ES2752131T3 - Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos - Google Patents

Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos Download PDF

Info

Publication number
ES2752131T3
ES2752131T3 ES15725326T ES15725326T ES2752131T3 ES 2752131 T3 ES2752131 T3 ES 2752131T3 ES 15725326 T ES15725326 T ES 15725326T ES 15725326 T ES15725326 T ES 15725326T ES 2752131 T3 ES2752131 T3 ES 2752131T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
herv
seq
antibody
cdr
env
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15725326T
Other languages
English (en)
Inventor
Hervé Perron
François Curtin
Alois Lang
Raphaël Faucard
Julie Medina
Alexandra Madeira
Nadège Gehin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Geneuro SA
Original Assignee
Geneuro SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geneuro SA filed Critical Geneuro SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2752131T3 publication Critical patent/ES2752131T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

Preparación combinada o composición que comprende: - un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o fragmento del mismo; y - un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica; para su uso como fármaco antirretrovírico dirigido a un virus perteneciente a retrovirus endógenos humanos tipo W (HERV-W), en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDRH1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.

Description

DESCRIPCIÓN
Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a un nuevo fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos.
Estado de la técnica
Los retrovirus endógenos humanos (HERV, de sus siglas en inglés) son familias multicopia complejas y heterogéneas de elementos genéticos que son restos de infecciones retrovíricas ancestrales que ingresaron al genoma de determinadas especies a través de inserciones dentro de las células de la línea germinal. En total, los elementos de HERV representan aproximadamente un 8 % del genoma humano y, cuando los elementos de HERV han retenido la actividad transcripcional, rara vez causan una expresión completa del genoma retrovírico y esto apenas se espera que surja de copias províricas completamente funcionales.
El elemento de retrovirus asociado a esclerosis múltiple (MSRV, de sus siglas en inglés), que es miembro de la familia de los retrovirus endógenos humanos tipo W (HERV-W), se aisló por primera vez de las células de pacientes que padecen esclerosis múltiple. El MSRV normalmente está latente en el genoma de los individuos, pero cuando se desencadena mediante cofactores, como determinados virus comunes, se puede reactivar y puede expresar además una proteína de envoltura de la familia HERV-W. Los inventores investigaron previamente este mecanismo y revelaron que es un importante factor desencadenante y agravante en el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades como la esclerosis múltiple (MS, de sus siglas en inglés), esquizofrenia (SZ, de sus siglas en inglés), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS (de sus siglas en inglés), con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CI-DP, de sus siglas en inglés), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2.
A pesar de la posible expresión de todos los genes retrovíricos estructurales de HERV, es decir, de la matriz que codifica el gen gag, la poliproteína precursora de la cápside y la nucleocápside, junto con el gen pol que codifica enzimas retrovíricas, incluida la poliproteína precursora de la proteasa, la transcriptasa inversa y la integrasa, y junto con el gen env que codifica la proteína precursora de envoltura del mismo HERV, hasta la fecha no se pudo encontrar ninguna copia retrovírica infecciosa de los HERV.
Por otro lado, a diferencia de los retrovirus infecciosos exógenos, los HERV están presentes en el ADN de todas las células de cada individuo humano y, por lo tanto, las moléculas terapéuticas utilizadas clásicamente para tratar los retrovirus humanos no pueden eliminar el provirus correspondiente dentro de una subpoblación de células de reservorio. Muchas restricciones celulares y genéticas sobre estos elementos endógenos también los hacen controlados mediante mecanismos moleculares no retrovíricos, escapando así de las rutas retrovíricas clásicas. Entre estos diversos mecanismos, se conoce una implicación del silenciamiento génico, del control génico mediante el promotor/potenciador celular o de la recombinación genética entre secuencias de HERV y genes celulares. Dichas características no se esperan con los retrovirus exógenos clásicos y, por lo tanto, no son accesibles para la terapia antirretrovírica actualmente existente.
En dichas condiciones, los tratamientos de retrovirus exógenos clásicos no pueden esperar controlar completamente la expresión de HERV patógenos y, por consiguiente, tener una eficacia terapéutica óptima, si la hubiera, en enfermedades asociadas a HERV. Anteriormente, la solicitud internacional WO2014/053489A1 describía un anticuerpo anti-HERV-W env denominado GNbAC1 y definido mediante las CDR con SEQ ID NO: 1-6, para el tratamiento de enfermedades asociadas a HERV-W, incluida la esclerosis múltiple. Además, la solicitud internacional WO2010/003977A1 también describía un anticuerpo anti-HERV-W env denominado GNbAC1 y definido mediante las CDR con SEQ ID NO: 1-6, para el tratamiento de enfermedades asociadas a MSRV, incluida la esclerosis múltiple, esquizofrenia, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica o diabetes tipo I.
Por lo tanto, durante mucho tiempo se sintió la necesidad insatisfecha de una nueva estrategia terapéutica antirretrovírica dirigida a los virus HERV.
Objeto de la invención
El ámbito de la presente invención está definido por las reivindicaciones, y cualquier información que no se encuentre en las reivindicaciones se proporciona solo a efectos informativos. Los inventores han descubierto sorprendentemente que un efecto anti-HERV inesperado dirigido a elementos endógenos de la familia HERV-W puede reducir e inhibir la expresión de HERV-W. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo para su uso como un fármaco antirretrovírico dirigido a un virus que pertenece a un retrovirus endógeno humano (HERV), en donde dicho anticuerpo está dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env). Preferentemente, dicho anticuerpo, fragmento o derivado es para prevenir y/o tratar una enfermedad asociada a HERV-W. Más preferentemente, dicho anticuerpo es para prevenir y/o tratar la esclerosis múltiple (MS) o la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP). Más preferentemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado, en donde la cadena pesada (HC, de sus siglas en inglés) tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 9 y la cadena ligera (LC, de sus siglas en inglés) tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
La presente invención se refiere a una preparación combinada o una composición que comprende, preferentemente que consiste en, un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), un fragmento o un derivado del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica para su uso como un fármaco antirretrovírico dirigido a un virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV), en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), un fragmento o un derivado del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en un método para tratar una enfermedad asociada a HERV-W, preferentemente una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
La presente divulgación también se refiere a un kit que comprende al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11 a 28.
La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), un fragmento o un derivado del mismo para su uso como un fármaco antirretrovírico dirigido a un virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV), preferentemente a la familia HERV-W, más preferentemente a MSRV, en un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W, en donde dicho paciente se identifica mediante un método que comprende una etapa i) de detección y/o cuantificación de HERV-W en una muestra biológica.
Descripción detallada de la invención
Definición
Como se usa en el presente documento, las expresiones "retrovirus endógeno humano" y "HERV", se refieren a los retrovirus endógenos humanos que comprenden el virus que pertenece a la familia de los retrovirus endógenos de tipo W, generalmente denominado "HERV-W".
"HERV-W" es una familia de retrovirus endógenos humanos que se deshizo en el genoma humano a partir del descubrimiento inicial del "Retrovirus asociado a la esclerosis múltiple", MSRV, un retrovirus humano aislado por primera vez de pacientes con esclerosis múltiple. Por lo tanto, cuando los estudios mencionan "LM7" (primer aislado descrito de MS), "retrovirus de MS", "MSRV", "Sincitina", "HERV-W 7q", "ERVW-E1", "ERVW-E2", "copias HERV-W del cromosoma X" o "HERV-W", todas designan elementos de HERV-W.
Como se usa en el presente documento, el término "MSRV" se refiere a un retrovirus endógeno específico que es un miembro de la familia HERV-W. En el contexto de la presente invención, las expresiones "HERV-W" y "MSRV" designan ambas elementos HERV-W. Específicamente, las expresiones "HERV-W Env" y "MSRV-Env" se refieren ambas a las mismas proteínas de envoltura. Normalmente, pocas variaciones eventuales en la secuencia de aminoácidos no evitan la unión de anticuerpos anti-Env específicos para su uso terapéutico, en particular, un anticuerpo que tiene una cadena pesada (HC) con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera (LC) con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad asociada a HERV-W" se refiere a una afección patológica asociada con la expresión de HERV-W, preferentemente de la proteína de envoltura de HERV-W. Normalmente, dicha enfermedad asociada a HERV-W es una enfermedad inflamatoria crónica. Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad inflamatoria crónica" se refiere a cualquier enfermedad en la que la inflamación persistente o recurrente es impulsada por la inmunidad innata y/o por la inmunidad adaptativa implicada en lesiones tisulares y/o puede detectarse localmente o sistémicamente a partir de una sobreexpresión de moléculas proinflamatorias.
Preferentemente, dicha enfermedad asociada a HERV-W se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2. Más preferentemente, dicha enfermedad asociada a HERV-W se selecciona del grupo que consiste en Esclerosis Múltiple (MS) y Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica (CIDP), que son enfermedades desmielinizantes.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, significan revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección, al que se aplica dicho término, o revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir uno o más síntomas del trastorno o afección, al que se aplica dicho término.
Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a prevenir que la enfermedad o afección ocurra en un sujeto que aún no ha presentado síntomas clínicos, lesiones típicas o disfunciones fisiológicas que permitirían su diagnóstico clínico.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" o "inmunoglobuMna" tienen el mismo significado, y se usarán igualmente en la presente invención. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Como tal, el término "anticuerpo" abarca no solo moléculas de anticuerpo completas, sino también fragmentos de anticuerpos, así como derivados de anticuerpos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de dicho anticuerpo que imita la región hipervariable, tal como una CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3). Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención retienen la afinidad y especificidad de unión de dicho anticuerpo. Dichos fragmentos son equivalentes funcionales de dicho anticuerpo y se unen sustancialmente al mismo epítopo que dicho anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, cadena pesada, cadena ligera, VL, VH, Fv, Fab, Fab', F(ab)2, y F(ab')2.
Como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de anticuerpo" se refiere a un fragmento del anticuerpo de la invención, que incluye preferentemente al menos una CDR de dicho anticuerpo, preferentemente al menos una CDR3 de dicho anticuerpo, fusionada a al menos una secuencia diferente de la secuencia natural (por ejemplo, una secuencia enlazadora de otra especie...), teniendo dicho derivado afinidad y especificidad de unión a HERV-W Env comparable a la del anticuerpo de la invención. Los derivados de acuerdo con la presente invención retienen la afinidad y especificidad de unión de dicho anticuerpo. Dichos derivados son equivalentes funcionales de dicho anticuerpo y se unen sustancialmente al mismo epítopo que dicho anticuerpo. Los ejemplos de derivados de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, scFv, (scFv)2 y diacuerpos.
En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas (HC) están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera (LC) mediante un enlace disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (1) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos.
Normalmente, la cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL, de sus siglas en inglés) y un dominio constante (CL, de sus siglas en inglés). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH, de sus siglas en inglés) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH, de sus siglas en inglés). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el sitio de unión específico del epítopo antigénico. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes tales como asociación de cadena de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria, unión de complemento y unión a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consta de las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de unión del anticuerpo y el epítopo antigénico. Los sitios de unión a anticuerpos están formados por restos que provienen principalmente de las regiones determinantes de la hipervariabilidad o complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés). Ocasionalmente, los restos de regiones no hipervariables o marco (FR, de sus siglas en inglés) influyen en la estructura general del dominio y, por lo tanto, en el sitio de unión. Regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina natural. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR procedente de cada región V de cadena pesada y ligera. Las Regiones Marco (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre CDR.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo de cualquier especie, preferentemente de ratón, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.
De acuerdo con la invención, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene un marco de región variable y regiones constantes de un anticuerpo humano pero retiene las CDR de un anticuerpo de cualquier especie, preferentemente de ratón.
El término "Fab" denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de la IgG con una proteasa, papaína, se unen a través de un enlace disulfuro.
Como se usa en el presente documento, el término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión al antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de la IgG con una proteasa, pepsina.
Como se usa en el presente documento, el término "Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene mediante el corte de un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.
Las expresiones "Un Fv de cadena sencilla" o "scFv"" se refieren a un polipéptido que es un heterodímero VH::VL unido covalentemente, y generalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL unidos mediante un enlazador de codificación peptídico. "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado mediante un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFvs monovalentes, o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se obligan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo de la invención" se refiere a un anticuerpo dirigido contra, es decir, que se une específicamente a, la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), preferentemente contra la proteína de envoltura de HERV-W de la familia de retrovirus endógeno humano tipo W (HERV-W), más preferentemente contra la proteína de envoltura de MSRV, más preferentemente contra el dominio extracelular de la proteína de envoltura de MSRV. Preferentemente, el anticuerpo de la invención comprende todas las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 a 6.
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra biológica", como se usa en este documento, se refiere a cualquier muestra biológica obtenida con el propósito de realizar una evaluación in vitro. En la presente invención, la muestra o muestra del paciente puede comprender cualquier fluido corporal o lesiones y tejido específicos de la enfermedad. Ejemplos de fluidos corporales incluyen sangre, suero, plasma, líquido de aspirado de pezón, orina, saliva, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo (CSF, de sus siglas en inglés). Los ejemplos de lesiones y tejidos específicos de la enfermedad incluyen placa cerebral de MS, biopsias nerviosas CIDP o biopsias de páncreas de diabetes.
Anticuerpo para su uso como fármaco antirretrovírico
La expresión patógena de HERV-W se produce en determinados individuos cuando se asocia con afecciones patológicas, en particular, cuando se expresan elementos asociados a la esclerosis múltiple (MSRV) de esta familia HERV-W. Se ha demostrado que esto implica a la proteína de envoltura como el único agente patógeno entre las proteínas codificadas por HERV-W cuando se expone al sistema inmunitario o a las células neurogliales a pesar de la evidencia de antígenos codificados por gag de HERV-W en pacientes.
Hasta la fecha, la estrategia terapéutica ha consistido en dirigir a la proteína de envoltura de HERV-W con un anticuerpo neutralizante humanizado, para prevenir e inhibir sus efectos inmunoinflamatorios y neuropatógenos en las enfermedades humanas asociadas a HERV-W. Por consiguiente, este enfoque terapéutico se dirige cadena arriba de la cascada inflamatoria y de los efectos citotóxicos dirigidos, en particular, cadena arriba de la cascada desmielinizante inflamatoria con bloqueo de remielinización en el origen de las lesiones con potencial de curación deteriorado en el sistema nervioso central (CNS, de sus siglas en inglés) de la MS.
Los inventores han evaluado un anticuerpo IgG4 humanizado que se une selectivamente al dominio extracelular de la proteína de envoltura de MSRV, denominado en el presente documento "GNbAC1" por su seguridad y farmacocinética en voluntarios sanos en un ensayo clínico de fase I. Este anticuerpo también se ha evaluado en pacientes con MS durante un año, con infusiones repetidas de anticuerpo GNbAC1 cada 4 semanas a 6 mg/kg o 2 mg/kg en dos cohortes paralelas. En el último ensayo clínico de fase IIa en pacientes con MS, los inventores obtuvieron muestras de sangre de pacientes antes y durante el estudio en el que se analizaron los biomarcadores de HERV-W por primera vez después de 6 meses de tratamiento mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) para estudiar la expresión específica de ARNm de HERV-W env y pol junto con el tratamiento con GNbAC1.
Los resultados así obtenidos han revelado un efecto completamente inesperado y desconocido de la neutralización de la proteína HERV-W Env in vivo por el anticuerpo GNbAC1.
De hecho, los inventores descubrieron que los pacientes humanos tratados con este anticuerpo han revelado un efecto inhibidor sobre la expresión del genoma retrovírico de HERV-W, que no se limita al gen env que expresa la proteína de envoltura como diana específica de GNbAC1. De hecho, los resultados de los inventores indican indiscutiblemente que tanto los niveles de ARNm env (que codifica la proteína de envoltura de HERV-W) como los de ARNm pol (que codifican enzimas de HERV-W, incluida la transcriptasa inversa) mostraron una disminución paralela y progresiva después de tres y seis meses de tratamiento, en comparación con los niveles medidos antes del tratamiento en los mismos pacientes.
Por lo tanto, se ha observado un efecto antirretrovírico significativo sobre la expresión de HERV-W después de 6 meses de tratamiento con GNbAC1, y afectó a las expresiones de los genes env y pol en paralelo. Como no se espera que la expresión de ARN retrovírico de HERV-W esté regulada por la expresión de la proteína de envoltura de HERV-W, tanto más ARNm del gen pol que codifica proteínas antigénicas totalmente no relacionadas, los inventores concluyen que un efecto desconocido de HERV-W Env (o MSRV-Env) produce un efecto positivo en la regulación genética de HERV-W en relación con su expresión asociada a la enfermedad, como se observa en pacientes con MS, y ha sido antagonizado mediante GNbAC1 en pacientes del ensayo clínico de fase IIa realizado por los inventores (véase el Ejemplo 1). Este efecto no está en absoluto relacionado con los efectos fisiopatológicos de HERV-W Env conocidos en los sistemas inmunitario y neuroglial.
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo para su uso como un fármaco antirretrovírico dirigido a un virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV), en donde dicho anticuerpo, fragmento o derivado está dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env).
Como se usa en el presente documento, la expresión "fármaco antirretrovírico dirigido a virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV)" se refiere a un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo capaz de inhibir la expresión y/o la replicación de un virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV). Más específicamente, dicha expresión se refiere a un anticuerpo capaz de:
- suprimir o inhibir total o parcialmente la replicación de un virus perteneciente al HERV, preferentemente perteneciente a la familia HERV-W. Normalmente, dicha supresión o inhibición de la replicación es global y completa; o
- suprimir o inhibir total o parcialmente la expresión de un virus perteneciente a retrovirus endógenos humanos (HERV), preferentemente un virus que pertenece a la familia de retrovirus endógenos humanos tipo W (HERV-W) o la expresión de la proteína de envoltura de dicho virus.
Preferentemente, dicho virus pertenece a la familia de retrovirus endógeno humano tipo W (HERV-W). Más preferentemente, dicho virus es MSRV. En particular, el anticuerpo se dirige contra la proteína de envoltura de MSRV.
Más particularmente, el fármaco antirretrovírico, de acuerdo con la presente divulgación, suprime o inhibe total o parcialmente la expresión de las proteínas codificadas por env y/o pol de un virus que pertenece al HERV, preferentemente, un virus que pertenece al HERV-W.
Los inventores han demostrado que dirigir la proteína de envoltura específica de MSRV conduce al sorprendente efecto de inhibir o suprimir la expresión del virus. Como se ha mencionado previamente, el MSRV está implicado en el inicio y en el desarrollo de varias enfermedades. Por consiguiente, el anticuerpo de la presente divulgación es muy prometedor para su uso para tratar una enfermedad asociada a HERV-W, preferentemente una patología asociada con la expresión de la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env).
Preferentemente, dicha enfermedad asociada a HERV-W se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2.
Más preferentemente, dicha enfermedad asociada a HERV-W se selecciona del grupo que consiste en Esclerosis Múltiple (MS) y Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica (CIDP).
La presente divulgación también se refiere a un agente para su uso para prevenir y/o tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2, en donde dicho agente consiste en un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento o derivado del mismo. En este caso específico, el anticuerpo previene la expresión de HERV-W.
En particular, el anticuerpo, fragmento o derivado de la presente divulgación comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEC ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
En particular, el anticuerpo, fragmento o derivado de la presente divulgación comprende:
- una cadena ligera en donde el dominio variable comprende cada una de las 3 CDR como se representa en SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3; y
- una cadena pesada en donde el dominio variable comprende cada una de las 3 CDR como se representa en SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) mencionadas anteriormente se describen en la Tabla 1:
Tabla 1: Dominios CDR de un anticuer o de acuerdo con la invención
Figure imgf000007_0001
En particular, el anticuerpo, fragmento o derivado de la divulgación comprende:
- una región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en la SEQ ID NO: 7; y
- una región variable de cadena pesada (VH) como se muestra en la SEQ ID NO: 8.
Las regiones variables ligeras y pesadas mencionadas anteriormente se describen en la Tabla 2:
Tabla 2: Re iones variables li eras esadas de un anticuer o de acuerdo con la invención
Figure imgf000007_0002
En particular, el anticuerpo, fragmento o derivado de la divulgación se selecciona del grupo que consiste en un Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, un diacuerpo y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Más particularmente, el anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales de la divulgación son monovalentes, bivalentes, multivalentes, monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. En otro caso, el anticuerpo dirigido contra HERV-W Env es un fragmento de unión o un conjugado. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden conjugarse con un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico o una enzima activadora de profármacos.
También puede ser deseable modificar el anticuerpo de la divulgación con respecto a las funciones efectoras, por ejemplo, con el fin de potenciar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC, de sus siglas en inglés) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, de sus siglas en inglés) del anticuerpo. Esto se puede conseguir introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse uno o varios restos cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de la destrucción celular mediada por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Caron PC. Et al. 1992; y Shopes B. 1992).
Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la divulgación puede ser útil para alterar el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por "alteración" se entiende la deleción de una o más fracciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos está normalmente ligada a N. "Ligada a N" se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se realiza sistemáticamente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glucosilación ligados al átomo de N).
En otro caso, el anticuerpo de la divulgación es un anticuerpo monoclonal humanizado, más preferentemente un anticuerpo monoclonal humanizado IgG4.
Dicho anticuerpo humanizado puede producirse mediante la obtención de secuencias de ácido nucleico que codifican para el dominio de CDR mediante su inserción en un vector de expresión para células animales que tienen genes que codifican una región constante de cadena pesada idéntica a la de un anticuerpo humano; y una región constante de cadena ligera idéntica a la de un anticuerpo humano, y que expresa el vector de expresión mediante su introducción en una célula animal. El vector de expresión de anticuerpo humanizado puede ser de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo existen en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo en tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpos humanizados, la facilidad de introducción en las células animales y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L de anticuerpos en las células animales, es más preferido un vector de expresión de anticuerpos humanizados de tipo en tándem. Los ejemplos del vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo en tándem incluyen pKANTEX93, pEE18 y similares. Los métodos para producir anticuerpos humanizados basados en a Dn recombinante convencional y técnicas de transfección génica son bien conocidos en la materia. Los anticuerpos se pueden humanizar usando diversas técnicas conocidas en la materia, que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR, remodelación o acondicionamiento de la superficie y reorganización de cadenas. También se conoce la tecnología general de ADN recombinante para la preparación de dichos anticuerpos.
Por lo tanto, en particular, la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende:
- una cadena ligera en donde el dominio variable comprende cada una de las 3 CDR como se representa en SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3; y
- una cadena pesada en donde el dominio variable comprende cada una de las 3 CDR como se representa en SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
En particular, la cadena pesada (HC) de dicho anticuerpo humanizado tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 9 y la cadena ligera (LC) de dicho anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 10. Este anticuerpo específico se denomina en el presente documento "GNbACI". Las cadenas pesadas y ligeras mencionadas anteriormente se desvelan en la Tabla 3:
Tabla 3: HC LC del anticuer o humanizado
Figure imgf000009_0001
Composición para su uso como fármaco antirretrovírico
Los inventores investigaron además el efecto antirretrovírico recientemente revelado del anticuerpo de la divulgación. Para este fin, se evaluó su efecto in vitro en cultivos celulares que expresan proteínas codificadas por gag, pol y env de HERV-W, según lo detectado por anticuerpos específicos en el análisis de transferencia Western. Los inventores han confirmado que la expresión de la proteína pol correspondiente a la transcriptasa inversa (RT, de sus siglas en inglés) de HERV-W parecía menos importante en las células cultivadas en presencia de GNbAC1, además de la disminución de los niveles de ARN pol en pacientes tratados con GNbAC1. Por otro lado, se sabe que la RT amplifica la expresión retrovírica mediante la generación de copias adicionales de ADN retrovírico a partir de ARN expresado. Estas copias de ADN retrovírico recién producidas pueden expresar el ARN correspondiente, amplificando así la expresión global del elemento retrovírico mediante la multiplicación de las copias de expresión a través de un producto de esta expresión en sí, tal como la RT del ARN pol.
Por consiguiente, tuvieron la idea de que la combinación de GNbACI y un inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírico como la azidotimidina (AZT) podría producir mejores efectos inhibidores en la expresión de HERV-W, en particular en su expresión de RT como se ejemplifica actualmente.
Esto se estudió además y, sorprendentemente, esta combinación de un anticuerpo dirigido contra HERV-W Env y de un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica, abolió la expresión de la proteína HERV-W RT en estas células productivas.
En cultivos paralelos y simultáneos, la detección positiva de HERV-W RT mediante transferencia Western en células no tratadas y la reducción leve o parcial en células tratadas con GNbAC1 o AZT solo, confirmaron la especificidad y la importancia de esta observación: en las mismas condiciones, la combinación de la proteína HERV-W Env neutralizante de anticuerpos GNbAC1 y AZT había abolido la detección de esta proteína HERV-W RT.
Por lo tanto, la invención se refiere a una preparación combinada o una composición que comprende:
- un anticuerpo, un fragmento o un derivado de acuerdo con la invención; y
- un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica, para su uso como fármaco antirretrovírico dirigido a un virus perteneciente a los retrovirus endógenos humanos (HERV), en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
Preferentemente, dicho fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica se selecciona del grupo que consiste en azidotimidina, entecavir, lamivudina, adefovir, sofosbuvir, didanosina, tenofovir, abacavir, lamivudina, estavudina, emtricitabina, zalcitabina, telbivudina y didanosina. Más preferentemente, dicho fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica es azidotimidina (AZT). Todos los datos técnicos divulgados anteriormente son aplicables en el presente documento.
La composición de la invención proporciona una perspectiva inesperada y novedosa para la intervención terapéutica en la expresión patogénica de HERV-W. El tratamiento con una preparación combinada o una combinación que comprende:
- un anticuerpo dirigido contra HERV-W Env, tal como GNbAC1; y
- una molécula dirigida a la transcriptasa inversa en sí misma y/o su actividad, tal como AZT, demostró ser muy útil para inhibir la expresión de HERV-W RT en enfermedades asociadas con HERV-W.
Por lo tanto, la invención también se refiere a una preparación combinada o una composición que comprende:
- un anticuerpo dirigido contra HERV-W Env, un fragmento o un derivado como se desvela anteriormente; y - un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica,
para su uso para prevenir y/o tratar una enfermedad asociada a HERV-W, en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
La invención también se refiere a una preparación combinada o una composición que comprende:
- un anticuerpo dirigido contra HERV-W Env, un fragmento o un derivado como se describe anteriormente; y - un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica,
para su uso para prevenir y/o tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2. Más preferentemente, dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste en Esclerosis Múltiple (MS) y Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica (CIDP), en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR- L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
Todos los datos técnicos divulgados anteriormente son aplicables en el presente documento.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento o derivado del mismo, y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica, preferentemente azidotimidina como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en un método para tratar una enfermedad asociada a HERV-W, preferentemente, una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
Todos los datos técnicos divulgados anteriormente son aplicables en el presente documento.
Kit de acuerdo con la invención
La expresión de estos elementos de HERV-W en pacientes con enfermedad y/o su detección en lesiones y tejido específicos de la enfermedad identifica y define la categoría general de síndromes o enfermedades asociadas a HERV-W. También refleja la actividad biológica de HERV-W durante el transcurso del tiempo de la evolución de la enfermedad y durante sus tratamientos.
Por lo tanto, la detección de HERV-W con sensibilidad mejorada, con especificidad de enfermedad particular o con asociación particular con características clínicas en pacientes con síndromes o enfermedades asociadas con HERV-W, constituye un valor importante para la identificación y estratificación diagnóstica, así como para el seguimiento y la monitorización terapéutica de los pacientes. De un panel de cebadores, sondas y protocolos de PCR, los inventores seleccionaron y desarrollaron un kit de cebadores y sondas, que resultó útil para detectar la presencia y/o medir el nivel de expresión de HERV en pacientes.
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un kit que comprende al menos uno, preferentemente, al menos dos, preferentemente, al menos tres, preferentemente, al menos cuatro, preferentemente, al menos cinco, preferentemente, al menos seis, preferentemente, al menos siete, preferentemente, al menos ocho, preferentemente, al menos nueve, preferentemente, al menos diez oligonucleótidos seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11 a 28.
Preferentemente, dicho kit comprende al menos la SEQ ID NO: 17 y/o 18 o la SEQ ID NO: 19 y 20.
Alternativamente, dicho kit comprende:
- SEQ ID NO: 19, 20, 23, 24 y 25; o
- SEQ ID NO: 17, 18, 23, 24 y 25; o
- SEQ ID NO: 19, 20, 14, 15, 16, 23, 24 y 25; o
- SEQ ID NO: 17, 18, 14, 15, 16, 23, 24 y 25.
Más preferentemente, el kit de la presente divulgación comprende todos los oligonucleótidos como se representa en la s Eq ID NO: 11 a 28. Normalmente, dicho kit está destinado a usarse para realizar una pCr o, más particularmente, un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR). Por lo tanto, el kit, preferentemente, también comprende cebadores y/o sondas de genes celulares de referencia más apropiados para la cuantificación relativa de ARN o ADN y para diversas indicaciones.
Dicho kit, preferentemente, comprende además:
- SEQ ID NO: 26, 27 y 28; o
- Secuencias específicas para el gen GUSB; o
- Secuencias específicas para el gen RNAsa P; o
- Secuencias específicas para un gen celular de referencia para la cuantificación relativa por qPCR.
Dicho kit es útil para controlar la detección y/o la cuantificación de un virus y que pertenece a la familia de retrovirus endógenos humanos tipo W (HERV-W), que comprende MSRV pero también otros subtipos de HERV-W. Más específicamente, el kit de la divulgación es útil para detectar y/o cuantificar las secuencias que codifican para HERV-W Env como las que codifican para la poliproteína HERV-W pol, incluyendo RT. Normalmente, la detección y/o la cuantificación de HERV-W en un paciente abarca:
(i) la detección y/o la cuantificación de ARN, ADN o antígenos HERV-W específicos, preferentemente detectados en fluidos corporales o en tejidos y lesiones específicos de enfermedades,
(ii) la detección y/o la cuantificación de un número elevado de copias de ADN o ARN en células o tejidos de la sangre o de órganos con lesiones o disfunciones.
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), un fragmento o derivado del mismo para su uso como un fármaco antirretrovírico dirigido a un virus que pertenece a HERV, preferentemente a HERV-W, más preferentemente a MSRV, en un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W, en donde dicho paciente se identifica mediante un método que comprende una etapa i) de detección y/o cuantificación de HERV-W en una muestra biológica.
En este caso específico, el médico podría adaptar y optimizar la atención médica adecuada de un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W. El monitoreo de la presencia y/o del nivel de expresión de HERV-W es altamente apropiado para la atención de seguimiento y la toma de decisiones clínicas. De hecho, el médico puede definir la terapia adecuada con una estrategia óptima para cada paciente.
Normalmente, la etapa i) de detección y/o cuantificación puede realizarse de acuerdo con las técnicas de rutina, bien conocidas por el experto en la materia. Normalmente, dicha etapa i) comprende poner en contacto una muestra biológica del paciente con reactivos selectivos tales como sondas, cebadores, ligandos o anticuerpos, y detectar así la presencia de ácidos nucleicos o proteínas de interés originalmente en la muestra. Preferentemente, dicha etapa i) de detectar la presencia y/o cuantificar HERV-W se realiza con el kit de acuerdo con la presente divulgación.
Todos los datos técnicos mencionados anteriormente son aplicables en el presente documento.
Composición farmacéutica
Un objeto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz de un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) y que comprende opcionalmente un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica.
Cualquier agente terapéutico de la invención como se describió anteriormente puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.
"Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea adecuado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico auxiliar de cualquier tipo.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen naturalmente dependerán de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para administración tópica, oral, intranasal, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutánea y similar.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Estos pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que después de la adición, en función del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.
Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros, y en particular, en función del modo de administración usado, de la patología relevante o, como alternativa, de la duración deseada del tratamiento.
Para preparar composiciones farmacéuticas, una cantidad eficaz del anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) puede disolverse o dispersarse en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.
Tras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares. Preferentemente, el anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) de la invención o el fragmento y el derivado del mismo se puede formular en un tampón en el que se solubilizó, almacenó e inyectó a los pacientes. Preferentemente, dicho tampón comprende histidina 20 mM, sacarosa al 5 % y polisorbato 20 al 0,01 % y presenta un pH de 6,0. Un ejemplo de una formulación utilizada para la administración intravenosa de GNbAC1 se presenta en el Ejemplo 3.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución puede tamponarse adecuadamente y el diluyente líquido se vuelve en primer lugar isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, puede disolverse una dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y o bien se añade a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o se inyecta en el sitio de infusión propuesto, (véase, por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá cierta variación en la dosis dependiendo de la afección del paciente que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el paciente individual.
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyecciones intravenosas o intramusculares, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma utilizada actualmente.
Método terapéutico y método de monitoreo
La divulgación también se refiere a un método para inhibir la expresión y/o la replicación de un virus que pertenece a retrovirus endógenos humanos (HERV) en un paciente mediante la administración a dicho paciente de un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura HERV-W (HERV-W Env).
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para prevenir y/o tratar a un paciente que padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2, mediante la administración a dicho paciente de un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env), un fragmento o un derivado del mismo, en donde dicho anticuerpo actúa como un fármaco antirretrovírico dirigido a HERV, preferentemente dirigido a HERV-W, más preferentemente dirigido al MSRV.
La divulgación también se refiere a un método de tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W que comprende las etapas de:
1) predecir el pronóstico de un paciente mediante la detección y/o cuantificación de un virus que pertenece a la familia de los retrovirus endógenos humanos (HERV), preferentemente HERV-W, más preferentemente MSRV, en una muestra biológica mediante el kit de la presente divulgación; y después
2) si dicha etapa 1) muestra la expresión de un retrovirus endógeno humano (HERV), entonces el método de divulgación comprende una etapa 3) de proporcionar el anticuerpo, fragmento o derivado de la divulgación a dicho paciente.
La divulgación también se refiere a un método para monitorear la respuesta a un tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
a. tratar a dicho paciente con el anticuerpo, fragmento o derivado de acuerdo con la presente divulgación; después
b. detección y/o cuantificación de HERV-W en una muestra biológica de dicho paciente.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para monitorear la respuesta a un tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W, comprendiendo dicho método una etapa de detección y/o cuantificación de HERV-W en una muestra biológica de dicho paciente. Preferentemente, dicho paciente comprende un anticuerpo, un fragmento o un derivado de acuerdo con la presente descripción. La expresión "paciente que comprende un anticuerpo" se refiere a un paciente que fue tratado con un anticuerpo y presenta una cantidad detectable de dicho anticuerpo en su sangre, tejidos u órganos. Normalmente, dicho anticuerpo, fragmento o derivado se proporcionó o administró al paciente previamente a la etapa de detectar y/o cuantificar HERV-W.
De acuerdo con la presente divulgación, en caso de monitorear la respuesta a un tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada a HERV-W, una muestra biológica puede ser una muestra de fluidos corporales tales como sangre, fluido cefalorraquídeo, orina o en lesiones o tejido específico de la enfermedad tales como placas cerebrales de MS, biopsias de nervios de CIDP o biopsias de páncreas de diabetes.
Normalmente, la etapa b. de detección y/o cuantificación puede realizarse de acuerdo con las técnicas de rutina, bien conocidas por el experto en la materia. Normalmente, dicha etapa b. comprende poner en contacto una muestra biológica del paciente con reactivos selectivos tales como sondas, cebadores, ligandos o anticuerpos, y detectar así la presencia de ácidos nucleicos o proteínas de interés originalmente en la muestra. Preferentemente, dicha etapa b. de detección de la presencia y/o mediación del nivel de expresión de HERV-W se realiza con el kit de acuerdo con la presente divulgación.
Todos las características técnicas divulgadas anteriormente son aplicables en el presente documento.
Leyendas de las figuras
Figura 1
(A) Niveles de transcripción de HERV-W env y pol en la inclusión, según lo detectado por diferentes pares de cebadores y sondas para qPCR.
(B) Transcripción de HERV-W env con sondas y cebadores "env" y "UNO" en paralelo para pacientes incluidos para la cohorte de 2 mg/ml (círculos simples) y para la cohorte de 6 mg/ml (cuadrados simples). (C) Transcripción de HERV-W env con sondas y cebadores "UNO2", "syn" y "pol" en paralelo para pacientes incluidos para la cohorte de 2 mg/ml (círculos simples) y para la cohorte de 6 mg/ml (cuadrados simples). Las ordenadas representan la expresión relativa (relación con GUS B) del ARN diana para cada paciente y las abscisas representan los diferentes protocolos qPCR utilizados en las mismas muestras.
Figura 2: Diferencia en los niveles de transcripción de HERV-W env y pol entre diferentes formas clínicas de MS en la inclusión, según lo detectado por diferentes pares de cebadores y sondas para qPCR (A) protocolo "env" (B) protocolo "UNO" (C) protocolo "UNO2" (D) protocolo "syn" (E) protocolo "pol". Las ordenadas representan la expresión relativa (relación con GUS B) del ARN diana para cada paciente y las abscisas representan las diferentes formas clínicas de MS: Progresiva primaria (PPMS, de sus siglas en inglés), Remitente recurrente (RRMS, de sus siglas en inglés) y Progresiva secundaria (SPMS, de sus siglas en inglés).
Figura 3: La correlación entre los niveles de transcripción de HERV-W env y pol y los parámetros clínicos de los pacientes con MS en la inclusión, tal como se detecta por pares de cebadores particulares y sondas para qPCR (A) el protocolo "Syn" evidencia una correlación negativa entre la expresión de HERV-W de tipo Sincitina y la duración de la enfermedad: prueba de correlación de Pearson r = -0,96; p = 0,009 (B) el protocolo "Syn" evidencia una correlación positiva entre la expresión de HERV-W tipo Sincitina y el índice de progresión de la enfermedad: prueba de correlación de Pearson r = 0,95; p = 0,014 (C) el protocolo "pol" también evidencia una correlación positiva entre la expresión del gen tipo HERV-W pol (que codifica la proteasa, la transcriptasa inversa y la integrasa) y el índice de progresión de la enfermedad: prueba de correlación de Pearson r = 0,95; p = 0,048. Las ordenadas representan la duración de la enfermedad en años (A) o el índice de progresión (B y C); las abscisas representan la expresión relativa (relación con GUS B) del ARN diana para cada paciente.
Figura 4: Variación de los niveles de transcripción relacionados con HERV-W durante los primeros 6 meses de GNC002. Los datos representan la expresión relativa media de ARN dirigido a GUS B para cada transcripción relacionada con HERV-W en la cohorte de 2 mg/kg (A), en la cohorte de 6 mg/kg (B) y de todos los pacientes incluidos en GNC002 (C). Las líneas discontinuas representan el nivel de las transcripciones correspondientes en la inclusión. Las ordenadas representan la expresión relativa promedio (relación con GUS B) del a Rn diana para cada protocolo qPCR en el grupo de pacientes. Las abscisas representan el número de inyecciones de GNbAC1 a los pacientes.
Figura 5: Variación de los niveles de transcripción relacionados con HERV-W durante los primeros 6 meses de GNC002. Los datos representan la expresión relativa media de ARN dirigido a GUS B para cada transcripción de HERV-W en todos los pacientes incluidos en GNC002. La variación en los niveles de transcripción de HERV-W env y pol junto con el tratamiento en la MS desde la inclusión hasta la fecha de la sexta inyección se ilustra, como transferencia de Whiskers (percentiles 10-90) de cada paciente medidos con diferentes pares de cebadores y sondas para qPCR (A) protocolo "env" (B) protocolo "UNO" (C) protocolo "UNO2" (D) protocolo "syn" (E) protocolo "pol".
Las ordenadas representan la expresión relativa promedio (relación con GUS B) del ARN diana para cada protocolo qPCR en el grupo de pacientes. Las abscisas representan el número de inyecciones de GNbACI a los pacientes, antes de las cuales se recolectaron muestras de sangre (por lo tanto, "1" corresponde al estado antes de cualquier inyección, "3", el estado 4 semanas después de la segunda inyección y "6", el estado 4 semanas después de la quinta inyección.
Figura 6: Las células CH2 expresan espontáneamente proteínas HERV-W codificadas por gag, pol y env, tal como se detectan con anticuerpos específicos mediante transferencia Western.
El peso molecular aparente de las bandas detectadas con cada anticuerpo específico contra antígenos codificados por HERV-W gag, pol y env se indica en el lado derecho del carril correspondiente al extracto celular para cada antígeno. El carril izquierdo en A, B y C representa los marcadores de peso molecular utilizados para la estimación de KDa.
(A) Poliproteína HERV-W gag y productos de escisión, incluida la proteína de la cápside típica de aproximadamente 30 KDa.
(B) Poliproteína HERV-W Pol y productos de escisión, incluida la proteína transcriptasa inversa típica de aproximadamente 55 KDa.
(C) Proteína de envoltura HERV-W, productos de escisión y multímeros, incluidas las unidades escindidas SU (superficie) y TM (transmembrana) de aproximadamente 45 y 35 KDa. Los productos env glucosilados se detectan con una posible variación en las glucosilaciones entre bandas monoméricas detectadas alrededor de 75 y 80 KDa. Los 55 KDa corresponden al monómero no glucosilado, con un dímero de alrededor de 100 KDa. La banda de alrededor de 160 KDa podría ser un dímero glucosilado o un trímero no glucosilado Figura 7: Proteína de transcriptasa inversa codificada por HERV-W pol en cultivos CH2 con o sin tratamiento con GNbAC1 y/o AZT.
El peso molecular aparente de las bandas detectadas con el anticuerpo específico contra los antígenos codificados con HERV-W pol se indica en el lado derecho de la transferencia Western. El número de los carriles de la transferencia Western (1 a 6) se indican debajo de la imagen.
1) Tratamiento combinado con GNbAC1 y AZT
2) Tratamiento solo con AZT
3) Tratamiento solo con GNbAC1
4) Células tratadas simuladas (sin tratamiento)
5) Pocillo vacío
6) Marcador de peso molecular
Ejemplos
Ejemplo 1: Inhibición de la expresión de ARNm de retrovirus endógeno humano tipo W en pacientes con esclerosis múltiple tratados con GNbAC1.
GNbAc1 es un anticuerpo monoclonal IgG4 dirigido a la proteína de envoltura de retrovirus asociada a esclerosis múltiple (MSRV-Env), un miembro de la familia HERV-W de elementos retrovíricos endógenos, por lo tanto, también se conoce como HERV-W Env. GNbAC1 ha mostrado un perfil de seguridad favorable y una farmacocinética lineal en un ensayo clínico de fase I realizado en voluntarios sanos.
El presente ensayo clínico de Fase IIa GNC002 se realizó para evaluar el perfil de seguridad y la farmacocinética de GNbAC1 a 2 y 6 mg/kg en 10 pacientes con MS. GNC002 consistió en un estudio longitudinal de 12 meses, en el cual GNbAC1 se administra mensualmente.
El presente análisis se realizó en muestras recolectadas durante los primeros 6 meses de GNC002, donde se evaluaron los niveles de transcripciones relacionadas con HERV-W mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, de sus siglas en inglés) de pacientes inscritos. Las transcripciones de HERV-W se evaluaron mediante diferentes conjuntos de cebadores/sondas de la siguiente manera: MSRV-env, HERV-W-UNO, HERV-W-UNO2,
Materiales y métodos
Las muestras se recogieron en tubos Vacutainer CPT de 4 ml, se procesaron, almacenaron y enviaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por Geneuro en "The GNC002 Laboratory Manual".
Los 2 centros de reclutamiento implicados en el estudio GNC002 proporcionaron PBMC congeladas de 10 pacientes con MS.
n i ími i l i
Figure imgf000015_0001
continuación
Figure imgf000016_0001
Programas informáticos
- Biorad CFX Manager 2.0: ejecución y análisis de PCR
- Genex 5: suavizado de datos brutos de PCR
- Graph Pad Prism: transferencias
- SigmaStat: análisis estadísticos
La prueba de normalidad utilizada es la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las correlaciones se determinaron con el análisis de Pearson Product Moment si los datos eran paramétricos, o el análisis de Spearman Rank Order si los datos no eran paramétricos.
Protocolos
En resumen, la primera etapa consistió en la extracción de ARN total de las muestras de PBMC. Las muestras son PBMC aisladas de la sangre recogida en tubos de CPT y congeladas en 0,5 ml de DMSO al 10 % en suero de ternera fetal. Después de descongelar, las muestras de PBMC se lavaron con PBS helado y se extrajeron los ARN totales con el mini kit QIAamp RNeasy. A continuación, los ADNc se prepararon mediante retrotranscripción de todo el ARNm contenido en ARN totales extraídos previamente. Se realizaron PCR cuantitativas en estos ADNc, con la adición de un estándar interno utilizado como un calibrador entre placas (que permite la estandarización de los valores a lo largo de un experimento con múltiples placas). Los resultados se expresaron como la expresión relativa del ARN diana (MSRV/HERV-W), en una relación con la expresión del ARN de GUS B, un gen de mantenimiento de referencia con un nivel de expresión estable en la población con MS.
Secuencias de cebadores y sondas
El conjunto de cebadores/sonda de detección comercial para el gen de mantenimiento de control, GUS B, es el ensayo de expresión génica Taqman GusB (biosistema aplicado 4448485). VIC® es el marcador de tinción fluorescente detectado en el extremo 5' de la sonda GusB.
Los cebadores y la sonda de MSRV-env están diseñados para detectar específicamente la secuencia que codifica la proteína MSRV-Env y no Sincitina. Por el contrario, los cebadores de Sincitina permiten la amplificación específica de la secuencia que codifica para Sincitina, pero no MSRV-env. La fluorescencia del marcador de tinción FAM™ se mide en la sonda de MSRV-env y Sincitina.
Los cebadores UNO2 están diseñados por Geneuro para reconocer la secuencia de MSRV-Env que se supone que tiene una posible función inmunosupresora, por analogía con la región correspondiente en otras secuencias de retrovirus endógenas; sin embargo, esta terminología ("péptido/secuencia inmunosupresora") se usa en el presente documento para localizar un dominio definido en proteínas de envoltura retrovíricas, que pueden no ser inmunosupresoras en muchos retrovirus. Estos cebadores también pueden hibridar la secuencia que codifica Sincitina.
UNO, diseñado por Geneuro_une secuencias que codifican para MSRV-Env y Sincitina. Ninguna sonda está diseñada para las secuencias amplificadas por los cebadores UNO y UNO2, por lo tanto, la fluorescencia verde SYBR permite la cuantificación de la amplificación de estas secuencias.
Los cebadores y la sonda de MSRV-pol se diseñaron por Geneuro y reconocen la secuencia que codifica la transcriptasa inversa de MSRV. La detección de la hibridación de la sonda de MSRV-pol se cuantifica con el indicador fluorescente FAM™.
Tabla 4: Secuencia de todos los cebadores sondas utilizados en este estudio de biomarcadores
Figure imgf000017_0001
El fluoróforo detectado por el termociclador CFX está en 5' de la sonda. Para los cebadores establecidos sin sonda, la detección se realiza con tinte verde SYBR intercalante.
Análisis de resultados
Los criterios de exclusión para las muestras que previenen sesgos en los análisis fueron los siguientes: - Concentración de ARN de la muestra por debajo de 10 ng/pl, después de la extracción y el tratamiento con DNasa
- Desviación estándar del triplicado de PCR por encima de 0,2 Cq, para una muestra
- Cq (Ciclo de cuantificación) de GUS B por encima del límite de degradación, lo que indica que el ARN no está alcanzando el nivel de calidad esperado en el estudio. El límite de degradación se calcula de la siguiente manera: Media 2 x desviación estándar de todos los valores individuales del Cq de GUS B
Todos los Cq individuales para genes MSRV/HERV-W env y GUS B están estandarizados de acuerdo con sus propios estándares internos añadidos en cada placa experimental con el programa informático Genex® (análisis MultiD AB, Suecia).
La expresión relativa de cada ARN diana dentro de cada muestra se calcula de la siguiente manera:
Expresión relativa de ARN dirigido a GUS B = 2(Cq de GUS B - Cq de ARN dirisido) Rendimiento de extracción y exclusión de muestras
Después de la extracción, la concentración total de ARN para cada muestra se determina con un aparato Nanodrop®. Se excluyeron todas las muestras con una concentración de ARN total inferior a 10 ng/pl. Antes de la cuantificación de ARN total, el ARN total se sometió a un tratamiento con ADNasa para eliminar el ADN genómico contaminante que eventualmente quedaba en la preparación de ARN total. Después de esta etapa con DNasa, la ausencia de a Dn genómico contaminante para cada muestra se controló mediante una PCR sin retrotranscripción (NoRT Ctrl n.° 1). Si se detecta ADN genómico durante esta etapa, las muestras correspondientes se someten a una segunda etapa de ADNasa y una segunda cuantificación de ARN, así como un segundo control NoRT (NoRT Ctrl n.° 2). Las muestras finalmente se excluyeron si el ADN genómico todavía estaba presente en la preparación, o si el ARN total estaba por debajo de 10 ng/pl después de este tratamiento adicional con DNasa.
Estandarización de datos sin procesar con Genex® y exclusión de muestras
Para armonizar los datos sin procesar recopilados a través de múltiples microplacas de PCR, todos los datos sin procesar se estandarizaron de acuerdo con el estándar interno presente en cada microplaca con el programa informático Genex. Las muestras para las cuales la desviación estándar del triplicado de PCR fue superior a 0,2 Cq se excluyeron del estudio. La calidad de una muestra se refleja en su nivel de expresión de GUS B. Todas las muestras por encima del límite de degradación se excluyeron del estudio.
Resultados
Niveles de transcripción relacionados con HERV-W en la inclusión
En el primer momento del estudio, se aislaron PBMC de la sangre de todos los sujetos antes de la primera administración de GNbAC1 o placebo. Por lo tanto, los resultados presentados en la Tabla 5 y en la Figura 1 corresponden al nivel basal de transcripciones de interés relacionadas con HERV-W para cada paciente en el momento de la inclusión en el estudio.
Figure imgf000019_0001
La distribución de los resultados de todos los pacientes es homogénea con los protocolos qPCR para "env" y "syn", pero se pueden ver diferencias en la distribución con los protocolos para UNO y UNO2 a pesar de la menor expresión relativa detectada para ARN específicamente dirigido con "UNO2".
No se observó diferencia en la distribución de niveles de transcripciones de HERV-W en la inclusión entre los pacientes que se inscribieron en las cohortes de 2 mg/kg y 6 mg/kg y entre los dos centros de reclutamiento implicados en el estudio.
Comparación de los niveles de transcripción de HERV-W env y pol con datos clínicos en la inclusión
La correlación de los parámetros clínicos con los niveles de transcripción relacionados con HERV-W en la inclusión se evaluó de acuerdo con la información resumida en la tabla 6.
Figure imgf000021_0001
En primer lugar, estos resultados evidenciaron el hecho de que, independientemente de los cebadores y las sondas utilizados para los diferentes protocolos qPCR y cualesquiera que sean los genes HERV-W (env o pol), los niveles más altos de ARN de HERV-W se encontraron en pacientes PPMS y los más bajos en SPMS (Figura 2). Esto proporcionó claramente nueva información de interés sobre el nivel de expresión transcripcional diferencial de HERV-W en pacientes con dos formas diferentes de MS progresiva (PPMS y SPMS). Esto también puede ser de interés para RRMS, pero solo uno de estos casos se representa en el presente documento con una expresión relativa intermedia.
Esto muestra que la cuantificación del nivel transcripcional de HERV-W en pacientes con MS puede tener un valor de diagnóstico y puede, por ejemplo, usarse con el propósito de respaldar un diagnóstico diferencial entre los casos de SPMS y pPMs. Esto también puede ser útil para estratificar los umbrales de qPCR para el pronóstico o la monitorización terapéutica en PPMS, SPMS y, eventualmente también, en RRMS.
En segundo lugar, a pesar de los números actualmente bajos, se encontraron correlaciones estadísticamente significativas entre los niveles de transcripción de ARN de HERV-W env y pol y la duración de la enfermedad y/o el índice de progresión, cuando se usan los protocolos "Syn" y "pol". Los otros protocolos que utilizan diferentes cebadores y sondas no arrojaron correlaciones significativas con los parámetros clínicos, lo que resalta el valor del protocolo seleccionado, como se muestra en la Figura 3.
Esto muestra que una selección de protocolos para la cuantificación del nivel de transcripción de HERV-W del gen env que codifica el subtipo Sincitina (protocolo "Syn", con SEQ ID NO: 14, 15 y 16) o el gen pol en general (protocolo "pol", con SEQ ID NO: 23, 24 y 25) también puede tener un valor de diagnóstico particular en la MS. En este caso, el protocolo de qPCR "syn" y "pol" puede usarse como un biomarcador de la actividad de la enfermedad relacionada con HERV-W (evolutividad de la progresión de la enfermedad) para la estratificación clínica, el seguimiento y la monitorización terapéutica. Esto también puede ser útil para estratificar la "duración frente a la actividad" de la enfermedad en la MS progresiva con qPCR "Syn", lo que aumenta las perspectivas de diferencias en las estrategias terapéuticas que se aplicarán de acuerdo con el nivel de transcripción de HERV-W env "Sincitina" en pacientes con evolución progresiva durante varios años (SPMS, en particular).
Niveles de transcripción relacionados con HERV-W durante 6 meses
Para cada paciente incluido en el estudio, se aislaron PBMC de la muestra de sangre en el día 1 (inclusión), día 2, día 8, día 15 y día 29. A continuación, los pacientes recibieron 5 administraciones mensuales adicionales de GNbAC1 y se aislaron PBMC de la muestra de sangre antes de cada infusión de anticuerpos. Por lo tanto, los siguientes resultados representan la variación de cada transcripción relacionada con HERV-W durante los primeros 6 meses de estudio GNC002.
La segunda administración de GNbAC1 ocurrió en diferentes momentos del día 1, dependiendo de los pacientes. Por lo tanto, la variación media de las transcripciones relacionadas con HERV-W se evaluó con muestras de sangre recogidas antes de cada administración de GNbAC1 solamente.
En la cohorte de 2 mg/kg, se observó una disminución de todos los niveles de transcripción de HERV-W en la 6a administración de GNbAC1, en comparación con los valores basales en la inclusión (Figura 4). Esto se confirma en la cohorte de 6 mg/kg (Figura 4). Cuando se agrupan todos los pacientes (cohortes de 2 mg/kg y 6 mg/kg), la disminución se evidencia mejor por los protocolos qPCR HERV-W UNO, UNO2 y pol en todo el estudio GNC002 (Figura 4). Esto también se ilustra con la distribución estadística de los valores medidos antes de la primera, tercera y sexta inyección de GNbAC1 en todos los pacientes (Figura 5).
Muy inesperadamente, la disminución también está marcada para ARNm pol. Este efecto no es lo que se espera que produzca un anticuerpo que se une específicamente a la proteína HERV-W Env después de ser inyectado una vez al mes durante seis meses en pacientes con una expresión de HERV-W asociada a la enfermedad. Este efecto sobre los ARNm que codifican las enzimas transcriptasa inversa, proteasa e integrasa parece, por lo tanto, único y novedoso para un anticuerpo anti-Env como GNbAC1. Por lo tanto, evidencia un efecto sobre la expresión global de HERV-W y, a través de sus productos codificados en pol, sobre su actividad retrovírica replicativa. Por lo tanto, muestra un efecto antirretrovírico, en particular, un efecto antirretrovírico endógeno dirigido a la familia HERV-W. En la Figura 5, la selección de los cebadores y sondas más precisos para los protocolos qPCR para un monitoreo terapéutico de grupos de pacientes tratados con GNbAC1 o con cualquier fármaco que interfiera con la expresión de HERV-W, es "UNO2" para HERV-W env y "pol" para HERV-W las enzimas que codifican el gen pol. Sin embargo, el cálculo de las proporciones con cifras obtenidas por otros protocolos qPCR también puede revelar un interés diagnóstico o pronóstico.
En este experimento, los niveles de transcripción relacionados con HERV-W en pacientes con MS incluidos en el estudio GNC002 se evaluaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando diferentes conjuntos de cebadores que amplifican diferentes secuencias representativas del gen env de HERV-W y un conjunto de cebadores que amplifican secuencias del pol de HERV-W (dentro de la región de codificación de la transcriptasa inversa). Las transcripciones de HERV-W investigadas en el presente documento se denominan MSRV-env, HERV-W-UNO, HERV-W-UNO2, HERV-W-Syn y MSRV-pol.
Los resultados indican claramente que estos biomarcadores pueden proporcionar datos bioclínicos sensibles de interés para el diagnóstico de la MS y para el monitoreo terapéutico de las enfermedades asociadas a HERV-W. Asimismo, los niveles de transcripción relacionados con HERV-W parecen ser más altos en pacientes con SPPM que en pacientes con SPMS, lo que confirma el valor de las pruebas de PCR cuantitativas actuales con los diferentes conjuntos de cebadores para la evaluación bioclínica de pacientes y, más allá, para fines de diagnóstico diferencial entre formas de MS progresiva (SPMS y PPMS).
Dado que todos los niveles de transcripción relacionados con HERV-W disminuyeron durante los primeros 6 meses de GNC002 en las cohortes de 2 mg/kg y 6 mg/kg, esto confirma el valor bioclínico de los conjuntos actuales de cebadores y protocolos qPCR para el monitoreo terapéutico de los pacientes y para una evaluación bioclínica de la eficacia terapéutica.
Finalmente, esto también proporciona evidencia biológica de que el tratamiento con anticuerpos anti-HERV-W Env (como GNbAC1) en pacientes con MS tiene un efecto inhibidor sobre la expresión de HERV-W, que no se esperaba para el nivel de ARNm de env, pero aún menos para el ARNm de pol. Esto indica claramente una eficacia de este tratamiento de anticuerpos anti-Env contra un retrovirus endógeno asociado con una enfermedad humana, como nunca se ha descrito con retrovirus exógenos humanos.
Ejemplo 2: La inhibición de la proteína codificada por el gen pol del retrovirus endógeno humano tipo W (transcriptasa inversa) se potencia sinérgicamente mediante un tratamiento combinado con el anticuerpo GNbAC1 y AZT.
A. Caracterización antigénica de un cultivo celular que expresa espontáneamente las proteínas gag, pol y env de HERV-W
Material y métodos
Cultivo celular que expresa espontáneamente las proteínas gag, pol y env de HERV-W
Las células CH2 humanas se mantuvieron en medio IMDM (12440053; Lifetech) complementado con suero de ternera fetal al 10 % (10270106; Invitrogen), penicilina/estreptomicina al 1 % (P4333; Sigma) a 37 °C con CO2 al 5 %. Extracción de proteínas
Extracción de proteínas
Se resuspendieron células CH2 en 500 pl de tampón RIPA (R0278, SIGMA) que contenía cóctel inhibidor de antifosfatasa cOmplete® (04693 132001; Roche) y LPG al 0,05 % (326495-22-1; Avanti Polar) a 4 °C, se incubaron durante 2 horas a 26 °C en una plataforma giratoria y se centrifugaron a 10000 g durante 20 minutos a 26 °C. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20 °C.
Transferencia Western
Los extractos de proteínas se diluyeron en tampón Laemmli 2X (Biorad) y se calentaron durante 5 minutos a 100 °C antes de cargar. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio al 7,5 % (TGX, Biorad). Los geles se ejecutaron durante un período de tiempo de 15 minutos a 120 mA en el búfer de ejecución (Life Technologies). Después de la transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm (Biorad), la membrana se lavó dos veces con 1x PBS (Biomérieux) que contenía un tampón Tween20 al 0,05 % (Sigma) y se bloqueó durante 1 hora con el bloque de inicio (Thermo) en una plataforma giratoria a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se usaron de acuerdo con la Tabla 1 en 1x PBS durante 1 hora. La membrana se lavó tres veces y se incubó durante 30 minutos con el anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con HRP (G21234; lifetech, 1/1000 en 1x PBS) o anticuerpo IgG de ratón (115-035-146; jackson, 1/1000 en 1x PBS)). La proteína de interés se detectó con una reacción colorimétrica (Opti 4-CN, Biorad), de acuerdo con el protocolo proporcionado.
Anticuerpos con antígeno dirigido y dilución de anticuerpos: 1) AcP1 policlonal de conejo (SQ09AK001, Squarix), MSRV-Env, 0,5 pg/ml; 2) Suero policlonal de conejo 330110 J77 (330110 J77, InCellArt), poliproteína MSRV-Pol, 1/500; Monoclonal murino 38E12 (250510, Squarix); Poliproteína MSRV-Gag, 1 pg/ml.
Resultados
Como puede observarse a partir de la Figura 6, estas células expresan todas las proteínas estructurales de HERV-W, según lo detectado por anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas codificadas por gag, pol y env.
Es de destacar que,, el anticuerpo anti-gag detecta la poliproteína codificada por HERV-W gag y diferentes proteínas escindidas, incluida una detección más fuerte de la banda de proteína de tipo cápside P30. El patrón detectado por el anticuerpo anti-Env parece más complejo con la detección de monómeros, dímeros y trímeros glucosilados y no glucosilados codificados por HERV-W env, así como la unidad SU o TM escindida alrededor de 45 y 35 KDa. El anticuerpo anti-pol detecta principalmente la enzima transcriptasa inversa escindida, aunque se puede observar una banda de alto peso molecular en la parte superior del gel (no marcada con la estimación de KDa), que correspondería a la poliproteína codificada por HERV-W pol no escindida.
B. La proteína codificada por el gen pol del retrovirus endógeno humano tipo W (transcriptasa inversa) ya no se puede detectar en las células expuestas a un tratamiento combinado con el anticuerpo GNbAC1 y AZT. Material y métodos
Cultivo celular de cordomas
Se cultivaron conjuntamente células CH1 y CH2 humanas (1:1) para optimizar el crecimiento de células CH2 y se mantuvieron en placas de 6 pocillos (CC7672-7506; CytoOne) a una densidad de 1.106 células/pocillo en medio IMDM (12440053; Lifetech) complementado con suero de ternera fetal al 10 % (10270106; Invitrogen), penicilina/estreptomicina al 1 % (P4333; Sigma) a 37 °C con CO2 al 5 %. Las células se trataron con i) AZT (1 pg/ml, A21-69; Sigma), ii) GNbAC1 (300 pg/ml, T950111-A; Polymun), iii) AZT GNbAC1 o controles correspondientes con tampón GNbAC1 [His 20 mM, sacarosa al 5 % (p/v), Tween 20 al 0,01 % (p/v)].
Extracción de proteínas
Se resuspendieron células CH1 y CH2 en 200 pl de tampón RIPA (R0278, SIGMA) que contenía cóctel inhibidor de antifosfatasa cOmplete® (04693 132001; Roche) y LPG al 0,05 % (326495-22-1; Avanti Polar) a 4 °C, se incubaron durante 2 horas a 26 °C en una plataforma giratoria y se centrifugaron a 10000 g durante 20 minutos a 26 °C. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20 °C.
Transferencia Western
Los extractos de proteínas se diluyeron (2:1) en tampón Laemmli 2X (Biorad) y se calentaron durante 5 minutos a 100 °C antes de cargar. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio al 7,5 % (TGX, Biorad). Los geles se ejecutaron durante un período de tiempo de 15 minutos a 120 mA en el búfer de ejecución (Life Technologies). Después de la transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm (Biorad), la membrana se lavó dos veces con 1x PBS (Biomérieux) que contenía un tampón Tween20 al 0,05 % (Sigma) y se bloqueó durante 1 hora con el bloque de inicio (Thermo) en una plataforma giratoria a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se usaron de acuerdo con la Tabla 1 en 1x PBS durante 1 hora. La membrana se lavó tres veces y se incubó durante 30 minutos con el anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con HRP (G21234; lifetech, 1/400 en 1x PBS) o anticuerpo IgG de ratón (115-035-146; jackson, 1/1000 en 1x PBS)). La proteína de interés se detectó con una reacción colorimétrica (Opti 4-CN, Biorad), de acuerdo con el protocolo proporcionado. Anticuerpo: Suero policlonal de conejo 330110 J77 (330110 J77, InCellArt), producido contra la poliproteína MSRV-Pol y diluido 1/500.
Como se puede observar en los resultados de este experimento, que se ilustran en la Figura 7, las células cultivadas en presencia de la combinación de GNbAC1 y AZT (carril n.° 1) ya no expresan niveles detectables de transcriptasa inversa (RT) de HERV-W. Cuando se expone a AZT solo (Carril n.° 2), se muestra una reducción clara de la expresión de RT de HERV-W por la señal correspondiente reducida teñida por el anticuerpo anti-RT de HERV-W; no obstante, esto sigue siendo un efecto parcial. En el carril n.° 3, la exposición a GNbAC1 solo pareció tener efectos menores sobre la proteína de la transcriptasa inversa codificada por HERV-W pol, tal como se detecta en las presentes condiciones in vitro. Como control positivo paralelo, la expresión de la proteína RT de HERV-W de las células expuestas al diluyente GNbAC1 únicamente (tampón de dilución) como tratamiento simulado, muestra la presencia normal de esta banda RT expresada en estas células en el carril n.° 4.
Por lo tanto, en el presente documento se muestra que solo la combinación de ambos anticuerpos GNbAC1 anti HERV-W Env y Azidotimidina (AZT) tuvo el efecto suficiente para inhibir completamente la producción de RT de HERV-W de este cultivo de células humanas que expresan genes gag, pol y env de HERV-W en conjunto, mientras que cada molécula terapéutica solo tuvo un efecto parcial o muy pequeño en esta expresión de HERV-W. Incluso si esto se relaciona con las condiciones de cultivo celular in vitro, esto, sin embargo, evidencia un efecto sinérgico obviamente aumentado y mayor sobre la eficacia de la inhibición de la expresión de RT de HERV-W por esta combinación única de una proteína HERV-W Env neutralizante de anticuerpos y de un fármaco antirretrovírico de transcriptasa inversa. No se espera que estas moléculas terapéuticas sinergicen los efectos sobre la expresión de RT de un retrovirus endógeno como HERV-W, sobre todo porque (i) se dirigen específicamente a moléculas y estructuras de proteínas completamente diferentes, (ii) tienen modos de acción completamente diferentes (neutralización de Env mediante epítopo específico dirigido e inhibición de la actividad de la enzima RT) y (iii) uno es

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Preparación combinada o composición que comprende:
- un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o fragmento del mismo; y - un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica;
para su uso como fármaco antirretrovírico dirigido a un virus perteneciente a retrovirus endógenos humanos tipo W (HERV-W), en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
2. Preparación combinada o composición que comprende:
- un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o fragmento del mismo; y - un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica;
para su uso para prevenir y/o tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2,
en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
3. Preparación combinada o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica es azidotimidina (AZT).
4. Un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como una preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia (SZ), trastorno bipolar (BP), unipolar o depresión psicótica, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes como la diabetes tipo 1 o tipo 2,
en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende cada una de las 6 CDR como se representa en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.
5. Un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como una preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha enfermedad es la esclerosis múltiple (MS) o la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP).
6. La preparación combinada o la composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde dicho anticuerpo o fragmento se selecciona del grupo que consiste en un Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, un diacuerpo y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
7. La preparación combinada o la composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
8. La preparación combinada o la composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un anticuerpo dirigido contra la proteína de envoltura de HERV-W (HERV-W Env) o un fragmento del mismo y un fármaco inhibidor de la transcriptasa inversa retrovírica como preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde dicho anticuerpo o fragmento comprende:
- la cadena pesada (HC) que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 9 y - la cadena ligera (LC) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
ES15725326T 2014-05-28 2015-05-27 Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos Active ES2752131T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14305806.3A EP2949342A1 (en) 2014-05-28 2014-05-28 Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
PCT/EP2015/061691 WO2015181226A1 (en) 2014-05-28 2015-05-27 Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2752131T3 true ES2752131T3 (es) 2020-04-03

Family

ID=50976559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15725326T Active ES2752131T3 (es) 2014-05-28 2015-05-27 Fármaco antirretrovírico dirigido a retrovirus endógenos humanos

Country Status (24)

Country Link
US (2) US20170101461A1 (es)
EP (2) EP2949342A1 (es)
JP (1) JP2017519815A (es)
KR (1) KR20170012376A (es)
CN (2) CN114276444A (es)
AR (1) AR100642A1 (es)
AU (1) AU2015265936B2 (es)
BR (1) BR112016027671B8 (es)
CA (1) CA2949884C (es)
DK (1) DK3148582T3 (es)
EA (1) EA034612B1 (es)
EC (1) ECSP16091728A (es)
ES (1) ES2752131T3 (es)
HU (1) HUE046187T2 (es)
IL (1) IL249040B (es)
MX (1) MX2016015560A (es)
PL (1) PL3148582T3 (es)
PT (1) PT3148582T (es)
RU (1) RU2689326C1 (es)
SG (1) SG11201609886SA (es)
TW (1) TW201625679A (es)
UA (1) UA120274C2 (es)
WO (1) WO2015181226A1 (es)
ZA (1) ZA201608050B (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018028538A (ja) * 2016-08-12 2018-02-22 公立大学法人名古屋市立大学 統合失調症とその関連疾患の診断用マーカー及びその使用
WO2019201908A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Geneuro Sa Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomeric form of herv-w envelope protein
EP3916015A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Geneuro SA Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0893691A1 (en) * 1997-07-23 1999-01-27 Mach, Bernard François, Prof. Methods for diagnosis and therapy of autoimmunedisease, such as insulin dependent diabetes mellitus, involving retroviral superantigens
FR2791140B1 (fr) 1999-03-19 2002-03-22 Bio Merieux Procede de detection d'une activite superantigenique dans un echantillon et composition therapeutique ou prophylactique
EP2266396A3 (en) * 2001-09-24 2011-06-15 Sangamo BioSciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
FR2865403B1 (fr) * 2004-01-23 2009-06-12 Biomerieux Sa Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
FR2912314B1 (fr) * 2007-02-09 2012-08-03 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w.
SI3211005T1 (sl) * 2008-07-08 2021-06-30 Geneuro Sa Terapevtska uporaba specifičnega liganda pri boleznih, povezanih z MSRV
US20120321637A1 (en) * 2011-06-20 2012-12-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Combination cancer therapy with herv inhibition
UA119032C2 (uk) * 2012-10-02 2019-04-25 Женеро Са Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w

Also Published As

Publication number Publication date
CN106536550A (zh) 2017-03-22
ECSP16091728A (es) 2017-06-30
EP2949342A1 (en) 2015-12-02
AU2015265936B2 (en) 2020-07-30
CA2949884A1 (en) 2015-12-03
IL249040B (en) 2020-05-31
US20170101461A1 (en) 2017-04-13
BR112016027671A2 (pt) 2018-01-30
IL249040A0 (en) 2017-01-31
US10894820B2 (en) 2021-01-19
KR20170012376A (ko) 2017-02-02
BR112016027671B1 (pt) 2023-11-21
US20190263895A1 (en) 2019-08-29
SG11201609886SA (en) 2016-12-29
UA120274C2 (uk) 2019-11-11
EA201692471A1 (ru) 2017-04-28
JP2017519815A (ja) 2017-07-20
EP3148582B1 (en) 2019-07-31
BR112016027671B8 (pt) 2024-01-09
AR100642A1 (es) 2016-10-19
AU2015265936A1 (en) 2016-12-15
HUE046187T2 (hu) 2020-02-28
TW201625679A (zh) 2016-07-16
ZA201608050B (en) 2020-05-27
MX2016015560A (es) 2017-07-13
CA2949884C (en) 2023-09-05
PL3148582T3 (pl) 2020-06-15
EP3148582A1 (en) 2017-04-05
WO2015181226A1 (en) 2015-12-03
DK3148582T3 (da) 2019-10-28
PT3148582T (pt) 2019-11-04
EA034612B1 (ru) 2020-02-27
CN114276444A (zh) 2022-04-05
RU2689326C1 (ru) 2019-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101518144B1 (ko) 매트릭스 메탈로프로테이나제 ９에 대한 항체
ES2363732T3 (es) Anticuerpos monoclonales contra el receptor de tipo ii de hormona antimulleriana humana (amhr-ii).
US10894820B2 (en) Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
EP3102939A2 (en) AGENTS THAT MODULATE RGMb-NEOGENIN-BMP SIGNALING AND METHODS OF USE THEREOF
US20180163178A1 (en) Auf1 encoding compositions for muscle cell uptake, satellite cell populations, and satellite cell mediated muscle generation
KR20230017778A (ko) 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-vsig4 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
KR20220042131A (ko) 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-lrrc25 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
KR20220042128A (ko) 골수성 세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 항-cd53 조성물 및 방법, 그리고 이의 용도
CN110945128B (zh) 用于治疗肺纤维化的组合物和方法
AU2014324043B2 (en) Agents directed against a cis RGMa/Neogenin interaction or lipid rafts and use of the same in methods of treatment
US20220267428A1 (en) BLOCKADE OF RGMb FOR TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE AND COLITIS
US20210214453A1 (en) Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of autoimmune diseases
US20230192894A1 (en) Methods and compositions for antibody to high affinity receptor for ige
JP7475011B2 (ja) Ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ）治療又は予防剤、及びｈａｍの治療方法
EP3916015A1 (en) Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
WO2024056668A1 (en) New anti-itgb8 antibodies and its uses thereof
CN116635422A (zh) 抗cd38抗体及其用途
WO2017061125A1 (ja) Ｃａｒｄ１４を用いた治療、診断およびスクリーニング
TW202408577A (zh) Ｈｔｌｖ－１關聯性脊髓病（ｈａｍ）之治療或防預劑、及ｈａｍ之治療方法