前-后)作为离群值。将数据投影在单个背景图像上，提供受体/QD复合物及其轨迹的高分辨率分布。在MetaMorph软件(MolecularDevices)中使用Palmtracer v1.0插件完成所有单颗粒分析。ENV(GeNeuro)或LPS(Sigma-Aldrich)与相应媒介物(对照)相比对受体表面扩散的影响使用两种方法来解决：i)在初始基线采集后在成像室中施加浴5min后，或ii)在将蛋白质施加至培养皿中的培养基后24小时。仅在施用5min后评估重组IL-1β(R&D Systems,Minnesota,USA)。在QD实验开始之前，通过在37℃下与抗TLR-4中和Ab(20μg/ml,Affymetrix,Wien,Austria)预孵育30min阻断受体来研究TLR-4参与。TLR-4中和抗体的特异性通过在Iba-1阳性小胶质细胞上的主要TLR4染色(图S2A)和shTLR-4转染后降低的染色(由Küry博士惠赠的质粒，图S2B)来证实。为了证实我们的ENV结果的特异性，一方面，进行蛋白质的热灭活(参见上文)，另一方面，施用前在室温下在玻璃管中将重组ENV蛋白质与ENV中和抗体GN_ENV_01/03(Geneuro)以分子量比(1:2)在正常马血清中预孵育45分钟。为了分离突触后应答，在记录之前将河豚毒素(1μM,TTX,Tocris,Bristol,UK)施用到室中，并且为了细胞因子阻断实验，在记录期之前将IL-1ra(250ng/ml,R&D Systems)或中和抗体IL-6和TNF-α(1μg/ml,R&D Systems)施用到室中。与1μM PP2(Calbiochem,Merck)孵育15min后评估Src-家族激酶的参与。
细胞培养和转染
从E18 Sprague-Dawley大鼠制备海马神经元和神经胶质细胞的混合培养物。简言之，将细胞以300-350×100个细胞/皿的密度铺板在聚赖氨酸包被的盖玻片上，并在含3％马血清的Gibco神经基础培养基(Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)中体外(div)维持约4天，此时培养基变为无血清神经基础培养基。分两步制备庄家型“无神经胶质”海马培养物。简言之，首先在聚赖氨酸包被的培养皿中从海马制备神经胶质饲养细胞培养物，然后两周后，在悬浮于神经胶质层上方的聚赖氨酸包被的盖玻片上培养海马神经元(来自与神经胶质细胞相同类型的制备物)。将细胞在37℃下在5％ CO2中保持最多22div。将人胚肾细胞(HEK)293铺板在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Thermo Fisher Scientific)中的玻璃盖玻片上，并在一天后使用。
使用Effectene(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的建议或通过磷酸钙转染来转染细胞。编码HERV-W ENV蛋白的质粒在于插入phCMV载体中的参考MSRV-env基因，允许在转染的人细胞中表达：phCMV-MSRV env来自GeNeuro,Switzerland。插入的env合成核酸序列编码如数据库(Genbank Ref.AF 331500)所述的HERV-W包膜蛋白。
HERV-W ENV蛋白
重组ENV(548个氨基酸的全长MSRV包膜蛋白；ENV pV14；GenBank accessionno.AF331500)由PX’Therapeutics(Grenoble,France)根据GeNeuro(Geneva,Switzerland)的质量控制生产。通过Mustang Q Acrodisc抛光批次，然后在0.22μm过滤器Stericup(Merck,Darmstadt,Germany)上过滤来除去内毒素。使用的ENV批次的内毒素水平为13.6-92.3EU/ml，如通过鲎变形细胞溶解物试验所测量。如前所述(18)，100℃ 30min热灭活后，通过观察结果排除内毒素对我们结果的影响。
免疫细胞化学
在人血清孵育之前，用与Super Ecliptic pHluorin(SEP)融合的含有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPA)-A1；含有N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)-N1；含有γ-氨基丁酸(GABA)-γ2的亚基或用与Cyan Fluorescent Protein(CFP)融合的含有多巴胺(D)-1的亚基转染神经元(10div)。将血清样品缓慢解冻并在37℃下与20％ ENV阳性或ENV阴性血清样品一起孵育15分钟后，用抗GFP抗体在4℃下进行表面受体的活免疫染色10分钟(考虑血清样品中补体因子的热灭活，但由于ENV蛋白的已知热敏感性而不施用)。活染色后在4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟。通常，固定后通过在50mM NH4Cl中淬灭，封闭并在室温(R.T.)下在1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)中与偶联至Alexa荧光团的第二Ab一起孵育1小时。为了染色固定的细胞和组织，在1％ BSA(Sigma-Aldrich)和0.1％ Triton X-100(Sigma-Aldrich)中进行初始阻断和透化步骤30分钟后，在4℃下用一抗孵育过夜。将细胞固定在Mowiol(Calbiochem(Merck))或
Figure BDA0004113873100000381
+DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,CA)中。48小时后用抗ENV抗体(GN-mAb 01；GeNeuroSwitzerland)获得转染胞质增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和MSRV-ENV的HEK细胞中ENV的表面或细胞内染色。对于小胶质细胞活化研究，在LPS(血清型O26:B6,Sigma-Aldrich)(1μg/ml),ENV(PX’Therapeutics)(1μg/ml)或媒介物(对照)施用5分钟后，将细胞固定并针对电离钙结合衔接分子1(Iba1)进行染色。在具有CoolSNAP HQ2照相机(Photometrics,Tucson,USA)的视频共焦转盘系统(Leica DMI6000B,Wetzlar,Germany)上或在Nanozoomer(Hamamatsu,Japan)上收集图像。使用基于ImageJ中的整合荧光水平的固定阈值方法获得簇面积。从存在于整个盖玻片上的所有小胶质细胞获得小胶质细胞周长(μm)和面积(μm2)，并基于先前的出版物(27)计算转化指数(TI)(细胞周长)2/4pi(细胞面积)。
钙成像.
将用GCaMP3或GCaMP6以10div转染的神经元转移到含有(以mM计)：110NaCl，5KCl，25HEPES，15D-葡萄糖，2CaCl2和2MgCl2的Tyrode溶液中。为了分离NMDAR依赖性瞬变，然后在成像前15分钟用5μM Nifedipine(Tocris)和5μM Bicuculline(Tocris)将神经元移至无Mg2+的Tyrode中。在具有EMCCD照相机(Evolve,Photometric)的Nikon eclipse Ti落射荧光显微镜上，用MetaMorph软件(Molecular Devices)在20Hz下获取时移图像。为了评估即时效果树，连续记录了时移电影(3000帧)：前(基线)、后(PBS(空白)、媒介物(对照)或ENV和APV浴施用后5分钟(50μM D-(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV，Tocris)浴施用后5分钟)。对于延长的效果，记录两个时移电影。第一个，添加媒介物(对照)、ENV(1μg/ml)、载体+IL-ra(250ng/ml)或ENV+IL-ra后24小时，或用ENV-基因或空载体转染后4天，和第二个，施用APV浴后5分钟。时移电影在ImageJ(NIH)中与PoorMan3DReg插件(Michael Liebling)连接并重新对准。在由实验者(ImageJ,NIH)手动定义的各个ROI(脊)内测量来自钙瞬变对时间的荧光。将每个ROI内的所有像素平均以给出与ROI相关联的单个时程。通过用低于P50(μ)的先前5s值的平均值减去每个值并将结果除以μ来计算平均归一化荧光(ΔF/F)。按照两步程序鉴定阳性钙瞬变：最初，通过将原始信号与10s平方内核卷积来平滑ΔF/F迹线。使用定制编写的Matlab例程，在自动基础上定义真实阳性NMDA瞬态(瞬态之间最少1秒)，其中阈值设定为APV平均迹线的5*SD。使用0.5秒的时间窗计算相同神经元上的脊之间的瞬态的成对互相关。我们通过减去平均相关来校正相关值，该平均相关是通过对各个脊的瞬态间时间进行混洗(重复100次)而获得的。
化学诱导的增强作用(cLTP)。
将用GluA1-SEP和Homer 1c-DsRed以10div共转染的活海马神经元与ENV(1μl/ml)或无(对照)在37℃孵育(12div)过夜。如前所述(24)，通过共施用200μM甘氨酸(Tocris)和5μM印防己毒素(Tocris)浴4分钟来激发化学诱导的长期增强(cLTP)。在基线采集一段时间(2×5分钟)后总是施加cLTP，并在诱导后用新鲜的平衡和加热的培养基小心地替换培养基。然后，在接下来30分钟内每5分钟记录一次GluA1-SEP荧光信号。使用突触Homer1c信号描绘突触，并在这些突触区域内随时间跟踪GluA1-SEP强度(ImageJ,NIH)，然后如果突触显示稳定的基线(在-10和-5分钟之间变化低于10％)，则专门标准化至基线。在具有CoolSNAPHQ2照相机(Photometrics,Tucson,USA)的视频共焦转盘系统(Leica,DMI6000B,Wetzlar,Germany)上收集所有图像。
动物.
妊娠大鼠(Sprague Dawley)购自Janvier(France)，并且在P 0-1上，将来自同窝的雄性幼仔以随机方式分配至不同组：对照、对照+或ENV。将大鼠保持在恒定环境温度(21±1℃)，随意获取食物和水。尽一切努力减少使用的动物数量及其痛苦。根据欧洲社区指南(指令2010/63/EU)管理动物研究进行动物程序，并由当地波尔多伦理委员会(APAFIS#3420-2015112610591204)批准。如前所述，在新生幼仔中在P0-1之间进行出生后电穿孔。简言之，通过低温麻醉幼仔，并与空载体(对照组)或与phCMV-MSRV ENV(克隆pV14，AF331500)(ENV-组)组合注射编码胞质EGFP的脱氧核糖核酸(DNA)构建体，以鉴定转染的细胞(对照组)。将在8μl PBS中的约2μg DNA和0.1μl固绿注射到侧脑室中，然后立即用脉冲发生器(BTX,Harvard apparatus,ECM830,San Diego,CA)递送的5个电脉冲(150V，50ms持续时间，脉冲之间间隔1s)进行电穿孔。将幼仔在37℃的热毯上再次复活并快速返回至其母亲。
行为应答.
在光周期(14.00-20.00)期间由与在动物寿命期间处理动物的实验者相同的实验者进行实验。每周监测它们的重量，并且在P21，将幼仔断奶，并将2-5只大鼠圈养在相同的窝中，并使用相同的处理/笼。使用了5个不同的研究组：i)按照以下顺序对第一组中的动物，对照(n＝13)，ENV(n＝13)进行一系列行为测试：(1)在P35-37，运动活性和焦虑，(2)对开放场的习惯/适应，和(3)在P56-58，前脉冲抑制试验(PPI)和2天后(4)社交识别和相互作用。ii)第二研究组中的动物，对照(n＝30)，ENV(n＝30)，在PPI之前暴露于氯氮平/媒介物处理或/和在PPI之后的当天暴露于MK-801攻击。iii)在PPI中测试第三研究组，对照(n＝11)，对照+(n＝14)，和iv)将第四研究组，ENV(n＝22)，在PPI前一天进行交联方案(见下文立体定位注射)。v)最后一组对照(n＝13)，ENV(n＝24)中的动物在出生后早期用ENV中和-Ab处理。所有动物首次接受试验时均未使用过该器械，并在开始前适应室内至少1小时。在每个行为测试日对各组进行伪随机分组。在开放场和PPI测试期间，实验者对动物状况不知情，尽管行为数据收集是使用完全计算机控制的设置并以无偏的方式进行的。相比之下，研究者在社交识别和交互测试中的评分分析期间对处理不知情。对于实验布局，参见图4C。
开放场.
在开放场竞技场(长54cm×宽54cm×高40cm)中用约5lux的光设置测量运动活性。通过视频跟踪允许在连续3个测试日中的第1天在2×10分钟期间自由探索空竞技场的大鼠来评估新奇诱导的运动。从第1天的记录中，将焦虑评估为在前10分钟期间在包括50％竞技场的中心区域内花费的时间。然后，在第2-3天，将对环境的习惯/适应评估为运动活性的降低。对于MK-801研究，向对照(n＝13)和ENV(n＝12)大鼠腹膜内(i.p.)注射盐水并留置以在一小时内探查竞技场。然后，施用(i.p.)MK-801(0.5mg/kg，Tocris)注射液，并再监测动物2小时。1只动物由于注射后的刻板行为而被排除。用IDtracker软件(43)提取行进的总距离并用自动定制编写的MATLAB例程进行分析。
前脉冲抑制(PPI).
使用Panlab惊吓室(Harvard,San Diego Instruments)进行PPI。每个PPI疗程持续大约31分钟，并以恒定背景噪声的5分钟适应期开始。疗程由8种不同的试验类型组成：无脉冲，之前有或没有74dB背景噪声(20ms，间隔100ms)以上+4、+8和+12dB处的树预脉冲以及单独的预脉冲的惊吓脉冲(在8kHz，40ms处的120分贝(dB))。每个疗程以10个惊吓脉冲(ITI70sec)开始，随后是8次试验×6的伪随机平衡顺序，并以10个惊吓脉冲的最后块结束。最初合并来自不同组的基线数据，发现Envgene插入对在三个预脉冲测量的总PPI的影响是相似的：1)双向ANOVA，组因子；F(1,72)＝11.23,**P＝0.0013,n＝13和，2)双向ANOVA，组因子；F(1,102)＝9.597,**P＝0.0025,n＝18。在两个动物组中都观察到响应预脉冲的增强，并且这些动物从最终数据集中排除。预脉冲抑制表示为％PPI并通过(100*((S-PP)/S)计算，其中S＝仅惊吓试验的平均应答，和PP＝预脉冲+惊吓试验的平均应答。通过比较GFP动物与GFP+空载体电穿孔的动物，我们证实了DNA负载对于行为结果是微不足道的(研究组iii)(图S6C)。在研究组ii)中，将氯氮平(Abcam,Cambridge,UK)(12mg/kg)溶于0.1N HCl中并用氢氧化钠缓冲至pH5.6，并在PPI评价前20分钟向对照(n＝12)和ENV(n＝12)动物施用单次(i.p.)注射(1ml/kg，氯氮平或媒介物)(图S6D)。媒介物处理不影响PPI应答(数据未显示)。在研究组iv)中在PPI测试前一天进行立体定位注射。简言之，将来自ENV组的大鼠(P55-57)用异氟烷麻醉并置于立体定位框架中。将在0.1％胰蛋白蓝(Sigma-Aldrich)(1:5)中稀释的0.8mg(2μl)多克隆山羊抗兔IgG(Novex,Thermo Fisher)(ENV+Cont.IgG)(n＝13)或抗兔GluN1(Alomone Labs)(ENV+GluN1交联)(n＝11)立体定向注射到每个海马中(相对于前囟点的坐标，AP:-4.5mm,ML:±3.2mm,DV:-2.0mm)。基于交叉研究连贯性，在所有组中对增加的预脉冲的增加的应答和在预脉冲+8dB处的强应答，优先显示从该预脉冲获得的PPI数据。完整的数据集可以在图S6E中观察到。平行执行来自研究组ii-iv的实验。产后早期处理通过在PN4、8和12单次i.p.注射ENV中和Ab(GN_mAb_ENV_03,30mg/kg,GeNeuro)来进行，然后将动物留在它们的笼子里，直到在～P58进行PPI测试的那一天。
社交识别和互动.
该方案由(43)调整。在试验前一天，将来自不同窝的具有相似重量(±5％)的3只大鼠(1只研究大鼠(对照或ENV)和2只靶大鼠(天然的))分配在一起进行试验。然后，将靶大鼠习惯于实验房间中的实验笼(舍笼)1小时。在实验当天，使研究大鼠习惯实验笼1小时。此后，在没有任何训练的情况下，开始测试，并将第一只靶大鼠置于相同的实验笼中(3×1分钟，ITI3分钟)，并记录社交识别。随后，在最后的互动期间，取出第一只靶大鼠，将第二只靶大鼠与研究大鼠一起放入实验笼中，并记录社交互动10分钟。在最后一个疗程中，对照研究大鼠在第一分钟期间显示增加的互动，意味着大鼠再次对不熟悉的大鼠(第二靶大鼠)感兴趣。然后，对完整的最后一次疗程(10分钟)进行评分以测量社交互动。研究和靶大鼠在该范例中不使用超过一次。对于研究大鼠积极参与社交互动行为(嗅探、梳理、紧跟和爬上/爬下)的时间，以盲目方式对视频评分。在疗程期间未观察到攻击行为。
组织制备
在PPI后2-14天去除脑；并将整个脑在置于液氮中的异戊烷(Sigma-Aldrich)中快速冷冻，或转移至冰冷的人工脑液中以解剖海马区域，然后在液氮中冷冻。随后如下所述处理冷冻的海马组织用于蛋白质印迹。对于免疫组化，将20μm厚的冠状组织切片在切片机-低温恒温器上切割，解冻安装在超冷冻superfrost ultra plus(Thermo Scientific)载玻片上，并且储存在-20℃下直至进一步加工。P7年龄的动物，对照(n＝5)ENV(n＝5)和P59-70对照(n＝5)ENV.(n＝5)用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉(n＝5)并用0.1M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛经心脏灌注。取出脑并在4℃下后固定过夜，用VT1200S徕卡振动切片机制备50μm厚的切片。将切片用PBS洗涤三次，并在4℃下置于0.03％酸-PBS中备用。
免疫组化/TUNEL染色
在室温下将灌注的组织在BSA(Sigma-Aldrich)和0.1％ Triton X-100(Sigma-Aldrich)中阻断和渗透2小时。漂洗后，将样品与在2％BSA(Sigma-Aldrich)和0.2％Triton X-100(Sigma-Aldrich)中的第一Ab在4℃下孵育过夜。与Alexa荧光团偶联的第二Ab在室温下在与第一Ab相同的溶液中孵育2小时。使用Mowiol(Calbiochem)或
Figure BDA0004113873100000441
+DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,CA)固定切片。在具有CoolSNAPHQ2照相机(Photometrics)的视频共焦转盘系统(LeicaDMI6000B，63X)上或在Nanozoomer(Hamamatsu)上收集所有图像。
使用原位细胞凋亡检测系统荧光素(TUNEL,Promega,Madison,WI)组织学检查DNA片段。根据制造商的建议对来自P7电穿孔动物的冷冻组织切片进行染色并用Mowiol(Calbiochem)固定。
蛋白质印迹分析
通过亚细胞分级(图6D)处理来自对照和ENV电穿孔大鼠(～P70)的解剖海马体以单独收集突触(突触体)、突触质膜和突触囊泡。将蛋白酶和磷酸盐抑制剂(ThermoFisherScientific)添加到等渗蔗糖中用于均化和分级。用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)测定每个样品的蛋白质浓度，并在两个单独的实验中检查每种条件下9只动物的突触体。对于GFP检测，使用整个海马匀浆。我们使用WES-蛋白质简易装置(Protein simple,bio-techne,San Jose,USA)和WES-总蛋白质包装，加上WES-标准包装(12-230kDa)，包括抗兔二抗、抗体稀释剂、分子量梯、链霉抗生物素-HRP、二硫苏糖醇(DTT)、荧光主混合物、鲁米诺-S、过氧化物、样品缓冲液和洗涤缓冲液加上用于与PSD-95相关的GluN2B检测。该试剂盒还提供了毛细管盒和预填充的微孔板。加载0.1μg的每种样品，以及特异性的一抗、兔抗GluN2B(Agrobio)和抗PSD-95(Cell Signaling,Danvers,USA)。仅包括两个标准差范围内的值用于进一步分析。通过常规的蛋白质印迹检测GFP。简言之，将20μg总蛋白加载到用4-20％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的各泳道中，并转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad,Hercules,USA)上。在室温下将膜在5％脱脂奶TBS/0.1％ Tween 20(TBST)中封闭1小时。将一抗小鼠抗GFP(Roche,Basel,Switzerland)稀释于0.5％Milk的TBST溶液中用于蛋白免疫印迹分析，并在4℃在搅拌下孵育过夜。用HRP缀合的抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove,USA)在室温下孵育2小时。用ClarityTM Western ECL Substrate(Bio-Rad)显示特异性蛋白质条带，并使用Versadoc(Bio-Rad)扫描膜。
图的制备和分析。
在ImageJ(NIH)和Adobe Photoshop(Adobe Systems,San Jose,CA)中汇编图，仅调节对比度和亮度以优化图像质量。所有统计分析均在GraphPad Prism 6(GraphPadSoftware,San Diego,USA)中进行。简言之，使用α＝0.5进行统计分析。对于行为研究，预定的样本量基于文献。在此，在PPI中使用13-18只动物的样本量，其对应于0.6-0.75的功率因数和0.5的α，并且在交联和MK-801实验中，11只动物的样本量分别对应于0.55和<0.8的功率因数。当数据通过D'Agostino&Pearson综合正态性检验时，应用参数统计检验，因此进行有或没有Welch校正的双尾Student's t检验、单尾或双尾配对Student's t检验或双向ANOVA，随后进行Bonferroni's多重比较检验。使用非参数检验进行非高斯分布数据组间比较：双尾不配对Mann-Whitney检验，或对于多个组，Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验。为了直接比较分布，使用Kolmogorov-Smirnov检验。对于行为测试，使用因子组和预脉冲通过双向ANOVA分析PPI结果，随后对组和预脉冲强度进行Bonferroni多重比较测试。在交联和中和Ab方案中使用单因素ANOVA分析，随后用于处理的Tukey's多重比较测试。考虑因素处理和时间的RM双因素ANOVA，随后Fisher LSD事后分析用于分析MK-801反应，且双因素ANOVA用于具有因素处理和面积的TUNEL数据。显著性水平定义为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例1：来自精神病患者的血清对神经元神经递质受体的作用。
在第一个实验中，我们从患有精神障碍(精神分裂症和双相障碍)的患者或从对照健康受试者收集血清，以测试它们对含有神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的海马神经元网络中关键神经递质受体含量的影响(图1A-C)。不考虑谷氨酸能AMPA(GluA1亚基)和NMDA(GluN1亚基)、多巴胺能D1和抑制性GABAA(γ2亚基)受体，来自精神病患者的血清特异性地减少NMDA受体(NMDAR)簇(图1D)。值得注意的是，当与对照受试者相比时，这些患者也显示高水平的促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)(图1A和B)。因为我们使用来自精神病患者的人血清，如以下实施例所述的体外和体内研究证实的这种具有特定特征的NMDAR改变与测试的血清中HERV-W ENV的存在(抗原血症)一致。还如以下实施例中所述，其还与涉及IL-1β的HERV-W ENV致病性和小胶质细胞的先天免疫特性对于神经元突触NMDAR功能的特异性失调的相关性一致。最重要的是，它还与由收集诊断为精神分裂症或双相障碍和血清中促炎细胞因子检测(包括IL-1β)升高的病例的患者亚组代表的新医院实体的发现一致。包括在该新的生物学定义的疾病分类学实体中的患者已被诊断为精神分裂症或双相障碍。
实施例2：HERV-W ENV触发小胶质细胞的特异性细胞因子释放，具有协同的神经病 理作用。
令人惊讶地，当无神经胶质的神经元培养物(无星形胶质细胞或小胶质细胞)暴露于重组ENV时，GluN2B－NMDAR突触动力学保持稳定(图2A和B)。在神经元培养物中存在小胶质细胞的情况下，促炎细菌脂多糖分子LPS能够快速扩散突触GluN2B-NMDAR(图3A和B)。然而，由LPS或ENV激活的小神经胶质细胞显示不同的表型(图3C-E)，证明这两种蛋白激活不同的信号传导途径，尽管它们对TLR4具有共同的亲和力，这导致对神经元细胞的不同性质和机制的作用。在寻找由ENV触发的神经胶质细胞释放的神经胶质介质时，我们在体外测量了促炎细胞因子，特别是IL-1β在复制海马网络的培养物的介质中的高释放(图2D)。为了测试这些细胞因子，尤其是IL-1β是否在ENV引起的突触NMDAR去稳定中起直接作用，将海马网络与各种细胞因子阻断剂一起暴露于ENV。IL-1ra(250ng/ml)()一种天然IL-1受体(IL-1R)拮抗剂)逆转ENV-诱导的GluN2B-NMDAR突触扩散。阻断IL-6(1μg/ml)或TNF-α(1μg/ml)仅部分降低效应且不产生完全阻断(图2E)。此外，单独的IL-1β足以增加无神经胶质的神经元培养物中的GluN2B-NMDAR运输(图2G)。因此，这些数据提供了HERV-W ENV能够通过神经胶质和细胞因子依赖性过程快速扩散突触NMDAR的第一证据。现在表明这代表了一种新的机制，通过该机制，HERV-WENV可通过经由白介素-1影响突触中的神经受体分布来改变神经元功能，可能与IL-6和/或TNF-α协同作用，但靶向神经受体的特定亚类(GluN2B-NMDAR)。此外，尽管其可能被多种促炎激动剂(如LPS)诱导，观察到的来自小神经胶质细胞的ENV诱导的细胞因子的作用也揭示了ENV对神经元突触中和周围的GluN2B-NMDAR运输的特异性作用。
因此，在谷氨酸能神经受体亚类和小胶质细胞介导的炎性细胞因子产生的水平上，HERV-W ENV对神经元功能的功能性改变表现出高度特异性。因此，促炎细胞因子和涉及这种特定的神经元功能障碍的最相关的细胞因子(IL-1β)不是由环境因素(如感染因子)诱导的，而是当在神经元-神经胶质组织环境中表达和/或释放时由HERV-W ENV蛋白本身诱导的。由于IL-1β单独或与IL-6和/或TNF-α联合的这种特异性作用既未被描述也未被预期，因此显然HERV-W ENV的背景诱导和协同作用是这种ENV特异性致病机制的关键。
基于这些ENV-胶质细胞/细胞因子介导的神经元功能障碍，这也揭示了到目前为止分类为不同诊断类别的精神疾病(例如精神分裂症和双相障碍)中特定生物连续体的存在。
目前的心理学实体仅依赖于具有专门测试和量表的心理评估，以及依赖于临床的，主要是行为的，症状学。
因此，对这种HERV-W ENV诱导的神经元功能障碍的目前阐明提供了因果、机制和生物学定义，其构成与HERV-W ENV和IL-1β和/或IL-6和/或TNF-α、细胞因子驱动的对脑细胞的协同作用相关的不同诊断类别的症状和疾病演变的基础。
因此，新的生物学定义的疾病分类学实体可以包括患有精神分裂症、患有双相障碍或患有其它目前的精神病学诊断的患者的亚组，这是由于目前发现的HERV-W ENV和这些细胞因子之间的协同作用。取决于上游，可能是环境和时间因素(11)，该HERV-W表达可在各种脑区域中被激活，其中具有GluN2B-NMDAR的神经元突触参与各种行为、认知和其它神经系统功能。这也意味着当HERV-WENV和细胞因子驱动的协同作用在脑区域和功能的胚胎发生和早期生命发育期间发生时，神经发育受损。这意外地揭示了目前精神病诊断的不同医院实体之间先前未知但共同的致病过程。
HERV-W ENV诱导的促炎细胞因子的一个主要方面是IL-1和/或相关促炎细胞因子IL-6和/或TNF-α的存在，如观察到在目前描述的实验中共表达，但也可在这些患者的体液中检测到(参见实施例5)。
实施例3：HERV-W ENV对NMDAR的特异性作用可在体外和体内被单克隆抗体抑制。
大多数拟精神病药物(例如PCP)是NMDAR拮抗剂。尽管其生化性质，即蛋白质大分子不能具有用于干扰神经元神经递质受体的小化合物的分子相互作用，但HERV-W ENV阻断海马网络中NMDAR介导的突触传递。
HERV-W ENV蛋白对神经元受体的作用从未被描述过，也不能预期，因为已知仅与TLR4(30)受体和T细胞受体的V-β链(31)相互作用，其在神经元细胞中不存在或不表达。此外，这些结果还提供了HERV-W ENV不通过目前已知的机制干扰神经元受体的证据，因为不同浓度的HERV-W ENV既不改变NMDAR介导的钙瞬变，也不改变NMDAR介导的诱发的EPSC(图1E-G)，表明它不像已知的拟精神病药那样充当NMDAR拮抗剂。因此，我们发现HERV-WENV特异性改变了突触中的NMDAR运输，这可以解释观察到的患者血清和重组或组织表达的HERV-W ENV蛋白的作用。为了进一步探索这种非常规效应的可能解释，使用单纳米颗粒(量子点)成像在活神经元表面实时跟踪前脑中的两种主要NMDAR亚型，即含有GluN2A和GluN2B的NMDAR(图1H)(32)。HERV-W ENV暴露迅速增加GluN2B-而非GluN2A-NMDAR、突触后区室中的膜动力学和均方位移(MSD)(Homer 1c-阳性区；图1I-J和图4)。因此，神经元培养基中HERV-W ENV蛋白的存在诱导NMDAR，特别是含GluN2B的NMDA受体从突触到突触后隔室的离域(即，在突触外的神经元膜区域中)，导致受体以原始模式从突触令人惊讶地扩散，因为也不同于由另一种TLR4结合分子(即LPS)诱导的那种。
发现针对HERV-W ENV的特异性抗体抑制这种致病作用(图1K)，这揭示了靶向这种蛋白对这种神经元受体的致病潜力的特异性作用。平行地，热灭活的HERV-W ENV(图4C)显示相对于对照没有显著的作用，从而证实了其在天然蛋白质构象下的致病性。因为这种HERV-W ENV-诱导的作用仍然在被河豚毒素(TTX)剥夺动作电位的神经元网络中观察到(图4D)，所以目前发现的作用共同表明HERV-ENV以亚基特异性和神经元活性非依赖性方式侧向扩散突触NMDAR，其不是目前关于干扰神经递质受体的神经病发生分子的知识的一部分(33-35)。
为了测试TLR4活化是否可以出乎意料地触发该作用，将熟知的TLR4激动剂(脂多糖(LPS))施用到海马网络上。一致地，LPS能够快速扩散突触GluN2B-NMDAR(图3A和B)。但是LPS，其通过TLR4活化总是具有与HERV-W ENV相似的作用(30，36，37)，在此揭示显示与由HERV-W ENV诱导的表型不同的表型(图3C-E)，表明当考虑对神经元的神经递质受体的这种原始作用时，这两种蛋白质不共享相同的信号传导途径。HERV-W ENV蛋白诱导含GluN2B的NMDA受体从突触到突触后隔室的离域(即，在突触外的神经元膜区域中)，导致受体以不同于LPS诱导的原始模式从突触令人惊讶地扩散。
由于精神分裂症患者可能长期暴露于HERV-W ENV(11)，我们研究了长期暴露于ENV如何改变海马网络特性和动物行为。ENV暴露24小时后，突触GluN2B-NMDAR仍然横向扩散，该作用被选择的抗ENV抗体完全阻断(图5A-C)。在功能上，这导致树突脊中NMDAR介导的Ca2+瞬变的频率持续增加(图6A和B)，其随着时间变得彼此更相关(图6C-D)。这些网络活性变化通过IL-1β的阻断来调节(图6B和D)，与先前描述的小胶质细胞中ENV介导的IL-1β诱导的观察一致。
因为HERV-W ENV的大量暴露可能不反映患者脑中蛋白质的生物利用度，所以HERV-W ENV仅在3％的海马细胞中遗传表达几天(图6E)。值得注意的是，这足以模拟突触GluN2B-NMDAR的总体扩散和网络效应(图6F)。最后，GluN2B-NMDAR介导的突触和网络活性的这些改变将预测谷氨酸能突触的基础和可塑性范围的长期变化(38，39)。一致地，暴露于HERV-W ENV的神经元中GluA1-AMPA受体(AMPAR)的突触含量强烈增加(图6G和6H)。此外，谷氨酸能突触不能经历化学诱导的长期增强(cLTP)。在化学攻击后，AMPAR突触含量实际上降低，如同突触经历去增强作用(图6I和6J)。因此，在海马细胞上延长的HERV-W ENV暴露对谷氨酸能突触的网络活性和NMDAR依赖性适应具有深远的后果。这种主要的和一致的作用从未用HERV-W ENV蛋白描述过，并且在这种特殊的机制下，不被预期以这种特异性和显著的水平靶向神经递质的特异性受体。
在精神病中，NMDAR信号传导和突触可塑性的改变与认知和感觉运动门控(即预脉冲抑制，PPI)测试中的行为缺陷相关(40)，其为啮齿动物中精神病模型的标志。出生后电穿孔后，在海马星形胶质细胞/放射状神经胶质(GS+)或非神经胶质(GS-)细胞中观察到HERV-ENV电穿孔细胞(图7A)。对照(仅GFP)和ENV大鼠之间的细胞存活和机体生长无法区分(图7B和8A)。此外，对照和HERV-W ENV+大鼠表现出相似的基础运动、习惯和环境识别，没有焦虑的行为迹象(图9H)。在成年大鼠中(出生后第70天)，电穿孔诱导的蛋白质仍然是可检测的(图9F)，并且HERV-W ENV表达降低海马突触中GluN2/PSD-95比率(图9G)。引人注目的是，表达ENV的大鼠在单次注射拟精神病药物MK-801(NMDAR通道阻断剂)后表现出夸大的快速移动(图9I)，并且当与对照同窝出生仔畜相比时，它们在PPI测试中的表现受损(图9J)。总之，这些行为结果揭示，海马体中的HERV-W ENV表达足以触发与精神病相关的行为缺陷。作为支持，抗精神病药(氯氮平)在表达HERV-WENV的大鼠中防止PPI试验改变(图9J，8C)。最后，由于HERV-WENV通过最初的横向扩散机制诱导NMDAR特异性功能障碍，我们在使用GluN1交联方案测试它们的PPI性能之前在表达HERV-WENV的大鼠的海马体中人工稳定表面NMDAR(图9K)(32，39，41)。一致地，膜NMDAR的这种稳定减少了PPI测试中HERV-WENV诱导的损伤(图9L)。
总之，该研究证明在大部分精神病患者(12，42)中检测到的HERV-W ENV能够在NMDAR组织中产生功能障碍并在谷氨酸能突触中产生长期可塑性。突触受体NMDAR远离突触的这种扩散产生与精神病相关的行为缺陷。这使得HERV-W ENV成为精神病患者中具有新作用机制的新治疗策略的感兴趣的治疗靶标。
它还证明了当通过其在HERV-W ENV的神经元突触上的生物分布受到影响时，抗ENV抗体可以在神经递质GluN2B的独特神经元受体的水平上特异性地且有效地逆转和/或预防这些致病作用。抗ENV抗体的使用在神经元中诱导NMDAR，特别是含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中。抗ENV抗体的这种治疗效果在体内转化为逆转或预防精神病相关的行为异常。
因此，HERV-W ENV和谷氨酸突触之间的这种相互作用在我们对内源性逆转录病毒如何在精神疾病中发挥工具作用的理解中增加了新的和意想不到的层。事实上，现在发现HERV-W活化可以通过收敛的，但与先前知识显示的不同(包括细胞因子的协同诱导)的途径改变谷氨酸能突触的发育和功能。
然后，进行进一步的分析，其证明新生的ENV表达调节谷氨酸能突触成熟并诱导与精神病相关的行为缺陷，该作用被中和抗HERV-W ENV抗体逆转。
当考虑到谷氨酸能突触的适当成熟需要从未成熟的富含GluN2B的突触转换为成熟的富含GluN2A的突触时，构思了以下体内研究(44)。该基本过程发生在出生后阶段(出生后前两周)，其中建立了神经元网络和认知功能。在该时间窗期间发生的突触改变通常导致与精神障碍(如精神病)相关的成年行为功能障碍(44，45，46)。考虑到通过ENV体外改变了GluN2A/2B突触比，我们在出生后第一周(P7)和成年阶段(>P65)测定了GluN2A-和GluN2B-NMDAR突触含量(图10A)。在这些阶段，通过免疫组化和生化方法观察到插入的基因清楚地存在于海马区域(图10B，C)。GluN2A-NMDAR突触含量随着发育而增加，而GluN2B-NMDAR含量降低(图10D，E)。然而，在ENV大鼠中，GluN2A-NMDAR突触含量在P7已经增加(P＝0.06)，这使得随后从P7到P65的发育上升变平(图10D)。与两个年龄的对照大鼠相比，在ENV大鼠中GluN2B-NMDAR突触含量保持稳定(图10E)。因此，在成年阶段GluN2A-和2B-NMDAR的相对量一致地降低(Cont:1.0±0.08,ENV:0.90±0.10,n＝8；平均值±SEM:*P＝0.034,Student’st检验)。由于在P7有明显的炎症体征(未显示)，我们测试了IL-1β和GluN2A-NMDA受体之间相互作用的变化(47)是否可以解释突触NMDAR的早期改变。GluN2A-NMDAR和IL1R之间的共IP在ENV-海马突触中在P7显著增加(图5F)，而GluN2B-NMDAR和IL1R之间的共IP不受影响。在成年阶段，所有组均无显著差异(GluN2A/IL-1R:Cont:1.0±0.15,ENV:1.04±0.21,GluN2B/IL-1R:Cont:1.0±0.08,ENV:0.95±0.09,n＝6-7；平均值±SEM,P>0.05)。因为ENV增强培养的海马网络中的AMPAR突触含量(图6G，H)，我们最终比较了成年阶段的AMPAR突触含量(在P7，绝大多数谷氨酸能突触缺乏AMPAR)。与对照大鼠相比，ENV大鼠的突触含量显著增加(图5G)。在ENV大鼠中PSD-95的总量不变(图5H)。因此，ENV的新生儿表达改变NMDAR亚型的发育成熟，突触GluN2A-NMDAR的过早增加由与IL1-β受体信号传导复合物的功能相互作用驱动。NMDAR信号传导中的这种加速的成熟加强了后期的谷氨酸突触，可能损害它们的可塑性窗口。
因为谷氨酸能突触的成熟发生在出生后第一周，我们假定ENV对NMDAR信号传导和突触成熟的有害作用在该期间是显著的。为了检验该假说，ENV大鼠接受从P4到P12的ENV中和抗体注射(3次注射；图5I)。在成年阶段，尽管在接受对照抗体的大鼠中仍观察到ENV诱导的PPI缺陷，但通过ENV中和抗体处理明显恢复了行为应答(图10J)。
这些数据表明，ENV在出生后早期的表达改变突触GluN2A/B-NMDAR的成熟，并驱动成年中行为异常的出现，这可以通过连续体内注射中和性抗HERV-W ENV抗体来预防和/或恢复。
实施例4：针对HERV-W ENV蛋白的单克隆抗体(ENV-W2.3)的特征，其逆转和/或预防精神病患者中神经元神经递质受体GluN2B-NMDAR和HERV-W ENV诱导的作用的异常突触分布。
4.1ENV-W2.3抗体轻链可变结构域的序列(VL)。
4.1.1核苷酸序列编码抗体轻链可变域(VL)
>SEQ ID NO:12-GN_ENV-W2.3-VL
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAAGGGCATCACTTATTTGTATTGGTTTCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCCACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
4.1.2抗体轻链可变域的氨基酸序列
>SEQ ID NO:7-GN_ENV-W2.3-VL
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSKGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK
VL氨基酸序列连同所鉴定的CDR序列显示在图11中。
4.2ENV-W2.3抗体重链可变域的序列(VH)
4.2.1核苷酸序列编码抗体重链可变域(VH)
>SEQ ID NO:13-GN_ENV-W2.3-VH
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGTACTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATTTATCCGGGAAAAAGTGATACTAGCTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCAAGTTGACTGCGGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGAACTCACCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACAAGAACCGTCTATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
4.2.2抗体重链可变域的氨基酸序列
>SEQ ID NO:8-GN_ENV-W2.3-VH
EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGKSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELTSLTNEDSAVYYCTRTVYA MDYWGQGTSVTVSS
VH氨基酸序列以及鉴定的CDR序列显示在图12中。
3.3ENV-W2.3抗体的互补性分析
VL区对应于在数据库(Uniprot数据库-UniprotKB)中没有发现相同序列的Kappa同种型的重排和生产性IGK序列。
VH区对应于在数据库(Uniprot数据库-UniprotKB)中没有发现相同序列的Ig2a同种型的重排和生产性IGH序列。
实施例5：来自HERV-W(MSRV)蛋白序列上两个远离的线性序列的表位的识别：蛋白质构象诱导的构象表位。
材料和方法
按照制造商的建议，通过Pepscan,The Netherlands，使用包被有重叠在初始HERV-W/MSRV-ENV序列上的合成肽的ELISA板进行实验。将测试抗体从250ng/ml稀释至1μg/ml。读出值表示用每个连续肽测量的平均发光OD。
结果
使用15个氨基酸的重叠肽的表位作图在HERV-W序列(MSRV-ENV；Genbankref.AAK18189.1；Locus AF331500_1；542aa)上清楚地鉴定了由ENV-W2.3抗体显著检测到的两个远离的序列延伸(图13)。
这清楚地表明这些序列必须由该抗体在天然蛋白中联合检测，其中3D折叠结构呈现这两个肽区域，LFNTTLTRLHE(SEQ ID NO:10)和LYNHVVP(SEQ ID NO:11)，作为连续检测的氨基酸，即作为构象表位(图13)。
该表位检测表征了该抗体及其CDR和其可变轻链和重链(VL和VH)的序列。
总之，对于在人类中的治疗应用，通常需要人源化抗体或任何免疫耐受分子来治疗患者。因此，这种人源化抗体或等效治疗性分子的独特识别特征由以下测定：(i)众所周知参与表位识别的CDR序列和/或(ii)连接HERV-W ENV致病蛋白的两个远离的线性区域的构象表位的原始结构(参见实施例3和4)和/或(iii)其在神经元中诱导NMDAR，特别是含GluN2B的NMDA受体重定位到突触中的能力。
因此，本发明提供了用于先前诊断为具有症状学和心理学定义的标准的患者的新适应症的治疗产品，所述标准代表此类诊断类别的亚组并且现在代表生物学定义的新实体，包括特征在于在先前诊断为“精神分裂症”或“双相障碍”的患者中与升高的IL-1β(>0.05pg/ml)和/或TNF-α(>1.25pg/ml)和/或IL-6(>0.5pg/ml)水平平行检测HERV-W ENV抗原的水平。值得注意的是，血清中细胞因子的这些阈值随用于其剂量的试剂盒、抗体、技术和平台而变化。所给出的值仅仅是指示性的，并且应该根据制造商的说明来修改它们或者用给定的平台来评估它们。在这种情况下，当不具有局限于深部脑组织的表达时，循环体液中的HERV-W ENV抗原检测可以是互补的且高度指示性的生物标志物。
实施例5：基于HERV-W ENV抗原和/或血清中其他生物分子的检测，鉴定新的疾病分类实体，包括诊断为精神分裂症或双相障碍的患者亚组。
5.1患者、材料和方法
包括诊断为精神分裂症或双相障碍的患者的试验性研究调查了血清中的当前诊断参数、常规实验室生物标志物和HERV-W抗原检测。常规实验室生物测试根据制造商关于诊断试剂盒(例如细胞因子)的使用说明进行，并且通常根据在法国进行分析的医学生物分析的当前建议和规定进行。关于血清中HERV-W ENV抗原的检测和其循环可溶形式的定量，所有分析均根据参考文献WO2019201908(A1)公开的题为“Method for the detection ofthe soluble hydrophilic oligomeric form ofHERV-W envelope protein”的专利中提供的条件进行。血清中HERV-W ENV可溶性抗原的结果表示为“实验间标准化结果”，对应于从免疫毛细管WES平台计算的特异性HERV-W ENV可溶性抗原峰的曲线下面积(AUC)，在每个实验中使用健康对照系列的平均值+2x标准偏差(特异性/阳性截止值的下限：CO)对实验间变化进行归一化，以将所有数据调整为用作参考的第一实验的数据。因此，将在每个不同实验中测量的每个样品的AUC乘以相应的CO与第一实验的CO的比率，其将所有值调整为非特异性背景信号的相同平均值，还考虑了个体间差异的影响，其标准偏差为用于确定特异性信号(CO)的最小值的标准偏差的两倍。尽管变化不重要，但这进一步优化了与来自所有受试者的数据的相关性分析，从而避免了实验间的轻微变化影响统计结果。因此，所有测量值用15的CO标准化，高于或等于15，所有结果表明HERV-W ENV抗原的特异性检测和定量。在该CO以下，值对应于由样品的组分和由在阴性样品中具有不显著变化的技术方案(“技术噪声”)产生的非特异性背景信号。
为了鉴定可能的亚组，我们使用无偏两步聚类分析(48)，其中我们同时整合了HERV-W阳性(阳性截止值：IESR>15；作为分类变量估算)和来自精神分裂症(SZ，n＝29)、双相障碍(BP，n＝43)和匹配的健康对照(HC，n＝32)的血清细胞因子(IL-1b、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-a、IFN-y；所有LN转化；作为分类变量估算)。一些受试者的变量缺失导致样本量减少。聚类分析中纳入的受试者最终数量为：n(HC)＝29、n(SZ)＝18和n(BP)＝30。在不预先确定簇的数目的情况下运行簇分析，从而避免在鉴别可能的簇的数目方面的偏差。使用贝叶斯准则(BIC)估计最大聚类数，而对数似然法用作距离量度[1]。在将HC、SZ和BP受试者分层为亚组后，通过单因素或双因素方差分析(ANOVA)分析血清细胞因子和临床变量(疾病发病年龄、Montgomery-Asberg抑郁评定量表[MADRS]评分、青年躁狂评定量表[YMRS]评分、阳性和阴性综合征量表[PANSS]评分和每日氯丙嗪[CPZ]当量)，然后在适当时通过Tukey事后检验进行多重比较。使用SPSS Statistics(version 25.0,IBM,Armonk,NY,USA)和Prism(version 8.0；GraphPad Software,La Jolla,California)进行所有统计分析，统计显著性设定为p<0.05。
5.2结果
诊断为精神分裂症(SZ)、双相障碍(BP)的患者和没有已知精神病、炎性、感染性或代谢疾病(HC)的健康对照已给予知情同意以参与由相关伦理委员会验证的多参数研究，包括临床和治疗数据以及血清生物标志物的检测和/或剂量，包括其血清中的HERV-WENV抗原和细胞因子。
从患者和对照收集的数据示于图14。
在图14a中，针对HC、SZ和BP组呈现血清中HERV-W ENV抗原阳性的患病率。在健康对照和患有SZ(p<0.001)或患有BP(p<0.01)的精神病患者之间证明了统计学显著和重要的差异，其中鉴定了HERV-W ENV阳性患者的亚组。
进一步分析这些结果与其它参数的潜在相关性或共分层(聚类分析)。在血清中某些细胞因子的浓度升高的情况下，基本上发现显著的聚集。在图14b中，呈现了组合这些参数的聚类分析中相应血清值的预测重要性，表明HERV-W ENV抗原的主要预测性，随后是促炎细胞因子(如IL-6、IL-1β)和在较低程度上TNF-α的预测性。聚类分析显示在所有测试群体中存在两个簇，其基于HERV-W阳性和血清中细胞因子检测分离。簇1(CL1)代表具有阴性HERV-W ENV抗原血症且血清中无细胞因子检测(或HC中相应技术的背景检测正常范围内的低值)的个体。簇2(CL2)代表具有阳性HERV-W ENV抗原血症和血清中显著细胞因子检测的个体。在图14c中，给出了针对HC、SZ和BP组的每个簇的比例。看起来几乎所有的HC都属于CL1，而在CL2中只有一个轶事病例。在诊断为SZ的患者中，50％属于CL2，另一半属于CL1。CL2占所有BP患者的约三分之一(33.3％)，而CL1占约三分之二。因此，尽管与明显健康的对照相比，在精神病患者中具有强烈显著不同的患病率，但CL2在SZ中比在BP中更多。这些结果已经表明存在与升高的血清细胞因子相关的HERV-W ENV阳性的跨SZ和BP患者的重要亚组(CL2)，而CL1中的其他患者聚类对于这些生物参数与健康对照没有差异。
不同细胞因子的进一步详细分析示于图14d。总体上，他们显示来自CL2的仅IL-1β、IL-6和TNF-α血清水平与来自HC的显著不同。有趣的是，没有显著检测到干扰素γ(IFN-γ)。该细胞因子由T-淋巴细胞分泌并且是适应性免疫应答的指示物。因此，在不存在IFN-γ的情况下，先前显示在CL2中升高的三种细胞因子与由先天免疫的活化引起的促炎性概况一致。最有趣的是，IL-1β在BP组中的CL2中占优势，但在SZ组中不占优势，而IL-6在SZ组中的CL2中占优势，但在BP组中不占优势。TNF-α在BP组的CL2和HC之间有显著差异，但这对于CL1也是正确的，并且在SZ组的任一簇中没有显著差异。因此，除了血清中HERV-W ENV和促炎细胞因子检测的关联之外，CL2可在SZ和BP之间呈现不同的细胞因子优势。HERV-W ENV和IL-6之间的关联表现为SZ中CL2的可能的生物标志物特征，而HERV-W ENV、IL-1β和潜在地与TNF-α之间的关联表现为BP中CL2的可能的生物标志物特征。
还鉴定了与临床或治疗参数的相关性和/或聚类，并在图15中给出。在图15a中，仅在BP组中证明了与CL1相比，CL2的疾病发作年龄显著更小(p<0.01)。在图15b中，仅在SZ组中的CL2和CL1之间看到了年轻躁狂评定量表(YMRS)的显著差异。
在图15C中，阳性和阴性综合征量表[PANSS]评分仅表明BP和SZ组之间阴性症状的临床预期差异，与CL1和CL2亚组无关。
使用用于当前精神病诊断的临床评级得分获得的这些数据说明基于临床参数的患者分类为“SZ或BP”与基于引起致病作用的客观生物参数的分类为“具有精神病症状的CL1或CL2”(排除CL1中的HC)之间的差异。
最后并且最重要的是，在图15d中，发现了SZ组中CL2与CL1的每日氯丙嗪(CPZ)等效摄入量之间的显著差异。该CPZ等效量度是对患者的当前精神抑制治疗方案的日剂量的标准评估，并且在此显示CL2中的SZ患者需要和/或被给予比CL1中的SZ患者高得多的剂量。由于其它分析排除了各种抗精神病分子在检测HERV-WENV和促炎细胞因子表达中的可能关系，本观察结果与具有CL2标准的SZ患者具有更严重和/或频繁的精神病症状的事实一致，所述精神病症状导致医师开出更高剂量以稳定患者。非常有趣的是，该观察结果也与来自CL2组的患者对抗精神病药物的耐药性相容，这也不排除先前引起的更严重和/或频繁的精神病症状的发生。
因此，虽然在BP中的每日治疗剂量评估的等效标度是不可获得的，但在具有CL2生物标志物的SZ患者中更严重的疾病病程和/或对当前精神抑制药的耐药性要求使用其它治疗策略，隐含表明中和CL2生物标志物的致病作用并且优先中和CL2的那些主要预测因子(图14B)，即HERV-W ENV蛋白的致病作用。
因此，对来自包括健康个体和诊断为精神分裂症或双相障碍的患者的群体的临床、治疗和血清生物标志物数据的多参数分析独立地产生了与从先前HERV-W ENV致病作用的临床前研究获得的证据相同的证据，要求中和这种人内源性逆转录病毒蛋白的靶向治疗。因此，来自本发明的抗体的体外和体内效率提供了用于治疗患有精神分裂症或双相障碍的患者的独特治疗工具和具有类似生物学参数的聚类：HERV-W ENV抗原阳性和升高的促炎细胞因子，其可以在血液样品中，例如在血清中检测到(在此称为CL2)。
在没有靶向致病蛋白及其升高的细胞因子相关性的情况下，用这种抗体治疗来自CL1的患者是不相关的。这意味着该抗体在患者中的临床功效应该仅在与目前定义的CL2标准相匹配的患者中评估，而不在诊断为精神分裂症和/或双相障碍的任何患者的组中评估。它可以对应于新的疾病学定义，或者至少对应于两种类型的临床诊断(SZ和BP)中新定义的患者亚组，但是具有这种诊断的患者之间最可能的病因学和病原学异质性与在应用对所有病例中不涉及的病原蛋白特异的治疗之前定义相关靶群体的需要一致。对于常规实践和实践条件，CL2分析的结果还显示血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α剂量可用作常规CL2分类的替代物。
总之，本发明提供了以下预料不到且有意义的证据：(i)HERV-W ENV蛋白对与精神疾病相关的神经元的先前未知的作用模式，(ii)具有靶向HERV-W ENV蛋白的构象表位的新CDR序列的新单克隆抗体，其在由HERV-W ENV诱导的精神病行为/症状学的动物模型中抑制其对神经元的新发现的致病作用，和(iii)该新抗体用于治疗目前诊断为精神分裂症或双相障碍的患者的相关亚组的合适治疗用途的新适应症，具有定义新的疾病分类学亚组或实体的新的基于生物标志物的标准。因此，这些生物标志物(组合的或单独的)可用于面对相关的临床症状，以证实在给定患者中用该抗体治疗的准确性。
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Claims (16)

1.抗HERV-W包膜蛋白(ENV)的抗体，其用于治疗诊断为精神病并且特征在于体液样品，特别是血液样品，更特别是血清中的高细胞因子水平的患者组，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，如IL-6、IL-1β和/或TNF-α。
2.根据权利要求1所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述细胞因子是促炎细胞因子IL-6或促炎细胞因子IL-1β。
3.根据权利要求1或2所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述精神病选自下组：精神分裂症、双相障碍、分裂情感性精神病和精神分裂症样障碍。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述精神病是精神分裂症或双相障碍。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述精神病是精神分裂症且所述细胞因子是促炎细胞因子IL-6。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述精神病是双相障碍且所述细胞因子是促炎细胞因子IL-1β。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中已经在所述组的患者中检测到HERV-W ENV。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体特异性结合如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的两个远离的线性序列定义的构象表位。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR中的每一个。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体是嵌合单克隆抗体。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体是IgG。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体是人源化IgG4单克隆抗体或IgG1单克隆抗体。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的用于用途的抗HERV-W的抗体，其中所述抗体包含：
－轻链，其中可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO:1所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:2所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:3所示的CDR-L3的3个CDR的每一个；和
－重链，其中可变区(VH)包含如SEQ ID NO:4所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:5所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:6所示的CDR-H3的3个CDR的每一个。
15.鉴定诊断为精神病的患者是否属于患有精神病并且特征在于体液样品中高细胞因子水平的患者亚组的诊断方法，包括：
1)定量细胞因子的水平，特别是在血液样品中，更特别是在血清中，所述细胞因子特别是促炎细胞因子，如IL-6、IL-1β和/或TNF-α；和
2)任选地，检测HERV-W ENV的表达。
16.用于治疗诊断为精神病并且特征在于以下的患者组的方法：
－体液样品中高细胞因子水平，和/或
－在体液样品中检测到的HERV-W ENV的表达，
所述方法包括向所述患者施用有效量的抗HERV-W ENV抗体，特别是包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的6个CDR中的每一个的抗HERV-W ENV抗体。
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