TW202408577A

TW202408577A - Ｈｔｌｖ－１關聯性脊髓病（ｈａｍ）之治療或防預劑、及ｈａｍ之治療方法

Info

Publication number: TW202408577A
Application number: TW112142583A
Authority: TW
Inventors: 內丸薫; 山岸誠; 石崎伊純; 山野嘉久
Original assignee: 國立大學法人東京大學; 學校法人聖瑪麗安娜醫科大學
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2024-03-01
Also published as: JP2022180487A; EP3824907A4; US20210269535A1; IL280257A; ZA202101113B; TWI825131B; JP7150286B2; AU2019306721B2; PE20211376A1; JP2024095754A; JPWO2020017629A1; CN116942831A; WO2020017629A1; MX2021000732A; SG11202100561QA; CN112566664A; KR20210034055A; TW202019482A; PH12021550134A1; BR112021000949A2

Abstract

本發明提供一種HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)之治療或預防劑，其包含RGMa抑制物質；及一種HAM之治療方法，其包括將藥理學上有效量之RGMa抑制物質向需要其之HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)患者投予。

Description

ＨＴＬＶ－１關聯性脊髓病（ＨＡＭ）之治療或防預劑、及ＨＡＭ之治療方法

本發明係關於一種HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)之治療或預防劑。又，本發明亦關於一種HAM之治療方法。

HTLV-1(Human T-cell Lukemia Virus Type 1：人類Ⅰ型T細胞白血病病毒)係感染血液中之白血球之一之T細胞等(主要為CD4陽性T細胞)之病毒。感染HTLV-1之T細胞會於脊髄形成慢性炎症，其結果引起脊髄神經細胞之損傷及退化，導致痙攣性脊髄麻痺。將由感染HTLV-1之細胞引起之痙攣性脊髄麻痺稱為HTLV-1關聯性脊髓病(亦簡稱為HAM)。作為HAM之症狀，可列舉由神經之組織損傷引起之雙足麻痺、疼痛、排尿障礙、頑固便秘等症狀等。若該等症狀發展，則會導致不得不使用輪椅、臥床不起。HAM於日本被列為指定難病之一。目前尚未確立有效之HAM之治療方法，現行主要為對症療法。已證實作為治療方法之一，使用抗CCR4抗體之治療方法可減少HTLV-1感染細胞，減輕HAM之脊髄炎症，發揮症狀改善效果(非專利文獻1、專利文獻5)。

RGMa蛋白為參與視網膜或海馬之神經細胞之軸突導向、神經管之閉鎖等之RGM(Repulsive guidance molecule，排斥性導向分子)蛋白家族成員之一。RGM之作用並不限於該等，已知具有各種功能。

例如，專利文獻1中揭示有源自骨髄之樹狀細胞(BMDCs)表現RGM，CD4 ⁺T細胞及CD11b ⁺巨噬細胞表現RGM受體，藉由RGM結合於該RGM受體，CD4 ⁺T細胞及CD11b ⁺巨噬細胞之細胞黏著活性增強。又，專利文獻1中揭示有藉由抗RGM中和抗體可同時減輕多發性硬化症模型小鼠之臨床症狀及組織病變，於取自該小鼠之脾細胞中抗原特異性及非特異性T細胞活化減弱。

專利文獻2及3中揭示有選擇性地抑制RGMa向RGMa之受體再生蛋白以及骨形成蛋白2及4(BMP-2、BMP-4)結合之針對RGMa之中和單株抗體。認為藉由該中和單株抗體，能夠促進於受到損傷、發生炎症之人類中樞神經系統、具體而言多發性硬化症、急性脊髄損傷、腦外傷後綜合征、杭丁頓舞蹈症、帕金森氏症、阿茲海默症等神經退化疾病中被破壞之神經元結合之神經再生及再生長。

專利文獻4中揭示有RGMa集中存在於遭受外傷性腦損傷或患有缺血性中風之人之中樞神經系統髓磷脂、新鮮病灶及成熟瘢痕組織，以診斷該等神經退化疾病為目的而檢測RGMa片段並定量化之方法。又，於專利文獻4中，作為檢測RGMa片段之對象之神經退化疾病及障礙，列舉有：多發性硬化症、帕金森氏症、阿茲海默症、泰薩氏症、尼曼匹克症、高雪氏症、赫勒(Hurler)氏綜合征、杭丁頓舞蹈症、肌萎縮性側索硬化症、特發性炎症性脫髓鞘疾病、維生素B12缺乏症、腦橋中央髓鞘溶解症、脊髓癆、橫貫性脊髄炎、戴韋克(Devic)氏症、進行性多灶性白質腦病、視神經炎、脊髄損傷、外傷性腦損傷、中風、青光眼、糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性、白質失養症。先前技術文獻專利文獻

專利文獻1：國際公開2011/071059號專利文獻2：日本專利特開2014-138599號專利文獻3：日本專利特開2016-175897號專利文獻4：日本專利特表2017-526930號專利文獻5：日本專利特開2010-100578號非專利文獻

非專利文獻1：N Engl J Med, 2018, 378, 529-538.

[發明所欲解決之問題]

根據非專利文獻1、專利文獻5中所揭示之使用抗CCR4抗體之方法，雖可改善HAM之症狀，但抗CCR4抗體對於神經破壞發展之HAM患者之效果有限。因此，尋求能夠治療HAM之更優異之方法。

本發明係鑒於上述問題點而成者，目的在於提供一種能夠治療HAM之治療劑及治療方法。 [解決問題之技術手段]

本發明者等人為了解決上述課題，經過反覆銳意研究，結果發現抑制RGMa之物質對於治療HAM有效，從而完成本發明。

即，本發明如下所述。 [1] 一種HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)之治療或預防劑，其包含RGMa抑制物質。 [2] 如[1]記載之HAM之治療或預防劑，其中上述RGMa抑制物質為識別RGMa之抗體。 [3] 一種HAM之治療方法，其包括將藥理學上有效量之RGMa抑制物質向需要其之HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)患者投予。 [4] 如[3]記載之HAM之治療方法，其中上述RGMa抑制物質為識別RGMa之抗體。 [發明之效果]

根據本發明，能夠治療作為難治性疾病之HAM。

以下，對本發明之實施形態進行詳細說明。再者，本發明並不限於以下之本實施形態，可於其主旨之範圍內加以各種變化而實施。

本發明係一種包含RGMa抑制物質之HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)之治療或預防劑。RGMa抑制物質可為作用於RGMa其本身而抑制RGMa之活性之物質，亦可為抑制RGMa之表現之物質。作為RGMa抑制物質，例如可列舉：具有抑制RGMa之活性之化合物、及識別RGMa之抗體等。

又，作為RGMa抑制物質，例如可列舉表現RGMa之基因之siRNA(short interfering RNA，小干擾RNA)、shRNA(short hairpin RNA，小髮夾RNA)及反義寡核苷酸等抑制RGMa之表現之物質。作為RGMa基因，例如可列舉：包含序列編號1所示之鹼基序列之人RGMa基因、包含序列編號2所示之鹼基序列之RGMa基因等，但並不限定於此。源自各種生物之RGMa基因之鹼基序列之資訊可自GenBank等資料庫取得。

siRNA係能夠抑制作為標靶之RGMa基因之表現的雙鏈RNA。siRNA中之鹼基序列之長度(鹼基長度)並無特別限定，較佳為約未達30鹼基，更佳為約19〜27鹼基，進而較佳為約21〜25鹼基。 shRNA係指藉由在單鏈RNA中部分包含回文狀之鹼基序列而於分子內具有雙鏈結構，且於3'末端具有突出部之包含小髮夾結構之約20鹼基對以上之分子。shRNA於導入至細胞內後，於細胞內分解成約20鹼基之長度，能夠與siRNA同樣地抑制作為標靶之RGMa基因之表現。

siRNA及shRNA可採用人工方式化學合成。又，siRNA及shRNA例如可使用T7RNA聚合酶及T7啟動子，由模板DNA於體外合成反義及正義之RNA。

反義寡核苷酸只要為與RGMa基因之DNA序列中之連續之約未達30鹼基之鹼基序列互補或雜交之核苷酸即可，可為DNA或RNA之任意者。又，只要無損功能，則亦可為經修飾者。反義寡核苷酸可藉由常規方法合成，例如可利用市售之DNA合成裝置容易地合成。

作為本發明之HAM之治療或預防劑中包含之RGMa抑制物質，較佳為識別RGMa之抗體。以下，將識別RGMa之抗體亦稱為RGMa抗體。本發明中之RGMa抗體只要為與RGMa結合而抑制其活性之抗體即可，例如可列舉藉由與RGMa結合而使RGMa無法與RGMa受體結合之抗體等。

本發明中之RGMa抗體可為單株抗體，亦可為多株抗體。又，本發明中之抗體可為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之任意同型。本發明中之RGMa抗體可為例如小鼠抗體、人型CDR移植抗體、人型嵌合抗體、人類化抗體或完全人抗體，亦可為低分子抗體。該等抗體可單獨使用1種，亦可將2種以上組合使用。

人型CDR移植抗體係將人以外之動物之抗體之CDR置換為人抗體之CDR而成之抗體。人型嵌合抗體係包含源自人以外之動物之抗體之可變區與源自人抗體之恆定區的抗體。又，所謂人類化抗體係指於人以外之動物之抗體中保留安全性較高之一部分區域並組入源自人之抗體之部分而成者，其概念包括人型嵌合抗體及人型CDR移植抗體。

於本說明書中，所謂「低分子抗體」意指抗體之片段或者使抗體之片段與任意分子結合而成者，且和原抗體識別同一表位。具體而言，可列舉：包含VL、VH、CL及CH1區之Fab；由2個Fab於鉸鏈區藉由雙硫鍵連結而成之F(ab')2；包含VL及VH之Fv；藉由人工之多肽連接子將VL及VH連結而成之單鏈抗體即scFv，以及sdFv、雙功能抗體(Diabody)、sc(Fv)2，但並不限定於該等。

本發明中使用之RGMa抗體可使用RGMa或其片段作為免疫原，藉由公知方法製作。可將RGMa活性作為指標來確認所獲得之抗體為RGMa抗體。作為RGMa，例如可列舉：包含序列編號3所示之胺基酸序列之人RGMa、包含序列編號4所示之胺基酸序列之RGMa等。可使用源自各種生物之RGMa作為免疫原。RGMa之胺基酸序列可自公知之資料庫Protein Data Bank等取得。

於本發明中使用之RGMa抗體為多株抗體時，例如可藉由以下方式製作。首先，使作為抗原之RGMa或該等之片段溶解於磷酸緩衝生理鹽水(亦稱為PBS)，視需要適量混合通常之佐劑、例如Freund完全佐劑，將所獲得者作為免疫原，免疫小鼠、大鼠、兔、羊及馬等哺乳動物。免疫方法並無特別限定，例如可列舉進行1次或以適當間隔進行2次以上之皮下注射或腹腔內注射之方法。其次，依據常規方法自經免疫之動物採集血液，分離血清，純化多株抗體組分，藉此取得。於本發明中使用之RGMa抗體為單株抗體時，該單株抗體可藉由如下方式獲得：將自上述經免疫之哺乳動物獲得之免疫細胞、例如脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合而獲得融合瘤，自該融合瘤之培養物採集抗體。又，關於上述單株抗體，亦可自融合瘤選殖抗體基因，組入至適當之載體，將其導入至宿主細胞，採用基因重組技術生產重組型之單株抗體。進而，上述單株抗體亦可採用噬菌體展示法製作。

作為本發明中使用之RGMa抗體，可使用例如Yamashita, T., Mueller, B. K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34 (2007)；日本專利特開2014-138599號公報；日本專利特開2016-175897號公報；日本專利特表2017-526930號公報；國際公開2016/175236號；日本專利特表2015-508061號公報等中揭示之抗體。又，作為本發明中使用之RGMa抗體，亦可以例如免疫生物研究所(IBL)股份有限公司製造、R&D Systems公司製造等之市售品之形式獲得。

RGMa抗體較佳為含有包含選自由 GTTPDY(序列編號7)； FQATHDPLT(序列編號10)； ARRNEYYGSSFFDY(序列編號13)； LQGYIPPRT(序列編號16)；及與該序列之一具有至少50%之序列同一性之修飾CDR胺基酸序列；所組成之群中之胺基酸序列的至少1個CDR作為抗原結合區。上述序列同一性較佳為80%以上，更佳為90%以上。再者，於本說明書中，有時將胺基酸以慣用之一字元記法或三字元記法表示。

所謂互補決定區(CDR)係指免疫球蛋白分子之可變區中之形成抗原結合部位之區域，亦稱為超可變區，其係每個免疫球蛋白分子中胺基酸序列之變化特別大之部分。關於CDR，輕鏈及重鏈中分別有3個CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)。於本申請案中，免疫球蛋白分子之CDR係依據Kabat編號系統(Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest、Us Department of Health and Human Services，NIH，USA)確定。又，於本發明中之由輕鏈及重鏈之胺基酸序列所規定之抗體中，CDR之胺基酸序列保持特定序列不變，CDR以外可藉由變異等而變化。於CDR以外存在變異等時，較佳為同源性為90%以上。

又，RGMa抗體較佳為進而含有包含選自由序列編號5、6、8、9、11、12、14、15及與該序列之一具有至少50%之序列同一性之修飾CDR胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列的至少1個CDR。上述之序列同一性較佳為80%以上，更佳為90%以上。

RGMa抗體更佳為含有自表1所示之可變區CDR組、或該3個CDR之至少一者為與母序列具有至少50%、較佳為80%、更佳為90%之序列同一性之修飾CDR胺基酸序列的可變區組選擇之至少3個CDR。又，RGMa抗體進而較佳為含有至少2個表1所示之可變區CDR組。進而，至少2個可變區CDR組較佳為VH5F9組及VL5F9組之組合、或VH8D1組及VL8D1組之組合。

[表1]

VH5F9組
VH5F9 CDR-H1	序列編號17之殘基31-35	序列編號5
VH5F9 CDR-H2	序列編號17之殘基50-66	序列編號6
VH5F9 CDR-H3	序列編號17之殘基99-104	序列編號7
VL5F9組
VL5F9 CDR-L1	序列編號18之殘基24-39	序列編號8
VL5F9 CDR-L2	序列編號18之殘基55-61	序列編號9
VL5F9 CDR-L3	序列編號18之殘基94-102	序列編號10
VH8D1組
VH8D1 CDR-H1	序列編號19之殘基31-35	序列編號11
VH8D1 CDR-H2	序列編號19之殘基50-66	序列編號12
VH8D1 CDR-H3	序列編號19之殘基97-110	序列編號13
VL8D1組
VL8D1 CDR-L1	序列編號20之殘基24-34	序列編號14
VL8D1 CDR-L2	序列編號20之殘基50-56	序列編號15
VL8D1 CDR-L3	序列編號20之殘基89-97	序列編號16

RGMa抗體亦可含有架構區。作為架構區所包含之胺基酸序列，可列舉：序列編號22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39及40。該等胺基酸序列可為單獨1種，亦可為2種以上之組合。又，RGMa抗體較佳為含有選自序列編號41、42、43、44、45、46、47、48及49中之至少1個重鏈可變區及/或選自序列編號50、51及52中之至少1個輕鏈可變區作為重鏈可變區及輕鏈可變區。

又，RGMa抗體與RGMa結合時之結合部位只要為引起RGMa抑制之部位則並無特別限定，例如就人RGMa而言，較佳為結合於具有 EEVVNAVEDWDSQG(序列編號53) NQQIDFQAFHTNAE(序列編號54) PTAPETFPYET(序列編號55) KLPVEDLYYQA(序列編號56) LYERTRDLPGRAAAGL(序列編號57) 所示之胺基酸序列之一個以上之肽。 RGMa抗體更佳為結合於具有序列編號53及/或序列編號54所示之胺基酸序列之肽，更佳為結合於具有序列編號53及/或序列編號54所示之胺基酸序列之肽、與具有序列編號55及/或序列編號56所示之胺基酸序列之肽。 RGMa抗體較佳為結合於人RGMa之胺基酸序列中之第250號以後之抗體。 RGMa抗體更佳為結合於具有序列編號53與序列編號54、且具有序列編號55或序列編號56所示之胺基酸序列之肽。

RGMa抗體可為以RGMa蛋白或其部分片段(例如包含序列編號53〜57之一者以上之片段)作為抗原並對小鼠等哺乳動物免疫該抗原而獲得之多株抗體及單株抗體、採用基因重組技術製造之嵌合抗體及人類化抗體、以及使用產生人抗體之基因轉殖動物等製造之人抗體等。於本發明中，於將RGMa抗體作為醫藥對人進行投予之情形時，就副作用之觀點而言，較理想為人類化抗體或人抗體。 RGMa抗體亦可作為將RGMa蛋白或其部分片段(例如包含序列編號53〜57之一者以上之片段)識別為抗原之多株抗體及/或單株抗體之部分片段使用，亦可為低分子抗體。

作為RGMa抗體，可為除表1所示者以外，輕鏈之互補決定區1(LCDR1)、輕鏈之互補決定區2(LCDR2)、輕鏈之互補決定區3(LCDR3)、重鏈之互補決定區1(HCDR1)、重鏈之互補決定區2(HCDR2)及重鏈之互補決定區3(HCDR3)各自之胺基酸序列分別包含 LCDR1：RASQDISSYLN(序列編號58) LCDR2：YTSRLHS(序列編號59) LCDR3：QQLNTLP(序列編號60) HCDR1：DAWMD(序列編號61) HCDR2：EIRSKANNHATYYAESVKG(序列編號62)及 HCDR3：RDGAY(序列編號63)、或者包含 LCDR1：RSSQSLVHSNGNTYLH(序列編號64) LCDR2：KVSNRFS(序列編號65) LCDR3：SQSTHVP(序列編號66) HCDR1：TSYYWN(序列編號67) HCDR2：YISYDGTNNYNPSLKN(序列編號68)及 HCDR3：SFG 之經單離之RGMa抗體、或其抗原結合片段。各CDR序列中可取代、缺失及/或附加1個或數個胺基酸，例如可取代、缺失及/或附加1個或2個胺基酸。

作為RGMa抗體，可例示於輕鏈具有序列編號73之胺基酸序列、於重鏈具有序列編號74之胺基酸序列之抗體。該等序列編號所示之胺基酸序列中可有1個或數個胺基酸(1〜20個、1〜10個或1〜5個)之取代、缺失、附加或插入。此種取代、缺失、附加可導入至CDR，但較佳為導入至CDR以外之區域。

可為恆定區源自人之小鼠/人嵌合抗體，作為小鼠/人嵌合抗體，可例示於輕鏈具有序列編號77之胺基酸序列(可變區為1〜107)、於重鏈具有序列編號78之胺基酸序列(可變區為1〜116)之抗體。該等序列編號所示之胺基酸序列中可有1個或數個胺基酸(1〜20個、1〜10個或1〜5個)之取代、缺失、附加或插入。此種取代、缺失、附加可導入至CDR，但較佳為導入至CDR以外之區域。

可為CDR以外源自人之人類化抗體。作為人類化抗體，可例示於重鏈具有序列編號70〜87(可變區為N末端側至116殘基)之任意胺基酸序列、於輕鏈具有序列編號88〜94(可變區為N末端側1至107殘基)之任意胺基酸序列之抗體。該等序列編號所示之胺基酸序列中可有1個或數個胺基酸(1〜20個、1〜10個或1〜5個)之取代、缺失、附加或插入。此種取代、缺失、附加可導入至CDR，但較佳為導入至CDR以外之區域。

重鏈胺基酸序列與輕鏈胺基酸序列可為該等之任意組合，較佳為於重鏈具有序列編號84之胺基酸序列、於輕鏈具有序列編號88之胺基酸序列之抗體。序列編號84之胺基酸序列中之相當於重鏈可變區之胺基酸序列係以序列編號95表示，相當於輕鏈可變區之胺基酸序列係以序列編號96表示。

作為RGMa抗體，較佳為重鏈可變區(VH)包含 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDW VRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(序列編號95)或與該胺基酸序列具有至少90%之同一性之胺基酸序列，輕鏈可變區(VL)包含 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(序列編號96)或與該胺基酸序列具有至少90%之同一性之胺基酸序列的經單離之RGMa抗體、或其抗原結合片段。

作為RGMa抗體，可例示於輕鏈具有序列編號75之胺基酸序列、於重鏈具有序列編號76之胺基酸序列之抗體。該等序列編號所示之胺基酸序列中可有1個或數個胺基酸(1〜20個、1〜10個或1〜5個)之取代、缺失、附加或插入。此種取代、缺失、附加可導入至CDR，但較佳為導入至CDR以外之區域。可為恆定區源自人之小鼠/人嵌合抗體，亦可為CDR以外源自人之人類化抗體。

又，作為抗RGMa抗體，亦可為自下述(a1)〜(h1)中選擇之經單離之RGMa抗體、或其抗原結合片段。 (a1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號99記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (b1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號103記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (c1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號104記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (d1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號105記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (e1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號106記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (f1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號107記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段； (g1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號108記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段；以及 (h1)含有：含有包含序列編號97記載之胺基酸序列之LCDR1、包含序列編號98記載之胺基酸序列之LCDR2及包含序列編號109記載之胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區，以及含有包含序列編號100記載之胺基酸序列之HCDR1、包含序列編號101記載之胺基酸序列之HCDR2及包含序列編號102記載之胺基酸序列之HCDR3的重鏈可變區之、抗RGMa抗體或其抗原結合片段。

RGMa抗體較佳為具有上述胺基酸序列之人類化抗體，又，較佳為具有人IgG之恆定區。

藉由本發明中之RGMa抑制物質而能夠治療或預防HAM。如下文記述之實施例及圖13所示，於HAM患者中，由源自HAM患者之細胞引起神經細胞死亡、即誘導脊髄組織之損傷及退化。本發明者等人經過研究，結果如下文記述之實施例所示，於HAM患者之主要之HTLV-1感染細胞即CD4陽性T細胞中RGMa表現顯著，可知HAM與RGMa之表現有關。又，使用RGMa抗體進行RGMa抑制試驗，結果可知RGMa與CXCL10、IL(Interleukin，白細胞介素)-2及IL-10之產生有關。已知CXCL10為應答IFN-γ(Interferon-γ，干擾素-γ)而自HAM病原性之HTLV-1感染T細胞產生之蛋白質，誘導HAM之病狀(Brain 2013)，又，已知亦與HAM之症狀之發展速度緊密相關(PLoS Negl Trop Dis 2013)。若使RGMa抗體作用於HAM患者之細胞，則抑制該CXCL10之產生。又，IL-10為細胞激素之一，發揮抑制炎症之作用。若使RGMa抗體作用於HAM患者之細胞，則IL-10之產生顯著增加。為了對HAM產生真正之治療效果，要求抑制神經細胞之損傷。揭示有於HAM患者之HTLV-1感染細胞中HTLV-1-tax之表現水平較高(Blood 2002)，HTLV-1-tax對於病狀形成起重要作用(J Clin Invest 2014)。於本發明中，揭示HTLV-1-tax誘導RGMa之表現，RGMa表現水平較高之源自HAM患者之細胞誘導神經細胞死亡，揭示重要的是使RGMa抑制物質抑制由HTLV-1-tax表現細胞引起之神經細胞死亡。如上所述，RGMa抑制物質能夠抑制HAM之炎症病狀之誘導，又，能夠抑制由HAM患者細胞引起之炎症反應，因此能夠治療或預防HAM。進而，RGMa抑制物質不僅抑制HAM特有之炎症反應，且能夠抑制由HAM患者之病原性細胞即HTLV-1-tax表現細胞引起之神經細胞死亡，因此能夠治療或預防HAM。

如上所述，RGMa抑制物質能夠治療或預防HAM，本發明提供：一種RGMa抑制物質，其用於治療HAM；一種醫藥組合物，其用於治療HAM；一種RGMa抑制物質之用途，其用以治療HAM；一種RGMa抑制物質之用途，其用以製造HAM之治療用醫藥；一種RGMa抑制物質，其用於製造HAM之治療用醫藥；一種HAM之治療或預防方法，其包括將有效量之RGMa抑制物質向需要其之對象投予。

本發明之HAM之治療或預防劑包含RGMa抑制物質，可進而適當調配藥學上容許之載體及/或添加劑而製劑化。作為製劑化之形態，例如可列舉：錠劑、包衣錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑、懸浮劑、乳劑等經口劑；注射劑、輸液劑、栓劑、軟膏、貼劑等非經口劑。關於載體或添加劑之調配比率，基於醫藥品領域通常採用之範圍適當設定即可。作為上述載體，並無特別限制，例如可列舉：水、生理鹽水、其他水性溶劑、及水性或油性基劑等。作為上述添加劑，並無特別限制，可列舉：賦形劑、結合劑、pH值調整劑、崩解劑、吸收促進劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑及香料等。

於本發明中之RGMa抑制物質為識別RGMa之抗體時，較佳為將該抗體與藥學上容許之載體一起製劑化而製成注射劑或輸液劑，經由非經口投予路徑、例如靜脈內、肌肉內、皮膚內、腹腔內、皮下或局部投予。包含RGMa抗體之注射劑或輸液劑可以溶液、懸浮液或乳濁液之形式使用。作為其溶劑，例如可使用：注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖溶液及等張液(例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等之溶液)等。該等溶劑可單獨使用1種，亦可將2種以上組合使用。

上述注射劑或輸液劑可進而包含穩定劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、鎮痛劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH值調整劑等添加劑。作為穩定劑，例如可使用：白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、EDTA鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。作為增溶劑，例如可使用：醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(例如Polysorbate 80(註冊商標)、HCO-50等)等。作為懸浮化劑，例如可使用：單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為乳化劑，例如可使用：阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃耆膠等。作為鎮痛劑，例如可使用：苄醇、氯丁醇、山梨醇等。作為緩衝劑，例如可使用：磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、Trsi(三羥甲基胺基甲烷)緩衝液等。作為保存劑，例如可使用：對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、氯化苄烷銨、去氫乙酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、硼酸、硼砂等。作為防腐劑，例如可使用：氯化苄烷銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。作為pH值調整劑，例如可使用：鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。

於本發明中之RGMa抑制物質為表現RGMa之基因之siRNA(小干擾RNA)、shRNA(小髮夾RNA)及反義寡核苷酸等抑制RGMa之表現之物質時，可以非病毒載體或病毒載體之形態投予。於RGMa抑制物質為非病毒載體形態時，作為投予方法，可列舉：使用脂質體導入核酸分子之方法(脂質體法、HVJ(Hemagglutinating Virus of Japan，日本血凝病毒)-脂質體法、陽離子脂質體法、脂轉染法、脂染胺法等)、顯微注射法、使用基因槍(Gene Gun)將載體(金屬粒子)與核酸分子一起移入至細胞之方法等。於使用病毒載體對生物體投予siRNA或shRNA之情形時，可利用重組腺病毒、反轉錄病毒等病毒載體。對無毒化之反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒、痘病毒、脊髓灰白質炎病毒、辛德比病毒、仙台病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒導入表現siRNA或shRNA之DNA，使細胞或組織感染該重組病毒，藉此可向細胞或組織內導入基因。

藉由將如此獲得之製劑以其有效量對例如人以及大鼠、小鼠、兔、羊、豬、牛、貓、狗及猴等其他哺乳動物進行投予，能夠預防或治療HAM。投予量係考慮到目的、疾病之嚴重度、患者之年齡、體重、性別、既往病史、有效成分之種類等適當設定。實施例

[實施例1：用以解明HAM及成人T細胞白血病淋巴瘤(ALT：adult T-cell leukemia/lymphoma)之發病機制及病狀之網羅比較分析] 如圖1所示，針對HTLV-1感染未發病者之檢體，對CD4陽性細胞中之根據作為HTLV-1感染細胞之指標的CADM1與CD7進行分類而獲得之P組、D組、N組，進行mRNA之表現分析。又，亦針對HAM，對利用磁珠自HAM患者末梢血單核細胞濃縮而成之CD4陽性細胞與CD4陰性細胞各4例進行分析。亦針對HTLV-1非感染健康正常人(Normal)同樣地進行分離。末梢血單核細胞亦記為PBMC。ATL(smodering、chronic、acute各病型)係使用主要包含CD4陽性細胞之PBMC。進行安捷倫科技股份有限公司製造之單色微陣列基因表現分析法。

對神經關聯分子進行網羅比較分析，結果可知於HAM患者之CD4陽性細胞中RGMa表現顯著。針對正常T細胞 4例(Normal.CD4)、源自HAM患者之CD4陽性T細胞 4例(HAM.CD4)、源自健康正常人之CD4陽性/CADM1陰性/CD7陽性T細胞 3例(Normal.P)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陰性/CD7陽性T細胞 5例(P組)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陽性T細胞 5例(D組)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陰性T細胞 5例(N組)、急性型ATL患者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陰性T細胞 3例(Acute.N)、健康正常人CD4陽性T細胞 21例(Normal.CD4.1)、源自冒煙型ATL患者之PBMC 3例(Smoldering)、源自慢性型ATL患者之PBMC 20例(Chronic)、源自急性型ATL患者之PBMC 26例(Acute)，使用安捷倫科技股份有限公司之人基因表現4×44K微陣列(Human Gene Expression 4×44K Microarray)取得全基因表現資料，用中央值標準化後，繪製RGMa基因水平之圖。於圖中繪出陣列之螢光強度之Log ₂值。源自HAM患者之CD4陽性T細胞組明顯高於其他所有組，存在有意差(P＜0.05)。將圖表示於圖2。

[實施例2：CD4陽性HAM患者中之基因表現分析] 自5名HAM患者之末梢血分離PBMC，使用人CD4+分離套組(human CD4+ isolation kit)(Miltenyi Biotec)，自所分離出之PBMC分離CD4陽性T細胞，作為包含大量HTLV-1感染細胞之細胞群。同樣地自4名健康正常人之PBMC分離CD4陽性T細胞，作為對照。自所分離出之CD4陽性T細胞回收全RNA，使用ReverTra Ace(東洋紡)製作cDNA。使用所製作之cDNA，藉由即時PCR(Real time-Polymerase Chain Reaction，即時聚合酶鏈鎖反應))分析HAM患者CD4陽性T細胞與健康正常人CD4陽性T細胞之間的RGMa之表現量之差。內對照係使用18srRNA。將分析結果之圖表示於圖3。圖中之HD-CD4+係指對照組、HAM-CD4+係指HAM患者組。

[實施例3：PBMC中之RGMa表現細胞之分析] 使用Clear Back(MBL)對HAM患者PBMC進行Fc封閉(Fc block)處理後，添加抗CD3-PECy7(TONBO)、CD4-FITC(eBioscience)、CD14-PE(eBioscience)抗體，於4℃下進行30分鐘染色。將經過抗體染色之PBMC洗淨後，使用AriaIIIu(BD)實施FACS分選，並進行CD3陽性CD4陰性細胞(CD3+CD4-)、CD3陽性CD4陽性細胞(CD3+CD4+)、CD3陰性CD14陰性細胞(CD3-CD14-)及CD3陰性CD14陽性細胞(CD3-CD14+)之分離回收。自所回收之各細胞回收全RNA，使用ReverTra Ace(東洋紡)製作cDNA。使用所製作之cDNA，藉由即時PCR分析細胞種類間之RGMa之表現量之差。內對照係使用18srRNA。將分析結果之圖表示於圖4。可知於HAM-PBMC中，存在大量感染細胞之CD3陽性CD4陽性細胞(CD3+CD4+)中RGMa之表現最高。

[實施例4：伴隨HAM患者PBMC之培養而產生之RGMa表現變化] 使2名HAM患者之PBMC懸浮於培養基(包含10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)(GIBCO)之RPMI1640培養基(wako))，以每孔1e5個細胞向96孔圓底培養盤(96 well round bottom plate)接種10孔後，培養1、3、5、7天。自未進行培養之Day0之PBMC以及各期間培養之PBMC提取全RNA，使用ReverTra Ace(東洋紡)製作cDNA。已知若將HAM患者PBMC進行培養則HTLV-1病毒過度表現，使用所製作之cDNA，藉由即時PCR分析伴隨HAM患者PBMC之培養、即病毒之表現而產生之RGMa之表現變化。內對照係使用18srRNA。將分析結果之圖表示於圖5。

[實施例5：全啟動子上之H3K27me3水平之分析] 針對正常T細胞 3例(Normal T cell)、源自HAM患者之CD4陽性T細胞 4例(HAM)、源自急性型ATL患者之PBMC 3例(ATL)，使用安捷倫科技公司之SurePrint G3人類啟動子2×400K微陣列(SurePrint G3 Human Promoter 2×400K Microarray)，取得全啟動子上之H3K27me3水平，標準化後，繪製距RGMa基因之轉錄起始位點-2,916 bp上游附近之H3K27me3水平之圖。將圖表示於圖6。於圖中繪出陣列之螢光強度之Log ₂值。再者，圖中之HAM50及HAM123分別指獲得CD4陽性T細胞之HAM患者。此提示於源自HAM患者之CD4陽性T細胞中RGMa之基因表現抑制被解除。

[實施例6：RGMa基因mRNA水平之定量] 將插入編碼HTLV-1 Tax之cDNA之慢病毒載體導入至人CD4陽性T細胞白血病細胞株Jurkat，藉由定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉錄聚合酶鏈鎖反應)測定導入後3天之經時之RGMa基因mRNA之水平。亦測定RPL19基因mRNA，用作內部標準。將表示定量結果之圖表示於圖7。此提示由HTLV-1病毒引起RGMa表現。

[實施例7：HTLV-1-tax表現誘導細胞株JPX-9細胞中之Tax依賴性RGMa之表現誘導] 將JPX9細胞於培養基(包含10%FBS之RPMI1640培養基)中培養24小時，以最終濃度成為20 μM之方式添加誘導HTLV-1-tax表現之氯化鎘(CdCl ₂，Nacalai Tesque)後，培養1、2及3天。針對經過氯化鎘處理及未處理之JPX9細胞，就Tax及RGMa之蛋白質表現進行FACS分析。將經過氯化鎘處理及未處理之JPX9細胞分別洗淨，使用Foxp3/轉錄因子染色緩衝液套組(Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit)(eBioscience)進行細胞滲透處理。其後，添加抗Tax-FITC抗體(Lt-4：由琉球大學之田中老師分讓)於4℃下處理1小時，藉此將細胞內表現之Tax蛋白染色。藉由使用CantoII之FACS分析來檢測經染色之Tax蛋白。將經過氯化鎘處理及未處理之JPX9細胞分別洗淨，添加抗RGMa抗體(免疫生物研究所(IBL)股份有限公司製造)於4℃下處理30分鐘。其後，洗淨細胞，添加抗小鼠IgG-PE抗體(BioLegend)，於4℃下反應30分鐘，將JPX9中表現之RGMa蛋白染色。藉由使用CantoII之FACS分析來檢測經染色之RGMa蛋白。將Tax及RGMa之蛋白質表現之分析結果示於圖8。

[實施例8：RGMa抗體對HAM患者PBMC之作用研究] (RGMa抗體對自發增殖活性之作用) 使4例之HAM患者PBMC懸浮於培養基(包含10%FBS之RPMI1640培養基)，以每孔1e5個細胞接種於96孔圓底培養盤，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加RGMa抗體(R&D Systems製造)，於合計0.1 ml之培養液中於37℃、5%CO ₂條件下培養7天。將無任何添加組(培養基(Medium))、同濃度之正常山羊IgG(Normal Goat IgG)(Santa Cruz Biotechnology)添加組(正常IgG)、及1 μg/ml潑尼松龍(PSL)(Funakoshi)添加組作為對照。於培養開始起經過6天後，向各孔添加1 μ Ci ³H-胸苷( ³H-Thymidine)，於37℃、5%CO ₂條件下培養16小時。其後，使用細胞採集器(Tomtec MH3，PerkinElmer)使培養細胞吸附於玻璃過濾器(Printed Filtermat A，PerkinElmer)，加以乾燥後，使固體閃爍劑Meltilex-A(PerkinElmer)滲入，使用MicroBeta(WALLAC MicroBeta TriLux 1450-021)測定細胞中摻入之 ³H-胸苷量。將各HAM患者PBMC於培養基組中之 ³H-胸苷之計數之平均設為100%，計算各組之相對值，求出4例HAM患者之 ³H-胸苷摻入率之平均值。將結果示於圖9。

(RGMa抗體對HTLV-1原病毒量變化之作用) 使4例之HAM患者PBMC懸浮於培養基(包含10%FBS之RPMI1640培養基)中，以每孔1e5個細胞接種於96孔圓底培養盤，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加RGMa抗體(R&D Systems製造)，於合計0.1 ml之培養液中於37℃、5%CO ₂條件下培養7天。將無任何添加組(培養基)、同濃度之正常山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology)添加組(正常IgG)、1 μg/ml潑尼松龍(PSL)(Funakoshi)添加組作為對照。於培養開始起經過7天後，自離心去除了上清液之細胞塊進行基因組DNA提取。使用所提取之基因組DNA，藉由即時PCR進行HTLV-1原病毒量(感染細胞率)之測定。將各HAM患者PBMC於培養基組中之HTLV-1原病毒量設為100%，計算各組中之HTLV-1原病毒量之相對值，求出4例HAM患者之HTLV-1原病毒量之平均值。將結果示於圖10。

(RGMa抗體對CXCL10之產生之作用) 為了分析RGMa抗體對自HAM患者PBMC產生CXCL10之作用，使4例之HAM患者PBMC懸浮於培養基(包含10%FBS之RPMI1640培養基)，以每孔1e5個細胞接種於96孔圓底培養盤，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加RGMa抗體(R&D Systems製造)，於合計0.1 ml之培養液中於37℃、5%CO ₂條件下培養7天。將無任何添加組(培養基)、同濃度之正常山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology)添加組(正常IgG)、1 μg/ml潑尼松龍(PSL)(Funakoshi)添加組作為對照。於培養開始起經過7天後，對培養液進行離心分離而僅回收培養上清液。使用細胞介素珠陣列套組(Cytokine Beads Array kit)(BD Biosciences)，利用流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences)測定培養上清液中之CXCL10濃度。將培養基組之培養液中之CXCL10濃度設為100%，計算各組中之各組之培養液中CXCL10濃度之相對值，求出4例HAM患者之CXCL10濃度之平均值。將結果示於圖11。

(RGMa抗體對產生HAM患者PBMC之細胞介素之作用) 為了分析RGMa抗體對產生HAM患者PBMC中之各種細胞介素之作用，使4例之HAM患者PBMC懸浮於培養基(包含10%FBS之RPMI1640培養基)，以每孔1e5個細胞接種於98孔圓底培養盤，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加RGMa抗體(R&D Systems製造)，於合計0.1 ml之培養液中於37℃、5%CO ₂條件下培養7天。將無任何添加組(培養基)、同濃度之正常山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology)添加組(正常IgG)、1 μg/ml潑尼松龍(PSL)(Funakoshi)添加組作為對照。於培養開始起經過7天後，對培養液進行離心分離而僅回收培養上清液。使用細胞介素珠陣列套組(BD Bio sciences)，利用流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences)測定培養上清液中之IFNγ、TNF(Tumor Necrosis Factor，腫瘤壞死因子)、IL-2、IL-10濃度。將培養基組之培養液中之各細胞介素濃度設為100%，計算各培養條件下之細胞介素濃度之相對值，求出4例HAM患者之平均值。

[實施例9：由HAM-PBMC引起之神經細胞株之細胞凋亡誘導] 於6孔培養盤接種神經細胞株NB-1或SK-N-AS，培養24小時後，添加健康正常人(HD)或HAM患者PBMC進行共培養。於共培養開始起經過48小時後，去除培養基及所添加之PBMC，利用PBS洗淨後回收神經細胞株。針對所回收之各神經細胞株，藉由特異性地檢測因細胞凋亡而發生DNA片段化之細胞之TUNEL法(MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct(MBL))進行分析。將分析結果示於圖13。條帶圖中之X軸表示DNA片段化陽性之強度。與源自HD之細胞相比，源自HAM之細胞對神經細胞株更強地誘導細胞凋亡。具體而言，依據以下之＜實驗程序＞進行細胞死亡之分析。＜實驗程序＞分別於6孔培養盤接種神經細胞株NB-1、SK-N-AS，培養24小時。繼而，添加HD或HAM-PBMC(神經細胞株之接種數之2倍量)，培養48小時。其後，使用4%多聚甲醛固定細胞，利用70%乙醇進行細胞滲透處理。為了進行DNA切口末端標記(DNA nick end labeling)，使細胞懸浮於MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct(MBL)之TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，末端脫氧核苷酸轉移酶)溶液20 uL(TdT緩衝液II：TdT：FITC-dUTP(Fluorescein Isothiocyanate-Deoxyuridine Triphosphate，異硫氰酸螢光素-去氧鳥苷三磷酸)=18：1：1)，於37℃下反應60分鐘後進行FACS分析。

[實施例10：RGMa抗體對由HTLV-1 Tax表現T細胞株誘導之神經細胞株之細胞凋亡之抑制作用] 於6孔培養盤接種神經細胞株NB-1，培養24小時後，添加未刺激JPX9(JPX9(-))進行共培養，或添加了20 μM氯化鎘24小時誘導Tax表現之JPX9(JPX9(+CdCl ₂))進行共培養。又，於NB-1細胞與JPX9(+CdCl ₂)之共培養時，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加正常小鼠IgG2b(MBL)或RGMa抗體(IBL)。於共培養開始起經過48小時後，去除培養基及所添加之JPX9，利用PBS洗淨後回收神經細胞株。針對所回收之各神經細胞株，藉由特異性地檢測因細胞凋亡而發生DNA片段化之細胞之TUNEL法(MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct(MBL))進行分析。將分析結果示於圖14。條帶圖中之X軸表示DNA片段化陽性之強度。具體而言，依據以下之＜實驗程序＞進行細胞死亡之分析。＜實驗程序＞於6孔培養盤接種神經細胞株(NB-1)，培養24小時。繼而，於NB-1細胞中添加JPX9(-)或JPX9(+CdCl ₂)進行共培養。再者，JPX9(-)或JPX9(+CdCl ₂)之細胞數設為NB-1細胞之接種數之2倍量。對於JPX9(+CdCl ₂)，為了去除氯化鎘而利用10 ml培養基清洗3次後添加至NB-1細胞。繼而，於NB-1細胞與JPX9(+CdCl ₂)之共培養時，以最終濃度成為10 μg/ml之方式添加正常小鼠IgG2b(MBL)或抗RGMa抗體(IBL)，培養48小時。其後，使用4%多聚甲醛固定細胞，利用70%乙醇進行細胞滲透處理，添加抗CD45-V450抗體進行染色。為了進行DNA切口末端標記，使細胞懸浮於MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct(MBL)之TdT溶液20 uL(TdT緩衝液II：TdT：FITC-dUTP=18：1：1)，於37℃下反應60分鐘後進行FACS分析。

本說明書中引用記載之刊物、專利文獻及非專利文獻中記載之所有內容直接以參考之形式併入本說明書中。

[圖1]係表示根據作為HTLV-1感染細胞之指標的CADM1及CD7對CD4陽性T細胞進行分類而獲得之P組、D組、N組之圖。 [圖2]係表示正常T細胞(Normal.CD4)、源自HAM患者之CD4陽性T細胞(HAM.CD4)、源自健康正常人之CD4陽性/CADM1陰性/CD7陽性T細胞(Normal.P)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陰性/CD7陽性T細胞(P組)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陽性T細胞(D組)、HTLV-1感染者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陰性T細胞(N組)、急性型ATL患者CD4陽性/CADM1陽性/CD7陰性T細胞(Acute.N)、健康正常人CD4陽性T細胞(Normal.CD4.1)、源自冒煙型ATL患者之PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單個核細胞)(Smoldering)、源自慢性型ATL患者之PBMC(Chronic)、源自急性型ATL患者之PBMC(Acute)中之RGMa基因之表現水平之圖。 [圖3]係表示HAM患者CD4陽性T細胞及健康正常人CD4陽性T細胞中之RGMa之表現量的圖。 [圖4]係表示HAM患者PBMC之細胞種類間之RGMa之表現量之分析結果的圖。 [圖5]係表示於HAM患者PBMC之培養中伴隨HTLV-1病毒之表現而產生之RGMa之表現變化的圖。 [圖6]係表示距RGMa基因之轉錄起始位點-2,916 bp上游附近之H3K27me3水平之圖。 [圖7]係表示將插入編碼HTLV-1 Tax之cDNA之慢病毒載體導入至人CD4陽性T細胞白血病細胞株Jurkat時之RGMa基因mRNA之水平的圖。 [圖8]係表示HTLV-1-tax表現誘導細胞株JPX-9中之Tax及RGMa之蛋白表現之分析結果之圖。 [圖9]係表示關於RGMa抗體對HAM患者PBMC之作用，RGMa抗體對自發增殖活性之作用之結果的圖。 [圖10]係表示關於RGMa抗體對HAM患者PBMC之作用，RGMa抗體對HTLV-1原病毒量變化之作用之結果的圖。 [圖11]係表示關於RGMa抗體對HAM患者PBMC之作用，RGMa抗體對產生CXCL10(C-X-C motif chemokine 10，C-X-C型趨化介素10)之作用之結果的圖。 [圖12]係表示關於RGMa抗體對HAM患者PBMC之作用，RGMa抗體對產生HAM患者PBMC之細胞介素之作用之結果的圖。 [圖13]係表示HAM-PBMC引起神經細胞株之細胞凋亡誘導之圖。 [圖14]係表示RGMa抗體對由HTLV-1-tax誘導細胞株引起之神經細胞株之細胞凋亡誘導的抑制作用之結果之圖。(a)係將NB-1細胞與JPX-9細胞(未刺激)共培養時之FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting，螢光激活細胞分選)圖。(b)係將NB-1細胞與CdCl ₂刺激JPX-9細胞(HTLV-1-tax表現細胞)共培養時之FACS圖。(c)係於(b)之條件下添加對照抗體時之FACS圖。(d)係於(b)之條件下添加抗RGMa抗體時之FACS圖。

Claims

一種使用在製造使用於HTLV-1關聯性脊髓病(HAM)之治療或預防的醫藥組成物之RGMa抑制物質的用途。
如請求項1之用途，其中前述RGMa抑制物質為作用於RGMa而抑制RGMa之活性的物質，或抑制RGMa之表現的物質。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa的抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段結合於具有選自由序列編號53、54、55、56及57所成群的胺基酸序列的1個以上之肽。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa的抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段結合於人類RGMa的胺基酸序列中之第250號以後者。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa的抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段作為輕鏈之互補決定區1(LCDR1)、輕鏈之互補決定區2(LCDR2)、輕鏈之互補決定區3(LCDR3)、重鏈之互補決定區1(HCDR1)、重鏈之互補決定區2(HCDR2)及重鏈之互補決定區3(HCDR3)的各胺基酸序列，含有 LCDR1：RASQDISSYLN(序列編號58)、 LCDR2：YTSRLHS(序列編號59)、 LCDR3：QQLNTLP(序列編號60)、 HCDR1：DAWMD(序列編號61)、 HCDR2：EIRSKANNHATYYAESVKG(序列編號62)及 HCDR3：RDGAY(序列編號63)，或者含有 LCDR1：RSSQSLVHSNGNTYLH(序列編號64)、 LCDR2：KVSNRFS(序列編號65)、 LCDR3：SQSTHVP(序列編號66)、 HCDR1：TSYYWN(序列編號67)、 HCDR2：YISYDGTNNYNPSLKN(序列編號68)及 HCDR3：SFG。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa之抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段的輕鏈之互補決定區1(LCDR1)、輕鏈之互補決定區2(LCDR2)、輕鏈之互補決定區3(LCDR3)、重鏈之互補決定區1(HCDR1)、重鏈之互補決定區2(HCDR2)及重鏈之互補決定區3(HCDR3)的各胺基酸序列為， LCDR1：序列編號8、 LCDR2：序列編號9、 LCDR3：序列編號10、 HCDR1：序列編號5、 HCDR2：序列編號6及 HCDR3：序列編號7，或 LCDR1：序列編號14、 LCDR2：序列編號15、 LCDR3：序列編號16、 HCDR1：序列編號11、 HCDR2：序列編號12及 HCDR3：序列編號13。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa的抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段為選自下述(a1)～(h1)， (a1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號99記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (b1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號103記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (c1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號104記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (d1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號105記載的胺基酸序列之LCDR3的輕鏈可變區域，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (e1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號106記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (f1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號107記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (g1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號108記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3； (h1)含有輕鏈可變區域及重鏈可變區域的抗RGMa抗體，或該抗原結合片段，其中輕鏈可變區域含有：含有序列編號97記載的胺基酸序列之LCDR1、含有序列編號98記載的胺基酸序列之LCDR2及含有序列編號109記載的胺基酸序列之LCDR3，重鏈可變區域含有：含有序列編號100記載的胺基酸序列之HCDR1、含有序列編號101記載的胺基酸序列之HCDR2及含有序列編號102記載的胺基酸序列之HCDR3。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為識別RGMa之抗體或該抗原結合片段，前述抗體或該抗原結合片段中，重鏈可變區域(VH)為序列編號95或含有與該胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區域(VL)為序列編號96或含有與該胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列。
如請求項1或2之用途，其中前述RGMa抑制物質為選自由表現RGMa之基因的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸所成群的一種或二種以上。