KR20230018463A - 정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-herv-w 엔벨로프 단백질 항체 - Google Patents

정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-herv-w 엔벨로프 단백질 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20230018463A
KR20230018463A KR1020227046045A KR20227046045A KR20230018463A KR 20230018463 A KR20230018463 A KR 20230018463A KR 1020227046045 A KR1020227046045 A KR 1020227046045A KR 20227046045 A KR20227046045 A KR 20227046045A KR 20230018463 A KR20230018463 A KR 20230018463A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
env
herv
antibody
seq
patients
Prior art date
Application number
KR1020227046045A
Other languages
English (en)
Inventor
마리옹 르부아예
에르베 페론
Original Assignee
제네유로 에스에이
퐁다멘딸
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제네유로 에스에이, 퐁다멘딸 filed Critical 제네유로 에스에이
Publication of KR20230018463A publication Critical patent/KR20230018463A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/545—IL-1
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/302—Schizophrenia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/304—Mood disorders, e.g. bipolar, depression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

본 발명은 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 HERV-W 엔벨로프 단백질(ENV)에 대한 항체에 관한 것이다.

Description

정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W 엔벨로프 단백질 항체
본 발명은 이전에 정신 질환(psychotic disease), 특히 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단받은 신규로 식별된 환자 그룹에 관한 것으로, 환자의 체액 샘플에서의 높은 수준의 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인이 HERV-W 엔벨로프 단백질(ENV)에 대한 표적 치료를 받을 수 있도록 하는 환자 그룹에 관한 것이다.
정신병적 장애(psychotic disorder)는 지각, 기분 및 사회적 상호작용의 손상을 포함하는 유전적 및 환경적으로 매개된 정신 질환이다(1). 지금까지 정신병적 장애의 진단은 임상적으로 정의되었으며 화학적 화합물에 의해서만 치료되었다(26, 27, 28).
이러한 장애를 뒷받침하는 병원성 메커니즘은 여전히 불분명하지만, 최근 면역-관련 유전자 및 이동성 유전 인자(mobile genetic elements)가 병인 체인(etiopathogenetic chain)의 주요 행위자를 구성한다는 사실이 밝혀졌다(1-3). 인간 내인성 레트로바이러스(HERV)를 포함한 이동성 유전 인자는 수백만년 전에 발생한 감염의 잔재이며 인간 게놈의 약 8%를 구현한다(4). 초기에 "정크" DNA로 분류된 것 외에도, 인간 뇌의 진화 및 발달 동안 유전자 조절 네트워크를 제어하는 내인성 레트로바이러스 능력(5-8), 주요 신경 및 정신 질환과의 연관성 증가(9, 10)는 면역학적, 유전적, 및 뇌 시스템 간의 상호 작용을 해독하기 위한 새로운 개념적 프레임워크를 제공한다. HERV는 일반적으로 세포 기관들(cell machinery)에 의해 침묵되지만, 면역 문제 및 병리학적 조건 하에서 활성화될 수 있다(11). 예를 들어, 정신분열증 및 양극성 장애로 진단된 환자는 다양한 전사 수준 및 단백질 검출과 함께 HERV 유전자 발현에 변화가 관찰되었다(1, 12, 13).
다발성 경화증 치료를 명확하게 타겟으로 하는 출원 WO2010/0033977A1 및 US2019/263895A1은 정신 분열증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환이 HERV-W의 엔벨로프 단백질(또는 항-HERV-W ENV)에 대한 항체로 치료될 수 있음을 매우 일반적인 방식으로 개시하고 있는데, 이는 HERV-W ENV의 발현이 다발성 경화증뿐만 아니라 정신 질환에서 관찰되었기 때문이다.
그러나 엔벨로프 단백질과 같은 HERV 유전자에 의해 발현되는 단백질이 정신 질환에서, 그리고 가장 중요하게는 어떤 환자들에게 어떤 중요한 역할을 하는지 여부는 여전히 도메인에서 지식이 누락된 채 답이 없는 질문으로 남아있다.
이는 정신 질환의 병리학적 정의가 잠재적으로 명확하게 확인된 병인 없이 이질적인 집단을 초래하고 병인의 해당 메커니즘에 대한 이해가 제한된 경우 관련 환자에서 표적 치료에 대한 일관된 적응증을 배제한다(14-16). 현재까지 이러한 지식의 부재는 환자의 증상을 조절할 수 있는 일반적인 다운스트림 결과만을 표적으로 삼을 수 있다.
예를 들어, NMDAR(N-Methyl-D-aspartate receptors) 신호전달의 변화는 설치류의 정신증(psychosis) 모델의 특징인 인지 및 감각 운동 게이팅 테스트(33)의 행동 결함과 관련이 있다. 따라서 대부분의 정신 모방 약물은 PCP라고도 하는 펜시클리딘(1-페닐사이클로헥실피페리딘)과 같은 NMDAR의 길항제이다.
정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자에서 HERV-W ENV 검출의 잠재적인 임상적 및/또는 생물학적 상관관계를 탐구하면서, 본 발명자들은 현재 존재하는 진단에 걸쳐 환자의 다양한 클러스터를 입증했다. 그들은 특히 혈청에서 사이토카인 수준이 상당히 높은 환자 하위 그룹과 검출 가능한 HERV-W ENV 항원이 있는 하위 그룹 및 검출 가능한 HERV-W ENV 항원이나 유의한 사이토카인 수준이 없는 하위 그룹을 식별했다. 이러한 하위 그룹은 바이오마커-정의 하위 그룹을 나타내는 것으로 보이며, 그 중 하나만 HERV-W ENV 병원성과 일치하여 다른 임상 결과를 초래한다. 실제로, 다양한 임상 결과는 다른 병원성 물질과 함께 발생할 수 있다 (예: HIV-1 레트로바이러스에 의해 유발되는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS) 다면적 질환) (17).
따라서, 처음으로, 본 발명자들은 정신분열증이나 양극성 장애와 같은 정신 질환으로 진단된 환자들 중에서, 뜻밖에도 실제로 HERV-W ENV를 발현하는 환자들은 그러한 진단을 받은 모든 환자를 포함하는 것이 아니라 특정 하위 그룹만을 포함한다는 것을 발견했다. 그들은 또한 이 하위 그룹의 환자들이 동일한 진단을 받은 다른 환자들에 비해 혈청 내 사이토카인 수준이 유의하게 증가했음을 발견했다.
이러한 예상치 못한 발견은 선행기술에 대한 진보이다. 실제로, 이제 정신 분열증이나 조울증과 같은 정신 질환 진단을 받은 모든 환자들이 항-HERV-W ENV 항체로 치료될 수 있는 것은 아닌 것으로 보인다. 본 발명자들은 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자들 중 30~50%만이 HERV-W ENV를 발현한다는 것을 강조하였다(도 14C 참조). 이러한 놀라운 결과로부터, 본 발명자들은 바이오마커, 즉 체액 샘플에서 HERV-W ENV의 발현 및/또는 높은 수준의 사이토카인을 진단에 조합함으로써 정신 질환을 앓고 있는 환자들 중에서 새로운 환자 집단을 정의했다.
이들의 발견은 정신분열증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환으로 진단된 모든 환자 중에서, 항-HERV-W ENV 항체 치료에 적합한 환자를 선택할 수 있게 한다. 이 새로운 적응증에 대한 지식은 이 환자 하위 그룹에 대한 진단-기반 치료의 연구를 가능하게 했다. 이것은 정신증 치료제의 돌파구를 나타내는데, 정신분열증 진단을 받은 환자의 약 50%, 양극성 장애 환자의 약 70%가 이들 질환의 병인에 HERV-W ENV를 포함하지 않기 때문에, 선행기술은 HERV 단백질을 표적으로 하는 제품의 효능을 보여주는 규제 임상 실험을 수행하는 것을 불가능하게 했다. 기존 진단에 근거하여 포함된 보이지 않고 알려지지 않은 대다수의 관련이 없는 환자 때문에, 치료 효능에 대한 통계적 분석은 중요하지 않게 된다. 따라서, 어떠한 특정 치료 제품을 적절하게 선택하고 개발할 수 없었으며, 임상에서 검증된 것은 더욱 적었다.
뜻밖에도, 본 발명자들은 HERV-W ENV를 표적으로 하는 항체의 생체내 사용이 이 하위 그룹의 개인에서 신경생물학적 기능 장애 및 정신병적 증상을 효율적으로 치료할 수 있음을 발견했다. 그들은 HERV-W ENV를 발현하고 체액 샘플, 특히 혈청에서 높은 수준의 사이토카인을 갖는 이 정신병 환자의 하위 그룹를 치료하기 위한 항-HERV-W ENV 항체의 효능을 보였다.
또한, 본 발명자들은 이미 알려진 항HERV-W ENV 항체에 비해 장점을 갖는 항HERV-W ENV 항체를 개발하였다. 개발된 항체는 구조적 에피토프 (conformational epitope)를 인식하고 뉴런에서 NMDAR의 재배치, 특히 GluN2B 서브유닛을 포함하는 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도할 수 있다.
이 신규한 항-HERV-W ENV 항체의 특성과 결합된 진단-기반 치료법은 환자의 하위 그룹에 효과적인 치료가 된다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 HERV-W ENV가 미세아교세포를 통해 매개되는 것으로 보이는 해마 네트워크에서 NMDAR-매개 시냅스 전달을 변경시킨다는 점과 IL-1β 또는 IL-6과 같은 전-염증성 사이토카인의 방출을 강조했다. 이것은 HERV-W ENV에 의해 유발되는 특정 병원성 경로에서 선천성 면역 및 전-염증성 사이토카인을 포함한다. 글루탐산성 GluN2B 함유 NMDA 수용체는 일반적으로 시냅스에 존재하지만, HERV-W ENV에 대한 노출은 시냅스로부터 떨어진 곳에서 GluN2B가 놀라운 분산을 일으키는 것으로 나타났다. 이러한 생화학적 특성, 즉 단백질 거대분자 때문에, HERV-W ENV는 신경 전달 물질의 수용체를 방해하는 데 사용되는 작은 화학 화합물에 의해 매개되는 것과 유사한 효과를 유도하는 분자 상호 작용을 나타낼 것으로 예상되지 않았지만, 놀랍게도, 본 발명자들은 정신병 표현형에 직접 관여함을 증명했다. GluN2B-함유 NMDA 수용체의 비편재화는 그것들이 시냅스에서 기능을 못하게 한다. 동물에서 HERV-W ENV 단백질의 효과는 정신분열증이나 양극성 장애와 같은 정신 질환의 특징을 재현했으며, 전-염증성 사이토카인의 분비를 동반했다.
본 발명자들은 생물학적으로 정의된 정신병 환자의 관련 그룹에서 검출된 HERV-W ENV가 사이토카인 생산의 유도와 함께 NMDAR 조직의 기능 장애를 일으킬 수 있으며, 이는 글루탐산 작용성 시냅스 내의 장기간 가소성에 영향을 미치고 정신증과 관련된 행동 장애를 일으킨다.
놀랍게도, 항-HERV-W ENV 항체의 사용은 시냅스로부터의 이동을 방지하고/하거나 GluN2B-함유 NMDA 글루탐산 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하여, NMDA 수용체 시냅스 신경전달의 병원성 기능 장애에 유익한 효과를 제공한다. 따라서 본 발명자들은 HERV-W ENV에 의해 신경 시냅스에서 생물학적 분포를 통해 영향을 받을 때, 항-HERV-W ENV 항체(여기서는 항-ENV 또는 항-ENV 항체라고도 함)의 사용이 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 수준에서 병원성 효과를 특이적이고 효율적으로 역전시킬 수 있음을 입증했다.
종래 기술에서, 어떠한 식별된 병리학적 하위군도 관련 환자 그룹, 즉 HER-W ENV 및 전-염증성 사이토카인의 관여가 없는 다른 하위 그룹의 환자가 아닌 HERV-W ENV가 병인을 유발하는 정신분열증 또는 양극성 환자가 없는 다른 하위군(들)의 환자가 아닌 정신분열증 또는 양극성 환자를 치료하기 위한 규정된 적응증을 제공할 수 없었다. 따라서, 새로 정의된 적응증과 함께 항-HERV-W ENV 항체를 사용한 정신 질환 치료의 효율성은 전혀 예상치 못했는데, 이는 이 단백질이 정신 질환 진단을 받은 환자의 생물학적으로 정의된 하위 그룹에서 표적이 될 필요가 있고 이러한 항체의 사용이 HERV-W ENV 유도 사이토카인에 의해 매개되는 것으로 나타난 바와 같이 NMDAR의 비편재화를 타겟으로 할 수 있다는 징후가 없었기 때문이다.
따라서, 본 발명은 정신 질환 진단을 받고 체액 샘플, 특히 혈청에서 높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 환자의 하위 그룹의 치료에 사용하기 위한, 체액에서 HERV-W ENV 및 사이토카인 검출을 포함하는 진단 바이오마커와 조합된, 항-HERV-W ENV 항체 또는 이의 약학적 조성물에 관한 것이며, 상기 사이토카인은 특히 전-염증성 사이토카인, 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다.
특정 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 정신 질환으로 진단된 환자가 본원에 정의된 바와 같은 정신 질환을 앓고 있는 환자의 하위 그룹에 속하는지를 식별하기 위한 진단 방법에 관한 것이다:
1) 사이토카인 수준의 정량화; 및/또는
2) HERV-W ENV의 발현 검출.
또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 환자 생물학적 샘플에서 상기 사이토카인의 정량화 및/또는 HERV-W ENV의 검출을 포함하는, 정신 질환을 앓고 있고 높은 수준의 사이토카인을 가진 환자 그룹의 치료 효능에 대한 후속 방법에 관한 것이다.
또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이고, 특히 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타난 2개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합하는 항체에 관한 것이며, 더욱 구체적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 각각의 상보성 결정 영역(complementary-determining region, CDR)를 포함하는 항체에 관한 것이다.
또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 이러한 항-HERV-W ENV 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
모든 범례 및 도면에서, "Cont"는 대조군(control)을 의미한다.
도 1: 검출 가능한 HERV-W ENV(ENV) 단백질(양성 항원혈증)을 가진 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자들의 혈청은 재조합 ENV에 의해 입증된 동일한 특성을 갖는 신경전달물질 장애(NMDAR 특이적 감소 및 시냅스 분산)를 유도하며, 이는 항-HERV-W ENV 항체에 의해 역전되거나 예방될 수 있다.
(A 및 B) 정신 질환 환자(neg, n=5)의 엔벨로프-양성(pos, n=6) 혈청 샘플에서 인터류킨-1β 수준의 증가. *P = 0.043, 스튜던트 t-테스트.
(C) 혈청-샘플 인큐베이션 15분 후 배양된 네트워크와 형질주입된 뉴런의 대표 이미지. 스케일바, 상단/하단=30/10μm.
(D) ENV-pos. 혈청 샘플은 특히 GluN1 클러스터 영역(삽입)을 감소시킨다. GluA1-SEP(n=57/43 뉴런 neg./pos.), GluN1-SEP(n=56/61), 도파민1-CFP(n=54/61) 및 GABAγ2-SEP(n=59/68). 스케일바=1μm및 삽입(inset) 0.3μm. *P = 0.048, 스튜던트 t-테스트.
(E 및 F) 수상돌기 가시(spine)에 기록된 NMDAR-매개 Ca2+ 추적, 점은 재조합 엔벨로프 단백질(ENV) 또는 비히클(Cont.)에의 노출 5분 후 검출된 과도상태(transient)를 나타낸다. D-AP5(50μM)는 모든 과도상태를 차단한다. 스케일바=1μm.
(F) Blank(n=47/5 수상돌기 가시/뉴런), Cont. (n=92/7), ENV: 0.5μg/ml (n=87/6), 1.0μg/ml (n=114/9) 및 10μg/ml (n=18/1)의 Ca2+-과도상태 비율.
(G) 대표적인 NMDA 추적 및 Cont. (n=4 뉴런) 또는 ENV (1μg/ml, n=6) 적용 전(pre) 및 5분 후 평균 피크 진폭.
(H) Cont. 또는 ENV (1μg/ml) 노출 5분 후 시냅스 후 밀도(PSD)에서 GluN2A- 및 GluN2B-NMDAR-QD 복합체의 대표 궤적. 스케일바=1μm.
(I) ENV는 주로 시냅스 영역에서 GluN2B-함유 NMDAR-수용체 표면 확산의 특정 증가를 유도한다. 데이터는 개별 뉴런에 대한 사전-노출로 정규화된다. GluN2A: Extra Syn(시냅스 밖).: Cont. n=(300/4 궤적/뉴런) ENV (n=445/5), Synaptic(시냅스): Cont. (n=176/4), ENV (n=200/5). GluN2B: Extra Syn.: Cont. (n=819/10), ENV (n=727/10), Synaptic: Cont. (n=670/10), ENV (n=792/10). *P = 0.0319 및 ***P < 0.0001, Mann-Whitney 테스트.
(J) (I)에서 시냅스 데이터에 대한 평균 제곱 변위(MSD).
(K) 항-HERV-W ENV 단일클론 항체의 공동-적용은 ENV 효과를 없앤다. Cont. (n=407/7), ENV (n=484/6). 막대와 점은 평균 ± SEM이다.
도 2: 신경아교 세포(Glial cell)는 ENV-유도 글루탐산 작용 교란에 관여한다.
(a) 신경아교 세포가 없는 뉴런 배양물 (노란색) 뉴런 (MAP-2 양성) 및 (마젠타) 신경아교 세포 (GFAP 및 Iba1 양성)의 대표적인 이미지. 스케일바=50 μm.
(b) 비히클(Cont., n = 295/7 궤적/뉴런) 또는 ENV(1μg/ml, n = 377/6) 노출 5분 후 신경아교 세포가 없는 배양물에서 GluN2B 시냅스 확산. (오른쪽) 평균 제곱 변위(MSD).
(c) TLR-4 중화-Ab 존재 하에서 Cont. 또는 ENV 노출 후 GluN2B 시냅스 확산. Cont. (n = 163/5), ENV (1μg/ml, n = 276/6), (오른쪽) MSDs. 스케일바=1μm
(d) ENV(10μg/ml) 노출 5분 후 배양 배지에서 사이토카인 방출 검출, (n = 5배양) *P = 0.037, 0.026, 0.026, **P = 0.009, 0.009, 대응 스튜던트 t-테스트.
(e,f) ENV (1μg/ml) + αTNF-α, αIL-6 (1μg/ml) 차단 Ab 또는 IL-1 수용체 길항제 (IL-1ra, 250ng/ml) 존재 하에서의 GluN2B 시냅스 확산. Cont. (비히클, n = 579/6), ENV (n = 352/6), ENV + αTNF-α (n = 461/5), ENV + αIL-6 (n = 404/4), ENV + IL-1ra (n = 365/7). ***P <0,0001 및 0.006, Kruskal-Wallis 테스트 이후 Dunn 다중 비교
(f) Cont. + IL-1ra (n = 176/7)를 포함한 E의 데이터에 대한 MSD.
(g) 신경아교 세포가 없는 해마 배양물에서 IL-1β 노출 5분 후 증가된 GluN2B 표면 확산. Cont. (n = 423/7), IL-1β (1ng/ml, n = 480/7). ***P <0,0001, Mann-Whitney 테스트. 데이터 (평균 ± SEM)는 개별 뉴런에 대한 사전 노출로 정규화된다.
도 3: ENV와 비교하여 LPS 자극 및 다양한 미세아교 세포 활성화에 대한 GluN2B 반응
(A) LPS(1μg/ml) 자극 후 5분 후 혼합된 신경아교 세포가 있는(not glia free) 배양물에서 시냅스 GluN2B-NMDAR 확산 계수의 증가. 혼합 배양물: 식염수 (Cont.) n = 340/6 (궤적/뉴런), LPS (0.01μg/ml) n = 281/5, LPS (0.1μg/ml) n = 329/5, LPS (1μg/ml) n = 446/6. 신경아교 세포가 없는 배양물: Cont. n = 547/4, LPS (1μg/ml) n = 312/4. 데이터는 각 개별 뉴런 ± SEM에 대해 Cont. 또는 LPS 추가 전에 기준-조건으로 정규화된다. ***P = 0,0004, Kruskal-Wallis 테스트 이후 Dunn 다중 비교.
(B) LPS 자극 24시간 후 GluN2B-NMDAR 시냅스 확산. Cont. n = 990/27, ENV n = 606/32. 데이터는 중앙값 ± 25-75% 사분위수 범위 (inter-quartile range, IQR)를 나타낸다, ***P <0,0001, Mann-Whitney 테스트.
(C) LPS (1μg/ml) 또는 ENV (1μg/ml) 노출 24시간 후 Iba1 양성 미세아교 세포의 대표적 이미지. 스케일바 = 10μm.
(D) 혼합 배양에서 미세아교 세포 면적 (μm²) 정량화. Blank (Cont.) n = 1420 (세포), ENV n = 1279 및 LPS n = 1763. ***P <0,0001, Kruskal-Wallis 테스트 이후 Dunn 다중 비교.
(E) (위) 변환 지수(TI)와 관련된 미세아교세포 형태의 그래픽 그림. (아래) 아메바이드 세포로 정의된 TI 값 <3인 세 가지 조건에서 TI의 누적 분율. Cont.(70%) 및 ENV(71%)와 비교하여 LPS 자극 후 아메바이드 세포의 비율 변화(56%)에 주목.
도 4: ENV에 대한 시냅스 GluN2B 반응
(A) 다른 용량으로 ENV 적용 후 5분 후 시냅스 GluN2B-NMDAR 확산 계수. 표시된 데이터는 각 개별 뉴런에 대해 비히클(Cont.) 또는 엔벨로프-단백질(ENV)의 추가 전에 기준선으로 정규화되며, 평균 ± SEM이다. Cont. n = 164/19 (궤적/뉴런), ENV 0.5μg/ml, n = 90/7, ENV (1μg/ml), n = 805/13, ENV (10μg/ml), n = 140/7. ***P <0.0001, Kruskal-Wallis 테스트 이후 Dunn 다중 비교.
(B) 개별 뉴런(원)의 시냅스 GluN2B-NMDAR 궤적에 대한 중앙값 확산 계수. 기준선(pre) 및 비히클(Cont. n = 16/12 뉴런/배양물) 또는 ENV(1μg/ml, n=17/13) 추가 5분 후에 대한 대응 데어터가 표시된다. *P=0.038, 양측 대응 t-테스트.
(C) 열 불활성화는 ENV 효과를 없앤다. 열 불활성화 비히클(Cont., n = 563/7) 또는 ENV(n = 443/6). (오른쪽) 시냅스 데이터의 평균 제곱 변위(MSD).
(D) 테트라도톡신(TTX, 1μM)과 ENV의 동시 적용해도 ENV 효과(Cont., n = 181/3) 또는 ENV(n = 182/4)는 없어지지 않는다. 표시된 데이터는 각 개별 뉴런에 대한 사전-조건으로 정규화된 확산 계수이다, 평균 ± SEM.
도 5: 장기간 ENV 노출에 대한 GluN2B 반응 및 항-HERV-W ENV 항체에 의해 중화되는 ENV-특이적 효과.
(A) 24시간 ENV 노출에 대응하여 GluN2B-함유 NMDAR-수용체 표면 이동성의 특이적 증가. GluN2A: Cont. n = 382/15 (궤적/뉴런), ENV(0.5μg/ml) n = 147/6, ENV(1.0μg/ml) n = 277/13. GluN2B: Cont. n = 612/22, ENV(0.5μg/ml) n = 485/19, ENV(1.0μg/ml) n = 600/18, 항-HERV-W ENV Ab (N.Ab) n=204/14. ***P = 0,0004, Kruskal-Wallis 테스트 이후 Dunn 다중 비교.
(B) (A)의 데이터의 평균 제곱 변위 (MSD).
(C) 24시간 ENV 노출 후 GluN2A- 및 GluN2B-NMDAR의 시냅스 외 표면 확산. GluN2A: Cont. n = 2214/28 (궤적/뉴런 필드) ENV n = 1670/31, GluN2B: Cont. n = 3882/65, ENV n= 3872/51. **P = 0,0029, Mann-Whitney 테스트. 값은 시냅스 중앙값 확산 계수 ± 25-75% 사분위수 범위 (inter-quartile range, IQR)를 나타낸다
도 6: HERV-W ENV(ENV)는 글루탐산성 네트워크 활성 및 시냅스 작용의 변경을 유도한다.
(A) 실험 설정. 스케일바= 10μm.
(B) ENV에 장기간(24시간) 노출된 후 NMDAR-매개 Ca2+ 과도상태 빈도의 증가는 IL-1ra 공동-노출에 의해 조절된다. Cont. (n = 103/8 수상돌기 가시/뉴런), Cont.+IL-1ra (n = 110/7), ENV (n = 79/10), ENV+IL-1ra (n = 111/7). **P = 0.0055 및 ***P < 0.0001, 양방향 ANOVA 이후 Bonferroni 다중 비교.
(C) Ca2+ 과도상태 검출 (점) 및 장기간 Cont. 및 ENV 노출 후 2개의 예시 뉴런에 있는 3개의 수상돌기 가시로부터의 연관 타이밍(음영 영역).
(D) Cont. 또는 ENV 노출 24시간 후 평균 수상돌기 가시 과도 상태 상관관계의 특징적인 상관도 및 (오른쪽) 양적 그래프. ***P < 0.0001, Mann-Whitney 테스트.
(E) 실험 설정 및 공동-형질주입 뉴런의 대표적 이미지. 스케일바 = 300 및 40μm.
(F) Cont. (빈 벡터) 및 ENV(phCMV-MSRV ENV) 형질주입된 세포를 IL-1ra와 조합하거나 조합하지 않을 때의 상관도 및 양적 그래프. Cont. n = (118/8), Cont.+IL-1ra (n = 151/8), ENV (n = 166/8), ENV+IL-1ra (n = 154/8), ***P < 0.0001 및 **P = 0.0052, Mann-Whitney 테스트.
(G) 시냅스 영역의 표면 GluA1-SEP (Homer 1c). 스케일바 = 5 및 1μm.
(G (아래) 및 H) 장기간 ENV 노출 후 시냅스 GluA1 형광 강도, Cont. (n = 1071/25, 수상돌기 가시/뉴런 영역) 및 ENV (n = 728/21), ***P < 0.001, Kolmogorov-Smirnov 테스트.
(I) 기준선(-5분) 및 화학적 LTP (cLTP) 유도 후 실시간 타임-랩스 이미지 및 (오른쪽) cLTP 유도 후 시냅스 GluA1-SEP 형광 진화의 예시, Cont. 및 ENV에 대한 기준선으로 정규화됨. 스케일바 = 1μm
(J) 개별 수상돌기 가시에 대한 cLTP 후와 기준선(pre) 사이의 GluA1-SEP 강도 비율. Cont. no cLTP (n = 621/13), cLTP (n = 902/12), ENV no cLTP (n=461/17), cLTP (n=472/14)에서 Box-and-whisker 플롯 (10-90 백분위수). *P = 0.0233, ***P < 0.0001, Mann-Whitney 테스트. 다른 언급이 없는 경우 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 7: 전기천공 세포에서 MSRV-ENV의 발현, 해마 시냅토좀 분획에서 세포 생존률 및 GluN2 발현.
(A) P7에서 GFP-전기천공 동물의 해마 CA1 영역의 관상 단면(coronal section), 글루타민 합성효소(GS) 또는 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1(Iba1)와 공동-염색. 스케일바 = 10μm.
(B) P7에서 전기천공 동물의 해마 CA1 영역에서 세포사멸 세포 검출(TUNEL)의 대표적인 이미지. 스케일바 = 1mm 및 200μm.
(C) 다른 지역에서 양성 세포/mm²의 정량화. 값은 평균 ± SEM를 나타낸다, n = 3 동물/그룹.
(D) 세포하 분획의 웨스턴 블롯 분석. NMDA 수용체(GluN2A/2B)와 시냅스 후 밀도 단백질(PSD-95)은 H에 비해 P2-와 시냅토좀 분획이 풍부한 반면, 신경아교세포(GFAP)의 고갈이 관찰된다.
(E) GluN2(A+B) 및 PSD-95에 대해 WESTM 장치에서 탐지된 시냅토좀의 대표적인 화학발광 추적.
도 8: DNA 삽입이 체중 발달 및 행동 수행에 미치는 영향
(A) 원시(naive) 동물과 비교하여 전기천공 동물의 정상적인 체중 증가 (n = 17-31 동물/그룹).
(B) Env-쥐는 오픈 필드 중앙에서 보낸 시간으로 측정된 불안-유사 행동에 변경이 없음을 보여준다 (n = 16).
(C) 사전 자극 억제(PPI) 반응에 대한 DNA 로드의 영향 없음 (Cont. n = 11, Cont. + 빈 벡터 n = 14).
(D) 클로자핀(12mg/kg)은 Env 동물의 PPI 반응을 개선한다 (n = 12).
(E) Cont. IgG 또는 GluN1-Ab와의 교차결합 프로토콜 이후 대조군-동물의 PPI 반응 (Cont. IgG n = 12, GluN1 n = 11). 값은 평균 ± SEM.
도 9: 해마 세포에 선택적 HERV-W ENV(ENV) 삽입은 시냅스 NMDA 변경 및 쥐의 정신병과 관련된 행동을 유도한다.
(A) 출생 후의 1 일(P)에서 전기 천공의 도식적 표현.
(B 및 C) 해마 삽입 유전자 분포의 대표적 이미지. 스케일바 = 1mm 및 삽입 = 100μm.
(D) CA1 영역에서 phCMV-MSRV ENV 발현 세포. 스케일바 =20μm.
(E) 행동 연구 시퀀스: 적응(Adapt.)/오픈 필드, 사전자극 억제(PPI) 및 NMDAR 길항제(MK-801) 챌린지.
(F) 전기천공 70일 후 삽입된 유전자 발현(GFP)의 블롯.
(G) ENV-해마 시냅토좀에서 GluN2(A+B)/PSD-95 비율 감소. *P = 0.012, Mann Whitney 테스트. 점은 개별 동물이고 막대는 평균을 나타낸다.
(H) 20분 동안 이동 거리(cm)로 측정된 기본 이동 및 상황에 대한 적응. 값은 평균 ± SEM로 나타남.
(I) ENV 동물에서 MK-801(0.3mg/kg) 유도 과운동(hyperlocomotion) 증가. 값은 평균 ± SEM로 나타남, *P 및 **P (흑색 선), RM 양방향 ANOVA, Fisher LSD 사후 분석(Fisher's LSD post-hoc analysis), (n = 9-11 쥐/그룹).
(J) ENV 발현은 PPI 놀람 반응을 손상시킨다. *P = 0.0180 및 **P = 0.0019, 양방향 ANOVA, 이후 Bonferroni 다중 비교 테스트. (오른쪽) 클로자핀 (12mg/kg)은 중단된 PPI 반응을 복구한다.
(K) 실험 설계, (right) 해마-내 주입 부위.
(L) GluN1 x-결합 후 ENV 동물에서 PPI 수행. *P = 0.0195, **P = 0.0093, 비가중 평균에 대해 보정된 단방향 ANOVA, 이후 Tukey 다중 비교 테스트. 점은 개별 동물이고 선은 평균을 나타낸다.
도 10: 신생아 ENV 발현은 글루탐산성 시냅스 성숙을 조정하고 정신병-유사 행동에 필요하며, 이는 HERV-W ENV 중화 항체의 생체 내 주입으로 역전될 수 있다.
(A) 해마 조직의 세포하 분획. 초기 균질액과 비교하여 P2- 및 시냅토좀(시냅스 단백질 농축) 분획에서 NMDA 수용체(GluN2A로 표시됨)와 시냅스 후 밀도 단백질(PSD-95)의 농축과 신경아교세포의 고갈(GFAP)에 주목.
(B) P7에서 삽입 유전자 분포의 대표적 이미지. 스케일바 = 1mm.
(C) ~P65에서 해마 삽입 유전자 발현.
(D) ENV 노출은 시냅스(P7, Cont. vs ENV, P = 0.06)에서 GluN2A/PSD-95 서브유닛 안정화에 영향을 미치는 경향이 있으며 이는 일정하게 유지된다. 상호 작용: F(1,29) = 8.69, 양방향 ANOVA, Bonferroni 다중 비교 테스트, *P = 0.021, ***P = 0.0004.
(E) GluN2B/PSD-95 발현은 두 연령 모두에서 ENV의 영향을 받지 않는다. 상호 작용: F(1,29) = 2.46, P = 0.13, 양방향 ANOVA, Bonferroni 다중 비교 테스트, ***P < 0.0001, (n = 8-9 동물/그룹). 바는 평균 ± SEM이다.
(F) P7에서 ENV-동물은 증가된 GluN2A-IL-1R 상호작용을 나타낸다. IL-1R의 면역침전 (IP), *P = 0.0462, 스튜던트 t-테스트 (n = 5-7 동물/그룹).
(G) 성인 동물에서 GluA2/PSD-95 발현은 증가한다, **P = 0.0098 스튜던트 t-테스트 (n = 6-9 동물/그룹).
(H) PSD-95의 발현은 P7 및 P65 쥐에서 Cont. 및 ENV를 비교하는 것과 유사하다.
(I) ENV 중화-Ab(30mg/kg)로 P4, 8 및 12에서 초기 생후 치료 프로토콜(i.p 주입).
(J) 치료는 ENV-동물 PPI 반응을 개선시킨다, *P = 0.037, 단방향 ANOVA, Tukey 다중 비교 테스트. 점은 개별 동물이고 바는 평균을 나타낸다.
도 11: ENVW2.3 항체 -VL 영역의 CDR 서열을 갖는 기능성 단백질 구조
(A) 선형 펩타이드 서열은 CDR 서열(CDR1, CDR2 및 CDR3)의 표시로 표시된다.
(B) Pommie C et al. 2004. Journal of Molecular Recognition, 17, 17-32; IMGT (면역글로불린 또는 항체, T 세포 수용체, MH, 면역글로불린 수퍼패밀리 IgSF 및 MhSF에 대한 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템) 에 따른 "Pearl Necklace representation".
도 12: ENVW2.3 항체 -VH 영역의 CDR 서열을 갖는 기능성 단백질 구조
(A) 선형 펩타이드 서열은 CDR 서열(CDR4, CDR5 및 CDR6)의 표시로 표시된다.
(B) Pommie C et al. 2004. Journal of Molecular Recognition, 17, 17-32; IMGT (면역글로불린 또는 항체, T 세포 수용체, MH, 면역글로불린 수퍼패밀리 IgSF 및 MhSF에 대한 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템) 에 따른 "Pearl Necklace representation".
도 13: 흑색 실선(부위 1) 및 회색 실선(부위 2)으로 밑줄이 그어진 ENVW2.3 고정 부위를 갖는 HERV-W/MSRV-ENV 아미노산 서열.
MSRV-ENV 단백질의 3차 구조는 흑색 실선과 회색 실선(부위 1 및 부위 2)으로 밑줄 친 서열이 서로 맞닿도록 유도한다. 이는 ENVW2.3 항체에 의해 인식되는 구조적 에피토프를 생성한다. 점선으로 밑줄 친 서열은 ENVW2.3 에피토프를 형성하는 부위 1과 부위 2 사이에 포함되지만 항체가 인식하지 못하는 아미노산에 해당한다.
도 14: HERV-W ENV 발현 및 혈청 내 염증성 사이토카인은 정신분열증 및 양극성 장애의 하위 그룹을 정의한다.
(a) HERV-W ENV 항원혈증에 대해 양성(HERV-Wpos) 또는 음성(HERV-Wneg)인 건강한 대조군(HC), 정신분열증(SZ) 사례 및 양극성 장애(BP) 사례의 백분율. 포함된 숫자는 대상체 수를 나타낸다. **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 카이-제곱 테스트를 기반으로 HC와 SZ 또는 BP 사례 간의 유의한 차이를 반영한다.
(b) 2-단계 클러스터 분석에 의해 밝혀진 클러스터 계층화 및 클러스터 특성 요약에 대한 예측 인자의 중요도. 클러스터 분석은 HERV-W 양성 및 혈청 사이토카인에 기초하여 분리된 2개의 주요 클러스터(CL1 및 CL2)를 밝혔다. CL2 대상체는 HERV-Wpos이고 혈청 사이토카인의 증가된 수준을 나타내는 반면, CL1 대상체는 혈청 사이토카인의 뚜렷한 변화가 없는 HERV-Wneg이다.
(c) CL1 및 CL2에 걸친 HC, SZ 및 BP 대상체의 분포(백분율, %). 괄호 안의 숫자는 각 클러스터의 대상체 수를 나타낸다.
(d) HC 대상체, SZ 사례의 하위 그룹(SZ/CL1 및 SZ/CL2) 및 BP 사례의 하위 그룹(BP/CL1 및 BP/CL2)에서 인터류킨(IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8, 인터페론(IFN)-y 및 종양괴사인자(TNF)-α의 혈청 수준. *p < 0.01, **p < 0.01 및 ***p < 0.001, 단방향 ANOVA 후 다중 비교를 위한 Tukey 사후 테스트를 기반으로 함. 바는 평균 +/- S.E.M을 나타낸다.
도 15: 정신분열증 및 양극성 장애 사례의 뚜렷한 하위 그룹은 서로 다른 임상 특성을 나타낸다.
클러스터 분석은 HERV-W 양성 및 혈청 사이토카인에 기초하여 분리된 2개의 주요 클러스터(CL1 및 CL2)를 밝혔다(도 14 참조). CL2 대상체는 HERV-Wpos이고 혈청 사이토카인의 증가된 수준을 나타내는 반면, CL1 대상체는 혈청 사이토카인에 뚜렷한 변화가 없는 HERV-Wneg이다(도 14 참조).
(a) SZ 사례의 하위 그룹(SZ/CL1 및 SZ/CL2)과 BP 사례의 하위 그룹(BP/CL1 및 BP/CL2)에서의 질병 발병 연령(년). **p < 0.01, 양방향 ANOVA 후 다중 비교를 위한 Tukey 사후 테스트를 기반으로 함.
(b) SZ 사례의 하위 그룹(SZ/CL1 및 SZ/CL2)과 BP 사례의 하위 그룹(BP/CL1 및 BP/CL2)에서의 Montgomery-Asberg Depression Rating Scale [MADRS] 점수와 Young Mania Rating Scale [YMRS] 점수. *p < 0.05, 양방향 ANOVA 후 다중 비교를 위한 Tukey 사후 테스트를 기반으로 함.
(c) SZ 사례의 하위 그룹(SZ/CL1 및 SZ/CL2)과 BP 사례의 하위 그룹(BP/CL1 및 BP/CL2)에서의 Positive and Negative Syndrome Scale [PANSS] 점수 (양성, 음성 및 일반적 증상). *p < 0.05 및 ***p < 0.001, 하위 그룹 분류에 관계없이 SZ와 BP 대상체 간의 유의한 차이를 반영, 양방향 ANOVA를 기반으로 함.
(d) SZ 사례의 하위 그룹(SZ/CL1 및 SZ/CL2)에서의 일일 클로르프로마진 [CPZ] 당량. *p < 0.05, 양측 t-테스트를 기반으로 함. 모든 값은 평균 +/- S.E.M이다.
정의
본 명세서에서, 용어 "인간 내인성 레트로바이러스" 및 "HERV"는 일반적으로 "HERV-W"라고 명명되는 W형 내인성 레트로바이러스 패밀리에 속하는 바이러스를 포함하는 인간 내인성 레트로바이러스를 지칭한다.
"HERV-W"는 다발성 경화증 환자로부터 처음 분리된 인간 레트로바이러스인 "다발성 경화증 관련 레트로바이러스(MSRV)"의 초기 발견으로 인간 게놈에서 공개된 인간 내인성 레트로바이러스의 패밀리이다. 따라서 연구에서 "LM7"(MS에서 기재된 최초의 분리물(isolate)), "MS-레트로바이러스", "MSRV", "신시틴(syncytin)", "HERV-W 7q", "ERVW-E1", "ERVW E2", "X 염색체로부터 HERV-W 복제" 또는 "HERV-W"를 언급 시, 이들은 모두 HERV-W 요소를 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "MSRV"는 HERV-W 패밀리의 일원인 특정 내인성 레트로바이러스를 의미한다. 본 발명의 문맥상, "HERV-W" 및 "MSRV"라는 표현은 모두 HERV-W 요소를 나타낸다. 구체적으로, "HERV-W 엔벨로프 단백질", "HERV-W ENV", "MSRV-ENV" 및 "ENV"라는 표현은 모두 동일한 엔벨로프 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 아미노산 서열의 가능한 몇 가지 변형은 HERV-W ENV 관련 정신 질환에서 치료 용도로 사용하기 위한 특정 항-ENV 항체의 결합을 방해하지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "치료(treating or treatment)"는, 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상의 진행을 역전시키거나, 완화시키거나, 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. 이와 같이 용어 "항체"는 광범위하게 이해되어야 하며 면역글로불린 분자뿐만 아니라 항체 단편 및 항체 유도체도 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 HERV-W ENV에 대해 지시되고 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항체이다. 특정 구현예에서 상기 항체는 서열번호 1 내지 6에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR을 모두 포함한다.
본 명세서에서, "항체 단편"이라는 표현은 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)과 같이 초가변 영역을 모방하는 항체의 일부를 의미한다. 본 발명에 따른 항체의 단편은 상기 항체의 결합 친화도 및 특이성을 유지한다. 이러한 단편들은 상기 항체의 기능적 등가물이며, 실질적으로 상기 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 항체 단편의 예시로는 중쇄, 경쇄, VL, VH, Fv, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "항체 유도체"라는 표현은 본 발명의 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게는 상기 항체의 6개의 CDR을 포함하는, 자연적 서열(예: 다른 종의 링커 서열...)과 다른 적어도 하나의 서열에 융합된 단편을 의미하며, 상기 유도체는 본 발명의 상기 항체에 비교할 만한 HERV-W ENV에 대한 결합 친화도 및 특이성을 갖는다. 본 발명에 따른 유도체는 상기 항체의 결합 친화도 및 특이성을 유지한다. 이러한 유도체는 상기 항체의 기능적 등가물이며, 상기 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 항체 유도체의 예로는 scFv, (scFv)2 및 디아바디를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
자연 항체에서, 두 개의 중쇄(HC)는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄(LC)에 연결된다. 경쇄에는 람다(l)와 카파(k)의 두 가지 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 클래스(또는 이소형)에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 각 사슬은 고유한 서열 영역을 포함한다.
일반적으로 경쇄는 가변 영역(VL)과 불변 영역(CL)의 두 영역을 포함한다. 중쇄는 4개의 영역, 1개의 가변 영역(VH) 및 3개의 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3이고, CH로 통칭됨)을 포함한다. 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)은 항원 에피토프에 특이적인 결합 부위를 결정한다. 경쇄 불변 영역(CL) 및 중쇄 불변 영역(CH)은 항체 사슬 결합(antibody chain association), 분비, 태반통과 이동(trans-placental mobility), 보체 결합(complement binding) 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 가변 부분으로 구성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 에피토프 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR)에서 유래한 잔기로 구성된다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 자연 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3으로 지정된 3개의 CDR을 갖는다. 따라서 항원-결합 부위는 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "키메라 항체"는 임의의 종, 바람직하게는 마우스의 항체의 VH 영역 및 VL 영역과 인간 항체의 CH 영역 및 CL 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "인간화 항체"는 인간 항체로부터 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 가지지만 임의의 종, 바람직하게는 마우스의 항체의 CDR을 보유하는 항체를 지칭한다.
용어 "Fab"는 분자량 약 50,000의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 나타내며, IgG를 단백질분해효소인 파파인으로 처리하여 얻은 단편 중 H사슬의 N-말단의 절반 정도와 L사슬 전체가 이황화 결합에 의해 결합된다.
본 명세서에서, 용어 "F(ab')2"는 분자량 약 100,000의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭하며, IgG를 단백질분해효소인 펩신으로 처리하여 얻은 단편 중 힌지 영역의 이황화 결합을 통해 결합된 Fab보다 약간 큰 항체 단편을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "Fab'"은 F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합을 절단하여 얻어지는 분자량 약 50,000의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭한다.
"단쇄 Fv(single chain Fv)" 또는 "scFv"라는 표현은 공유결합으로 연결된 VH::VL 이종 이량체인 폴리펩타이드를 지칭하며, 일반적으로 펩타이드-암호화 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 암호화 유전자들을 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정된 VH::VL 이종 이량체이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv와의 결합에 의해 자발적으로 형성되거나 또는 2가의sc(Fv)2와 같은 펩타이드 링커에 의해 1가 scFv를 커플링함으로써 생성될 수 있다.
용어 "디아바디(diabodies)"는 2개의 항원-결합 자리를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이들 단편은 동일 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에 있는 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 동일 사슬에 있는 상기 2개의 영역 사이에 페어링(pairing)을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 영역들을 다른 사슬의 상보성 영역과 페어링을 하게 되어 2개의 항원-결합 자리를 생성하게 된다.
본 명세서에서, "본 발명의 항체"라는 표현은 HERV-W 엔벨로프 단백질(HERV-W ENV)에 대해, 바람직하게는 W형 인간 내인성 레트로바이러스 패밀리(HERV-W)의 HERV-W ENV 단백질에 대해, 더욱 바람직하게는 MSRV의 엔벨로프 단백질에 대해, 더욱 바람직하게는 MSRV의 엔벨로프 단백질의 세포외 영역에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 HERV-W ENV에 대한 항체이며, 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항체이다. 본 발명의 항체는 일반적으로 구조적 에피토프에 결합한다.
특히, 본 발명의 항체는 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2 개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 구조적 에피토프에 결합한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 6에 나타된 6개의 CDR을 모두 포함한다.
본 발명의 의미 내에서, "항-ENV 항체", "항-HERV-W ENV 항체", "HERV-W ENV에 대한 항체" 및 "HERV-W ENV를 표적으로 하는 항체"라는 표현은 서로 무관하게 사용되며, 동등하다.
본 명세서에서, 용어 "생물학적 샘플"은 시험관 내 평가의 목적으로 얻은 모든 생물학적 샘플을 의미한다. 본 발명에서, 상기 샘플 또는 환자 샘플은 임의의 체액 또는 질병-특이적 조직 및 병변을 포함할 수 있다. 체액의 예로는 혈액, 유두 흡인액, 소변, 타액, 윤활액, 뇌척수액(CSF) 등이 있다. 특히, 혈액 샘플은 혈청 또는 혈장일 수 있다.
정신 질환 치료를 위한 항-HERV W ENV 항체 및 진단 바이오마커의 용도
본 발명은 정신 질환으로 진단된 환자들의 진단-기반 치료법에 관한 것으로, 상기 환자들은 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인 및/또는 체액 샘플에서 HERV-W ENV의 발현을 나타내는 바이오마커에 대한 검사를 받았고, 나아가 HERV-W 엔벨로프 단백질에 대한 항체(항HERV-W ENV 항체)로 치료되었다.
특히, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 높은 수준의 사이토카인을 갖는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
본 발명에서, "환자 그룹", "환자 하위 그룹" 및 "환자 클러스터"라는 표현은 서로 무관하게 사용되며, 동등하다.
정신 질환을 앓고 있는 환자는 정신 질환 증상이 있거나 정신 질환 진단을 받은 환자이다.
즉, 정신 질환 진단을 받은 환자는 정신 질환 증상이 있고 임상적으로 의사의 진단을 받은 정신 질환을 앓고 있는 환자이다.
특히 상기 정신 질환은 정신분열증(schizophrenia), 양극성 장애(bipolar disorder), 정신분열성 정신병(schizoaffective psychosis) 및 정신분열형 장애(schizophreniform disorder)로 이루어진 군에서 선택된다. 이러한 병리는 DSM IV 또는 V 분류 또는 정신 질환에 대한 적절한 분류에 따라 정의된다(25-28). 정신 질환의 진단, 특히 이 정신 질환의 목록은 의사들에 잘 알려져 있다. 보다 구체적으로, 상기 정신 질환은 정신분열증 또는 양극성 장애이다.
본 개시내용에서 "높은 수준의 사이토카인을 갖는 것"은 "사이토카인이 높은 수준으로 테스트된 것" 또는 "높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 것"을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "사이토카인에 대한 높은 수준" 또는 "높은 수준의 사이토카인" 또는 "증가된 수준의 사이토카인"은 환자 그룹 내에서 상기 사이토카인의 수준이 건강한 사람의 수준보다 유의하게 높다는 것을 의미한다. 예를 들어, 높은 수준의 사이토카인은 혈청에서 IL-6의 경우 0.5pg/ml 이상, 혈청에서 IL-1β의 경우 0.05pg/ml 이상, 혈청에서 TNF-α의 경우 1.25pg/ml 이상이다. 주목할 점은, 본 개시내용에서 인용된 사이토카인의 임계값은 이의 용량 및 민감도(true-positive의 비율) 및 특이성(true-negative의 비율)에 사용되는 키트, 항체, 테크닉, 프로토콜, 장치 및 플랫폼에 따라 다르다. 제시된 값은 지시적인 것일 뿐이며 제조업체의 지침에 따라 조정하거나 건강한 개인에 대한 주어진 플랫폼으로 평가해야 한다. 즉, 환자군에서 상기 사이토카인의 수준이 상기 사이토카인의 정상 수준보다 현저히 높다는 것을 의미한다. 이 정상 값은 키트 공급업체에서 제공하고/거나, 시작 가능한 또는 진행 중인 감염 또는 염증 없이 확인된 건강한 개인으로 구성된 패널에서 결정할 수 있다. 당업자는 시장에서 이용 가능한 상이한 테크닉, 프로토콜 및 장치에 따라 주어진 사이토카인에 대한 이러한 임계값 또는 정상 수준을 측정 및 결정하는 방법을 완벽하게 알고 있다.
이 정의는 본 개시내용에서 인용된 특정 사이토카인(예: IL-6, IL-1β 및 TNF-α)의 높은 수준에 적용된다.
일반적으로 사이토카인의 수준은 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 측정된다.
본 개시내용에서, 상기 사이토카인은 특히 전-염증성 사이토카인이다. 보다 구체적으로, 상기 전-염증성 사이토카인은 IL-6, IL-1β 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택된다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고, 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청에서 사이토카인에 대한 높은 수준을 갖는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이며, 상기 사이토카인은 특히 전-염증성 사이토카인이고, 더욱 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고, 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청에서 높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이며, 상기 사이토카인은 특히 전-염증성 사이토카인이고, 더욱 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다.
특정 구현예에서, 상기 정신 질환은 정신분열증이며, 체액 샘플에서 높은 수준을 갖는 상기 사이토카인은 바람직하게는 IL-6이다.
특정 구현예에서, 상기 정신 질환은 양극성 장애이며, 체액 샘플에서 높은 수준을 갖는 상기 사이토카인은 바람직하게는 IL-1β이다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 양극성 장애로 진단되고 체액 샘플에서 IL-1β에 대한 높은 수준을 갖는 환자 그룹은 체액 샘플에서 TNF-α의 높은 수준을 더 갖는다.
특정 구현예에서, HERV-W ENV는 상기 그룹의 환자에서 검출되었다. 사이토카인의 높은 수준을 나타내는 환자의 하위 그룹은 HERV-W ENV를 발현하는 환자의 하위 그룹에 해당하므로, HERV-W ENV의 검출은 필수가 아니고 선택적일 수 있다. 특히, HERV-W ENV는 생물학적 샘플에서 검출된다. 더욱 구체적으로, HERV-W ENV는 혈액 샘플, 특히 혈청 또는 혈장에서 검출된다. HERV-W ENV는 본 개시내용에 따른 항-HERV-W ENV 항체와 같은 항-HERV-W ENV 항체로 검출된다.
HERV-W ENV의 발현은 하기 설명된 조건에 따라 HERV-W DNA, RNA, 항원 또는 단백질의 검출에 의해 특징지을 수 있다.
HERV-W 패밀리는 다발성 경화증(18-20) 환자로부터 처음 분리된 인간 레트로 바이러스인 MSRV 이후에 발견되었다. HERV-W ENV의 발현 식별은 당업자에게 잘 알려져 있다. 관련 질병 또는 증후군은 해당 환자에서 다음의 존재에 의해 정의된다: (i) 바람직하게는 체액(혈액, 뇌척수액, 소변 등)에서 검출된 특정 HERV-W RNA 또는 항원, (ii) 병변 또는 기능 장애가 있는 장기의 세포 또는 조직에서 증가된 DNA 또는 RNA 복제 수, (iii) 질병 또는 임상 증후군의 과정에 관련된 세포 또는 조직의 특정 MSRV/HERV-W 단백질 또는 항원, 또는 (iv) 질환이 있거나 임상 증후군을 발현하는 개인의 체액의 HERV-W 단백질 또는 항원 (국제 출원 WO2019201908A1 - HERV-W 엔벨로프 단백질의 수용성 친수성 올리고머 형태의 검출 방법 참조). 다양한 기술적 조건 및 표적을 가진 검출 분석의 예가 설명되었다(21-23). 이러한 모든 검출 조건은 정상 및 발현의 생리학적 조건(즉, 임신 중)에서 발현되는 생리학적 HERV-W 복제인 신시틴-1의 검출을 배제한다(24).
특히, 본 발명에서 HERV-W ENV의 발현은 샘플 내 단백질 HERV-W ENV의 검출에 의해 수행된다. 이 검출을 위해, 항-HERV-W ENV 항체가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항-HERV-W ENV 항체는 본 출원에서 설명된 것일 수 있다.
추가로, 이는 다음을 포함하는 뮤린 항체일 수 있다:
- 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL); 및
- 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH).
상기 언급한 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표 1에 개시되어 있다.
뮤린 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역
영역 서열번호 서열
VL 7 DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSKGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK
VH 8 EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGKSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELTSLTNEDSAVYYCTRTVYA MDYWGQGTSVTVSS
이러한 구현예에서, 정신 질환은 "HERV-W ENV 관련 정신 질환"으로도 불릴 수 있다. 정신 질환을 앓고 있는 환자들 중에서, 상기 환자 그룹은 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인, 특히 높은 수준의 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α을 가지며, 여기서 HERV-W ENV는 예를 들어 HERV-W DNA, RNA, 항원 또는 단백질을 상기 상술한 조건에 따라 검출함으로써 검출되는 정신 질환을 앓고 있는 환자 그룹이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 HERV-W ENV의 검출이 체액 샘플에서 HERV-W DNA, RNA, 항원 또는 단백질의 검출을 특징으로 하고/하거나 사이토카인에 대한 높은 수준을 갖는 정신 질환을 앓고 있는 환자 그룹에 적용된다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청 및 혈장에서 사이토카인의 높은 수준을 갖고/갖거나 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 검출된 HERV-W ENV의 발현을 갖는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청 및 혈장에서 사이토카인의 높은 수준을 특징으로 하고/하거나 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 검출된 HERV-W ENV의 발현을 갖는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항HERV-W ENV 항체에 관한 것으로, 여기서 상기 항-HERV-W ENV 항체는 뉴 런에서 NMDA 수용체, GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도한다.
이는 상기 항-HERV-W ENV 항체가 미세아교세포(microglia)에 의한 사이토카인 생성과 유사한 신경 시냅스로부터의 NMDAR의 분산을 역전시킬 수 있고, 이는 이들 신경수용체가 정상적인 기능적 활성을 회복할 수 있음을 의미한다. 이것은 특히 글루탐산성 GluN2B-함유 NMDA 수용체와 관련이 있다. 실제로, 실시예 2에서 입증된 바와 같이, HERV-W ENV는 생리학적으로 관련된 시냅스 영역으로부터 비편재화를 유도함으로써 NMDAR의 기능적 활성의 손실을 야기한다. GluN2B-함유 NMDA 수용체가 시냅스에서 시냅스 후 구획(즉, 시냅스 밖의 신경 막 영역)으로 분산되면 정신 질환의 특징적인 증상으로 이어진다.
일반적으로, 실시예 2는 해마 뉴런에서 시냅스 후 구획으로부터 시냅스로의 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 재배치에 대한 항-HERV-W항체의 치료 활성을 식별하는 방법을 교시한다. 동물 해마는 정신 질환 연구를 위한 동물 세포 모델을 구성하고 쉽게 접근할 수 있는 뇌 영역에 해당하기 때문에 신경학에서 널리 사용된다.
해마의 뉴런은 전체적인 시냅스 기능과 신경 전달 물질에 대한 수용체의 시냅스 국소화 필요성에 있어서 다른 뇌 영역에서 발견되는 뉴런과 동일하기 때문에, 해마 뉴런에 대한 관찰은 다른 뇌 영역의 뉴런으로 외삽된다. 따라서 비록 다른 정신병적 병리와 관련된 뇌 영역이 다를 수 있지만, 해마의 뉴런에 대한 현재 관찰은 다른 뇌 영역에 위치한 뉴런을 대표한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항HERV-W ENV 항체에 관한 것으로, 여기서 상기 항체는 HERV-W ENV에 결합한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것으로, 여기서 상기 항체는 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로, 상기 구조적 에피토프는 서열번호 10 및 서열번호 11 에 나타낸 바와 같은 2 개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것으로, 여기서 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 각각을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 뉴런에서 NMDA 수용체의 재배치, 특히 GluN2B 서브유닛을 포함하는 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하며, 여기서 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 각각을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 뉴런에서 NMDA 수용체의 재배치, 특히 GluN2B 서브유닛을 포함하는 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하며, 여기서 상기 항체는 서열번호 10 및 서열번호 11 에 나타낸 바와 같은 2 개의 원거리 선형 서열에 의해 정의되는 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하며, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 각각을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 상기 항-HERV-W 항체는 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체이다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG이다. 보다 구체적으로, 인간화 IgG4 단일클론 항체 또는 IgG1 단일클론 항체이다.
특정 구현예에서 상기 언급된 바와 같은 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 상기 항-HERV-W 항체는 다음을 포함한다:
- 경쇄 가변 영역(VL)이 CDR-L1에 대해 서열번호 1, CDR-L2에 대해 서열번호 2 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 경쇄; 및
- 중쇄 가변 영역(VH)이 CDR-H1에 대해 서열번호 4, CDR-H2에 대해 서열번호 5 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 중쇄.
또한, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된, 전술한 항HERV-W 항체의 단편 또는 유도체일 수 있다.
정신 질환으로 진단된 환자의 하위 그룹을 식별하는 진단 방법
본 발명은 또한 다음을 포함하는, 정신 질환으로 진단된 환자가 본 개시내용에 정의된 바와 같은 정신 질환을 앓고 있는 환자의 하위 그룹에 속하는지를 식별하기 위한 진단 방법에 관한 것이다:
1) 사이토카인 수준의 정량화; 및/또는
2) HERV-W ENV의 발현 검출.
특히 상기 사이토카인은 전-염증성 사이토카인, 보다 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다.
특히, 상기 정신 질환은 정신분열증, 양극성 장애, 정신분열성 정신병 및 정신분열형 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 환자가 정신분열증으로 진단된 경우, IL-6의 수준을 정량화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 환자가 양극성 장애로 진단된 경우, IL-1β의 수준을 정량화하는 것이 바람직하다. 양극성 장애의 경우, 추가로 TNF-α의 수준도 정량화할 수 있다.
일반적으로, 사이토카인의 수준은 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 정량화된다.
상기 환자가 체액 샘플에서 상기 사이토카인의 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 환자는 정신 질환을 앓고 있으며 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 특징으로 하고, 또한 HERV-W ENV의 발현을 특징으로 하는 환자의 하위 그룹에 속한다는 것을 의미한다.
상기 제시된 "사이토카인의 높은 수준"의 정의는 여기에서도 적용된다.
HERV-W ENV를 검출하기 위한 방법들의 예시들이 이전의 본 개시내용에서 제공된다. 특히, HERV-W ENV의 발현은 생물학적 샘플에서 단백질 HERV-W ENV의 검출에 의해 수행된다. 이 검출을 위해, 항-HERV-W ENV 항체가 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 항-HERV-W ENV 항체는 본 출원에서 설명된 것일 수 있다.
추가로, 다음을 포함하는 뮤린 항체일 수 있다:
- 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL); 및
- 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH).
본 개시내용에서, HERV-W ENV는 생물학적 샘플, 특히 혈액 샘플과 같은 체액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 검출된다.
사이토카인의 높은 수준을 나타내는 환자의 하위 그룹은 HERV-W ENV를 발현하는 환자의 하위 그룹, 즉 HERV-W ENV가 검출된 환자의 하위 그룹에 해당하므로, 정신 질환을 앓고 있는 환자의 하위 그룹을 식별하는 것은 따라서 사이토카인의 수준을 정량화하고 HERV-W ENV를 검출하는 것 모두를 필요로 하지 않는다. 따라서 이러한 매개 변수 중 하나만 분석하면 충분하다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 출원은 정신 질환을 진단받은 환자가 정신 질환을 앓고 있고, 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 특징으로 하는 환자의 하위 그룹에 속하는지 여부를 식별하기 위한 진단 방법에 관한 것으로, 다음을 포함한다:
1) 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청에서 사이토카인의 수준을 정량화하며, 상기 사이토카인은 특히 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인인 단계; 및
2) 선택적으로, HERV-W ENV의 발현을 검출하는 단계.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 뮤린 항체에 관한 것이다:
- 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL); 및
- 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH).
상기 뮤린 항체는 서열번호 1-6의 CDR을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 개시내용에서 설명된 바와 같이 항-HERV-W ENV를 포함하는, 생물학적 샘플, 특히 혈액 샘플과 같은 체액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 HERV-W ENV의 검출 키트에 관한 것이다.
특히, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 규정된 CDR 각각을 포함하는 항-HERV-W ENV를 포함한다.
보다 구체적으로, 다음을 포함하는 항-HERV-W ENV를 포함한다:
- 경쇄 가변 영역(VL)이 CDR-L1에 대해 서열번호 1, CDR-L2에 대해 서열번호 2 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 경쇄; 및
- 중쇄 가변 영역(VH)이 CDR-H1에 대해 서열번호 4, CDR-H2에 대해 서열번호 5 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 중쇄.
상기 키트는 또한 다음을 포함하는 뮤린 항체를 포함할 수 있다:
- 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL); 및
- 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH).
본 발명에 따른 치료방법 및 모니터링 방법
다른 측면에서, 본 발명은 또한 정신분열증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환으로 진단되고, 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 환자 그룹을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 환자에게 유효량의 항-HERV-W ENV 항체, 특히 본 개시내용에서 설명된 것을 투여하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 정신분열증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환으로 진단되고,
- 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인 및/또는
- 체액 샘플에서 검출된 HERV-WENV의 발현
을 특징으로 하는 환자 그룹을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 환자에게 유효량의 항-HERV-W ENV 항체, 특히 본 개시내용에서 설명된 것을 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 정신 질환으로 진단되고 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 갖는 환자 그룹의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본 개시내용에서 설명된 바와 같은 항-HERV-W ENV 항체의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한
- 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인 및/또는
- 체액 샘플에서 검출된 HERV-WENV의 발현
을 특징으로 하는 정신 질환으로 진단된 환자 그룹의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본 개시내용에서 설명된 바와 같은 항-HERV-W ENV 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 정신 질환으로 진단되고,
- 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인 및/또는
- 체액 샘플에서 검출된 HERV-WENV의 발현
을 특징으로 하는 환자 그룹을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 환자에게 유효량의 항-HERV-W ENV 항체, 특히 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 각각을 포함하는 항-HERV-W ENV 항체를 투여하는 것을 포함한다.
상술한 모든 구현예들은 본 발명의 이러한 다른 측면들에 적용된다.
특히, 본 발명은 또한 정신 질환으로 진단된 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함한다:
1) 사이토카인 수준의 정량화 및/또는
2) HERV-W ENV의 발현 검출.
특히 상기 사이토카인은 전-염증성 사이토카인, 보다 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다. 특히, 상기 사이토카인의 수준은 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 정량화된다. 사이토카인의 수준을 정량화하기 위해, 상기 사이토카인의 하나 이상의 특정 바이오마커가 사용될 수 있다. HERV-W ENV의 발현을 검출하기 위해 본 출원에서 개시된 것과 같은 항-HERV-W ENV 항체가 사용될 수 있다. HERV-W ENV는 생물학적 샘플, 특히 혈액 샘플과 같은 체액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 검출된다.
상기 단계 1이 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인을 나타내는 경우 및/또는 상기 단계 2가 HERV-W ENV의 검출을 나타내는 경우, 본 발명의 방법은 상기 환자에게 본 개시내용에서 설명한 바와 같은 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는 단계 1이 먼저 수행된다는 점에 유의해야 한다. 본 구현예에서, 단계 1이 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 나타내는 경우, 단계 2는 선택적일 수 있다.
"사이토카인의 높은 수준"을 결정하기 위해, 상기 주어진 "사이토카인의 높은 수준"의 정의가 여기에도 적용된다.
이후 환자와 관련된 사이토카인(들)의 특정 바이오마커 또는 본 출원에서 개시된 바와 같은 항-HERV-W ENV 항체를 사용하여 후속 조치를 확립할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 정신분열증으로 진단된 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함한다:
1) IL-6 수준의 정량화, 및/또는
2) HERV-W ENV의 발현 검출.
상기 단계 1이 높은 수준의 IL-6을 나타내는 경우 및/또는 상기 단계 2가 HERV-W ENV의 검출을 나타내는 경우, 본 발명의 방법은 상기 환자에게 본 발명의 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 양극성 장애로 진단된 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함한다:
1) IL-1β 수준의 정량화, 및/또는
2) HERV-W ENV의 발현 검출;
3) 선택적으로, TNF-α 수준의 정량화.
상기 단계 1이 높은 수준의 IL-1β를 나타내는 경우 및/또는 상기 단계 2가 HERV-W ENV의 검출을 나타내는 경우, 및 선택적으로 단계 3이 높은 수준의 TNF-α를 나타내는 경우, 본 발명의 방법은 상기 환자에게 본 발명의 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 갖는 정신 질환으로 진단된 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 사이토카인 수준의 정량화, 및/또는
2) HERV-W ENV 단백질의 검출.
특히 상기 사이토카인은 전-염증성 사이토카인, 보다 구체적으로 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α이다. 특히, 상기 사이토카인의 수준은 혈액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 정량화된다. 사이토카인의 수준을 정량화하기 위해, 상기 사이토카인의 하나 이상의 특정 바이오마커가 사용될 수 있다. HERV-W ENV의 발현을 검출하기 위해, 본 출원에서 개시된 것과 같은 항-HERV-W ENV 항체가 사용될 수 있다. HERV-W ENV는 생물학적 샘플, 특히 혈액 샘플과 같은 체액 샘플, 보다 구체적으로 혈청 또는 혈장에서 검출된다. 예를 들어, 정신 질환이 정신분열증인 경우, 상기 사이토카인은 IL-6인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 정신 질환이 양극성 장애인 경우, 상기 사이토카인은 IL-1β인 것이 바람직하며, 추가로 선택적으로 TNF-α인 것이 바람직하다.
환자에서 사이토카인 수준의 감소 및/또는 HERV-W ENV 단백질의 감소는 치료 효과에 대한 지표이다. 또한, 환자의 행동 연구 및/또는 임상 평가 척도를 수행하여 환자의 일반적인 상태의 개선을 분석하고 따라서 치료의 효과를 확인하고/하거나 환자에게 투여량을 조절할 수 있다.
일반적으로, 본 출원에서, 검출 및/또는 정량화 단계는 당업자에게 잘 알려진 일상적인 기술에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 단계는 환자의 체액 샘플과 같은 생물학적 샘플을 프로브, 프라이머, 리간드 또는 항체와 같은 선별 시약(selective reagent)과 접촉시켜 샘플에서 원래 관심 있는 핵산 또는 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
항-HERV-W ENV 항체
본 발명은 또한 HERV-W ENV에 대해 지시되고 뉴런에서 NMDAR 의 재배치, 특히 GluN2B 서브유닛을 포함하는 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항체에 관한 것이다.
뉴런의 NMDA 수용체(NMDAR라고도 함)에는 두 가지 주요 하위 유형이 있다. GluN2A-함유 NMDA 수용체(GluN2A-NMDAR)로 불리는 GluN2A 서브유닛을 포함하는 NMDAR 및 GluN2B-함유 NMDA 수용체(GluN2B-NMDAR)로 불리는 GluN2B 서브유닛을 포함하는 NMDAR이 있다.
본 발명은 또한 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
용어 "구조적(conformational)"은 용어 "선형(linear)"과 반대된다. 본 발명에서, 이는 에피토프가 단백질의 1차 아미노산 서열을 덮는 중첩 펩타이드를 갖는 고전적인 에피토프 매핑 프로토콜에서 동일한 단일클론 항체에 의해 유의하게 검출되는 2 개의 분리되고 원거리의 선형 아미노산 서열로 보여진다는 것을 의미한다. 구조적 에피토프는 단백질이 이러한 2 개의 원거리 아미노산 서열을 인접한 것으로 나타내는 특정 3차원 형태로 접힐 때 형성되며, 따라서 결합 서열로 구성된 단일 고유 에피토프로 표적화된다.
바람직하게는, 상기 항-HERV-W ENV 항체는 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2 개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합한다.
아미노산 서열에 의해 정의된 특정 에피토프에 결합하는 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(29).
본 발명은 또한 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 각각의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 각각의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하고, 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 각각의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 HERV-W ENV의 구조적 에피토프에 결합하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 각각의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
- 경쇄 가변 영역(VL)이 CDR-L1에 대해 서열번호 1, CDR-L2에 대해 서열번호 2 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 경쇄; 및
- 중쇄 가변 영역(VH)이 CDR-H1에 대해 서열번호 4, CDR-H2에 대해 서열번호 5 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 중쇄.
상기 언급된 상보성 결정 영역(CDR)은 표 2에 개시되어 있다:
본 발명에 따른 항체의 CDR 영역
영역 서열번호 서열
CDR-L1 1 KSLLHSKGITY
CDR-L2 2 QMS
CDR-L3 3 AQNLELPWT
CDR-H1 4 GYSFTSYW
CDR-H2 5 IYPGKSDTS
CDR-H3 6 TRTVYAMDY
일 구현예에서, 본 발명은 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, a 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된, 전술한 항체의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 단일클론 항체는 1가, 2가, 다가, 단일특이적 또는 이중특이적이다. 다른 구현예에서, HERV-W ENV에 대한 항체는 결합 단편 또는 접합체(conjugate)이다. 본 발명의 항체는 예를 들어 성장 억제제, 세포독성제 또는 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체의 다른 유형의 아미노산 변형은 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경하는데 유용할 수 있다. "변경(altering)"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 삭제하고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 일반적으로 N-결합형이다. "N-결합(n-linked)"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에 이러한 트라이펩타이드 서열 중 하나가 존재하면 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어지며, 이는 하나 이상의 상기 기재된 트라이펩타이드 서열(N-결합 글리코실화 부위의 경우)을 함유하도록 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 항-HERV-W ENV 항체는 단일클론 항체, 키메라 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체이다.
바람직하게는, 상기 항-HERV-W ENV 항체는 IgG, 특히 IgG1 또는 IgG4이며, 바람직하게는 IgG4이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간화 단일클론 항체이고, 보다 바람직하게는 인간화 IgG4 단일클론 항체 또는 인간화 IgG1 단일클론 항체이다.
상기 인간화 항체는 CDR 영역을 암호화하는 핵산 서열을 인간 항체와 동일한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 유전자; 및 인간 항체와 동일한 경쇄 불변 영역을 암호화하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하고, 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 발현시켜 수득함으로써 생산될 수 있다. 상기 인간화 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 암호화하는 유전자와 항체 경쇄를 암호화하는 유전자가 별도의 벡터에 존재하는 형태 또는 두 유전자가 동일한 벡터에 존재하는 형태(탠덤형, tandem type)일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 제작 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성, 동물 세포 내 항체 H와 L 사슬의 발현 수준 간의 균형 등의 측면에서, 인간화 항체 발현 벡터의 탠덤형이 더 바람직하다. 상기 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예로는 pKANTEX93, pEE18 등이 포함된다. 종래의 재조합 DNA 및 유전자 형질주입 기술에 기초한 인간화 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체는 예를 들어, CDR-이식(CDR-grafting), 피복(veneering), 또는 재표면화(resurfacing), 및 체인 셔플링(chain shuffling)을 포함하여 당 업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 이러한 항체의 제조를 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 구현예는 다음을 포함하는 단일클론 인간화 항체에 관한 것이다:
- 경쇄 가변 영역(VL)이 CDR-L1에 대해 서열번호 1, CDR-L2에 대해 서열번호 2 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 경쇄; 및
- 중쇄 가변 영역(VH)이 CDR-H1에 대해 서열번호 4, CDR-H2에 대해 서열번호 5 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR 각각을 포함하는 중쇄.
본 발명은 또한 치료적 용도 또는 약제로서의 용도를 위한 전술된 항-HERV-W ENV 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 치료적 용도를 위한, HERV-W ENV에 대해 지시되고 뉴런에서 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 치료적 용도를 위한 HERV-W ENV에 대한 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2 개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 구조적 에피토프에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 치료적 용도를 위한 HERV-W ENV에 대한 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 각각을 포함한다.
이 세가지 구현예들은 서로 결합될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 HERV-W Env에 대한 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 약학적 조성물은 상기 항체의 유효량을 포함한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 정신 질환을 앓고 있고 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 갖는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 이러한 약학적 조성물에 관한 것이다.
전술한 바와 같은 본 발명의 임의의 치료제는 약학적으로 허용가능한 부형제 및 선택적으로 생분해성 고분자와 같은 서방형(sustained-release) 매트리스와 조합하여 치료 조성물을 형성할 수 있다.
"약학적으로 (pharmaceutically)" 또는 "약학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)"은 포유동물, 특히 인간에게, 적절하게 투여될 경우 부작용, 알러지 또는 기타 예상치 못한 이상 반응(untoward reaction)을 일으키지 않는 분자체(molecular entities) 및 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 모든 유형의 제제 보조제(formulation auxiliary)를 의미한다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 투여 방법은 치료 대상의 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중, 성별 등에 따라 자연스럽게 달라진다.
본 발명의 약학적 조성물들은 국소, 경구, 비강내, 안구내, 정맥내, 척수강내(직접 뇌척수액 내), 근육내 또는 피하 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 주사 가능한 제제를 위한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 식염수 (모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 염화 마그네슘 등 또는 이들 염의 혼합물)에 있거나, 또는 건조된, 특히 동결건조된 조성물일 수 있으며, 이는 경우에 따라, 멸균수나 생리 식염수를 추가하면 주사 가능한 용액의 구성이 가능하다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수로서 적용될 수 있으며, 특히, 사용되는 투여 방식, 관련 병리 또는 대안적으로 원하는 치료 기간의 함수로 조정될 수 있다.
약학적 조성물을 제조하기 위해, HERV-W Env에 대한 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체의 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩 기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 제형은 무균 상태여야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하며 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기(free base) 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제를 적절히 혼합한 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤과 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위한 보존료를 포함한다.
제제화 시, 용액은 투여 제형(dosage formulation)과 호환되는 방식으로 투여되며, 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 상기 제제는 전술한 주사 가능한 용액 종류와 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 HERV-W ENV에 대한 항체는 가용화되고 보관된 완충액에서 제형화될 수 있으며, 환자에게 주입된다. 바람직하게는, 상기 완충액은 20mM 히스티딘, 5% 수크로스 및 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함한다.
수용액에서 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 상기 용액은 적절히 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장성으로 만든다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 하나의 투여 용량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주사액(hypodermoclysis fluid)에 첨가하거나 또는 주입(infusion) 예정 부위에 주입할 수 있다 (예를 들어: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참고). 치료받는 환자의 상태에 따라 필요한 경우 투여 용량에 약간의 변화가 발생할 수 있다. 투여 담당자는 어떠한 경우에도 개별 환자에게 적절한 용량을 결정한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 정맥내 또는 척수강내 주입에 의해 투여되도록 제형화된다.
실시예 1 내지 3에 대한 재료 및 방법
연구 설계
본 발명자들은 HERV-W 유래 엔벨로프-단백질(ENV)이 알려진 글루탐산, 즉 NMDAR 발달 신경정신 장애의 교란에 역할을 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 이 연구를 설계했다. 먼저 수용체의 이온성 기능(NMDAR 길항제는 정신병 유사 효과와 관련됨)이 ENV 노출 후 손상되지 않았으며, 대신 NMDAR-GluN2B 하위 유형의 표면 확산이 ENV에 민감하다는 것을 보였다. 재조합 ENV 완충액을 대조군으로 사용하였고, 또한 특정 ENV-항체를 사용한 열 불활성화 및 중화는 HERV-W ENV의 관여를 입증했다. 단일 입자 추적 실험을 시작할 때 샘플 크기는 한편으로는 실험실의 이전 연구를 참조하여 결정되었고 다른 한편으로는 0.6-0.8의 역률(power factor)과 0.5의 α로 계산되었으며(Power & Sample Size Calculator, Statistical Solutions, LLC), 본 조건에서는 샘플의 SD에 따라 조건당 4-13개의 셀로 변환되었다. 모든 유형의 실험에 대해 조건당 최소 3개의 독립 배양물이 사용되었다. 배양물은 무작위로 선택되었고 실험 조건은 라이브 이미징 실험 전반에 걸쳐 교대되었으며, 실험자는 특정하지 않은 궤적을 제거하는 동안 조건을 보지 못했고, 다른 모든 분석은 완전히 자동화된 기반에서 수행되었다. 면역세포화학은 중요한 시냅스 GluN2A/2B NMDAR-서브유닛 균형의 발현이 영향을 받는다는 것을 보였다. 면역조직화학/면역세포화학과 관련 모든 분석은 블라인드로 수행되었다. 우리는 프로피듐 아이오다이드(Propidium Iodide)를 첨가하고 ENV 노출 후 건강한 세포를 시각화함으로써 뉴런 네트워크에서 ENV에 의해 독성이 유도되지 않는다는 것을 통제했다. 다음으로 NMDAR-의존적 장기간 시냅스 강화(LTP)뿐만 아니라 ENV 처리 배양물에서 칼슘 빈도와 cLTP 유도의 절제에 대한 전체적인 NMDAR-매개 활성을 측정하였다. 화학적 LTP 실험에서 기준선 동안 단일 시냅스에서 GluA1SEP 강도의 10%를 초과하는 변이는 불안정한 것으로 간주되어, 이 수상돌기 가시(spine)는 제외되었으며, 칼슘 이미징의 경우 D-APV 적용 후 2개 이상의 칼슘 버스트가 있는 수상돌기 가시는 비 NMDAR로 간주되어 제외되었다. 그런 다음 HERV-W ENV를 포함하는 플라스미드로 신경 배양물을 형질주입하고 유사한 결과를 관찰했다. 빈 벡터를 가진 플라스미드가 대조군으로 사용되었다. 그런 다음 특정 ENV 발현이 동물의 행동에 영향을 미칠 수 있는지를 물었다. 이를 위해, 생후 0일부터 새끼 쥐의 해마에서 ENV를 발현하고 일련의 행동 연구에 미치는 영향을 연구했다. TUNEL 염색 세포와 동물의 체중 증가를 평가하여 세포 독성을 통제했으며, 면역조직화학과 웨스턴 블롯 분석을 통해 ENV 발현의 존재와 정도를 확인했다. GFP의 발현과 추가적으로 빈 벡터의 발현을 대조군 동물에서 사용하였다. 행동 연구를 위해 12마리 동물의 미리 결정된 최소 샘플 크기는 이전 연구를 기반으로 했다. PPI에서 13-18마리의 동물의 샘플 크기를 사용했는데, 이는 0.6-0.75의 역률 및 0.5의 α에 해당했고, x-link 및 MK-801 실험에서 11마리의 동물의 샘플 크기를 사용했으며, 각각 0.55의 역률 및 <0.8이다. 동일한 배에서 나온 새끼 쥐를 무작위 방식으로 다른 실험 그룹에 할당하고 각 행동 실험일에 그룹들은 의사 무작위로 지정되었다. 미리 결정된 바와 같이, 선행자극(prepulse)에 반응한 PPI의 강화 및 MK-801 챌린지 테스트에서 고정관념적 행동이 배제 기준으로 사용되었다. 동물 연구 동안 실험자는 완전한 데이터 세트를 수집한 후 실험이 끝날 때 완전히 자동화된 기반으로 모든 분석이 수행되었기 때문에 동물의 상태를 확인하였다. 여러 행동 실험에서 결함을 관찰한 후 시험관 내 데이터를 이러한 관찰의 가능한 근본 원인과 연관시키기 위해 동물의 해마 NMDAR 발현을 조사했다. 단백질 발현 연구는 조건별로 9마리를 대상으로 수행되었으며 2-3회 반복되었다. 발달 중에 ENV를 특이적으로 중화함으로써 행동 반응의 명확한 개선을 관찰했다. 데이터는 해마에서 HERV-W ENV 발현이 행동 결함을 유도하고 발달 중 시냅스 NMDAR 성숙을 조절한다는 것을 보여주었다.
신경정신 장애 환자 7명의 혈청 내 ENV 발현을 ELISA로 검출하였다. 알려진 뇌 질환이 없는 6명의 개인의 혈청 샘플을 대조군으로 사용했으며 샘플 크기는 샘플의 가용성을 기반으로 했다. 파일럿 실험에서, 본 발명자들은 혈청 샘플로 주요 신경전달물질 수용체(AMPA, NMDA, 도파민 및 GABA)를 포함하는 플라스미드로 형질주입된 신경 네트워크를 자극했고 혈청을 포함하는 ENV가 NMDAR 변경을 특이적으로 유도함을 관찰했다.
ELISA multiplex
사이토카인 수준은 Milliplex Map Kit(RECYTMAG-65K, Millipore)를 사용하여 검사되었다. 비히클(대조군) 또는 ENV(10μg/ml) 적용 5분 후에 수집된 3가지 다른 배양물의 배양 배지를 제조업체의 권장 사항에 따라 처리하고 평균 형광 강도를 BioplexTM MAGPIX 리더 (BioRad, Hercules, USA)에서 Luminex xPONENT 소프트웨어를 사용하여 얻었다. 데이터는 각 실험 내에서 통제하기 위해 정규화 되었다.
엔벨로프 단백질.
재조합 ENV (548aa의 전장 MSRV 엔벨로프 단백질; ENV pV14; GenBank accession no. AF331500)는 (GeNeuro Geneva, Switzerland)의 품질 관리 사양에 따른 PX'Therapeutics (Grenoble, France)에서 생산되었다. 내독소 제거는 Mustang Q Acrodisc를 통해 배치를 연마한 후 0.22μm 필터 Stericup (Merck, Darmstadt, Germany)에서 여과하여 수행했다. 사용된 ENV 배치에 대한 내독소 수준은 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 테스트로 측정했을 때 13.6-92.3 EU/ml 사이였다. 내독소가 본 결과에 미치는 영향은 100℃에서 30분간 열 불활성화 후 관찰에 의해 배제되었다.
수용체 표면 확산 실험.
뉴런은 7 div (days in vitro)에 시냅스 후 마커 Homer 1c-DsRed로 형질주입 되었다. NMDAR의 고해상도 단일 분자 추적은 11-14 div에 GluN2A 또는 GluN2B 서브유닛 (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, 표 S3)의 세포외 에피토프에 대한 항체와 함께 37℃에서 10분간 인큐베이션 후 달성되었다. 1% BSA (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)가 있는 배지에서 양자점 (QDs) 655 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)로 10분간 인큐베이션한 후, 선택된 관심 영역 (regions of interest, ROI) (Homer-1c발현 뉴런이 있는 경우)을 EMCCD 카메라 (Evolve, Photometric, Tuscon, USA)를 사용하여 Nikon eclipse Ti epifluorescent 현미경에서 50ms의 수집 시간(acquisition time)으로 500개의 연속 프레임에 대해 이미지화했다. 수집은 MetaMorph 소프트웨어 (v.7.7.11.0, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 이루어졌다. 순간 확산 계수(D)는 MSD(t) = < r2 > (t) = 4Dt를 사용하여 평균 제곱 변위(MSD) 대 시간 함수의 처음 4개 지점의 선형 맞춤(linear fit)으로부터 각 궤적에 대해 계산되었다. 단일 QD 복합체의 분포를 결정하기 위해, 프레임 스택을 얻었고 시냅스 신호의 이진화 후 복합체가 자동으로 시냅스(주변 2픽셀을 포함하는 Homer-1c 양성 영역) 및 시냅스 외부 구획에 위치했다. 총량과 관련하여 스택당 시냅스 위치의 백분율을 계산하고 두 개의 가장 높은 델타(전-후)를 각 그룹의 특이값(outlier)으로 제외했다. 데이터는 단일 배경 이미지에 투영되어 수용체/QD 복합체 및 그 궤적의 고해상도 분포를 제공한다. 모든 단일 입자 분석은 MetaMorph 소프트웨어 (Molecular Devices)의 Palmtracer v1.0 플러그인을 사용하여 완료되었다. 수용체 표면 확산에 대한 각각의 비히클(대조군)과 비교한 ENV (GeNeuro) 또는 LPS (Sigma-Aldrich)의 효과는 두 가지 접근법을 사용하여 다뤘다: i) 초기 기준선(baseline) 수집 후 이미징 챔버에서 5분간 수조(bath)에 적용 후 또는, ii) 접시의 배양 배지에 단백질 적용 후 24시간. 재조합 IL-1β (R&D Systems, Minnesota, USA)는 5분간 적용 후에만 평가되었다. TLR-4 관여는 QD 실험의 시작 전 37℃에서 Ab (20μg/ml, Affymetrix, Wien, Austria)를 중화하는 항TLR-4로 30분간 사전 인큐베이션을 통해 수용체를 차단하여 연구하였다. TLR-4 중화 항체의 특이성은 Iba-1 양성 미세아교세포에 염색된 주요 TLR4와 shTLR-4 형질주입 후 염색 감소에 의해 확인되었다 (Dr. Kurydp 의해 제공된 플라스미드, 도. S2B). ENV 결과의 특이성을 확인하기 위해 한편으로는, 단백질의 열 불활성화(상기 참고)를 수행하였고, 다른 한편으로는 재조합 ENV 단백질과 ENV-중화 항체인 GN_ENV_01/03 (Geneuro)을 정상 말 혈청에서 분자량비 1:2로 유리관에서 사전 인큐베이션(45 분간, R.T.에서)을 수행한 후에 적용하였다. 시냅스 후 반응의 분리를 위해 테트라도톡신 (1μM, TTX, Tocris, Bristol, UK)을 기록 전에 챔버에 적용하였고, 사이토카인 차단 실험을 위해 IL-1ra (250ng/ml, R&D Systems) 또는 중화 항체 IL-6 및 TNF-α (1μg/ml, R&D Systems)를 기록 세션 전에 챔버에 적용하였다. Src-계열 키네이스의 관여는 1μM PP2 (Calbiochem, Merck)로 15분간 인큐베이션 후 평가되었다
세포 배양 및 형질주입
해마 뉴런과 신경아교세포(glia cell)의 혼합 배양물은 E18 Sprague-Dawley 쥐로부터 준비되었다. 간단히 말해서, 세포는 폴리-리신 코팅 커버슬립에 접시당 300-350x100 세포의 밀도로 플레이팅되었고, 약 4 div (days in vitro) 동안 3% 말 혈청이 함유된 Gibco neurobasal 배지 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)에서 유지되었으며, 상기 배지는 무혈청 neurobasal 배지로 교체되었다. 뱅커(Banker) 유형의 "아교 세포가 없는(glia free)" 해마 배양물은 두 단계로 제조되었다. 간략하게, 첫 번째 신경아교 영양세포 배양물을 해마의 폴리-리신 코팅된 접시에서 제조한 후, 2주 후에 해마 뉴런 (신경아교세포와 동일한 유형의 제조물에서 유래)을 아교세포 층 위에 매달린 폴리-리신 코팅된 커버슬립에서 배양했다. 세포는 최대 22 div 동안 5% CO2에서 37℃로 유지되었다. 인간 배아 신장 세포(HEK) 293을 10% 소 태아 혈청이 포함된 Dulbecco 변형 이글 배지 (Thermo Fisher Scientific)의 유리 커버슬립에 도말하고 하루 후에 사용했다.
제조업체의 권장 사항에 따라 Effectene (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하거나 인산 칼슘 형질주입에 의해 세포를 형질주입 시켰다. HERV-W ENV 단백질을 암호화하는 플라스미드는 형질주입된 인간 세포에서 발현을 가능하게 하는 phCMV 벡터에 삽입된 참조 MSRV-env 유전자로 구성되었다: 스위스 GeNeuro의 phCMV-MSRV env. 삽입된 env 합성 핵산 서열은 데이터베이스 (Genbank Ref. AF 331500)에 설명된 바와 같이 HERV-W 엔벨로프 단백질을 암호화한다.
HERV-W ENV 단백질
재조합 ENV (548aa의 전장 MSRV 엔벨로프 단백질; ENV pV14, GenBank accession no. AF331500)는 GeNeuro (Geneva, Switzerland)의 품질 관리 사양에 따라 PX'Therapeutics(Grenoble, France)에서 생산되었다. 내독소 제거는 Mustang Q Acrodisc를 통해 배치를 연마한 후 0.22μm 필터 Stericup (Merck, Darmstadt, Germany)에서 여과하여 수행했다. 사용된 ENV 배치에 대한 내독소 수준은 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 테스트로 측정했을 때 13.6-92.3EU/ml 사이였다. 내독소가 본 결과에 미치는 영향은 전술한 바와 같이 100℃에서 30분간 열 불활성화 후 관찰에 의해 배제되었다(18).
면역세포화학 (Immunocytochemistry)
인간 혈청 인큐베이션 전에, 뉴런(10 div)을 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 수용체 (AMPA)-A1를 포함하고; N-메틸-D-아스파르트산 수용체 (NMDA)-N1를 포함하고; 감마-아미노부티르산 (GABA)-γ2를 포함하고 SEP(Super Ecliptic pHluorin)에 융합된 서브유닛을 포함하거나, 도파민(D)-1을 포함하고 시안 형광 단백질(CFP)에 융합된 서브유닛으로 형질주입 시켰다. 혈청 샘플을 천천히 해동하고 인큐베이션한 후 ENV-양성 또는 ENV-음성 혈청 샘플을 20%, 37℃에서 15분 동안, 표면 수용체의 생 면역염색을 4℃에서 10분 동안 항-GFP 항체로 수행했다 (혈청 샘플에서 보체 인자의 열 불활성화가 고려되었지만 ENV-단백질의 알려진 열 민감성으로 인해 적용되지 않았다). 생 염색 후 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 15분간 고정했다. 일반적으로, 고정 후 50mM NH4Cl에서 담금질하고, 차단하고 실온(R.T.)에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)에서 1시간 동안 Alexa 형광단에 결합된 2차 Ab로 인큐베이션했다. 고정된 세포 및 조직의 염색을 위해 1% BSA(Sigma-Aldrich) 및 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)에서 30분 동안 초기 차단 및 투과화 단계 후에 4℃에서 1차 항체로 밤새 인큐베이션을 수행했다. 세포를 Mowiol (Calbiochem(Merck)) 또는 Vectashield® + DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 고정했다. 세포질 강화 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 MSRV-ENV로 형질주입된 HEK-세포에서 ENV의 표면 또는 세포내 염색을 항-ENV 항체((GN-mAb 01; GeNeuro Switzerland),)로 48시간 후에 얻었다. 미세아교세포 활성화 연구를 위해, 세포를 고정하고 LPS(혈청형 O26:B6, Sigma-Aldrich)(1μg/ml), ENV(PX'Therapeutics)(1μg/ml) 또는 비히클(대조군) 적용 5분 후 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1(Iba1)에 대해 염색했다. 이미지는 CoolSNAP HQ2 카메라(Photometrics, Tucson, USA) 또는 Nanozoomer(Hamamatsu, Japan)가 있는 비디오 공초점 회전-디스크 시스템(Leica DMI6000B, Wetzlar, Germany)에서 수집되었다. 클러스터 영역은 ImageJ의 통합 형광 수준을 기반으로 하는 고정 임계값 접근법을 사용하여 얻었다. 전체 커버슬립에 존재하는 모든 미세아교세포로부터 미세아교세포 둘레(μm) 및 면적(μm2)을 얻었고 이전 간행물(27)을 기반으로 변환 지수(TI) ((세포 둘레) 2/4pi(세포 면적))를 계산했다.
칼슘 이미징.
10 div에서 GCaMP3 또는 GCaMP6로 형질도입된 뉴런을 110 NaCl, 5 KCl, 25 HEPES, 15 D-글루코스, 2 CaCl2 및 2 MgCl2를 함유하는 티로드 용액(Tyrode's solution)(mM 단위)으로 옮겼다. NMDAR 의존성 과도상태(transient)의 분리를 위해 이미징 15분 전에 뉴런을 5μM 니페디핀(Tocris) 및 5μM 비쿠쿨린(Tocris)이 포함된 Mg²+가 없는 티로드로 옮겼다. 타임-랩스 이미지는 EMCCD 카메라(Evolve, Photometric)가 장착된 Nikon eclipse Ti epifluorescent 현미경에서 20Hz에서 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices)로 획득했다. 즉각적인 효과를 평가하기 위해 트리 타임랩스 영상 (3000프레임)을 연속적으로 기록했다: Pre(기준선), Post(PBS(Blank), 비히클(대조군) 또는 ENV의 수조 적용 5분 후, 및 APV(50μM D-(-)-2-아미노-5-포스포노펜탄산 (APV, Tocris) 수조 적용). 장기간의 효과를 위해 2개의 타임 랩스 영상이 기록되었다. 첫 번째로, 비히클(대조군), ENV(1μg/ml), 비히클 + IL-ra(250ng/ml) 또는 ENV + IL-ra 첨가제 후 24시간, 또는 ENV-유전자 또는 빈 벡터로 형질주입 후 4일이며, 두 번째는 APV 수조 적용 후 5분이다. PoorMan3DReg 플러그인(Michael Liebling)을 사용하여 ImageJ(NIH)에서 타임랩스 영상을 연결하고 재정렬했다. 칼슘 과도상태 vs 시간의 형광은 실험자(ImageJ, NIH)가 수동으로 정의한 개별 ROI(수상돌기 가시) 내에서 측정되었다. 각 ROI 내의 모든 픽셀은 ROI와 관련된 단일 시간 코스를 제공하기 위해 평균화되었다. 평균 정규화 형광(ΔF/F)은 P50(μ)보다 낮은 이전 5s 값의 평균에서 각 값을 빼고 결과를 μ로 나누어 계산했다. 2단계의 절차에 따라 양성 칼슘 과도상태가 식별되었다: 초기에 원시 신호를 10s 제곱 커널(10s squared kernel)로 컨볼루션(convolution)하여 ΔF/F 추적을 부드럽게 했다. 맞춤 작성 Matlab 루틴을 사용하여, 임계값이 APV 평균 트레이스의 5*SD로 설정된 자동화 기반에서 진정한 양성 NMDA 과도상태(과도상태 사이에 최소 1초 포함)이 정의되었다. 0.5초의 타임 창을 사용하여 동일한 뉴런의 수상돌기 가시 간 과도상태의 쌍별 교차-상관을 계산했다. 개별 수상돌기 가시에 대한 과도 시간을 셔플링하여 얻은 평균 상관을 빼서 상관 값을 수정했다 (100회 반복).
화학적으로 유도된 강화 (cLTP).
GluA1-SEP 및 Homer 1c-DsRed로 10 div에서 공동-형질주입된 살아있는 해마 뉴런을 37℃에서 ENV(1μl/ml)와 함께 또는 추가 없이(대조군) 밤새 인큐베이션(12 div)했다. 화학적으로 유도된 장기 강화(Chemically induced long-term potentiation, cLTP)는 전술한 바와 같이 4분 동안 200μM 글리신(Tocris) 및 5μM 피크로톡신(Tocris)의 수조 공동-적용에 의해 유발되었다(24). cLTP는 기준선 수집 기간(2 x 5분) 후에 항상 적용되었으며 배지는 유도 후 새로운 평형 및 가열 배지로 조심스럽게 교체되었다. GluA1-SEP 형광 신호는 이후 30분 동안 5분마다 기록되었다. 시냅스 Homer 1c 신호와 GluA1-SEP 강도 (ImageJ, NIH)를 사용하여 시냅스의 윤곽을 잡았고, 이러한 시냅스 영역 내에서 시간이 지남에 따라 시냅스가 안정적인 기준선(-10과 -5분 사이의 10% 미만 변동)을 나타내는 경우 전적으로 기준선으로 정규화하였다. 모든 이미지는 CoolSNAP HQ2 카메라 (Photometrics, Tucson, USA)가 장착된 비디오 공초점 회전 디스크 시스템(Leica, DMI6000B, Wetzlar, Germany)에서 수집되었다.
동물.
임신한 쥐(Sprague Dawley)는 Janvier(프랑스)에서 구입했고 P 0-1에서 같은 배에서 나온 수컷 새끼를 무작위 방식으로 다른 그룹(대조군, 대조군+ 또는 ENV)에 할당했다. 쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 일정한 주변 온도(21±1℃)에서 유지되었다. 사용되는 동물의 수와 이들의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 동물 절차는 동물 연구를 규제하는 유럽 공동체 지침(Directive 2010/63/EU)에 따라 수행되었으며, 로컬 보르도 윤리 위원회(APAFIS#3420-2015112610591204)의 승인을 받았다. 출생 후 전기천공(electroporation)은 전술한 바와 같이 P0-1 사이의 신생아 새끼에서 수행되었다. 간략하게, 새끼를 저체온으로 마취시키고 빈 벡터(대조군+ -군) 또는 phCMV-MSRV ENV (클론 pV14, AF 331500) (ENV-그룹)와 함께 형질주입된 세포(대조군)를 식별하기 위해 세포질 EGFP를 암호화하는 디옥시리보스 핵산(DNA) 구조물을 주입했다. 8 μl의 PBS와 0.1 μl의 Fast Green에 약 2 μg의 DNA를 측뇌실(lateral ventricles)에 주입한 후, 즉시 자극 발생기(BTX, Harvard 장치, ECM830, San Diego, CA)를 통해 전달된 5개의 전기 자극(150V, 50-ms 지속시간, 자극 간 1-s 간격)로 전기천공을 수행하였다. 새끼들은 37℃의 열담요 위에서 다시 살아났고 재빨리 어미 품으로 돌아갔다.
행동 반응 (Behavioral responses).
실험은 일생 동안 동물을 취급한 실험자와 동일한 실험자에 의해 명 주기 (14.00-20.00) 동안 수행되었다. 그들의 체중은 매주 모니터링되었고 P 21에서 새끼는 젖을 뗐고 같은 배에서 나온 2-5마리의 쥐를 같은 처리/케이지에 수용했다. 5개의 다른 연구 그룹이 사용되었다: i) 첫 번째 그룹, 대조군(n = 13), ENV(n = 13)의 동물은 다음 순서로 일련의 행동 테스트를 받았다: (1) P35-37에서, 운동 활성(locomotor activity) 및 불안, (2) 오픈 필드에 대한 습관화/적응 및 (3) P56-58에서 PPI(prepulse inhibitor test) 및 2일 후 (4) 사회적 인식 및 상호 작용. ii) 두 번째 연구 그룹, 대조군(n = 30), ENV(n = 30)의 동물은 PPI 전에 클로자핀/비히클 치료에 노출되거나 PPI 다음날 MK-801 챌린지에 노출되었다. iii) 세 번째 연구 그룹, 대조군(n = 11), 대조군+(n = 14)은 PPI로 테스트되었고, iv) 네 번째 연구 그룹, ENV(n = 22)는 PPI 전날 교차결합 프로토콜(정위(stereotaxic) 주입에 대해서는 아래 참조)을 받았다. v) 마지막 그룹, 대조군(n=13), ENV(n=24)의 동물은 출생 후 초기에 ENV 중화-Ab로 처리되었다. 모든 동물은 처음 테스트를 받았을 때 장치에 익숙하지 않았고(naive) 발병 전 최소 1시간 동안 방에 적응했다. 그룹은 각 행동 테스트 날에 의사-무작위로 지정되었다. 오픈 필드 및 PPI 테스트 동안 실험자는 동물의 상태를 모르지 않았지만 행동 데이터 수집은 완전히 컴퓨터 제어 설정을 사용하여 편향되지 않은 방식으로 수행되었다. 대조적으로, 연구자는 사회적 인식 및 상호 작용 테스트에서 채점 분석 동안 치료에 대해 알지 못했다. 실험 레이아웃은 도 4C 참조.
오픈 필드 (Open field). 운동 활성은 약 5럭스의 조명 설정으로 오픈 필드 아레나 (길이 54cm x 너비 54cm x 높이 40cm)에서 측정되었다. 신규하게 유도된 운동(Novelty-induced locomotion)은 3일 연속 테스트 중 1일에 2x10분 동안 빈 아레나를 자유롭게 탐색할 수 있도록 허락된 쥐를 비디오 추적하여 평가했다. 1일차 기록에서, 불안은 처음 10분 동안 아레나의 50%를 포함하는 중앙 구역 내에서 보낸 시간으로 평가되었다. 그런 다음, 상황에 대한 습관화/적응은 2-3일째에 운동 활성의 감소로 평가되었다. MK-801 연구의 경우, 대조군(n = 13) 및 ENV(n = 12) 쥐에게 식염수를 복강내(i.p.) 주사하고 1시간 동안 아레나를 탐색하도록 내버려 두었다. 그런 다음, MK-801(0.5mg/kg, Tocris) 주사를 투여하고(i.p.) 동물을 추가로 2시간 동안 모니터링했다. 주사 후 정형적인 행동으로 인해 한 마리의 동물 배제되었다. 총 이동 거리는 IDtracker 소프트웨어(43)로 추출하고 자동화된 맞춤형 MATLAB 루틴으로 분석했다.
선행자극 억제(prepulse inhibition, PPI)
PPI는 Panlab startle chamber(Harvard, San Diego Instruments)를 사용하여 수행되었다. 각 PPI 세션은 약 31분 동안 지속되었으며 일정한 배경 잡음과 함께 5분의 적응 기간으로 시작되었다. 세션은 8개의 다른 시험 유형으로 구성되었다: 자극 없음, 74dB 배경 잡음(20ms, 간격 100ms) 위의 +4, +8 및 +12dB에서 트리 선행자극(tree prepulse)이 선행했거나 선행하지 않은 놀람 자극(startle pulse) (8kHz, 40ms에서 120데시벨(dB)) 및, 선행자극 단독. 각 세션은 10번의 놀람 자극(ITI 70초)로 시작하여 그 후 8번 시도 x 6의 균형 잡힌 의사 무작위 순서로 진행하여 10번의 놀람 자극의 최종 블록으로 종료되었다. 서로 다른 그룹의 기준선 데이터를 초기에 통합하여 3개의 선행자극에서 측정된 전체 PPI에 대한 Envgene 삽입의 효과가 유사하다는 것을 확인했다: 1) 양방향 ANOVA, 그룹 요인; F(1,72) = 11.23, **P = 0.0013, n = 13 및, 2) 양방향 ANOVA, 그룹 요인; F(1,102) = 9.597, **P = 0.0025, n = 18. 두 동물 그룹 모두에서 선행자극에 대해 반응하는 강화가 관찰되었으며, 이러한 동물은 최종 데이터 세트에서 제외되었다. 선행자극 억제는 % PPI로 표현되고 (100*((S-PP)/S)로 계산되었으며, 여기서 S = 놀람만을 시도한 실험에서의 평균 반응 및 PP = 선행자극 + 놀람 실험에서 평균 반응이다. 본 발명자들은 GFP 동물과 GFP + 빈 벡터 전기천공된 동물을 비교하여 DNA 부하가 행동 결과(연구 그룹 iii)에 사소한 것임을 확인했다 (도. S6C). 연구 그룹 ii) 클로자핀(Abcam, Cambridge, UK)(12 mg/kg)을 0.1 N HCl에 용해하고 NaOH로 pH 5.6으로 완충하고 단일 (i.p.) 주사(1 ml/kg, 클로자핀 또는 비히클)를 PPI 평가 20분 전에 대조군(n = 12) 및 ENV(n = 12) 동물에게 투여했다 (도. S6D). 비히클 처리는 PPI 반응에 영향을 미치지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 정위 주사는 PPI 검사 하루 전에 연구 그룹 iv)에서 수행되었다. 간략하게, ENV-그룹의 쥐(P55-57)를 이소플루란으로 마취시키고 정위 프레임에 넣었다. 0.1% 트립탄 블루(Sigma-Aldrich)(1:5)에 희석된 0.8mg(2μl)의 다클론 염소 항-토끼 IgG (Novex, Thermo Fisher)(ENV + Cont.IgG)(n = 13) 또는 항-토끼 GluN1 (Alomone Labs)(ENV+GluN1 교차결합)(n = 11)을 각 해마에 정위적으로 주입했다 (bregma에 대한 좌표, AP: -4.5mm, ML: ±3.2mm, DV: -2.0mm). 교차 연구 일관성을 기반으로, 모든 그룹에서 증가된 선행자극에 대한 증가된 반응과 선행자극 +8dB에서의 강한 반응, 이 선행자극에서 얻은 PPI 데이터가 우선적으로 표시된다. 전체 데이터 세트는 도. S6E에서 관찰될 수 있다. 연구 그룹의 ii-iv의 실험은 병렬로 실행되었다. 생후 초기 치료는 PN4, 8 및 12에서 ENV-중화 Ab(GN_mAb_ENV_03, 30mg/kg, GeNeuro)의 단일 i.p. 주입에 의해 수행되었고, 동물들은 ~P58에서 PPI 테스트가 있는 날까지 홈 케이지에 두었다.
사회적 인식 및 상호작용.
이 프로토콜은 (43)에서 조정되었다. 시험 전날, 서로 다른 배의 새끼에서 유사한 체중(±5%)을 갖는 3마리의 쥐(1마리의 연구 쥐(대조군 또는 ENV) 및 2마리의 표적 쥐(naive))가 함께 검사되도록 지정하였다. 그런 다음 표적 쥐는 1시간 동안 실험실의 실험 케이지(사육 케이지)에 길들여졌다. 실험 당일, 연구 쥐는 실험용 케이지에 1시간 동안 길들여졌다. 그 후, 아무런 훈련 없이 테스트를 시작하고 첫 번째 표적 쥐를 동일한 실험 케이지에 넣고(3x1분, ITI 3분) 사회적 인식을 기록했다. 이어서 마지막 상호작용 세션 동안 첫 번째 표적 쥐를 제거하고 두 번째 표적 쥐를 연구 쥐와 함께 실험 케이지에 넣어 사회적 상호작용을 10분 동안 기록했다. 마지막 세션에서, 대조군 연구 쥐는 처음 1분 동안 증가된 상호 작용을 보였는데, 이는 쥐가 익숙하지 않은 쥐 (두 번째 표적 쥐)에 다시 한 번 관심을 가졌다는 것을 의미한다. 그런 다음 사회적 상호작용을 측정하기 위해 전체 마지막 세션(10분)을 점수로 매겼다. 연구 쥐와 대상 쥐는 이 패러다임에서 한 번 이상 사용되지 않았다. 비디오는 연구 쥐가 사회적 상호작용 행동(냄새 맡기, 그루밍, 뒤따라가기, 기어가기)에 적극적으로 참여한 시간 동안 블라인드 방식으로 점수가 매겨졌다. 세션 중에 공격적인 행동은 관찰되지 않았다.
조직 준비
뇌는 PPI 후 2-14일 사이에 제거되었으며, 액체 질소에 넣어둔 이소펜탄(Sigma-Aldrich)에서 급속 냉동되거나, 해마 부위의 해부를 위해 얼음처럼 차가운 인공 뇌액(cerebral fluid)으로 옮겨진 다음 액체 질소에서 냉동되었다. 냉동된 해마 조직은 이후의 웨스턴 블롯을 위해 아래와 같이 처리되었다. 면역 조직 화학을 위해 20μm 두께의 관상 조직 단면(coronal tissue section)을 마이크로톰-크라이오스탯에서 절단하고, superfrost ultra plus (Thermo Scientific) 슬라이드에 해동-고정하고, 추가 처리가 있을 때까지 -20℃에서 저장했다. 연령 P7의 대조군(n=5) ENV(n=5) 및, P59-70 대조군(n=5) ENV(n=5)의 동물을 펜토바르비탈(50mg/kg)로 마취하고 0.1M 인산 완충액에 4% 파라포름알데히드를 경심관류(transcardially perfused)했다. 뇌를 제거하고 4℃에서 밤새 후고정 하였으며, VT1200S Leica 진동기로 50μm 두께의 슬라이스를 준비했다. 슬라이스는 PBS로 세 번 세척한 후 나중에 사용할 수 있도록 4℃에서 0.03%의 산-PBS에 남겨두었다.
면역조직화학/TUNEL 염색
관류된 조직을 BSA(Sigma-Aldrich) 및 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)에서 2시간 동안 R.T.에서 차단하고 투과시켰다. 샘플을 세척한 후 4℃에서 밤새 2% BSA(Sigma-Aldrich) 및 0.2% Triton X-100(Sigma-Aldrich)의 1차 Ab와 함께 인큐베이션 했다. Alexa 형광단에 결합된 2차 Ab를 1차 Ab와 동일한 용액에서 2시간 동안 R.T.에서 인큐베이션 했다. Mowiol(Calbiochem) 또는 Vectashield® + DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 단면을 고정했다. 모든 이미지는 CoolSNAP HQ2 카메라(Photometrics) 또는 Nanozoomer(Hamamatsu)가 있는 비디오 공초점 회전 디스크 시스템(Leica DMI6000B, 63X)에서 수집되었다.
DNA 단편화는 n situ Apoptosis Detection System Fluorescein (TUNEL, Promega, Madison, WI)을 사용하여 조직학적으로 조사되었다. 제조사의 권고에 따라 P7 전기천공의 냉동조직 단면을 염색하고 Mowiol(Calbiochem)로 고정했다.
웨스턴 블롯 분석
대조군에서 해부된 해마와 ENV 전기천공 쥐(~P70)는 시냅스(시냅토좀), 시냅스 원형질막 및 시냅스 소포만을 수집하기 위해 세포하 분획(도 6D)으로 처리되었다. 균질화 및 분획을 위해 프로테아제 및 인산염 억제제(ThermoFisher Scientific)가 등장성 수크로스에 첨가되었다. 각 샘플의 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 결정되었으며, 조건당 9마리 동물의 시냅토솜을 두 번의 별도 실험에서 검사했다. GFP 검출을 위해 전체 해마 균질체가 사용되었다. 본 발명자들은 WES 단백질 단순 장치(Protein Simple, Bio-techene, San Jose, USA) 및 WES-토탈 단백질 팩, 항 토끼 2차 항체, 항체 희석제, 분자량 래더, 스트렙타비딘-HRP, 디티오트레이톨(DTT), 형광 마스터 혼합물, 루미놀-S, 과산화물, 샘플 완충액 및 세척 완충액을 포함하는 PSD-95와 관련하여 GluN2B 검출을 위한 WES-표준 팩(12-230 kDa)을 사용했다. 이 키트는 또한 모세관 카트리지와 미리 채워진 마이크로플레이트를 제공한다. 각 샘플은 0.1μg로 로딩되었고 1차 항체인 토끼 항-GluN2B(Agrobio)와 항-PSD-95(Cell Signaling, Danvers, USA)의 특이성을 측정하였다. 추가 분석을 위해 두 표준 편차 범위 내의 값만 포함하였다. GFP는 전통적인 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. 간략하게, 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리된 각각의 레인마다 총 단백질 20μg을 로딩하여 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, Herculus, USA)으로 옮겼다. 막은 상온에서 5% 무지방 밀크 TBS/0.1% Tween 20(TBST)에서 1시간 동안 차단되었다. 1차 항체 마우스 항-GFP(Roche, Basel, Swiss)는 단백질 면역블롯 분석을 위해 TBST의 0.5% 밀크에 희석되었고, 교반하에 O.N. 4℃에서 인큐베이션 하였다. HRP-접합 항-마우스 IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, USA)와의 인큐베이션을 실온에서 2시간 동안 수행하였다. 특정 단백질 밴드는 ClarityTM Western ECL Substrate(Bio-Rad)로 밝혀졌으며 막은 Versadoc(Bio-Rad)을 사용하여 스캔되었다.
도면의 준비와 분석.
도면은 ImageJ(NIH) 및 Adobe Photoshop(Adobe Systems, San Jose, CA)에서 만들었으며 이미지 품질을 최적화하기 위해 대비와 밝기만 조정되었다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 6(GraphPad Software, San Diego, USA)에서 수행되었다. 간단히 말해서, 알파=0.5를 사용한 통계 분석이 수행되었다. 행동 연구의 경우 미리 결정된 샘플 크기는 문헌을 기반으로 한다. 여기에서 13-18마리 동물의 샘플 크기가 PPI에 사용되었으며, 이는 0.6-0.75의 역률 및 0.5의 α에 해당하고, 교차결합 및 MK-801 실험에서 11마리 동물의 샘플 크기가 사용되었고 역률은 각각 0.55 및 <0.8이다. 데이터가 D'Agostino & Pearson 옴니버스 정규성 테스트를 통과할 때 모수 통계 테스트(parametric statistical test)가 적용되었으며, 따라서 Welch 보정(Welch's correction)이 있거나 없는 양측 스튜던트 t-검정(two-tailed Student's t-test), 단측 또는 양측 대응 스튜던트 t-검정(one- or two-tailed paired Student's t-test) 또는 양방향 ANOVA(two-way ANOVA)가 수행되었고, 이어서 본페로니 다중 비교 테스트(Bonferroni's multiple comparisons test)가 수행되었다. 비가우스 분포(non-gaussian distribution)의 데이터를 사용한 그룹 간 비교는 비모수 테스트(양측 대응 Mann-Whitney 테스트 또는, 여러 그룹의 경우 Kruskal-Wallis 테스트에 이어서 Dunn 다중 비교 테스트)를 사용하여 수행되었다. 분포의 직접 비교를 위해, Kolmogorov-Smirnov 테스트가 사용되었다. 행동 검사의 경우 PPI 결과를 양방향 ANOVA에 의한 요인 그룹과 사전자극을 이용하여 분석한 후, 그룹과 사전자극 강도에 대한 Bonferroni 다중 비교 테스트를 수행하였다. 단방향 ANOVA에 이어 치료를 위한 Tukey 다중 비교 테스트가 교차 결합 및 중성화 Ab 프로토콜에 사용되었다. 요인 치료 및 시간을 고려한 RM 양방향 ANOVA와 이후에 Fisher LSD 사후분석(Fisher's LSD post-hoc analysis)을 이용하여 MK-801 반응을 분석하였고, 양방향 ANOVA를 이용하여 요인 치료 및 면적을 갖는 TUNEL 데이터를 분석하였다. 유의 수준은 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001로 정의되었다.
실시예 1: 정신 질환 환자의 혈청의 신경전달 물질 수용체에 대한 효과
첫 번째 실험에서, 본 발명자들은 정신 질환(정신분열증 및 양극성 장애)를 앓고 있는 환자 또는 대조군의 건강한 대상체로부터 혈청을 수집하여 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포를 포함하는 해마 신경 네트워크에서 주요 신경전달 물질 수용체의 함량에 미치는 영향을 테스트했다 (도. 1A-C). 글루탐산성 AMPA (GluA1 서브유닛) 및 NMDA (GluN1 서브유닛), 도파민성 D1, 및 억제성 GABAA (감마2 서브유닛) 수용체와 상관없이, 정신 질환 환자의 혈청은 특히 NMDA 수용체 (NMDAR) 클러스터를 감소시켰다 (도. 1D). 주목할 만한 것은, 이 환자들은 대조군 대상체와 비교했을 때 높은 수준의 전-염증성 사이토카인인 인터류킨-1베타(IL-1β)를 보였다는 것이다 (도. 1A 및 B). 정신 질환 환자의 인간 혈청을 사용했기 때문에, 다음 예에서 설명한 것처럼 인 비트로 및 인 비보 연구에서 입증된 특정 특성을 가진 이 NMDAR 변경은 검사된 혈청(항원혈증)에서 HERV-W ENV의 존재와 일치한다. 또한, 다음의 예에서 설명된 바와 같이, IL-1β를 포함하는 HERV-W ENV 병원성 및 신경 시냅스 NMDAR 기능의 특정 기능 장애에 대한 미세아교세포의 선천 면역 특성의 관련성과도 일치한다. 가장 중요한 것은, 정신분열증 또는 양극성 장애 진단을 받고 IL-1β를 포함한 혈청 내 전-염증성 사이토카인이 증가된 사례를 수집하는 환자의 하위 그룹으로 대표되는 새로운 병원내 개체의 발견과도 일치한다. 이 새롭게 생물학적으로 정의된 병리학적 개체에 포함된 환자들은 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단되었다.
실시예 2: HERV-W ENV는 시너지적인 신경병인성 효과로 미세아교세포로부터 특정 사이토카인 방출을 유발한다.
놀랍게도, 신경아교 세포가 없는 신경 세포 배양물 (성상세포 또는 미세아교세포가 없는)이 재조합 ENV에 노출되었을 때, GluN2B-NMDAR 시냅스 역학은 안정적으로 유지되었다(도. 2A 및 B). 신경 세포 배양물에서 미세아교세포의 존재 하에, 전-염증성 박테리아 지질다당류 분자인 LPS는 시냅스 GluN2B-NMDAR를 빠르게 분산시킬 수 있었다(도. 3A 및 B). 그러나, LPS 또는 ENV에 의해 활성화된 미세아교세포는 서로 다른 표현형을 나타냈으며(도. 3C-E), 이 두 단백질이 TLR4에 대한 공통된 친화성에도 불구하고 서로 다른 신호 전달 경로를 활성화하여 신경 세포에 대한 서로 다른 성질 및 메커니즘의 작용을 초래함을 입증하였다. ENV에 의해 유발된 신경아교 세포에 의해 방출된 신경아교 매개체(glial mediator)를 찾기 위해, 본 발명자들은 해마 네트워크를 재생하는 배양 배지에서 전-염증성 사이토카인, 특히 IL-1β의 높은 방출을 시험관 내에서 측정했다(도 2D). 이러한 사이토카인, 특히 IL-1β가 ENV에 의한 시냅스 NMDAR 불안정화에 직접적인 역할을 하는지 여부를 테스트하기 위해, 해마 네트워크를 다양한 사이토카인 차단제와 함께 ENV에 노출했다. 천연 IL-1 수용체(IL-1R) 길항제인 IL-1ra(250ng/ml)는 ENV-유도 GluN2B-NMDAR 시냅스 분산을 역전시켰다. IL-6(1μg/ml) 또는 TNF-α(1μg/ml) 차단은 효과를 부분적으로만 감소시켰고 완전한 차단을 생성하지 못했다(도. 2E). 또한, IL-1β 단독은 신경아교 세포가 없는 신경 세포 배양물에서 GluN2B-NMDAR 트래피킹(trafficking)을 증가시키기에 충분했다(도. 2G). 따라서, 이러한 데이터는 HERV-W ENV가 신경아교- 및 사이토카인-의존적 과정을 통해 시냅스 NMDAR를 빠르게 분산시킬 수 있다는 첫 번째 증거를 제공한다. 이는 이제 HERV-W ENV가 인터루킨-1을 통해 시냅스의 신경수용체 분포에 영향을 미치고 IL-6 및/또는 TNF-α와 시너지를 낼 수 있지만, 신경수용체(GluN2B-NMDAR)의 특정 하위 클래스를 표적으로 하여 신경 기능을 변경할 수 있는 새로운 메커니즘을 나타내는 것으로 보여진다. 더욱이, LPS와 같은 다중 전염증성 작용제에 의한 유도 가능성에도 불구하고, 미세아교세포로부터 ENV-유도 사이토카인의 관찰된 효과는 신경 시냅스 내 및 주변에서 GluN2B-NMDAR 트래피킹에 대한 ENV-특이적 효과를 보여주었다.
따라서 HERV-W ENV에 의한 신경 기능의 기능적 변경은 글루탐산성 신경수용체 하위 클래스 수준 및 미세아교세포-매개 염증성 사이토카인 생성 모두에서 매우 특이적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 특정 신경 기능 장애에 관여하는 전-염증성 사이토카인 및 가장 관련성이 높은 것인 IL-1β는 감염원과 같은 환경 요인에 의해 유도되지 않고 HERV-W ENV 단백질 자체가 뉴런-신경아교 조직 환경에서 발현 및/또는 방출될 때 유도된다. IL-1β 단독 또는 IL-6 및/또는 TNF-α와 연관된 이러한 특정 효과가 설명된 적이 없고 예상할 수 없었기 때문에, HERV-W ENV의 맥락적 유도 및 시너지 효과가 ENV-특이적 병원성 메커니즘의 핵심이라는 것이 분명해졌다.
이는 또한 정신분열증 및 양극성 장애와 같이 지금까지 다른 진단 카테고리로 분류된 정신 질환에서, 이러한 ENV-신경아교/사이토카인-매개 신경 기능 장애를 기반으로 하는 특정 생물학적 연속체(continuum)의 존재를 밝혀낸다.
현재의 병리학적 개체는 전용 테스트 및 척도를 사용한 심리적 평가와 임상, 대부분 행동, 증상에만 의존한다.
따라서 이러한 HERV-W ENV 유도 신경 기능 장애의 현재 설명은 뇌 세포에 대한 사이토카인-주도 시너지적인 효과인 HERV-W ENV 및 IL-1β 및/또는 IL-6 및/또는 TNF-α와 관련된 다양한 진단 범주에 걸쳐 증상 및 질병 진화의 기초가 되는 인과적, 기계적, 및 생물학적 정의를 제공하고 있다.
따라서 새롭게 생물학적으로 정의된 병리학적 개체는 HERV-W ENV와 이러한 사이토카인 사이에 현재 발견된 시너지 효과의 결과일 때, 정신분열증, 양극성 장애 또는 다른 현재의 정신 질환을 가진 환자의 하위-그룹을 포함할 수 있다. 상류, 아마도 환경 및 시간적 요인에 따라(11), 이 HERV-W 발현은 다양한 뇌 영역에서 활성화될 수 있으며, 여기서 GluN2B-NMDAR이 있는 신경 시냅스는 다양한 행동, 인지 및 기타 신경계 기능에 관여한다. 이는 또한 HERV-W ENV 및 사이토카인-주도 시너지 효과가 뇌 영역 및 기능의 배아 발생과 초기 생애 발달 동안 발생할 때의 신경 발달 장애를 암시한다. 이는 현재 정신과 진단의 다른 병원내 개체 사이의 이전에는 알려지지 않았지만 일반적인 병원성 과정을 예기치 않게 밝혀낸다.
HERV-W ENV 유도 전-염증성 사이토카인의 한 가지 주요 측면은 현재 설명된 실험에서 공통적으로 발현되는 것으로 관찰된 바와 같이 IL-1 및/또는 관련된 전-염증성 사이토카인, IL-6 및/또는 TNF-알파의 존재이며, 이는 이러한 환자의 체액에서도 검출 가능하다 (실시예 5 참조).
실시예 3: NMDAR에 대한 HERV-W ENV의 특이적 효과는 인 비트로 및 인 비보에서 단일클론 항체에 의해 억제될 수 있다.
대부분의 정신모방 약물(예: PCP)은 NMDAR 길항제이다. HERV-W ENV는 이의 생화학적 성질에도 불구하고, 즉 신경전달 물질의 수용체를 방해하는 데 사용되는 작은 화합물의 분자 상호작용을 가질 수 없는 단백질 거대분자임에도 불구하고, 해마 네트워크에서 NMDAR-매개 시냅스 전달을 차단했다.
뉴런 수용체에 대한 HERV-W ENV 단백질의 효과는 설명되지 않았으며 예상할 수도 없었는데, 이는 뉴런 세포에는 존재하지도 발현되지도 않는 TLR4(30) 수용체 및 T-세포 수용체의 V-베타 사슬(31)과 상호작용하는 것으로만 알려져 있었기 때문이다. 또한, 이러한 결과는 다양한 농도의 HERV-W ENV에 의해 NMDAR 매개 칼슘 과도상태나 NMDAR 매개 유발 EPSC가 변경되지 않았기 때문에 HERV-W ENV가 현재 알려진 메커니즘을 통해 신경 수용체를 방해하지 않는다는 증거를 제공했으며(도. 1E-G), 이는 알려진 정신모방제 (psychomimetics)처럼 NMDAR 길항제로 작용하지 않음을 나타낸다. 따라서 본 발명자들은 HERV-W ENV가 시냅스에서 NMDAR 트래피킹을 특이적으로 변경했다는 것을 발견했으며, 이는 환자의 혈청 및 재조합 또는 조직-발현 HERV-W ENV 단백질 모두에서 관찰된 효과를 설명할 수 있다. 이러한 비-관습적인 효과에 대한 가능한 설명을 추가로 탐색하기 위해, 전뇌의 두 가지 주요 NMDAR 하위 유형, 즉 GluN2A- 및 GluN2B- 함유 NMDAR를 단일 나노입자(양자점) 이미징을 사용하여 살아있는 뉴런의 표면에서 실시간으로 추적했다 (도. 1H)(32). HERV-W ENV 노출은 GluN2B-를 급격히 증가시켰지만, GluN2A-NMDAR, 막 역학 및 시냅스후 구획의 평균 제곱 변위(MSD)는 그렇지 않았다 (Homer 1c-양성 영역; 도 1I-J 및 도 4). 따라서, 뉴런 배양 배지에 HERV-W ENV 단백질이 존재는, NMDAR, 특히 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스에서 시냅스후 구획(즉, 시냅스 밖의 뉴런 막 영역)으로의 비편재화를 유도하여, 기존 패턴을 가진 시냅스로부터 수용체의 놀라운 분산을 유도하는데, 이는 또한 다른 TLR4-결합 분자, 즉 LPS에 의해 유도된 것과는 다르기 때문이다.
HERV-W ENV에 대한 특이적 항체가 이 병원성 효과를 억제하는 것으로 밝혀졌으며(도. 1K), 이는 이러한 신경 수용체에 대한 이 단백질의 병원성 잠재력을 표적으로 하는 특정 효과로 밝혀졌다. 동시에, 열-불활성화 HERV-W ENV(도. 4C)는 대조군에 비해 유의한 효과를 나타내지 않았으며, 따라서 천연 단백질 구조 하에서 병원성 특성을 확인했다. 이 HERV-W ENV-유도 효과는 테트라도톡신 (TTX)에 의한 활동 전위(action potential)가 없는 신경 네트워크에서 여전히 관찰되었기 때문에(도. 4D), 현재 발견된 효과는 HERV-ENV가 시냅스 NMDAR을 서브 유닛-특이적 및 신경 활성-독립적 방식으로 측면 분산시킨다는 것을 종합적으로 보여주는데, 이는 신경전달 물질의 수용체를 방해하는 신경병원성 분자에 대한 현재 지식의 일부가 아니다(33-35).
TLR4 활성화가 예기치 않게 이 효과를 유발할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 잘 알려진 TLR4 작용제인 리포폴리사카라이드(LPS)를 해마 네트워크에 적용했다. 일관되게, LPS는 시냅스 GluN2B-NMDAR를 빠르게 분산시킬 수 있었다(도. 3A 및 B). 그러나, TLR4 활성화를 통해 항상 HERV-W ENV와 유사한 효과를 나타내는 LPS(30, 36, 37)는, 여기에서 HERV-W ENV에 의해 유도된 것과 다른 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌는데(도. 3C-E), 이는 뉴런의 신경전달 물질 수용체에 대한 이러한 기존 효과를 고려할 때 이 두 단백질이 동일한 신호전달 경로를 공유하지 않는다는 것을 시사한다. HERV-W ENV 단백질은 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스에서 시냅스후 구획(즉, 시냅스 밖의 뉴런 막 영역)으로의 비편재화를 유도하여, LPS에 의해 유도된 것과는 다른 기존 패턴을 가진 시냅스로부터 수용체의 놀라운 분산으로 이어진다.
정신분열증 환자가 HERV-W ENV에 만성적으로 노출될 수 있기 때문에(11), ENV에 대한 장기간 노출이 해마 네트워크 특성과 동물 행동을 어떻게 변화시키는지 조사했다. ENV 노출 24시간 후, 시냅스 GluN2B-NMDAR는 여전히 측면으로 분산되었으며, 이 효과는 선택된 항-ENV 항체에 의해 완전히 차단되었다(도. 5A-C). 기능적으로, 이는 수상돌기 가시 (dendritic spine)에서 NMDAR-매개 Ca²+ 과도 상태의 빈도를 지속적으로 증가시켰고(도. 6A 및 B), 시간이 지남에 따라 서로 더 상관관계가 높아졌다(도. 6C-D). 이러한 네트워크 활성 변화는 IL-1β의 차단에 의해 조절되었으며(도. 6B 및 D), 이전에 설명한 미세아교세포에서 ENV 매개 IL-1β 유도의 관찰과 일치한다.
HERV-W ENV의 대량 노출은 환자의 뇌에서 단백질의 생물학적 이용 가능성을 반영하지 않을 수 있기 때문에, HERV-W ENV는 해마 세포의 3%에서만 며칠 동안 유전적으로 발현되었다 (도. 6E). 놀랍게도, 이는 시냅스 GluN2B-NMDAR의 전반적인 분산과 네트워크 효과를 모방하기에 충분했다 (도. 6F). 마지막으로, GluN2B-NMDAR-매개 시냅스 및 네트워크 활성의 이러한 변경은 글루탐산성 시냅스의 기저 및 소성 범위의 장기적인 변화를 예측할 수 있다(38, 39). 일관되게, GluA1-AMPA 수용체(AMPAR)의 시냅스 함량은 HERV-W ENV에 노출된 뉴런에서 크게 증가했다 (도. 6G 및 6H). 또한, 글루탐산성 시냅스는 화학적으로 유도된 장기 강화 (cLTP)를 겪을 수 없었다. 화학적 챌린지 이후, AMPAR 시냅스 함량은 마치 시냅스가 약화(de-potentiation)된 것처럼 실제로 감소했다 (도. 6I 및 6J). 따라서, 해마 세포에 대한 장기간의 HERV-W ENV 노출은 네트워크 활성 및 글루탐산성 시냅스의 NMDAR-의존적 적응에 중대한 결과를 초래한다. 이러한 주요하고 일관된 효과는 HERV-W ENV 단백질과 기술된 적이 없으며, 이러한 독특한 메커니즘 하에서 특이적이고 유의한 수준의 신경전달 물질의 특이적 수용체를 표적으로 할 것으로 예상되지 않았다.
정신 질환에서 NMDAR 신호전달 및 시냅스 가소성의 변경은 설치류의 정신병 모델의 특징인 인지 및 감각 운동 게이팅(예: 선행자극 억제, PPI) 테스트(40)의 행동 결함과 관련이 있다. 생후 전기천공 이후에, HERV-ENV 전기천공 세포가 해마 성상세포/방사형 신경아교(GS+) 또는 비신경아교(GS-) 세포에서 관찰되었다 (도 7A). 세포 생존과 신체 성장은 대조군 (GFP only)과 ENV 쥐 사이에서는 구별할 수 없었다 (도. 7B 및 8A). 또한, 대조군과 HERV-W ENV+ 쥐는 불안의 행동 징후 없이 유사한 기본 운동(basal locomotion), 습관화(habituation) 및 상황 인식(context recognition)을 나타냈다 (도. 9H). 성인 쥐 (출생 후 70일)에서 전기천공-유도 단백질은 여전히 검출 가능했고(도. 9F) HERV-W ENV 발현은 해마 시냅스에서 GluN2/PSD-95 비율을 감소시켰다(도. 9G). 놀랍게도, ENV를 발현하는 쥐는 정신 모방 약물인 MK-801(NMDAR 채널 차단제)을 한 번 주사한 후 과장된 과운동(hyperlocomotion)을 보였고(도. 9I) PPI 테스트에서 이들의 퍼포먼스는 같은 배의 대조군과 비교했을 때 손상되었다 (도 9J). 이와 함께, 이러한 행동 결과는 해마에서의 HERV-W ENV 발현이 정신 질환과 관련된 행동 결함을 촉발하기에 충분하다는 것을 보여준다. 이를 뒷받침하기 위해, 항정신병 약물인 클로자핀은 HERV-W ENV 발현 쥐의 PPI 검사 변경을 방지했다 (도. 9J, 8C). 마지막으로, HERV-W ENV가 측면 분산의 기존 메커니즘을 통해 NMDAR 특이적 기능 장애를 유도함에 따라, GluN1 교차결합 프로토콜을 사용하여 PPI 퍼포먼스를 테스트하기 전에 HERV-W ENV를 발현하는 쥐의 해마에서 표면 NMDAR을 인위적으로 안정화했다(도 9K) (32, 39, 41). 일관되게, 이러한 막 NMDAR의 안정화는 PPI 테스트에서 HERV-W ENV 유도 손상을 감소시켰다 (도. 9L).
종합적으로, 이 연구는 많은 정신 질환 환자(12, 42)에서 검출되는 HERV-W ENV가 NMDAR 조직의 기능 장애와 글루탐산성 시냅스 내에서 장기적인 가소성을 생성할 수 있음을 보여준다. 시냅스 수용체 NMDAR이 시냅스로부터 멀리 분산되면 정신 질환과 관련된 행동 장애가 발생한다. 이로 인해 HERV-W ENV는 정신 질환 환자에서 새로운 작용 메커니즘을 가진 새로운 치료 전략을 위한 관심있는 치료 표적이 되었다.
또한 항-ENV 항체가 HERV-W ENV에 의한 신경 시냅스에 대한 생물학적 분포를 통해 영향을 받을 때 신경 전달 물질의 독특한 신경 수용체인 GluN2B의 수준에서 이러한 병원성 효과를 특이적이고 효율적으로 역전 및/또는 예방할 수 있음을 보여준다. 항-ENV 항체의 사용은 뉴런에서 NMDAR, 특히 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도한다. 항-ENV 항체의 이러한 치료 효과는 생체 내에서 정신병-관련 행동 이상을 역전시키거나 예방하는 것을 의미한다.
HERV-W ENV와 글루탐산 시냅스 사이의 이러한 상호 작용은 내인성 레트로바이러스가 정신 질환에서 어떻게 중요한 역할을 할 수 있는지에 대한 우리의 이해에 새롭고 예상치 못한 층을 추가한다. 실제로, 이제 HERV-W 활성화가 수렴적이지만 이전 지식에서 보여진 것과는 다른 (사이토카인의 시너지적 유도 포함) 경로를 통해 글루탐산성 시냅스 발달 및 기능을 변경할 수 있다는 것이 드러났다.
그런 다음 신생아 ENV 발현이 글루탐산성 시냅스 성숙을 조정하고 정신 질환과 관련된 행동 결함을 유발한다는 것을 입증하는 추가 분석이 수행되었으며, 이는 중화 항-HERV-W ENV 항체에 의해 역전되는 효과이다.
다음과 같은 생체 내 연구는 글루탐산성 시냅스의 적절한 성숙을 위해서는 미성숙 GluN2B가 풍부한 시냅스에서 성숙 GluN2A가 풍부한 시냅스로의 전환이 필요하다는 것을 고려할 때 구상되었다(44). 이 근본적인 과정은 신경 네트워크와 인지 기능이 확립되는 출생 후 기간(출생 후 처음 2주) 동안 발생한다. 이 기간 동안 발생하는 시냅스 변경은 종종 정신병과 같은 정신 장애와 관련된 성인 행동 기능 장애로 이어진다(44, 45, 46). GluN2A/2B 시냅스 비율이 ENV에 의해 시험관 내에서 변경된 것을 고려하여, 출생 후 첫 주의 말(P7)과 성인 단계(>P65)에서 GluN2A- 및 GluN2B-NMDAR 시냅스 함량을 측정했다 (도. 10A). 이 단계에서, 삽입된 유전자는 면역조직화학적 및 생화학적 수단에 의해 관찰된 바와 같이 해마 영역에 명확하게 존재하였다 (도. 10B,C). GluN2A-NMDAR 시냅스 함량은 발달에 따라 증가한 반면, GluN2B-NMDAR 함량은 감소했다 (도 10D,E). 그러나, ENV 쥐에서 GluN2A-NMDAR 시냅스 함량은 P7에서 이미 증가했으며 (P = 0.06), 이는 P7에서 P65로 이어지는 발달 상승을 평탄하게 했다 (도. 10D). GluN2B-NMDAR 시냅스 함량은 두 연령의 대조군 쥐에 비해 ENV 쥐에서 안정적으로 유지되었다 (도. 10E). 따라서 성인 단계에서 GluN2A-와 2B-NMDAR의 상대적 양은 지속적으로 감소하였다 (Cont: 1.0 ± 0.08, ENV: 0.90 ± 0.10, n = 8; 평균 ± SEM: *P = 0.034, 스튜던트 t-테스트). P7(표시되지 않음)에서 염증의 명확한 징후가 있었기 때문에, IL-1β 및 GluN2A-NMDA 수용체(47) 간의 상호작용의 변화가 시냅스 NMDAR의 초기 변경을 설명할 수 있는지 여부를 테스트했다. GluN2A-NMDAR과 IL1R 사이의 Co-IP(면역침강법)는 P7(도 5F)에서 ENV-해마 시냅스에서 유의하게 증가한 반면, GluN2B-NMDAR과 IL1R 사이의 Co-IP는 영향을 받지 않았다. 성인 단계에서는 모든 그룹에서 유의한 차이가 없었다 (GluN2A/IL-1R: Cont: 1.0 ± 0.15, ENV: 1.04 ± 0.21,
GluN2B/IL-1R: Cont: 1.0 ± 0.08, ENV: 0.95 ± 0.09, n = 6-7; 평균 ± SEM, P > 0.05). ENV가 배양된 해마 네트워크에서 AMPAR 시냅스 함량을 강화했기 때문에 (도. 6 G,H), 최종적으로 성인 단계에서 AMPAR 시냅스 함량을 비교했다 (P7에서 대부분의 글루탐산성 시냅스는 AMPAR이 없음). 시냅스 함량은 대조군과 비교했을 때 ENV 쥐에서 유의하게 증가했다 (도. 5G). PSD-95의 전체 양은 ENV 쥐에서 변경되지 않았다 (도 5H). 따라서, ENV의 신생아 발현은 IL1-β 수용체 신호전달 복합체와의 기능적 상호작용에 의해 작동되는 시냅스 GluN2A-NMDAR에서의 조기 성숙의 증가와 함께 NMDAR 하위 유형의 발달 성숙을 변경시킨다. NMDAR 신호전달의 이러한 가속된 성숙은 이후의 단계에서 글루탐산 시냅스를 강화하여 이들의 가소성 창을 손상시킬 가능성이 있다.
글루탐산성 시냅스의 성숙은 출생 후 첫 주 동안 발생하기 때문에, 본 발명자들은 NMDAR 신호전달 및 시냅스 성숙에 대한 ENV의 유해한 영향이 이 기간 동안 두드러진다고 가정했다. 이 가설을 테스트하기 위해, ENV 쥐에게 P4에서 P12까지 ENV-중화 항체를 주입하였다 (3 주입; 도. 5I). 성인 단계에서, 대조군 항체를 투여받은 쥐에서 여전히 ENV-유도 PPI 결손이 관찰되었으나, ENV- 중화 항체 처리에 의해 행동 반응이 명확하게 회복되었다 (도. 10J).
이러한 데이터는 출생 후 초기 기간의 ENV 발현이 시냅스 GluN2A/B-NMDAR 성숙을 변경시키고, 성인의 행동 이상의 출현을 유도하며, 중화 항-HERV-W ENV 항체의 연속적인 생체 내 주입을 사용하여 예방 및/또는 복원할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 정신 질환 환자에서와 같은 신경전달 물질 수용체 GluN2B-NMDAR 및 HERV-W ENV-유도 효과의 비정상적인 시냅스 분포를 반전 및/또는 예방하는 HERV-W ENV 단백질(ENV-W2.3)에 대한 단일클론 항체의 특성.
4.1 ENV-W2.3 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 서열.
4.1.1 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열
> 서열번호 12 - GN_ENV-W2.3 -VL
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAAGGGCATCACTTATTTGTATTGGTTTCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCCACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
4.1.2 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
> 서열번호 7- GN_ENV-W2.3 -V
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSKGITYLYWFLQKPGQSPQLLIYQMSHLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEIK
식별된 CDR 서열과 함께 VL 아미노산 서열이 도 11에 나타나 있다.
4.2 ENV-W2.3 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 서열.
4.2.1 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열
> 서열번호 13 -GN_ENV-W2.3 -VH
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGTACTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATTTATCCGGGAAAAAGTGATACTAGCTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCAAGTTGACTGCGGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGAACTCACCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACAAGAACCGTCTATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
4.2.2 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
> 서열번호 8 -GN_ENV-W2.3 -VH
EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYSFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGKSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELTSLTNEDSAVYYCTRTVYA MDYWGQGTSVTVSS
식별된 CDR 서열과 함께 VH 아미노산 서열이 도 12에 나타나 있다.
3.3 ENV-W2.3 항체의 보충적 분석
VL 영역은 데이터베이스(Uniprot databank-UniprotKB)에서 발견된 동일한 서열이 없는 카파 이소형의 재배열되고 생산적인 IGK 서열에 해당한다.
VH 영역은 데이터베이스(Uniprot databank-UniprotKB)에서 발견된 동일한 서열이 없는 Ig2a 이소형의 재배열되고 생산적인 IGH 서열에 해당한다.
실시예 5: HERV-W(MSRV) 단백질 서열 상의 2개의 원거리 선형 서열로부터의 에피토프 인식: 구조적 에피토프의 단백질 입체구조-유도.
재료 및 방법
실험은 1차 HERV-W/MSRV-ENV 서열에 중첩되는 합성 펩타이드로 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 제조업체가 권장하는 대로 Pepscan, The Netherlands에서 수행되었다. 테스트 항체는 250 ng/ml에서 1 μg/ml로 희석되었다. 판독값은 각각의 연속적인 펩타이드로 측정된 평균 광도 측정 OD를 나타낸다.
결과
HERV-W 서열(MSRV-ENV; Genbank ref. AAK18189.1 ; Locus AF331500_1 ; 542 aa) 전체에 걸친 15개 아미노산의 중첩 펩타이드를 사용한 에피토프 매핑은 ENV-W2.3 항체에 의해 유의하게 검출된 2개의 원거리 서열 신장부(stretch)를 명확하게 식별했다 (도 13).
이는 연속적으로 검출된 아미노산, 즉 구조적 에피토프로서 LFNTTLTRLHE (서열번호 10)와 LYNHVVP (서열번호 11)의 두 펩타이드 영역을 나타내는 3D 폴딩 구조를 가지고, 이러한 서열이 천연 단백질에서 이 항체에 의해 공동으로 검출되어야 함을 분명히 나타낸다 (도 13).
이 에피토프 검출은 이 항체의 CDR 및 가변 경쇄 및 중쇄(VL 및 VH)의 서열과 함께 이 항체를 특징화한다.
결론적으로, 인간에의 치료적 적용을 위해, 인간화 항체 또는 임의의 면역-내성 분자는 일반적으로 환자를 치료하는 데 필요하다. 따라서, 이러한 인간화 항체 또는 동등한 치료적 분자의 고유한 인식 특성은 (i) 에피토프 인식에 관여하는 것으로 잘 알려진 CDR 서열, 및/또는 (ii) HERV-W ENV 병원성 단백질의 2 개의 원거리 선형 영역 연결하는 구조적 에피토프의 기존 구조 (실시예 3 및 4 참조), 및/또는 (iii) 뉴런에서 NMDAR, 특히 GluN2B-함유 NMDA 수용체의 시냅스로의 재배치를 유도하는 능력에 의해 결정된다.
따라서 본 발명은 이러한 진단 카테고리의 하위 그룹을 나타내고 현재는 이전에 "정신분열증" 또는 "양극성 장애"로 진단된 환자에서 IL-1베타(>0.05pg/ml) 및/또는 TNF-알파(>1.25pg/ml) 및/또는 IL-6(>0.5pg/ml)의 상승된 수준과 동시에 HERV-W ENV 항원 검출에 의해 특징지어지는 개체를 포함하는 생물학적으로 정의된 신규 개체를 나타내는, 증상학 및 심리학적으로 정의된 기준으로 이전에 진단된 환자의 새로운 적응증에 대한 치료 제품을 제공한다. 주목할 점은, 혈청 내 사이토카인의 이러한 임계값은 투여 용량에 사용되는 키트, 항체, 기술 및 플랫폼에 따라 다르다. 제시된 값은 지시값일 뿐이며 제조업체의 지침에 따라 조정하거나 주어진 플랫폼으로 평가해야 한다. 이러한 경우, 심부 뇌 조직에 국한된 발현이 없을 때, 순환액에서 HERV-W ENV 항원 검출은 상호보완적이고 매우 지시적인 바이오마커가 될 수 있다.
실시예 5: HERV-W ENV 항원 및/또는 혈청 내 다른 생물학적 분자의 검출에 기초하여 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자의 하위 그룹을 포함하는 신규한 병리학적 개체(nosological entities)의 식별.
5.1 환자, 재료 및 방법
정신분열증 또는 양극성 장애 진단을 받은 환자를 포함한 파일럿 연구는 현재 진단 매개변수, 일상적인 실험실 생물학적 마커 및 혈청 내 HERV-W 항원 검출을 조사했다. 일상적인 실험실 생물학적 테스트는 사이토카인과 같은 진단 키트의 사용에 대한 제조업체의 지침에 따라, 그리고 일반적으로 분석이 수행된 프랑스의 의학 생물학 분석에 대한 현재 권장 사항 및 규정에 따라 수행되었다. 혈청에서 HERV-W ENV 항원의 검출 및 순환 가용성 형태의 정량화와 관련하여, 모든 분석은 ref. WO2019201908로 공개되고 (A1) 및 “Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomeric form of HERV-W envelope protein"라는 제목의 특허에 제공된 조건에 따라 수행되었다. 혈청 내 HERV-W ENV 가용성 항원에 대한 결과는 면역모세관 WES 플랫폼에서 계산된 특정 HERV-W ENV 가용성 항원 피크의 곡선 아래 면적(AUC)에 해당하는 "실험간 표준화 결과(Inter-Experiment Standardized Result)"로 표현하였으며, 모든 데이터를 참조로 사용된 첫 번째 실험의 데이터로 조정하기 위해 각 실험에서 일련의 건강한 대조군의 평균 + 2 x 표준 편차를 사용하여 (특이성/양성의 하한의 컷오프 값: CO) 실험 간 변이에 대해 정규화하였다. 따라서 각각의 다른 실험에서 각 샘플의 측정된 AUC에 첫 번째 실험의 해당 CO의 비율을 곱했으며, 이 비율은 모든 값을 비-특이적 배경 신호의 동일한 평균으로 조정한 것이며, 또한 특정 신호(CO)의 최소값을 결정하는 데 사용되는 표준 편차의 두 배로 개인 간 변이의 영향을 고려한 것이다. 변이가 중요하지는 않았지만, 이는 모든 대상체의 데이터와의 추가 상관 관계 분석을 최적화하여 통계 결과에 영향을 미치는 실험 간 약간의 변이를 방지한다. 따라서, 모든 측정값은 15 이상의 CO로 표준화되었으며, 모든 결과는 HERV-W ENV 항원의 특정 검출 및 정량화를 나타낸다. 이 CO 아래의 값은 음성 샘플 중에서 유의하지 않은 변이가 있는 샘플의 구성 요소와 기술적 프로토콜에 의해 생성된 비-특정 배경 신호에 해당한다 ("기술적 노이즈").
가능한 하위 그룹을 식별하기 위해, 본 발명자들은 정신분열증 (SZ, n = 29), 양극성 장애 (BP, n = 43), 및 일치하는 건강한 대조군 (HC, n = 32)에서 HERV-W 양성 (양성을 위한 컷오프: IESR>15; 카테고리형 변수로 귀속됨)과 혈청 사이토카인(IL-1b, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y; 전부 LN-변환; 카테고리형 변수로 귀속)의 측정을 동시에 통합한 편향되지 않은 2단계 클러스터 분석(48)을 사용했다. 일부 대상체에 대한 변수가 누락되어 표본 크기가 감소했다. 클러스터 분석에 포함된 최종 대상체 수는 n(HC) = 29, n(SZ) = 18, n(BP) = 30이었다. 클러스터 수를 사전에 결정하지 않고 클러스터 분석을 수행하여 가능한 클러스터 수를 식별하는 측면에서 편향을 방지하였다. 최대 클러스터 수를 추정하기 위해 베이지안 기준(Bayesian Criterion, BIC)을 사용한 반면, 거리 측정으로 로그 가능도 방법(log­-likelihood method)을 사용했다[1]. HC, SZ 및 BP 대상체를 하위 그룹으로 계층화한 후, 혈청 사이토카인과 임상 변수(질병 발생 연령, MADRS (Montgomery-Asberg Depression Rating Scale) 점수, YMRS (Young Mania Rating Scale) 점수, PANSS (Positive and Negative Syndrome Scale) 점수, 및 일일 클로로프로마진 [CPZ] 당량)를 단방향 또는 양방향 분산 분석(ANOVA)로 분석한 다음, 적절할 때마다 다중 비교를 위한 Tukey 사후 검정(Tukey's post-hoc test)을 수행했다. 모든 통계 분석은 SPSS Statistics (version 25.0, IBM, Armonk, NY, USA) 및 Prism (version 8.0; GraphPad Software, La Jolla, California)을 사용하여 수행되었으며, 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정하였다.
5.2 결과
정신분열증(SZ), 양극성 장애(BP) 및 알려지지 않은 정신적, 염증성, 감염성 또는 대사성 질환이 없는 건강한 대조군(HC)으로 진단된 환자는, 혈청 내 HERV-W ENV 항원 및 사이토카인을 포함한 혈청 바이오마커의 검출 및/또는 투여량과 병행하는 임상 및 치료 데이터를 포함하여 관련 윤리 위원회에서 검증한 다중 매개변수 연구에 참여하는데 동의했다.
환자 및 대조군으로부터 수집된 데이터는 도 14에 제시되어 있다.
도 14a에서, 혈청 내 HERV-W ENV 항원 양성의 유병률이 HC, SZ 및 BP 그룹에 대해 제시된다. SZ(p<0.001) 또는 BP(p<0.01)를 가진 건강한 대조군과 정신 질환 환자 사이에 통계적으로 유의하고 중요한 차이가 입증되었으며, 그 중 HERV-W ENV 양성 환자의 하위 그룹이 식별되었다.
이러한 결과는 다른 매개변수와의 잠재적 상관관계 또는 공동-계층화 (클러스터 분석)를 위해 추가로 분석되었다. 혈청에서 특정 사이토카인의 농도가 증가하면서 유의한 군집화가 본질적으로 발견되었다. 도 14b에는, 이들 매개변수를 결합한 클러스터 분석에서 해당 혈청 값의 예측 인자 중요도가 제시되어, HERV-W ENV 항원의 지배적인 예측성을 보여주고, 이어서 Il-6, IL-1β 및 낮은 범위에서는 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인의 예측 중요성을 보여준다. 클러스터 분석은 HERV-W 양성과 혈청에서 사이토카인 검출에 기초하여 분리된 모든 테스트된 모집단에 걸쳐 두 개의 클러스터의 존재를 밝혔다. 클러스터 1(CL1)은 음성 HERV-W ENV 항원혈증을 갖고 혈청에서 사이토카인 검출이 없는(또는 HC에서 해당 기술의 정상적인 배경 검출 범위 내에서 낮은 값) 개인을 나타낸다. 클러스터 2(CL2)는 양성 HERV-W ENV 항원혈증을 갖고 혈청에서 상당한 사이토카인 검출을 갖는 개인을 나타낸다. 도 14c에서, 각 클러스터의 비율은 HC, SZ 및 BP 그룹에 대해 표시된다. 거의 모든 HC가 CL1에 속하고, CL2에는 일화적인 케이스 하나만 있는 것으로 보인다. SZ로 진단된 환자 중, 50%는 CL2에 속했고 나머지 절반은 CL1에 속했다. CL2는 모든 BP 환자의 약 1/3(33.3%)을 나타내는 반면, CL1은 약 2/3를 차지했다. 따라서, 명백히 건강한 대조군과 비교하여 정신 질환 환자에서 상당히 다른 유병률을 보였음에도 불구하고, CL2는 BP보다 SZ에서 더 많이 나타났다. 이러한 결과는 이미 혈청 사이토카인 상승과 관련된 HERV-W ENV 양성을 나타내는 SZ 및 BP 환자에 걸쳐 환자의 중요한 하위 그룹(CL2)의 존재를 나타내는 반면, CL1에 군집화된 다른 환자는 이러한 생물학적 매개변수에 대해 건강한 대조군과 다르지 않았다.
상이한 사이토카인의 추가 상세한 분석이 도 14d에 제시되어 있다. 전 체적으로, CL2의 IL-1β, Il-6 및 TNF-α 혈청 수준만이 HC의 혈청 수준과 유의하게 다르다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 인터페론 감마(IFN-γ)는 유의하게 검출되지 않았다. 이 사이토카인은 T-림프구에서 분비되며 적응 면역 반응의 지표이다. 따라서, IFN-γ가 없는 경우, 이전에 CL2에서 증가된 것으로 나타난 3가지 사이토카인은 선천성 면역의 활성화에 의해 유발되는 전-염증성 프로필과 일치한다. 가장 흥미롭게도, IL-1β는 BP 그룹 내 CL2에서 우세하지만 SZ 그룹에서는 그렇지 않은 반면, IL-6은 SZ 그룹 내 CL2에서 우세하지만 BP 그룹에서는 그렇지 않다. TNF-α는 BP 그룹에서 CL2와 HC 사이에 유의한 차이가 있었지만 CL1에서도 마찬가지였으며, SZ 그룹 내 어느 클러스터에서도 유의한 차이가 없었다. 따라서, HERV-W ENV와 혈청 내 전-염증성 사이토카인 검출의 연관성을 넘어, CL2는 SZ와 BP 사이에 다른 사이토카인 우세를 나타낼 수 있다. HERV-W ENV와 IL-6 사이의 연관성은 SZ에서 CL2에 대한 가능한 바이오마커 서명으로 나타나는 반면, HERV-W ENV, IL-1β 및 잠재적으로 TNF-α 사이의 연관성은 BP에서 CL2에 대한 가능한 바이오마커 서명으로 나타난다.
임상 또는 치료 매개변수와의 상관관계 및/또는 클러스터링도 식별되었으며 도 15에 제시되어 있다. 도 15a에서, CL1과 비교하여 CL2에서 질병이 발병한 연령이 유의하게 어린 것은 (p<0.01) BP 그룹 내에서만 입증된다. 도 15b에서, SZ 그룹 내에서만 CL2와 CL1 사이에 YMRS(Young mania rating scale)의 유의한 차이가 나타난다.
도 15c에서, PANSS(positive and negative syndrome scale) 점수는 CL1 및 CL2 하위 그룹에 관계없이 음성 증상에 대해 BP와 SZ 그룹 간에 임상적으로 예상되는 차이만을 보여준다.
현재의 정신과 진단에 사용되는 임상 평가 점수로 얻은 이러한 데이터는 임상 매개변수를 기반으로 "SZ 또는 BP"로 환자를 분류하는 것과 병원성 효과를 일으키는 객관적인 생물학적 매개변수를 기반으로 "정신병적 증상이 있는 CL1 또는 CL2"(CL1에서 HC를 제외하기 위해)로 분류하는 것 사이의 불일치를 설명한다.
마지막으로 그리고 가장 중요한 것은, 도 15d에서, SZ 그룹 내 CL2 대 CL1의 일일 클로르프로마진(CPZ) 당량 섭취 사이에 유의한 차이가 발견되었다. 이 CPZ 당량 측정은 환자의 현재 항-정신병 치료 요법의 일일 용량에 대한 표준 평가이며, 여기서 CL2의 SZ 환자가 CL1의 SZ 환자보다 훨씬 높은 용량을 요구하고/하거나 제공받는 것을 보여준다. 다른 분석은 HERV-W ENV와 전-염증성 사이토카인 발현의 검출에서 다양한 항정신병 분자의 가능한 관계를 배제했기 때문에, 현재의 관찰은 CL2 기준을 가진 SZ 환자들이 더 심각하고/하거나 빈번한 정신병적 증상을 가져서 의사가 환자를 안정시키기 위해 더 높은 용량을 처방하게 한다는 사실과 양립할 수 있다. 꽤 흥미롭게도, 이 관찰은 CL2 그룹의 환자에서 항-정신병 약물에 대한 내성과도 양립할 수 있으며, 이는 이전에 유발된 것처럼 더 심각하고/하거나 빈번한 정신병적 증상의 발생과 배타적이지 않다.
따라서, BP에서 일일 치료 용량 평가를 위한 동등한 척도는 없지만, CL2 바이오마커가 있는 SZ 환자의 더 심각한 질병 경과 및/또는 현재 항-정신병 약물에 대한 내성은 CL2 바이오마커의 병원성 효과 및 우선적으로 CL2의 주요 예측 인자(도. 14b), 즉 HERV-W ENV 단백질의 병원성 효과를 중화하는 것을 암시적으로 제안하면서, 다른 치료 전략의 사용을 요구한다.
따라서, 건강한 개인 및 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자를 포함하는 모집단으로부터의 임상, 치료 및 혈청 바이오마커 데이터의 다중 매개변수 분석은, 독립적으로 HERV-W ENV 병원성 효과에 대한 이전의 전임상 연구에서 얻은 것과 동일한 증거를 도출했으며, 이는 이러한 인간 내인성 레트로바이러스 단백질을 중화시키는 표적 치료를 요구한다. 따라서 본 발명으로부터의 항체의 시험관내 및 생체내 효율은 정신분열증 또는 양극성 장애를 갖는 환자의 치료를 위한 독특한 치료 도구 및 유사한 생물학적 매개변수: HERV-W ENV 항원 양성 및 증가된 전-염증성 사이토카인(혈액 샘플, 예를 들어 혈청에서 검출될 수 있음, 여기서는 CL2로 지정됨)로의 클러스터링을 제공한다.
표적 병원성 단백질이 없는 경우 이 항체로 CL1의 환자를 치료하는 것은 관련이 없으며, 이의 상승된 사이토카인은 상관관계가 있다. 이는 환자에서 이 항체의 임상적 효능은 정신분열증 및/또는 양극성 장애로 진단된 임의의 환자 그룹이 아닌 현재 정의된 CL2 기준에 일치하는 환자에서만 평가되어야 함을 암시한다. 이는 새로운 병리학적 정의 또는 적어도 두 가지 유형의 임상 진단(SZ 및 BP)에 걸쳐 새로 정의된 환자의 하위 그룹에 해당할 수 있지만, 이러한 진단을 가진 환자 사이의 가장 가능성 있는 병인 및 병원성 이질성은 모든 경우에 관여하지 않는 병원성 단백질에 특이적인 치료를 적용하기 전에 관련 표적 집단을 정의할 필요성과 일치한다. 일상적인 실행 및 실행 조건에서, CL2 분석의 결과는 또한 혈청 내 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 용량이 일상적인 CL2 분류를 위한 대용물로 작용할 수 있음을 보여준다.
결론적으로, 본 발명은 (i) 정신 질환과 관련된 뉴런에 대한 HERV-W ENV 단백질의 이전에 알려지지 않은 작용 방식, (ii) HERV-W ENV에 의해 유도된 정신병적 행동/증상의 동물 모델에서 뉴런에 대한 새로 발견된 병원성 효과를 억제하는 HERV-W ENV 단백질의 구조적 에피토프를 표적으로 하는 신규한 CDR 서열을 갖는 새로운 단일클론 항체, 및 (iii) 현재 정신분열증 또는 양극성 장애로 진단된 환자의 관련 하위-그룹을 치료하기 위한 이 새로운 항체의 적절한 치료적 사용을 위한 새로운 적응증과 새로운 병리학적 하위-그룹 또는 개체를 정의하는 새로운 바이오마커 기반 기준에 대한 예상치 못하고 의미 있는 증거를 제공한다. 따라서 이들 바이오마커는 결합되거나 단독으로 주어진 환자에서 이 항체를 사용한 치료의 정확성을 검증하기 위해 관련 임상 증상에 직면하여 사용될 수 있다.
참고문헌:
1. A. Sekar et al., Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature 530, 177-183 (2016).
2. S. M. Purcell et al., A polygenic burden of rare disruptive mutations in schizophrenia. Nature 506, 185-190 (2014).
3. M. Fromer et al., De novo mutations in schizophrenia implicate synaptic networks. Nature 506, 179-184 (2014).
4. N. Grandi, E. Tramontano, Type W Human Endogenous Retrovirus (HERV-W) Integrations and Their Mobilization by L1 Machinery: Contribution to the Human Transcriptome and Impact on the Host Physiopathology. Viruses 9, (2017).
5. E. B. Chuong, N. C. Elde, C. Feschotte, Regulatory evolution of innate immunity through co-option of endogenous retroviruses. Science 351, 1083-1087 (2016).
6. R. Ono et al., Deletion of Peg10, an imprinted gene acquired from a retrotransposon, causes early embryonic lethality. Nat Genet 38, 101-106 (2006).
7. Y. Sekita et al., Role of retrotransposon-derived imprinted gene, Rtl1, in the feto-maternal interface of mouse placenta. Nat Genet 40, 243-248 (2008).
8. L. Fasching et al., TRIM28 represses transcription of endogenous retroviruses in neural progenitor cells. Cell Rep 10, 20-28 (2015).
9. R. Douville, J. Liu, J. Rothstein, A. Nath, Identification of active loci of a human endogenous retrovirus in neurons of patients with amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 69, 141-151 (2011).
10. P. Kury et al., Human Endogenous Retroviruses in Neurological Diseases. Trends Mol Med 24, 379-394 (2018).
11. M. Leboyer, R. Tamouza, D. Charron, R. Faucard, H. Perron, Human endogenous retrovirus type W (HERV-W) in schizophrenia: a new avenue of research at the gene-environment interface. World J Biol Psychiatry 14, 80-90 (2013).
12. H. Karlsson, J. Schroder, S. Bachmann, C. Bottmer, R. H. Yolken, HERV-W-related RNA detected in plasma from individuals with recent-onset schizophrenia or schizoaffective disorder. Mol Psychiatry 9, 12-13 (2004).
13. H. Perron et al., Molecular characteristics of Human Endogenous Retrovirus type-W in schizophrenia and bipolar disorder. Transl Psychiatry 2, e201 (2012).
14. D. Tzur Bitan et al., Attitudes of mental health clinicians toward perceived inaccuracy of a schizophrenia diagnosis in routine clinical practice. BMC Psychiatry 18, 317 (2018).
15. E. Vieta, M. Berk, B. Birmaher, I. Grande, Bipolar disorder: defining symptoms and comorbidities--Authors' reply. Lancet 388, 869-870 (2016).
16. I. Grande, M. Berk, B. Birmaher, E. Vieta, Bipolar disorder. Lancet 387, 1561-1572 (2016).
17. A. Lloyd, HIV infection and AIDS. P N G Med J 39, 174-180 (1996).
18. H. Perron et al., Isolation of retrovirus from patients with multiple sclerosis. Lancet 337, 862-863 (1991).
19. H. Perron et al., Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7583-7588 (1997).
20. J. L. Blond et al., Molecular characterization and placental expression of HERV-W, a new human endogenous retrovirus family. J Virol 73, 1175-1185 (1999).
21. S. Levet et al., An ancestral retroviral protein identified as a therapeutic target in type-1 diabetes. JCI Insight 2, (2017).
22. R. Faucard et al., Human Endogenous Retrovirus and Neuroinflammation in Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy. EBioMedicine 6, 190-198 (2016).
23. H. Perron et al., Human endogenous retrovirus type W envelope expression in blood and brain cells provides new insights into multiple sclerosis disease. Mult Scler 18, 1721-1736 (2012).
24. S. Noorali et al., Role of HERV-W syncytin-1 in placentation and maintenance of human pregnancy. Appl Immunohistochem Mol Morphol 17, 319-328 (2009).
25. D. J. Stein, C. Lund, R. M. Nesse, Classification systems in psychiatry: diagnosis and global mental health in the era of DSM-5 and ICD-11. Curr Opin Psychiatry 26, 493-497 (2013).
26. D. A. Regier, E. A. Kuhl, D. J. Kupfer, The DSM-5: Classification and criteria changes. World Psychiatry 12, 92-98 (2013).
27. R. K. Blashfield, J. W. Keeley, E. H. Flanagan, S. R. Miles, The cycle of classification: DSM-I through DSM-5. Annu Rev Clin Psychol 10, 25-51 (2014).
28. N. Korver-Nieberg, P. J. Quee, H. B. Boos, C. J. Simons, Group, The validity of the DSM-IV diagnostic classification system of non-affective psychoses. Aust N Z J Psychiatry 45, 1061-1068 (2011).
29. A. S. Gonzalez et al., Recombinant mutagenic 3ABC protein and monoclonal antibody for quality-control testing in foot-and-mouth disease vaccines. Antiviral Res 157, 93-101 (2018).
30. A. Rolland et al., The envelope protein of a human endogenous retrovirus-W family activates innate immunity through CD14/TLR4 and promotes Th1-like responses. J Immunol 176, 7636-7644 (2006).
31. H. Perron et al., Multiple sclerosis retrovirus particles and recombinant envelope trigger an abnormal immune response in vitro, by inducing polyclonal Vbeta16 T-lymphocyte activation. Virology 287, 321-332 (2001).
32. L. Groc et al., Differential activity-dependent regulation of the lateral mobilities of AMPA and NMDA receptors. Nat Neurosci 7, 695-696 (2004).
33. M. B. Assie et al., F15063, a potential antipsychotic with dopamine D2/D3 receptor antagonist, 5-HT1A receptor agonist and dopamine D4 receptor partial agonist properties: influence on neuronal firing and neurotransmitter release. Eur J Pharmacol 607, 74-83 (2009).
34. R. R. Luedtke, C. Rangel-Barajas, M. Malik, D. E. Reichert, R. H. Mach, Bitropic D3 Dopamine Receptor Selective Compounds as Potential Antipsychotics. Curr Pharm Des 21, 3700-3724 (2015).
35. D. Zhu et al., Paliperidone Protects SH-SY5Y Cells Against MK-801-Induced Neuronal Damage Through Inhibition of Ca(2+) Influx and Regulation of SIRT1/miR-134 Signal Pathway. Mol Neurobiol 53, 2498-2509 (2016).
36. R. H. Johnson, D. T. Kho, O. C. SJ, C. E. Angel, E. S. Graham, The functional and inflammatory response of brain endothelial cells to Toll-Like Receptor agonists. Sci Rep 8, 10102 (2018).
37. A. Duperray et al., Inflammatory response of endothelial cells to a human endogenous retrovirus associated with multiple sclerosis is mediated by TLR4. Int Immunol 27, 545-553 (2015).
38. P. Paoletti, C. Bellone, Q. Zhou, NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nat Rev Neurosci 14, 383-400 (2013).
39. J. P. Dupuis et al., Surface dynamics of GluN2B-NMDA receptors controls plasticity of maturing glutamate synapses. EMBO J 33, 842-861 (2014).
40. C. A. Jones, D. J. Watson, K. C. Fone, Animal models of schizophrenia. Br J Pharmacol 164, 1162-1194 (2011).
41. M. Heine et al., Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science 320, 201-205 (2008).
42. H. Perron et al., Endogenous retrovirus type W GAG and envelope protein antigenemia in serum of schizophrenic patients. Biol Psychiatry 64, 1019-1023 (2008).
43. H. Huang et al., Chronic and acute intranasal oxytocin produce divergent social effects in mice. Neuropsychopharmacology 39, 1102-1114 (2014).
44. P. Paoletti, C. Bellone, Q. Zhou, NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nat Rev Neurosci 14, 383-400 (2013).
45. R. Birnbaum, D. R. Weinberger, Genetic insights into the neurodevelopmental origins of schizophrenia. Nat Rev Neurosci 18, 727-740 (2017).
46. O. Marin, Developmental timing and critical windows for the treatment of psychiatric disorders. Nat Med 22, 1229-1238 (2016).
47. F. Gardoni et al., Distribution of interleukin-1 receptor complex at the synaptic membrane driven by interleukin-1beta and NMDA stimulation. J Neuroinflammation 8, 14 (2011).
48. T. D. Purves-Tyson et al., Increased levels of midbrain immune-related transcripts in schizophrenia and in murine offspring after maternal immune activation. Mol Psychiatry, (2019).
SEQUENCE LISTING <110> GENEURO SA FONDAMENTAL <120> Anti-HERV-W envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases <130> B1905917EPWO <150> EP20305561.1 <151> 2020-05-28 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VL1 <400> 1 Lys Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Ile Thr Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VL2 <400> 2 Gln Met Ser 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VL3 <400> 3 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VH1 <400> 4 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VH2 <400> 5 Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-VH3 <400> 6 Thr Arg Thr Val Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VL <400> 7 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> VH <400> 8 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 542 <212> PRT <213> protein ENV of the Human endogenous retrovirus-W <400> 9 Met Ala Leu Pro Tyr His Thr Phe Leu Phe Thr Val Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Phe Ala Leu Thr Ala Pro Pro Pro Cys Cys Cys Thr Thr Ser Ser Ser 20 25 30 Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Thr Arg Leu Pro Gly Asn Ile Asp 35 40 45 Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Asn Ser Thr Phe Thr Ala 50 55 60 His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr Asn Ser Ala Thr Leu Cys Met 65 70 75 80 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys 85 90 95 Pro Gly Gly Leu Gly Ala Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr His Thr 100 105 110 Ser Met Ser Asp Gly Gly Gly Ile Gln Gly Gln Ala Arg Glu Lys Gln 115 120 125 Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Leu Thr Arg Gly His Ser Thr Pro Ser 130 135 140 Pro Tyr Lys Gly Leu Val Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Arg Leu His 165 170 175 Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Met Cys Leu Pro Leu 180 185 190 His Phe Arg Pro Tyr Ile Ser Ile Pro Val Pro Glu Gln Trp Asn Asn 195 200 205 Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly Pro Leu Val 210 215 220 Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys Val Lys Phe 225 230 235 240 Ser Asn Thr Ile Asp Thr Thr Ser Ser Gln Cys Ile Arg Trp Val Thr 245 250 255 Pro Pro Thr Arg Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe Phe Val Cys 260 265 270 Gly Thr Ser Ala Tyr His Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu Ser Met Cys 275 280 285 Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr Glu Gln Asp 290 295 300 Leu Tyr Asn His Val Val Pro Lys Pro His Asn Lys Arg Val Pro Ile 305 310 315 320 Leu Pro Phe Val Ile Arg Ala Gly Val Leu Gly Arg Leu Gly Thr Gly 325 330 335 Ile Gly Ser Ile Thr Thr Ser Thr Gln Phe Tyr Tyr Lys Leu Ser Gln 340 345 350 Glu Ile Asn Gly Asp Met Glu Gln Val Thr Asp Ser Leu Val Thr Leu 355 360 365 Gln Asp Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ala Val Val Leu Gln Asn Arg Arg 370 375 380 Ala Leu Asp Leu Leu Thr Ala Lys Arg Gly Gly Thr Cys Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Glu Glu Arg Cys Tyr Tyr Val Asn Gln Ser Arg Ile Val Thr Glu 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Arg Asp Arg Ile Gln Cys Arg Ala Glu Glu Leu 420 425 430 Gln Asn Thr Glu Arg Trp Gly Leu Leu Ser Gln Trp Met Pro Trp Thr 435 440 445 Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ile Phe Leu Leu Leu Phe 450 455 460 Gly Pro Cys Ile Phe Asn Phe Leu Val Lys Phe Val Ser Ser Arg Ile 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Leu Gln Ile Val Leu Gln Met Glu Pro Gln Met Gln 485 490 495 Ser Met Thr Lys Ile Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Arg Pro Ala Arg Leu 500 505 510 Cys Ser Asp Val Asn Asp Ile Glu Val Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser 515 520 525 Thr Ala Gln Pro Leu Leu His Ser Asn Ser Val Gly Ser Ser 530 535 540 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> protein ENV of the Human endogenous retrovirus-W <400> 10 Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Arg Leu His Glu 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> protein ENV of the Human endogenous retrovirus-W <400> 11 Leu Tyr Asn His Val Val Pro 1 5 <210> 12 <211> 336 <212> DNA <213> VL <400> 12 gatattgtga tgacgcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaagg gcatcactta tttgtattgg 120 tttctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc ccaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 13 <211> 348 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VH <400> 13 gaggtccagc tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cagttttacc agctactgga tgcactggat aaaacagagg 120 cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatccgg gaaaaagtga tactagctac 180 aaccagaagt ttaagggcaa ggccaagttg actgcggtca catccgccag cactgcctac 240 atggaactca ccagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attattgtac aagaaccgtc 300 tatgctatgg actattgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348

Claims (16)

  1. 정신 질환(psychotic disease)으로 진단되고 체액 샘플, 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청에서 높은 수준의 사이토카인을 특징으로 하는 환자 그룹의 치료에 사용하기 위한 HERV-W 엔벨로프 단백질(ENV)에 대한 항체로서, 상기 사이토카인은 특히 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α와 같은 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인인, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이토카인이 전-염증성 사이토카인 IL-6 또는 전-염증성 사이토카인 IL-1β인, HERV-W ENV에 대한 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 정신 질환은 정신분열증(schizophrenia), 양극성 장애(bipolar disorder), 정신분열성 정신병(schizoaffective psychosis) 및 정신분열형 장애(schizophreniform disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, HERV-W ENV에 대한 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정신 질환은 정신분열증 또는 양극성 장애인, 항-HERV-W ENV 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정신 질환은 정신분열증이고 상기 사이토카인은 전-염증성 사이토카인 IL-6인, 항-HERV-W ENV 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정신 질환은 양극성 장애이고 상기 사이토카인은 전-염증성 사이토카인 IL-1β인, 항-HERV-W ENV 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그룹의 환자에서 HERV-W ENV가 검출된 것인, 항-HERV-W ENV 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타낸 2개의 원거리 선형 서열에 의해 정의된 구조적 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하는 것인, HERV-W ENV에 대한 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6에 나타낸 6개의 CDR 각각을 포함하는 것인, HERV-W ENV에 대한 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 단일클론 항체인, 항-HERV-W ENV 항체.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체인, 항-HERV-W ENV 항체.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG인, 항-HERV-W ENV 항체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 IgG4 단일클론 항체 또는 IgG1 단일클론 항체인, 항-HERV-W ENV 항체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 경쇄 가변 영역(VL)이 CDR-L1에 대해 서열번호 1, CDR-L2에 대해 서열번호 2 및 CDR-L3에 대해 서열번호 3에 나타낸 3개의 CDR 각각을 포함하는 경쇄; 및
    중쇄 가변 영역(VH)이 CDR-H1에 대해 서열번호 4, CDR-H2에 대해 서열번호 5 및 CDR-H3에 대해 서열번호 6에 나타낸 3개의 CDR 각각을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인, HERV-W ENV에 대한 항체.
  15. 정신 질환을 진단받은 환자가 정신 질환을 앓고 있고, 체액 샘플에서 사이토카인의 높은 수준을 특징으로 하는 환자의 하위 그룹에 속하는지 여부를 식별하기 위한 진단 방법으로서,
    1) 특히 혈액 샘플, 더욱 구체적으로 혈청에서 사이토카인의 수준을 정량화하며, 상기 사이토카인은 특히 IL-6, IL-1β 및/또는 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인인 단계; 및
    2) 선택적으로, HERV-W ENV의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 진단 방법.
  16. 정신 질환으로 진단되고,
    - 체액 샘플에서 높은 수준의 사이토카인, 및/또는
    - 체액 샘플에서 검출된 HERV-W ENV의 발현을 특징으로 하는 환자 그룹의 치료 방법으로서,
    상기 환자들에게 유효량의 항-HERV-W ENV 항체, 특히 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6으로 나타낸 6개의 CDR 각각을 포함하는 항-HERV-W ENV 항체를 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
KR1020227046045A 2020-05-28 2021-05-28 정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-herv-w 엔벨로프 단백질 항체 KR20230018463A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20305561.1 2020-05-28
EP20305561.1A EP3916015A1 (en) 2020-05-28 2020-05-28 Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
PCT/EP2021/064364 WO2021239956A1 (en) 2020-05-28 2021-05-28 Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230018463A true KR20230018463A (ko) 2023-02-07

Family

ID=71575251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227046045A KR20230018463A (ko) 2020-05-28 2021-05-28 정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-herv-w 엔벨로프 단백질 항체

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240301040A1 (ko)
EP (2) EP3916015A1 (ko)
JP (1) JP2023527476A (ko)
KR (1) KR20230018463A (ko)
CN (1) CN116390944A (ko)
AU (1) AU2021281054A1 (ko)
CA (1) CA3185024A1 (ko)
IL (1) IL298594A (ko)
WO (1) WO2021239956A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2865403B1 (fr) * 2004-01-23 2009-06-12 Biomerieux Sa Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
MX2010014319A (es) * 2008-07-08 2011-05-19 Geneuro Sa Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.
AP3272A (en) 2008-09-22 2015-05-31 Cayman Chem Co Multiheteroaryl compounds as inhibitors of H-PGDS and their use for treating prosaglandin D2 mediated diseases
EP2949342A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-02 Geneuro SA Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
WO2019201908A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Geneuro Sa Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomeric form of herv-w envelope protein

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021281054A1 (en) 2023-01-05
IL298594A (en) 2023-01-01
CN116390944A (zh) 2023-07-04
US20240301040A1 (en) 2024-09-12
CA3185024A1 (en) 2021-12-02
JP2023527476A (ja) 2023-06-28
EP3916015A1 (en) 2021-12-01
WO2021239956A1 (en) 2021-12-02
EP4157871A1 (en) 2023-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2956171B1 (en) Methods to protect against and treat multiple sclerosis
KR102284780B1 (ko) Ｔ 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 ｔ 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법
CN114025785B (zh) 慢性炎症和病毒感染的诊断和治疗
US10981977B2 (en) Anti-HERV-K envelope protein antibodies and methods for detecting HERV-K envelope protein in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis
US11365243B2 (en) Inhibition of autism spectrum disorder using decoy antigens to maternal brain-reactive antibodies
ES2752131T3 (es) Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos
WO2023143425A1 (zh) 改善认知障碍的方法
KR20230018463A (ko) 정신 질환의 치료에 사용하기 위한 항-herv-w 엔벨로프 단백질 항체
JP7150286B2 (ja) Ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ）治療又は予防剤、及びｈａｍの治療方法
TW202334241A (zh) 治療硬皮病之方法
WO2023108102A1 (en) Anti-lcn-2 antibodies as a treatment for eye disorders
CN113874077A (zh) 精神障碍的治疗和诊断
Daniels Host Immune Signals Regulate Blood-Brain Barrier Function During Central Nervous System Infection and Autoimmunity

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination