JP5963233B2

JP5963233B2 - Ｈｔｌｖ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬および前記医薬を用いた抗体療法の治療効果の確認方法

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Publication number: JP5963233B2
Application number: JP2011268019A
Authority: JP
Inventors: 嘉久山野; 安藤　仁; 仁安藤; 知雄佐藤
Original assignee: St Marianna University School of Medicine
Current assignee: St Marianna University School of Medicine
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: JP2013119531A

Description

本発明は、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬、および前記医薬を用いた抗体療法の治療効果の確認方法に関する。

現在、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human T-cell leukemia virus type-1；以下「ＨＴＬＶ−Ｉ」と略記する）の感染者は、日本に約１１０万人存在する。そして、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者のうちの約０．３％（約３０００人）は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy；以下「ＨＡＭ」と略記する）を発症する。

ＨＡＭは、発症者の数が大変少ないため、病因解明および治療薬開発のための研究が進みにくい。また、ＨＡＭは、国の難病性疾患克服研究事業の対象疾患に指定されている。現在、ＨＡＭに対する有効な治療法は確立されておらず、一刻も早い治療法の開発が切望されている。

ＨＡＭの病態の特徴として、末梢血および脳脊髄液中においてＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の数が非常に多くなり、その量に比例して過剰な免疫応答が誘発されて、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球が異常に増加することが挙げられる。ＨＡＭの脊髄病変では、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞や各種炎症細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞やＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球）が、血液脳関門を介して脊髄外から脊髄内に浸潤していることが病理学的に報告されている。これらのことから、ＨＡＭの病態は、感染細胞に起因した過剰な免疫応答による神経組織障害であると考えられている。

これらの病態をふまえたＨＡＭの治療戦略として、（１）ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除、（２）過剰免疫応答（脊髄炎症）の沈静化、（３）損傷した脊髄の再生、が挙げられる。ＨＡＭを根治するためには、脊髄の再生治療が必要である。しかし、再生治療を成功させるためには、まず（１）または（２）を実現することが必要不可欠である。現在、ＨＡＭの治療には、（２）過剰免疫応答の沈静化を実現するために、ステロイドやインターフェロンなどの非特異的な抗炎症治療が用いられている。これらの治療方法は、短期的には治療効果を発揮するが、治療が長期化すると、副作用や治療効果の減弱が認められている。このように、従来の治療方法は、ＨＡＭの病態に即した治療法ではなかった。

一方、近年、ケモカインの一種であるＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０；Interferon-inducible protein 10）がリウマチ性関節炎や炎症性腸疾患などに関与していると報告されている。そして、これらの疾患を特異的に治療するため、抗ＣＸＣＬ１０抗体が抗体医薬として有用であることが報告されている（例えば、特許文献１参照）。これに伴い、関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎を対象として、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いた第II相試験が完了している。

特表２００７−５１４４１９号公報

前述のとおり、ＨＡＭを効果的に治療するためには、脊髄における過剰免疫応答（慢性的な炎症）を沈静化することが極めて重要であるが、この炎症を特異的に沈静化できる医薬はまだ開発されていない。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、脊髄における炎症を制御して、ＨＡＭを治療または予防することができる医薬を提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＡＭに対する抗体療法の治療効果を確認する方法を提供することも目的とする。

一般的な炎症では、ケモカインが炎症細胞の遊走に関与していることが知られている。このことから、ＨＡＭ発症者の脊髄における炎症でもケモカインが関与していることが考えられる。そこで、本発明者は、ＨＡＭの炎症に関与しているケモカインを網羅的に探索した結果、ＣＸＣＬ１０がＨＡＭの炎症に最も強く関与していることを見出した。後述するように、ＨＡＭ発症者では、ＣＸＣＬ１０の産生および炎症細胞などの浸潤が繰り返されることにより、脊髄における炎症が慢性化していると推察される。

そして、本発明者は、上記知見に基づきさらに検討した結果、抗ＣＸＣＬ１０抗体がＨＡＭの治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下のＨＴＬＶ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬に関する。
［１］ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体または前記抗体の断片を含む、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬。

また、本発明は、以下のＨＴＬＶ−１関連脊髄症の患者（発症者）に対する抗体療法の治療効果の確認方法に関する。
［２］ＨＴＬＶ−１関連脊髄症の患者に対する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体または前記抗体の断片を用いた抗体療法の治療効果を確認する方法であって、前記患者から採取された脳脊髄液を準備するステップと、前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度を測定するステップと、前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度を指標として、前記抗体療法の治療効果を判定するステップと、を有する、抗体療法の治療効果の確認方法。
［３］前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度が所定の値より低いときに、前記抗体療法が前記患者に対して有効であると判定する、［２］に記載の治療効果の確認方法。

本発明の医薬によれば、ＨＡＭ発症者に見られる炎症を制御することができるため、ＨＡＭを効果的に治療または予防することができる。また、本発明の治療効果の確認方法によれば、本発明の医薬を用いてＨＡＭを治療する場合に、その治療効果を確認することができる。

図１Ａ〜Ｃは、ＨＡＭ発症者とＨＡＭ非発症者の脳脊髄液中におけるケモカイン濃度を示すグラフ（１）である。図２Ａ〜Ｃは、ＨＡＭ発症者とＨＡＭ非発症者の脳脊髄液中におけるケモカイン濃度を示すグラフ（２）である。図３Ａ〜Ｃは、ＨＡＭ発症者とＨＡＭ非発症者の脳脊髄液中におけるケモカイン濃度を示すグラフ（３）である。図４Ａ〜Ｃは、脳脊髄液中の各種ケモカイン濃度と納の運動障害重症度との関係を示すグラフである。図５Ａ〜Ｃは、脳脊髄液中と血清中におけるケモカイン濃度を比較したグラフである。遊走阻害試験の結果を示すグラフである。

１．本発明の医薬
本発明の医薬は、ＨＡＭを治療または予防するための医薬であって、ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片を含むことを特徴とする。

前述したように、一般的な炎症において、ケモカインは、炎症細胞の遊走に重要な役割を果たしていることが知られている。しかしながら、ＨＡＭ発症者の脊髄における炎症にどのケモカインが関与しているのか、またＨＡＭ発症者の脊髄における炎症が慢性化する機構に関しては、明確に証明されていない。そこで、本発明者は、ＨＡＭ発症者の脊髄において炎症が慢性化する機構について、以下の仮説を立てた。

まず、ＨＡＭ発症者では、脊髄内に浸潤したＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞や各種炎症細胞が、周辺の神経組織に存在する細胞などに作用してケモカインの産生を誘導する。そして、脊髄内のケモカイン濃度が上昇すると、脊髄の内外でケモカインの濃度勾配が生じ、脊髄外の炎症細胞がさらに脊髄内に遊走（浸潤）する。このように、ＨＡＭ発症者では、ケモカインの産生および炎症細胞などの浸潤が繰り返されることにより、炎症サイクルが形成されて炎症が慢性化すると考えられる。

このように、本発明者は、特定のケモカインがＨＡＭ発症者の脊髄における炎症サイクルに重要な役割を果たしていると考え、そのようなケモカインを網羅的に探索した。その結果、本発明者は、ＣＸＣＬ１０がＨＡＭの炎症サイクルに最も関与していることを見出した。すなわち、後述の実施例に示すように、ＨＴＬＶ−１感染者のうち、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０の濃度は、ＨＡＭ非発症者の脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０の濃度と比較して著しく高い。また、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０と、運動障害重症度スコアとの間には、強い相関関係が見られる。さらに、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０の濃度は、血清中におけるＣＸＣＬ１０の濃度より高い。これらのことから、ＣＸＣＬ１０がＨＡＭにおける炎症サイクル形成の重要因子であることが強く示唆される。

ＨＡＭ発症者における炎症サイクル形成のメカニズムは、以下のように推察される（これに限定されるわけではない）。脊髄に浸潤したＨＴＬＶ−１感染細胞はＩＦＮ−γを産生する。産生されたＩＦＮ−γは、脊髄内の他の細胞（例えば、マクロファージ）に対してＣＸＣＬ１０の産生を誘導し、ＣＸＣＬ１０の濃度勾配を形成する。ＣＸＣＬ１０の受容体であるＣＸＣＲ３が発現している脊髄外の炎症性細胞は、ＣＸＣＬ１０の作用により、脊髄内に遊走しＩＦＮ−γを産生する。産生されたＩＦＮ−γは、脊髄内の他の細胞（例えば、マクロファージ）に対してＣＸＣＬ１０の産生をさらに誘導する。これにより、脊髄内から脊髄外にかけてＣＸＣＬ１０の濃度勾配がさらに形成され、脊髄外のＣＸＣＲ３陽性細胞をさらに脊髄内へ誘引する。

以上のように、ＨＡＭにおける炎症サイクル形成の主要なケモカインは、ＣＸＣＬ１０である可能性が非常に高い。よって、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いて炎症サイクルを抑制することで、ＨＡＭを効果的に治療または予防することができると考えられる。実際、本発明者らは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いることで、ＨＡＭ発症者由来の末梢血単核細胞（ＣＸＣＲ３陽性細胞を含む）の遊走を阻害できることを確認している（実施例参照）。この結果は、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いることでＨＡＭを治療または予防できることを支持している。

抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いた抗体療法がＨＡＭの有用な治療法となりうるか否かを検討する上で最も重要な点は、副作用をもたらす可能性の有無である。この点、前述したように、抗ＣＸＣＬ１０抗体は、関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎を対象とした第II相試験が完了しているため、大きな副作用がある可能性は低いと考えられる。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片の種類は、ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。

本発明の医薬に含まれる抗ＣＸＣＬ１０抗体の例には、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体が含まれる。

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下「ＶＨ」と略記する）および軽鎖可変領域（以下「ＶＬ」と略記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下「ＣＨ」と略記する）および軽鎖定常領域（以下「ＣＬ」と略記する）とからなる抗体である。可変領域についての動物の種類は、マウスやラット、ハムスター、ウサギなどのハイブリドーマを作製しうる動物であれば特に限定されない。ヒト型キメラ抗体は、ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで作製されうる。ヒト型キメラ抗体のＣＨは、ヒトイムノグロブリン（以下「ｈＩｇ」と略記する）であれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型キメラ抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。

ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と略記する）をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体である。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下「ＦＲ」と略記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることで、作製されうる。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば特に限定されない。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨは、ｈＩｇであれば特に限定されないが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬは、ｈＩｇに属すれば特に限定されない。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体の断片の例には、上記各抗体の断片が含まれる。抗体の断片の種類は特に限定されず、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどである。

Ｆａｂは、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＦａｂは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体をパパインで処理するか、前記抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧをペプシン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＦ（ａｂ’）_２は、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体をペプシンで処理するか、Ｆａｂ’（後述）をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で結合させることで、作製されうる。

Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＦａｂ’は、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールで処理するか、前記抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーを用いて連結した抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のｓｃＦｖは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のｄｉａｂｏｄｙは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片である。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のｄｓＦｖは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含むペプチドである。抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＣＤＲを含むペプチドは、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入して発現させることで、作製されうる。また、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体のＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても作製することができる。

本発明の医薬に含まれる抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片は、例えば、前述の特許文献１に記載された抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片である。

本発明の抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を含む医薬は、ＨＡＭの治療薬または予防薬として単独でも投与されうるが、通常は薬理学的に許容される１または２以上の担体と混合し、製剤学の技術分野において良く知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供されることが好ましい。

投与経路は、特に限定されず、ＨＡＭの治療に最も効果的なものを適宜選択することができる。投与経路の例には、経口投与、ならびに口腔内投与や気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの非経口投与が含まれる。通常は、静脈内投与が好ましい。

投与形態も、特に限定されず、投与経路などに応じて適宜選択することができる。投与形態の例には、注射剤や噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、座剤、軟膏、テープ剤などが含まれる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。通常は、注射剤が好ましい。

注射剤は、塩溶液またはブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製されうる。また、粉末注射剤は、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることにより製造されうる。

投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、有効成分（抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片）の量として通常成人１日あたり０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ程度である。

本発明の医薬は、ＨＡＭ発症者の脊髄における炎症サイクルを抑制しうるので、ＨＡＭに対する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体を用いた抗体療法に使用されうる。すなわち、本発明の医薬は、ＨＡＭの治療薬または予防薬として使用されうる。

２．本発明の治療効果の確認方法
本発明の治療効果の確認方法は、ＨＡＭ発症者（患者）に対する、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体またはその断片を用いた抗体療法の治療効果を確認する方法である。

本発明の治療効果の確認方法は、１）ＨＡＭ発症者の脳脊髄液を準備する第１のステップと、２）脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度を測定する第２のステップと、３）測定したＣＸＣＬ１０の濃度に基づいて、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症における治療効果を判定する第３のステップと、を有する。

第１のステップでは、抗体療法を受けているＨＡＭ発症者から採取された脳脊髄液を準備する。

第２のステップでは、第１のステップで準備した脳脊髄液に含まれるＣＸＣＬ１０の濃度を測定する。ＣＸＣＬ１０の濃度の測定方法は、特に限定されない。たとえば、ビーズアレイ法やＥＬＩＳＡ法などで測定すればよい。

第３のステップでは、第２のステップで測定したＣＸＣＬ１０の濃度を指標として、抗体療法の治療効果を判定する。

前述の通り、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度は、健常者（ＨＡＭ非発症者）に比べて顕著に高い。したがって、脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度が所定の値より低くなれば、抗体療法が当該ＨＡＭ発症者に対して有効であると判定することができる。

本発明の治療効果の確認方法は、ＨＡＭ発症者に対する治療効果を確認することができるので、当該ＨＡＭ発症者に対して抗体療法が有効であるかを確認することができる。

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

１．脳脊髄液中におけるケモカイン濃度の測定
前述したように、ケモカインは、ＨＡＭ発症者の炎症サイクルにおいて重要な役割を果たしていると考えられる。そこで、ＨＡＭ発症者の炎症サイクルにおいて重要な役割を果たしているケモカインを見出すことを目的として、ＨＡＭ発症者およびＨＡＭ非発症者（ＨＴＬＶ−１感染者）における脳脊髄液中の各種ケモカイン濃度を調べた。

図１〜３は、ＨＡＭ発症者とＨＡＭ非発症者（ＨＴＬＶ−１感染者）の脳脊髄液中におけるケモカイン濃度を示すグラフである。今回の実験では、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ；図１Ａ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０；図１Ｂ）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ；図１Ｃ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α；図２Ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β；図２Ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ；図２Ｃ）、ＣＣＬ１７（ＴＲＡＣ；図３Ａ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α；図３Ｂ）およびＣＣＬ２２（ＭＤＣ；図３Ｃ）の９種類のケモカインについて濃度を比較した。統計学的処理は、マンホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）を行った。

図１Ｃ、図２Ａ〜Ｃおよび図３Ａ〜Ｃに示されるように、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ２２については、ＨＡＭ発症者における脳脊髄液中の濃度と、ＨＡＭ非発症者における脳脊髄液中の濃度との間に、有意差は認められなかった。一方、図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０については、ＨＡＭ発症者における脳脊髄液中の濃度が、ＨＡＭ非発症者における脳脊髄液中の濃度に対して有意に高かった。また、ＣＸＣＬ９とＣＸＣＬ１０とを比較すると、ＨＡＭ発症者における脳脊髄液中の濃度は、ＣＸＣＬ９よりもＣＸＣＬ１０のほうが１００倍近く大きな値であった。これは、ＣＸＣＬ９よりもＣＸＣＬ１０の方がより容易に検出できることを意味する。

これらの結果から、ＣＸＣＬ９および／またはＣＸＣＬ１０が、ＨＡＭ発症者の炎症サイクルにおいて重要な役割を果たしている可能性があることが示唆される。

２．脳脊髄液中のケモカイン濃度と運動障害重症度との関係
次に、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０がＨＡＭ発症者の炎症サイクルに関与しているかどうかを確認するため、ＨＡＭ発症者における脳脊髄中の濃度と、ＨＡＭの症状の指標となる納の運動障害重症度（Osame motor dysfunction score）との相関関係について調べた。

図４は、脳脊髄液中の各種ケモカイン濃度と納の運動障害重症度との関係を示したグラフである。本実験では、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５（コントロール）について調べた。統計学的処理は、スペアマンの相関解析（Spearman's rank correlation）により行った。

図４Ｃに示されるように、脳脊髄液中におけるＣＣＬ５の濃度と納の運動障害重症度との間には、ほとんど相関関係は見られなかった（相関係数ｒ＝０．２３７５、有意水準ｐ＝０．２３４７）。また、図４Ｂに示されるように、脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ９の濃度と納の運動障害重症度との間には、低い正の相関が認められた（相関係数ｒ＝０．４７８９、有意水準ｐ＝０．００８６）。一方、図４Ａに示されるように、脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０の濃度と納の運動障害重症度との間には、高い正の相関関係が認められた（相関係数ｒ＝０．６６２１、有意水準ｐ＝０．０００１）。

これらの結果からも、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０が、ＨＡＭ発症者の炎症サイクルに関与している可能性があることが示唆される。

３．脳脊髄液中と血清中のケモカイン濃度の比較
ＨＡＭ発症者で見られる炎症サイクルは、脊髄内から脊髄外にかけてのケモカインの濃度勾配により、炎症細胞が脊髄外（血液）から脊髄内に浸潤することで起こると考えられる。そこで、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０について、脊髄内の濃度が高く、脊髄外の濃度が低い濃度勾配が形成されているかどうかを確認するため、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液および血清中の濃度を調べた。

図５は、ＨＡＭ発症者の脳脊髄液（cerebrospinal fluid；ＣＳＦ）中と血清（serum）中におけるケモカイン濃度を比較したグラフである。本実験では、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５（コントロール）について調べた。統計学的解析は、ペアＴ検定（paired t-test）を行った。

図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、ＨＡＭ発症者において、脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ９およびＣＣＬ５の濃度は、血清中の濃度より著しく低い値であった。これは、ＣＸＣＬ９およびＣＣＬ５は、脊髄内の濃度が高く、脊髄外の濃度が低い濃度勾配（炎症細胞の脊髄内への遊走に必要な濃度勾配）を形成していないことを意味する。この結果から、ＣＸＣＬ９およびＣＣＬ５は、ＨＡＭの炎症サイクル形成への貢献度に乏しいと考えられる。一方、図５Ａに示されるように、ＨＡＭ発症者において、脳脊髄液中におけるＣＸＣＬ１０の濃度は、血清中の濃度より高い値であった。これは、ＣＸＣＬ１０は、脊髄内の濃度が高く、脊髄外の濃度が低いという、炎症細胞の脊髄内への遊走に必須の濃度勾配を形成していることを意味する。

以上の結果から、ＨＡＭ発症者において、脊髄外から脊髄内への炎症細胞の遊走には、ＣＸＣＬ１０が関与していることが強く証明された。

４．遊走阻害試験
上記１〜３の実験結果から、ＣＸＣＬ１０は、ＨＡＭ発症者における細胞遊走の主要な因子と考えられる。このことから、ＣＸＣＬ１０による細胞遊走の作用を阻害することで、ＨＡＭの炎症サイクルを制御することができると考えられる。そこで、ＣＸＣＬ１０を認識する抗ＣＸＣＬ１０抗体、およびＣＸＣＬ１０の受容体であるＣＸＣＲ３を認識する抗ＣＸＣＲ３抗体による細胞遊走の阻害効果について調べた。遊走阻害試験は、ケモタキシスチャンバー（ＭＢＡ９６；Neuroprobe社）を用いて行った。
１）上室用の培養液の調製
上室用の培養液は、ＨＡＭ発症者における血液のモデルである。ＨＡＭ発症者の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。次いで、１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した後、上清を除去した。３７℃に加温したＲＰＭＩ１６４０培養液（ウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬを含む）を１０ｍＬ加え、細胞数を測定した。１×１０^６細胞／１００μＬとなるように調整した培養液に、以下の３種類の抗体のうちのいずれか一種類の抗体を最終濃度で１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で３０分間培養した。抗体は、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体（ＭＡＢ２２６；R&D Systems社）、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（ＭＡＢ１６０；R&D Systems社）、およびコントロールとして抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＡＢ００２；R&D Systems社）を使用した。その後、各培養液を上室ウェルに１×１０^６細胞／１００μＬ／ウェルとなるように分注した（図６参照）。

２）下室用の培養液の調製
下室用の培養液は、ＨＡＭ発症者における脊髄のモデルである。最終濃度が０．２５μｇ／ｍＬとなるようにリコンビナントヒトＣＸＣＬ１０（２６６−ＩＰ；R&D Systems社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液（ウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬを含む）を、４００μＬ／ウェルとなるように下室ウェルに分注した（図６参照）。

３）細胞数の測定
下室の上にケモタキシスフィルター（ＰＦＤ５；Neuroprobe社）を被せ、上室を重ねてロックした。その後、５％ＣＯ_２存在下で、３７℃、１２０分間培養した。培養後の下室の培養液を回収して遠心分離した後、下室に遊走したＰＢＭＣの数をフローサイトメーターで測定した。測定結果を図６に示す。図６における細胞遊走indexは、ＣＸＣＬ１０非存在下で下室に遊走したＰＢＭＣの数に対する、ＣＸＣＬ１０存在下で下室に遊走したＰＢＭＣの数である。また、統計学的解析は、Kruskal-Wallis検定後、Dunns検定をGraphPad Prism 5を用いて行った。

４）結果
図６は、遊走阻害試験の結果を示すグラフである。図６の実験Ｎｏ．２に示されるように、ＣＸＣＬ１０の濃度勾配を形成することで、ＰＢＭＣの上室から下室への細胞遊走が促進された。この状態でコントロール抗体を上室の培養液に添加したところ、図６の実験Ｎｏ．３に示されるように、細胞遊走はまったく抑制されなかった。同様に、抗ＣＸＣＲ３抗体を上室の培養液に添加したときも、図６の実験Ｎｏ．４に示されるように、細胞遊走はほとんど抑制されなかった。この理由は不明であるが、使用した抗ＣＸＣＲ３抗体がＣＸＣＲ３とＣＸＣＬ１０の結合を阻害しなかった可能性がある。

これに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体を上室の培養液に添加したところ、図６の実験Ｎｏ．５に示されるように、細胞遊走を有意に抑制することができた（ｐ＜０．０５）。このことから、中和抗体として抗ＣＸＣＬ１０抗体を使用することで、ＣＸＣＬ１０の濃度勾配によるＰＢＭＣの細胞遊走を抑制できることがわかる。

以上の結果から、本発明の医薬は、ＨＡＭ発症者における炎症サイクルを制御し、ＨＡＭを治療または予防できることが強く示唆された。

本発明の医薬は、ＨＡＭの治療薬または予防薬として有用である。また、本発明の治療効果の確認方法は、本発明の医薬を用いてＨＡＭを治療する場合に、その治療効果を確認する方法として有用である。

Claims

ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体、または前記抗体のヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する断片を含む、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症を治療または予防するための医薬。
ＨＴＬＶ−１関連脊髄症の患者に対する、ヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体、または前記抗体のヒトＣＸＣＬ１０に特異的に結合する断片を用いた抗体療法の治療効果を確認する方法であって、
前記抗体療法を受けた前記患者から採取された脳脊髄液を準備するステップと、
前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度を測定するステップと、
前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度を指標として、前記抗体療法の治療効果を判定するステップと、を有し、
前記抗体療法の治療効果を判定するステップでは、前記脳脊髄液中のＣＸＣＬ１０の濃度が所定の値より低いときに、前記抗体療法が前記患者に対して有効であると判定する、
抗体療法の治療効果の確認方法。