BR112016027671B1 - Uso de um anticorpo - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS, COMPOSIÇÕES E KIT. A invenção refere-se a um anticorpo, um fragmento ou um derivado do mesmo, para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos tipo W (HERV-W), em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado do mesmo é direcionado contra proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env). A invenção também se refere a uma composição que compreende o dito anticorpo e uma droga inibitória de transcriptase reversa, para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente ao HERV-W.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a uma nova droga antirretroviral de direcionamento de retrovírus endógeno humano.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Retrovírus endógenos humanos (HERV) são famílias complexas e de múltiplas cópias heterogêneas de elementos genéticos que são remanescentes de infecções retrovirais ancestrais que penetraram no genoma de certas espécies através de inserções dentro de células de linhagem germinativa. No total, elementos HERV representam cerca de 8% do genoma humano e, apesar de elementos HERV manterem a atividade transcricional eles raramente provocam expressão do genoma retroviral completo e é muito pouco esperado que esse surja a partir de cópias provirais completamente funcionais.
[003] Elemento Retroviral associado à Esclerose Múltipla (MSRV), que é um membro da família de retrovírus endógenos humanos tipo W (HERV- W), foi isolado pela primeira vez a partir de células de pacientes que sofrem de esclerose múltipla. MSRV normalmente está latente no genoma dos indivíduos, mas quando desencadeado por cofatores, como certos vírus comuns, pode ser reativado e pode ainda expressar uma proteína do envelope da família HERV- W. Os inventores investigaram anteriormente esse mecanismo e revelaram que ele é um dos principais fatores agravantes e de acionamento no desenvolvimento e progressão de várias doenças como esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2.
[004] Apesar da possível expressão de todos os genes retrovirais estruturais de HERVs, isto é, do gene gag que codifica matriz, poliproteína precursora de capsídeo e nucleocapsídeo, juntamente com o gene pol que codifica enzimas retrovirais incluindo protease, transcriptase reversa e poliproteína precursora de integrase, e juntamente com o gene env que codifica a proteína precursora do envelope a partir do mesmo HERV, nenhuma cópia retroviral infecciosa de HERVs pôde ser encontrada até a presente data.
[005] Além disso, ao contrário dos retrovírus infecciosos exógenos, HERVs infecciosos estão presentes no DNA de todas as células de cada indivíduo humano e, portanto, moléculas terapêuticas classicamente usadas para tratar retrovírus humanos não podem eliminar o provirus correspondente dentro de uma subpopulação de células do reservatório. Muitas restrições celulares e genéticas desses elementos endógenos também os tornam controlados pelos mecanismos moleculares não retrovirais, escapando assim das vias retrovirais clássicas. Entre esses diversos mecanismos, um envolvimento de silenciamento gênico, de controle gênico por promotor/enhancer celular ou de recombinação genética entre sequências de HERV e genes celulares são conhecidos. Essas características não são esperadas com retrovírus exógenos clássicos e, portanto, não são acessíveis para as terapias antirretrovirais atualmente existentes.
[006] Nessas condições, os tratamentos de retrovírus exógenos clássicos não podem esperar controle total da expressão de HERV patogênico e, consequentemente, ter uma eficiência terapêutica ótima, se for o caso, em doenças associadas ao HERV.
[007] Existe assim um longo tempo em que se sente a necessidade não satisfeita para uma nova estratégia terapêutica antirretroviral de direcionamento de vírus HERV.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[008] Os inventores surpreendentemente descobriram que um efeito anti-HERV inesperado de direcionamento de elementos endógenos da família HERV-W pode reduzir e inibir a expressão de HERV-W. Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo, um fragmento ou um derivado do mesmo, para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV), em que o dito anticorpo é direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV- W Env). Preferencialmente, o dito anticorpo, fragmento ou derivado é para prevenir e/ou tratar uma doença associada ao HERV-W. Mais preferencialmente, o dito anticorpo é para prevenir e/ou tratar Esclerose Múltipla (MS) ou Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica (CIDP). Mais preferencialmente, o dito anticorpo é um anticorpo humanizado monoclonal, em que a cadeia pesada (HC) tem a sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID No: 9 e a cadeia leve (LC) tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No: 10.
[009] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende, preferencialmente consiste em, um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W ENV), um fragmento ou um derivado do mesmo e uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente ao retrovírus endógeno humano (HERV).
[0010] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), um fragmento ou um derivado do mesmo e uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial em um método para tratar uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2.
[0011] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um kit que compreende pelo menos um oligonucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11 a 28.
[0012] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), um fragmento ou um derivado do mesmo, para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV), preferencialmente à família HERV-W, em um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W, em que o dito paciente é identificado por um método que compreende uma etapa i) para detectar e/ou quantificar HERV-W em uma amostra biológica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[0013] Como usado no presente pedido, os termos “retrovírus endógeno humano” e “HERV”, referem-se a retrovírus endógenos humanos que compreendem o vírus pertencente à família de retrovírus endógeno tipo W, geralmente denominado “HERV-W”.
[0014] “HERV-W” é uma família de retrovírus endógenos humanos que foi desvendada no genoma humano a partir da descoberta inicial de “Retrovírus Associado a Esclerose Múltipla”, MSRV, um retrovírus humano primeiro isolado de pacientes com esclerose múltipla. Portanto, quando estudos mencionam “LM7” (primeiro isolado descrito de MS), “retrovírus de MS”, “MSRV”, “Sincitina”, “HERV-W 7q”, “ERVW-E1”, “ERVW-E2”, “cópias de HERV-W do cromossomo X” ou “HERV-W”, eles são todos denominados elementos HERV- W.
[0015] Como usado no presente pedido, o termo “MSRV” refere-se a um retrovírus endógeno específico que é um membro da família de HERV-W. No contexto da presente invenção, as expressões “HERV-W” e “MSRV” ambas designam elementos HERV-W. Especificamente, as expressões “HERV-W Env” e “MSRV-Env” ambas referem-se às mesmas proteínas do envelope. Tipicamente, algumas variações eventuais na sequência de aminoácidos não previne a ligação de anticorpos anti-Env específicos para uso terapêutico, em particular um anticorpo que tem uma cadeia pesada (HC) com a sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID No: 9 e uma cadeia leve (LC) com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No: 10.
[0016] Como usado no presente pedido, a expressão “doença associada ao HERV-W” refere-se a um condição patológica associada com a expressão de HERV-W, preferencialmente da proteína do envelope de HERV- W. Tipicamente, a dita doença associada ao HERV-W é uma doença inflamatória crônica. Como usado no presente pedido, a expressão “doença inflamatória crônica” refere-se a qualquer doença na qual a inflamação persistente ou recorrente é dirigida pela imunidade inata e/ou pela imunidade adaptativa envolvida nas lesões de tecido e/ou podem ser detectadas localmente ou sistemicamente a partir de uma superexpressão de moléculas pró-inflamatórias.
[0017] Preferencialmente, a dita doença associada ao HERV-W é selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2. Mais preferencialmente, a dita doença associada ao HERV-W é selecionada a partir do grupo que consiste em Esclerose Múltipla (MS) e Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica (CIDP), que ambas são doenças desmielinizantes.
[0018] Como usado no presente pedido, o termo “tratar” ou “tratamento”, como usado no presente pedido, significa reverter, aliviar, inibir o progresso ou prevenir a disfunção ou condição para a qual esse termo se aplica, ou reverter, aliviar, inibir o progresso, ou prevenir um ou mais sintomas da disfunção ou condição para a qual esse termo se aplica.
[0019] Como usado no presente pedido, o termo “prevenção” refere-se a prevenir a ocorrência da doença ou condição em um sujeito que ainda não apresentava sintomas clínicos, lesões típicas ou disfunções fisiológicas que permitiriam o seu diagnóstico clínico.
[0020] Como usado no presente pedido, “anticorpo” ou “imunoglobulina” têm o mesmo significado e será usado igualmente na presente invenção. O termo “anticorpo”, como usado no presente pedido, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno. Desse modo, o termo “anticorpo” engloba não apenas as moléculas de anticorpo inteiro, mas também fragmentos de anticorpos, bem como derivados de anticorpos.
[0021] Como usado no presente pedido, a expressão “fragmento de anticorpo” refere-se a uma porção desse anticorpo que imita a região hipervariável, como uma CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3). Os fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção mantêm a afinidade de ligação e especificidade do dito anticorpo. Esses fragmentos são equivalentes funcionais do dito anticorpo e eles se ligam substancialmente ao mesmo epítopo como o dito anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, cadeia pesada, cadeia leve, VL, VH, Fv, Fab, Fab’, F(ab)2 e F(ab’)2.
[0022] Como usado no presente pedido, a expressão “derivado de anticorpo” refere-se a um fragmento do anticorpo da invenção, preferencialmente que inclui pelo menos uma CDR do dito anticorpo, preferencialmente pelo menos um CDR3 do dito anticorpo, fusionada a pelo menos uma sequência diferente da sequência natural (por exemplo, uma sequência ligante de outras espécies), cujo dito derivado tem afinidade de ligação e especificidade para HERV-W Env comparável àquela do anticorpo da invenção. Os derivados de acordo com a presente invenção mantêm a afinidade de ligação e especificidade do dito anticorpo. Esses derivados são equivalentes funcionais do dito anticorpo e eles se ligam substancialmente ao mesmo epítopo como o dito anticorpo. Exemplos de derivados de anticorpos incluem, mas não se limitam a, scFv, (scFv)2 e diacorpos.
[0023] Nos anticorpos naturais, duas cadeias pesadas (HC) estão ligadas entre si por pontes bissulfeto e cada cadeia pesada está ligada a uma cadeia leve (LC) por uma ponte bissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda (I) e kappa (k). Há cinco classes principais de cadeia pesada (ou isotipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadeia contém domínios de sequência distintos.
[0024] Tipicamente, a cadeia leve inclui dois domínios, um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). A cadeia pesada inclui quatro domínios, um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3, referidos coletivamente como CH). As regiões variáveis de ambas as cadeias leve (VL) e pesada (VH) determinam o sítio de ligação específico para o epítopo antigênico. Os domínios da região constante das cadeias leve (CL) e pesada (CH) conferem propriedades biológicas importantes como associação de cadeia de anticorpo, secreção, mobilidade transplacentária, ligação de complemento e ligação a receptores Fc (FcR). O fragmento Fv é a parte N-terminal do fragmento Fab de uma imunoglobulina e consiste em porções variáveis de uma cadeia leve e de uma cadeia pesada. A especificidade do anticorpo reside na complementaridade estrutural entre o sítio de ligação do anticorpo e o epítopo antigênico. Sítios de ligação do anticorpo são feitos de resíduos que são principalmente das regiões determinantes de complementaridade ou hipervariáveis (CDRs). Ocasionalmente, os resíduos das regiões não hipervariáveis ou de estrutura (FR) influenciam na estrutura de domínio total e, então, no sítio de combinação. Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) referem-se a sequências de aminoácidos que, em conjunto, definem a afinidade de ligação e a especificidade da região Fv natural de um sítio de ligação de imunoglobulina nativa. As cadeias leve e pesada de uma imunoglobulina têm, cada uma, três CDRs, designadas L- CDR1, L-CDR2, L-CDR3 e H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Portanto, um sítio de ligação ao antígeno inclui seis CDRs, que compreendem o conjunto de CDR de cada uma das regiões V de cada cadeia pesada e leve. Regiões de Estrutura (FRs) referem-se a sequências de aminoácidos interpostas entre CDRs.
[0025] Como usado no presente pedido, o termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo que compreende um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo de qualquer espécie, preferencialmente camundongo, e um domínio CH e um domínio CL de um anticorpo humano.
[0026] De acordo com a invenção, o termo “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo que tem estrutura de região variável e regiões constantes de um anticorpo humano, mas mantém as CDRs de um anticorpo de quaisquer espécies, preferencialmente camundongo.
[0027] O termo “Fab” denota um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e atividade de ligação de antígeno, em que cerca de metade do lado N-terminal da cadeia H e a cadeia L inteira, entre os fragmentos obtidos por tratamento de IgG com uma protease, papaína, são ligados entre si através de uma ponte bissulfeto.
[0028] Como usado no presente pedido, o termo “F(ab’)2” refere-se a um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 100.000 e atividade de ligação ao antígeno, que é ligeiramente maior do que o Fab ligado através de uma ponte bissulfeto da região de dobradiça, entre os fragmentos obtidos por tratamento de IgG com uma protease, pepsina.
[0029] Como usado no presente pedido, o termo “Fab” refere-se a um fragmento de anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e atividade de ligação ao antígeno, que é obtida por corte de uma ponte bissulfeto da região de dobradiça do F(ab’)2.
[0030] As expressões um “um Fv de cadeia única” ou “scFv” referem-se a um polipeptídeo que é um heterodímero VH::VL ligado de forma covalente, e geralmente expresso a partir de um fusão gênica que inclui genes que codificam VH e VL ligados por um ligante que codifica peptídeo. “dsFv” é um heterodímero VH::VL estabilizado por uma ponte bissulfeto. Fragmentos de anticorpos bivalentes e multivalentes podem se formar tanto espontaneamente por associação de scFvs monovalentes como podem ser gerados por acoplamento de scFvs monovalentes por um ligante peptídico, como sc(Fv)2 bivalentes.
[0031] O termo “diacorpos” refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH- VL). Com o uso de um ligante que é extremamente curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno.
[0032] Como usado no presente pedido, a expressão “anticorpo da invenção” refere-se a um anticorpo direcionado contra, isto é, que se liga especificamente à proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), preferencialmente contra a proteína do envelope de HERV-W da família do retrovírus endógeno humano tipo W (HERV-W), mais preferencialmente contra a proteína do envelope de MSRV, mais preferencialmente contra o domínio extracelular da proteína do envelope de MSRV. Preferencialmente, o anticorpo da invenção compreende todas as 6 CDRs conforme representado na SEQ ID No: 1 a 6.
[0033] Como usado no presente pedido, o termo “amostra biológica”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer amostra biológica obtida para efeitos de avaliação in vitro. Na presente invenção, a amostra ou amostra do paciente pode compreender qualquer fluido corporal ou lesões e tecidos específicos da doença. Exemplos de fluidos corporais incluem sangue, soro, plasma, líquido aspirado, urina, saliva, líquido sinovial e líquido cefalorraquidiano (CSF). Exemplos de lesões e tecidos específicos da doença incluem placa no cérebro com MS, biópsias de nervo CIDP ou biópsias de pâncreas com diabetes.
ANTICORPO PARA USO COMO UMA DROGA ANTIRRETROVIRAL
[0034] A expressão patogênica de HERV-W ocorre em certos indivíduos quando associada a condições patológicas, em particular quando expressam elementos Associados à Esclerose Múltipla (MSRV) dessa família HERV-W. Isso demonstrou envolver a proteína do envelope como o único agente patogênico entre as proteínas codificadas por HERV-W quando expostas ao sistema imune ou às células neurogliais, apesar da evidência de antígenos codificados por gag HERV-W em pacientes.
[0035] Até a presente data, a estratégia terapêutica consistiu-se em direcionar a proteína do Envelope de HERV-W com um anticorpo humanizado neutralizante, de modo a prevenir e inibir os seus efeitos imunoinflamatórios e neuropatogênicos em doenças humanas associadas ao HERV-W. Consequentemente, essa abordagem terapêutica é direcionada a montante da cascata inflamatória e de efeitos citotóxicos direcionados, em particular, a montante da cascata inflamatória desmielinizante com bloqueio de remielinização na origem de lesões com potencial de cicatrização diminuído no sistema nervoso central com MS (CNS).
[0036] Os inventores avaliaram um anticorpo IgG4 humanizado que se liga seletivamente ao domínio extracelular da proteína do envelope de MSRV, denominado no presente pedido “GNbAC1” para a sua segurança e farmacocinética em voluntários saudáveis em um ensaio clínico de Fase I. Esse anticorpo também foi avaliado em pacientes com MS durante um ano, com infusões repetidas de anticorpo GNbAC1 a cada quatro semanas a 6mg/Kg ou 2mg/kg em dois coortes paralelos. No último ensaio clínico de Fase IIa, em pacientes com MS, os inventores obtiveram amostras de sangue de pacientes antes e durante o estudo em que os biomarcadores HERV-W foram testados pela primeira vez após seis meses de tratamento por RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) para estudar a expressão de mRNAs específicos de env e pol de HERV-W, juntamente com o tratamento por GNbAC1.
[0037] Os resultados assim obtidos revelaram um efeito completamente inesperado e desconhecido da neutralização da proteína HERV-W Env in vivo pelo anticorpo GNbAC1.
[0038] De fato, os inventores descobriram que os pacientes humanos tratados com esse anticorpo revelaram um efeito inibidor na própria expressão do genoma retroviral HERV-W, que não se limita ao gene env que expressa à proteína do envelope como especificamente direcionada por GNbACl. De fato, os resultados dos inventores indicam indiscutivelmente que tanto os níveis de mRNA env (que codifica a Proteína do Envelope de HERV-W) como mRNA pol (que codifica as enzimas de HERV-W, incluindo a transcriptase reversa) exibiram uma diminuição paralela e progressiva após três e seis meses de tratamento, em comparação aos níveis medidos antes do tratamento nos mesmos pacientes.
[0039] Dessa forma, observou-se um efeito antirretroviral significativo sobre a expressão de HERV-W após seis meses de tratamento com GNbAC1 e, afetou ambas as expressões de genes env e pol em paralelo. Como não se espera que a expressão de RNA de HERV-W retroviral seja regulada pela expressão da proteína do envelope de HERV- W, todo mRNA do gene pol, que codifica proteínas antigênicas totalmente não relacionadas, os inventores concluem que um efeito desconhecido de HERV-W Env (ou MSRV-Env) produz um efeito positivo na regulação genética de HERV-W relacionado com a sua expressão associada à doença, conforme observado em pacientes com MS, e foi antagonizado por GNbAC1 em pacientes de ensaio clínico de Fase IIa realizado pelos inventores (consulte Exemplo 1). Esse efeito não está, de forma alguma, relacionado com os efeitos fisiopatológicos conhecidos de HERV-W Env nos sistemas imunológico e neuroglial.
[0040] Consequentemente, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo, um fragmento ou um derivado do mesmo para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV), em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado é direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env).
[0041] Como usado no presente pedido, a expressão “droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV)” refere-se a um anticorpo, um fragmento ou um derivado do mesmo, capaz de inibir a expressão e/ou a replicação de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV). Mais especificamente, a dita expressão refere-se a um anticorpo capaz de: - suprimir ou inibir totalmente ou parcialmente a replicação de um vírus pertencente ao HERV, preferencialmente pertencente à família HERV-W. Tipicamente, a dita supressão ou inibição da replicação é global e completa; ou - suprimir ou inibir totalmente ou parcialmente a expressão de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV), preferencialmente um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos tipo W (HERV-W) ou a expressão da proteína do envelope do dito vírus.
[0042] Preferencialmente, o dito vírus pertence à família de retrovírus endógeno humano tipo W (HERV-W). Mais preferencialmente, o dito vírus é MSRV. Nessa realização específica, o anticorpo da invenção é direcionado contra a proteína do Envelope de MSRV.
[0043] Em uma realização preferencial, a droga antirretroviral de acordo com a invenção suprime ou inibe total ou parcialmente a expressão das proteínas codificadas por env e/ou pol de um vírus pertencente ao HERV, preferencialmente um vírus pertencente ao HERV-W.
[0044] Os inventores mostraram que direcionar a proteína do envelope específica de MSRV leva ao efeito surpreendente de inibição ou supressão da expressão do vírus. Como mencionado anteriormente, MSRV está envolvida no princípio e no desenvolvimento de várias doenças. Consequentemente, o anticorpo da invenção é altamente promissor para uso no tratamento de uma doença associada ao HERV-W, preferencialmente uma patologia associada com a expressão da proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env).
[0045] Preferencialmente, a dita doença associada ao HERV-W é selecionada do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2.
[0046] Mais preferencialmente, a dita doença associada ao HERV-W é selecionada a partir do grupo que consiste em Esclerose Múltipla (MS) e Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica (CIDP).
[0047] Em uma realização, a invenção refere-se também a um agente para uso na prevenção e/ou tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que o dito agente consiste em um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) ou um fragmento ou derivado do mesmo. Nessa realização específica, o anticorpo impede a expressão de HERV-W.
[0048] Em uma realização, o anticorpo, fragmento ou derivado da invenção compreende cada uma das 6 CDRs conforme representado na SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 6.
[0049] Em uma realização, o anticorpo, fragmento ou derivado da invenção compreende: - uma cadeia leve em que o domínio variável compreende cada uma das 3 CDRs conforme representadas na SEQ ID No: 1 para CDR- L1, SEQ ID No: 2 para CDR-L2 e SEQ ID No: 3 para CDR-L3; e - uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende cada uma das 3 CDRs conforme representadas na SEQ ID No: 4 para CDR-H1, SEQ ID No: 5 para CDR-H2 e SEQ ID No: 6 para CDR-H3.
[0050] As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são divulgada na Tabela 1: TABELA 1: DOMÍNIOS DE CDR DE UM ANTICORPO DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0051] Em uma realização, o anticorpo, fragmento ou derivado da invenção compreende: - uma região variável da cadeia leve (VL) conforme representada na SEQ ID No: 7; e - uma região variável da cadeia pesada (VH) conforme representada na SEQ ID No: 8.
[0052] As regiões das cadeias leves e pesadas mencionadas acima são divulgadas na Tabela 2: TABELA 2: REGIÕES VARIÁVEIS DA CADEIA LEVE E PESADA DE UM ANTICORPO DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0053] Em uma realização, o anticorpo, fragmento ou derivado da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2, um diacorpo, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0054] Em uma realização preferencial, o anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais da invenção são monovalentes, bivalentes, multivalentes, monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Em outra realização, o anticorpo direcionado contra HERV-W Env é um fragmento de ligação ou um conjugado. Anticorpos de exemplos da invenção podem ser conjugados a um agente inibidor do crescimento, agente citotóxico ou uma enzima de ativação de pró-droga.
[0055] Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção em relação às funções efetoras, por exemplo, a fim de aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode ser alcançado pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, através disso permitindo formação de ponte bissulfeto entre cadeias nessa região. O anticorpo homodimérico gerado dessa forma pode ter aprimorado a capacidade de internalização e/ou aumento de destruição celular mediada por complemento e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (Caron PC. et al. 1992; e Shopes B. 1992).
[0056] Outro tipo de modificação de aminoácido do anticorpo da invenção pode ser útil para alterar o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por “alteração” entende-se delação de uma ou mais porções de carboidratos encontrados no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligado a N. “N-ligado” refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina- X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são sequências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. Dessa forma, a presença de ambas as sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, como aquela que contém uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados).
[0057] Em outra realização, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado monoclonal, mais preferencialmente um anticorpo monoclonal humanizado IgG4.
[0058] O dito anticorpo humanizado pode ser produzido por obtenção das sequências de ácido nucleico que codificam o domínio de CDRs inserindo-as em um vetor de expressão para células animais que têm genes que codificam uma região constante da cadeia pesada idêntica àquela de um anticorpo humano; e uma região constante da cadeia leve idêntica àquela de um anticorpo humano, e expressando o vetor de expressão por introdução do mesmo em uma célula animal. O vetor de expressão de anticorpo humanizado pode ser tanto do tipo no qual um gene que codifica uma cadeia pesada do anticorpo e um gene que codifica uma cadeia leve do anticorpo existem em vetores separados, como do tipo no qual ambos os genes existem no mesmo vetor (tipo tandem). No que diz respeito à facilidade de construção de um vetor de expressão de anticorpo humanizado, facilidade de introdução nas células animais e equilíbrio entre os níveis de expressão das cadeias H e L do anticorpo em células animais, um tipo tandem do vetor de expressão de anticorpo humanizado é mais preferencial. Exemplos do vetor de expressão de anticorpo humanizado tipo tandem incluem pKANTEX93, pEE18 e similares. Métodos para produzir anticorpos humanizados com base no DNA recombinante convencional e técnicas de transfecção gênica são bem conhecidos na técnica. Anticorpos podem ser humanizados com o uso de uma variedade de técnicas conhecidas incluindo, por exemplo, enxerto de CDR, recobrimento ou recomposição (veneering ou resurfacing) e embaralhamento de cadeia. A tecnologia de DNA recombinante geral para preparação desses anticorpos também é conhecida.
[0059] Dessa forma, uma realização da invenção refere-se a um anticorpo humanizado monoclonal que compreende: - uma cadeia leve em que o domínio variável compreende cada uma das 3 CDRs conforme representadas na SEQ ID No: 1 para CDR-L1, SEQ ID No: 2 para CDR-L2 e SEQ ID No: 3 para CDR-L3; e - uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende cada uma das 3 CDRs conforme representadas na SEQ ID No: 4 para CDR-H1, SEQ ID No: 5 para CDR-H2 e SEQ ID No: 6 para CDR-H3.
[0060] Em uma realização específica, a cadeia pesada (HC) do dito anticorpo humanizado tem a sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID No: 9 e a cadeia leve (LC) do dito anticorpo tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID No: 10. Esse anticorpo específico é citado no presente pedido como “GNbAC1”.
[0061] As cadeias pesadas e leves acima estão divulgadas na Tabela 3: TABELA 3 HC E LC DO ANTICORPO HUMANIZADO
COMPOSIÇÃO PARA USO COMO UMA DROGA ANTIRRETROVIRAL
[0062] Os inventores investigaram ainda o efeito antirretroviral recentemente desvendado do anticorpo da invenção. Para esse propósito, eles avaliaram seu efeito in vitro nas culturas celulares que expressam proteínas codificadas por gag, pol e env de HERV-W, detectadas por anticorpos específicos na análise Western Blot.
[0063] Os inventores confirmaram que a expressão da proteína pol correspondente à transcriptase reversa (RT) de HERV-W pareceu menos importante em células cultivadas na presença de GNbAC1, além de diminuir os níveis de RNA de pol em pacientes tratados com GNbAC1. Além disso, RT é conhecida por amplificar a expressão retroviral gerando cópias adicionais de DNA retroviral a partir de RNA expresso. Essas cópias de DNA retroviral recém produzidas podem então expressar RNA correspondente, amplificando assim a expressão global do elemento retroviral por multiplicação das cópias que expressam através de um produto dessa própria expressão, como RT de RNA pol.
[0064] Consequentemente, eles tiveram a ideia de que a combinação de ambos GNbAC1 e um inibidor da transcriptase reversa retroviral, como azidotimidina (AZT) poderia produzir melhores efeitos inibitórios sobre a expressão de HERV-W, em particular na sua expressão de RT como atualmente exemplificado.
[0065] Isso foi, dessa forma, ainda estudado e, bastante surpreendentemente, essa combinação de um anticorpo direcionado contra HERV-W Env e de uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral, aboliu a expressão de proteína RT de HERV-W nessas células produtivas.
[0066] Em culturas paralelas e simultâneas, a detecção positiva de RT de HERV-W por Western blot em células não tratadas e a e redução leve ou parcial em células tratadas com GNbAC1 ou AZT sozinho, confirmou a especificidade e a significância dessa observação: nas mesmas condições, a combinação de ambos, anticorpo que neutraliza HERV-W Env e AZT, aboliram a detecção dessa proteína RT de HERV-W.
[0067] Portanto, em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende: - um anticorpo, um fragmento ou um derivado de acordo com a invenção; e - uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral,
[0068] para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV).
[0069] Preferencialmente, a dita droga inibitória de transcriptase reversa retroviral é selecionada a partir do grupo que consiste em azidotimidina, entecavir, lamivudina, adefovir, sofosbuvir, didanosina, tenofovir, abacavir, lamivudina, estavudina, entricitabina, zalcitabina, telbivudina e didanosina. Mais preferencialmente, a dita droga inibitória de transcriptase reversa é azidotimidina (AZT). Todos os dados técnicos divulgados anteriormente são aplicáveis no presente pedido.
[0070] A composição da invenção fornece nova perspectiva e inesperada para intervenção terapêutica na expressão de HERV-W patogênico. O tratamento com uma combinação de: - um anticorpo direcionado contra HERV-W Env, como GNbAC1; e - uma molécula de direcionamento da própria transcriptase reversa e/ou sua atividade como AZT provaram ser extremamente úteis para inibir a expressão de HERV-W RT em doenças associadas com HERV-W.
[0071] Dessa forma, a invenção também se refere a uma composição que compreende: - um anticorpo, um fragmento ou um derivado de acordo com a invenção; e - uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral, para uso para prevenir e/ou tratar uma doença associada ao HERV-W.
[0072] A invenção também se refere a uma composição que compreende: - um anticorpo, um fragmento ou um derivado de acordo com a invenção; e - uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral, para uso para prevenir e/ou tratar uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2. Mais preferencialmente, a dita doença é selecionada a partir do grupo que consiste em Esclerose Múltipla (MS) e Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica (CIDP).
[0073] Todos os dados técnicos divulgados anteriormente são aplicáveis no presente pedido.
[0074] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), ou um fragmento ou derivado do mesmo, e uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral, preferencialmente azidotimidina, como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequencial em um método para tratar uma doença associada ao HERV-W, preferencialmente uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2.
[0075] Todos os dados técnicos divulgados anteriormente são aplicáveis no presente pedido.
KIT DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0076] A expressão desses elementos HERV-W em pacientes com doença e/ou sua detecção em lesões e tecidos específicos da doença identifica e define a categoria geral de doenças ou síndromes associadas ao HERV-W. Ela também reflete a atividade biológica de HERV-W durante o tempo de curso da evolução da doença e durante seu tratamento.
[0077] Dessa forma, a detecção de HERV-W com sensibilidade aprimorada, com especificidade da doença específica ou com associação específica com características clínicas em pacientes com doenças ou síndromes associadas com HERV-W constitui um importante valor para a identificação de diagnóstico e estratificação, bem como para o acompanhamento e monitoramento terapêutico dos pacientes. A partir de um painel de primers, sondas e protocolos de PCR, os inventores selecionaram assim e desenvolveram um kit de primers e sondas, que se revelaram úteis para detectar a presença e/ou medir o nível de expressão de HERV em pacientes.
[0078] Consequentemente, em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um kit que compreende pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro, preferencialmente pelo menos cinco, preferencialmente pelo menos seis, preferencialmente pelo menos sete, preferencialmente pelo menos oito, preferencialmente pelo menos nove, preferencialmente pelo menos dez oligonucleotídeos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID No: 11 a 28.
[0079] Preferencialmente, o dito kit compreende pelo menos SEQ ID No: 17 e/ou 18 ou SEQ ID No: 19 e 20.
[0080] Alternativamente, o dito kit compreende: - SEQ ID No: 19, 20, 23, 24 e 25; ou - SEQ ID No: 17, 18, 23, 24 e 25; ou - SEQ ID No: 19, 20, 14, 15, 16, 23, 24 e 25; ou - SEQ ID No: 17, 18, 14, 15, 16, 23, 24 e 25.
[0081] Mais preferencialmente, o kit da invenção compreende todos os oligonucleotídeos conforme representado na SEQ ID No: 11 a 28. Tipicamente, o dito kit destina-se a ser usado para realizar um ensaio de PCR ou, mais particularmente, um ensaio de PCR quantitativa (qPCR). Portanto, o kit preferencialmente compreende primers e/ou sondas de genes de células de referência mais apropriadas para quantificação relativa de RNA ou DNA e para várias indicações.
[0082] O dito kit preferencialmente compreende: - SEQ ID No: 26, 27 e 28; ou - Sequências específicas para o gene GUSB; ou - Sequências específicas para o gene RNAse P; ou - Sequências específicas para um gene de célula de referência para quantificação relativa por qPCR.
[0083] O dito kit é útil para monitorar a detecção e/ou quantificação de um vírus pertencente à família de retrovírus endógeno humano tipo W (HERV- W), que compreende MSRV mas também outro(s) subtipo(s) de HERV-W. Mais especificamente, o kit da invenção é útil para detectar e/ou quantificar as sequências codificadoras para HERV-W Env como as que codificam a poliproteína pol de HERV-W, incluindo RT. Tipicamente, a detecção e/ou quantificação de HERV-W em um paciente engloba: (i) a detecção e/ou a quantificação de RNA, DNA ou antígenos específicos de HERV-W, preferencialmente detectados em fluidos corporais ou em lesões e tecidos específicos da doença, (ii) a detecção e/ou a quantificação de número de cópias elevados de DNA ou RNA em células ou tecidos do sangue ou de órgãos com lesões ou disfunções.
[0084] Consequentemente, em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), um fragmento ou derivado do mesmo, para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente ao HERV, preferencialmente ao HERV-W, mais preferencialmente ao MSRV, em um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W, em que o dito paciente é identificado por um método que compreende uma etapa i) para detectar e/ou quantificar HERV-W em uma amostra biológica.
[0085] Nessa realização específica, o médico seria assim capaz de se adaptar e otimizar os cuidados médicos apropriados de um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W. O monitoramento da presença e/ou do nível de expressão de HERV-W é altamente apropriado para cuidados de acompanhamento e decisões clínica. De fato, o médico pode definir a terapia apropriada com ótima estratégia para cada paciente.
[0086] Tipicamente, a etapa i) para detectar e/ou quantificar pode ser realizada de acordo com as técnicas rotineiras, bem conhecidas do técnico no assunto. Tipicamente, a dita etapa i) compreende colocar uma amostra biológica do paciente em contato com reagentes seletivos como sondas, primers, ligantes ou anticorpos, e assim detectar a presença de ácidos nucleicos ou proteínas de interesse originalmente na amostra. Preferencialmente, a dita etapa i) para detectar a presença e/ou quantificar HERV-W é realizada com o kit de acordo com a invenção.
[0087] Todos os dados técnicos anteriormente mencionados são aplicáveis no presente pedido.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[0088] Um objeto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma dose efetiva de um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) e que opcionalmente compreende uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral.
[0089] Qualquer agente terapêutico da invenção, conforme descrito acima, pode ser combinado com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, matrizes de liberação sustentada, como polímeros biodegradáveis, para formar composições terapêuticas.
[0090] “Farmaceuticamente” ou “farmaceuticamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um mamífero, especialmente um humano, conforme apropriado. Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a um material sólido, semissólido ou líquido preenchedor, diluente, material encapsulante ou formulação auxiliar não tóxica de qualquer tipo.
[0091] A forma das composições farmacêuticas, a rota de administração, a dosagem e o regime dependem naturalmente da condição a ser tratada, da gravidade da doença, da idade, peso e sexo do paciente, etc.
[0092] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para uma administração tópica, oral, intranasal, intraocular, intravenosa, intramuscular ou subcutânea, e similares.
[0093] Preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Essas podem ser, em particular, soluções isotônicas, estéreis, salinas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares ou misturas destes sais), ou composições secas, especialmente liofilizadas que, após adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permitem a constituição de soluções injetáveis.
[0094] As doses usadas para a administração podem ser adaptadas em função de vários parâmetros e, em particular, em função do modo de administração usado, da patologia relevante ou, alternativamente, da duração do tratamento desejado.
[0095] Para preparar composições farmacêuticas, uma quantidade efetiva do anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) pode ser dissolvida ou dispersa em um carreador ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável.
[0096] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propileno glicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida para facilitar a injetabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação de contaminação de microrganismos, como bactérias e fungos.
[0097] As soluções dos compostos ativos, como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis, podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, misturas dos mesmos e óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microrganismos.
[0098] Após a formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente efetiva. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação da droga e similares também podem ser empregadas.
[0099] Preferencialmente, o anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) da invenção ou o fragmento e o derivado do mesmo podem ser formulados em um tampão em que foi solubilizado, armazenado e injetado aos pacientes. Preferencialmente, o dito tampão compreende histidina 20 mM, sacarose 5% e polissorbato 20 a 0,01% e apresenta um pH de 6,0. Um exemplo de uma formulação usada para administração intravenosa de GNbACl é apresentado no Exemplo 3.
[00100] Para administração parenteral em solução aquosa, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas específicas são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesse contexto, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos pelos técnicos no assunto à luz da presente descrição. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (consulte, por exemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15a Edição, páginas 1035 a 1038 e 1570 a 1580). Alguma variação na dosagem irá necessariamente ocorrer dependendo da condição do paciente a ser tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer evento, a dose apropriada para cada paciente.
[00101] Além disso, os compostos formulados para administração parenteral, como injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação prolongada; e qualquer outra forma atualmente usada.
MÉTODO TERAPÊUTICO E MÉTODO DE MONITORAMENTO DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[00102] A invenção também se refere a um método para inibir a expressão e/ou a replicação de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos (HERV) em um paciente por administração ao dito paciente de um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env).
[00103] Em uma realização adicional, a invenção refere-se a um método para prevenir e/ou tratar um paciente que sofre de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que o dito agente consiste em um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) ou um fragmento ou derivado do mesmo, por administração ao dito paciente um anticorpo direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env), um fragmento ou um derivado do mesmo, em que o dito anticorpo atua como uma droga antirretroviral de direcionamento de HERV, preferencialmente de direcionamento de HERV-W, mais preferencialmente de direcionamento de MSRV.
[00104] A invenção também se refere a um método de tratamento de um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W que compreende as etapas de: 1) predizer o prognóstico de um paciente por detecção e/ou quantificação de um vírus pertencente à família dos retrovírus endógenos humanos (HERV), preferencialmente HERV-W, mais preferencialmente MSRV, em uma amostra biológica por meio do kit da invenção; e em seguida 2) se a dita etapa 1) mostra a expressão de um retrovírus endógeno humano (HERV), então o método da invenção compreende uma etapa 3) de fornecimento do anticorpo, fragmento ou derivado da invenção ao dito paciente.
[00105] A invenção também se refere a um método para monitorar a resposta a um tratamento de um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W, cujo dito método compreende as seguintes etapas: a. tratar o dito paciente com o anticorpo, fragmento ou derivado de acordo com a invenção; em seguida b. detectar e/ou quantificar HERV-W em uma amostra biológica do dito paciente.
[00106] Em outra realização, a invenção refere-se a um método para monitorar a resposta a um tratamento de um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W, cujo dito método compreende uma etapa de detecção e/ou quantificação de HERV-W em uma amostra biológica do dito paciente. Preferencialmente, o dito paciente compreende um anticorpo, um fragmento ou um derivado de acordo com a invenção. A expressão “paciente que compreende um anticorpo” refere-se a um paciente que foi tratado com um anticorpo e apresenta uma quantidade detectável do dito anticorpo no seu sangue, tecidos ou órgãos. Tipicamente, o dito anticorpo, fragmento ou derivado foi fornecido ou administrado ao paciente anteriormente à etapa de detecção e/ou quantificação de HERV-W.
[00107] De acordo com a invenção, no caso de monitoramento da resposta a um tratamento de um paciente que sofre de uma doença associada ao HERV-W, uma amostra biológica pode ser uma amostra de fluidos corporais como sangue, líquido cefalorraquidiano, urina ou de um tecido específico da doença e lesões como placas cerebrais com MS, biópsias de nervo com CIDP ou biópsias de pâncreas com diabetes.
[00108] Tipicamente, a etapa b. de detecção e/ou quantificação pode ser realizada de acordo com as técnicas de rotina, bem conhecidas pelo técnico no assunto. Tipicamente, a dita etapa b. compreende colocar uma amostra biológica do paciente em contato com reagentes seletivos como sondas, primers, ligantes ou anticorpos, e assim detectar a presença de ácidos nucleicos ou proteínas de interesse originalmente na amostra. Preferencialmente, a dita etapa b. de detecção da presença e/ou medição do nível de expressão de HERV- W é realizada com o kit de acordo com a invenção.
[00109] Todas as características técnicas anteriormente divulgadas são aplicáveis no presente pedido.
LEGENDAS DAS FIGURAS FIGURA 1
[00110] (A) Níveis de transcritos de env e pol de HERV-W na inclusão, conforme detectado por diferentes pares de primers e sondas para qPCR.
[00111] (B) Transcrito de env de HERV-W com primers e sondas “env” e “UNO” em paralelo para os pacientes incluídos para o coorte de 2 mg/mL (círculos planos) e para o coorte de 6 mg/mL (quadrados planos).
[00112] (C) Transcrito de env de HERV-W com primers e sondas “UNO2”, “syn” e “pol” em paralelo para os pacientes incluídos para o coorte de 2 mg/mL (círculos planos) e para o coorte de 6 mg/mL (quadrados planos).
[00113] As ordenadas representam a expressão relativa (razão para GUS B) do RNA direcionado para cada paciente e as abscissas representam os diferentes protocolos de qPCR usados nas mesmas amostras.
FIGURA 2
[00114] Diferença nos níveis de transcritos de env e pol de HERV- W entre diferentes formas clínicas de MS na inclusão, conforme detectado por diferentes pares de primers e sondas para protocolo qPCR (A) protocolo “env” (B) protocolo “UNO” (C) protocolo “UNO2” (D) protocolo “syn” (E) protocolo “pol”.
[00115] As ordenadas representam a expressão relativa (razão para GUS B) do RNA direcionado para cada paciente e as abscissas representam as diferentes formas clínicas de MS: Progressivo Primário (PPMS), Recidivante Remitente (RRMS) e Progressivo Secundário (SPMS).
FIGURA 3
[00116] Correlação entre os níveis de transcrito de env e pol de HERV-W e parâmetros clínicos de pacientes com MS na inclusão, conforme detectado por pares de primers e sondas específicos para qPCR (A) protocolo “Syn” evidenciou uma correlação negativa entre a expressão do tipo Sincitina- HERV-W e a duração da doença: Teste de correlação de Pearson r = -0,96; p = 0,009 (B) protocolo “Syn” evidenciou uma correlação positiva entre a expressão tipo Sincitina HERV-W e o índice de progressão da doença: Teste de correlação de Pearson r = 0,95; p = 0,014 (C) protocolo “pol” também evidenciou uma correlação positiva entre o gene tipo pol de HERV-W (que codifica a protease, transcriptase reversa e integrase) índice de expressão e progressão da doença: Teste de correlação de Pearson r = 0,95; p = 0,048.
[00117] As ordenadas representam a duração da doença em anos (A) ou o índice de progressão (B & C); as abscissas representam a expressão relativa (razão para GUS B) do RNA direcionado para cada paciente.
FIGURA 4
[00118] Variação nos níveis de transcritos relacionados com HERV-W durante os seis primeiros meses de GNC002. Os dados representam a expressão média relativa do RNA direcionado para GUS B para cada transcrito relacionado com HERV-W no coorte de 2 mg/kg (A), no coorte de 6 mg/kg (B), e todos os pacientes incluídos em GNC002 (C). As linhas sublinhadas representam o nível de transcritos correspondentes na inclusão. As ordenadas representam a expressão media relativa (razão para GUS B) do RNA direcionado para cada protocolo qPCR no grupo dos pacientes. As abscissas representam o número de injeções de GNbAC1 nos pacientes.
FIGURA 5
[00119] Variação nos níveis de transcritos relacionados com HERV-W durante os seis primeiros meses de GNC002. Os dados representam a expressão relativa média do RNA direcionado a GUS B para cada transcrito de HERV-W em todos os pacientes incluídos em GNC002. A variação nos níveis dos transcritos de env e pol de HERV-W junto com o tratamento em MS desde a inclusão até a data da sexta injeção é ilustrada, como diagrama de caixa e bigode (10 a 90 percentis) dos dados de cada paciente conforme medido com diferentes pares de primers e sondas para qPCR (A) protocolo “env” (B) protocolo “UNO” (C) protocolo “UNO2” (D) protocolo “syn” (E) protocolo “pol”.
[00120] As ordenadas representam a expressão media relativa (razão para GUS B) do RNA direcionado para cada protocolo qPCR no grupo dos pacientes. As abscissas representam o número de injeções de GNbAC1 para os pacientes, antes de cada amostra sanguínea ser coletada (portanto “1” corresponde ao estado antes de qualquer injeção, “3” os estado quatro semanas após a segunda injeção e “6”, o estado quatro semanas após a quinta injeção.
FIGURA 6
[00121] As células CH2 expressam espontaneamente proteínas de HERV-W codificadas por gag, pol e env proteínas, conforme detectado com anticorpo específico por Western Blotting.
[00122] O peso molecular aparente para as bandas detectadas com cada anticorpo específico contra antígenos codificados por gag, pol e env de HERV-W é indicado no lado direito da faixa correspondente ao extrato celular para cada antígeno. A faixa esquerda em A, B e C representa os marcadores de peso molecular usados para a estimativa de KDa.
[00123] (A) A poliproteína Gag de HERV-W e produtos da clivagem, incluindo a proteína de capsídeo típica com cerca de 30KDa.
[00124] (B) A poliproteína Pol de HERV-W e produtos da clivagem, incluindo a proteína de transcriptase reversa típica com cerca de 55KDa.
[00125] (C) Proteína de envelope de HERV-W, produtos da clivagem e multimeros, incluindo as unidades clivadas SU (superfície) e TM (transmembrana) com cerca de 45 e 35KDa. Os produtos env glicosilados são detectados com potencial variação em glicosilações entre bandas monoméricas detectadas por volta de 75 e 80 KDa. Os 55 KDa correspondem ao monômero não glicosilado, com um dímero por volta de 100KDa. A banda por volta de 160K Da poderia ser tanto um dímero glicosilado como um trímero não glicosilado.
FIGURA 7
[00126] Proteína Transcriptase reversa codificada por pol de HERV-W em culturas de CH2 com ou sem tratamento por GNbAC1 e/ou AZT.
[00127] O peso molecular aparente para as bandas detectadas com cada anticorpo específico contra antígenos codificados por pol de HERV-W é indicado no lado direito do Western Blot. O número de faixas de Western blot (1 a 6) é indicados abaixo da figura.
[00128] 1) Tratamento combinado com GNbAC1 e AZT
[00129] 2) Tratamento somente com AZT
[00130] 3) Tratamento somente com GNbAC1
[00131] 4) Células tratadas de forma simulada (sem tratamento)
[00132] 5) Poço vazio
[00133] 6) Marcador de peso molecular
EXEMPLOS EXEMPLO 1: INIBIÇÃO DE EXPRESSÃO DE MRNA DE RETROVÍRUS ENDÓGENO HUMANO TIPO W EM PACIENTES COM ESCLEROSE MÚLTIPLA TRATADOS COM GNBACI
[00134] GNbAc1 é um anticorpo monoclonal IgG4 direcionado para a proteína do envelope do retrovírus associada à esclerose múltipla (MSRV- Env), um membro da família do HERV-W de elementos retrovirais endógenos, portanto, também referida como HERV-W Env. GNbAC1 mostrou um perfil de segurança favorável e farmacocinética linear em ensaio clínico de Fase I realizado em voluntários saudáveis.
[00135] O presente ensaio clínico GNC002 Fase IIa foi realizado para avaliar o perfil de segurança e a farmacocinética de GNbAC1 a 2 e 6mg/kg em 10 pacientes com MS. GNC002 consistiu em um estudo longitudinal de 12 meses, em que GNbAC1 é administrado mensalmente.
[00136] A presente análise foi conduzida em amostras coletadas durante os seis primeiros meses de GNC002, em que os níveis dos transcritos relacionados com HERV-W foram avaliados por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) dos pacientes cadastrados. Os transcritos de HERV-W são avaliados por conjuntos diferentes de primers/sondas, da seguinte forma: MSRV- env, HERV-W-UNO, HERV-W-UNO2,
MATERIAIS E MÉTODOS
[00137] As amostras foram coletadas em tubos Vacutainer CPT de 4 mL, processadas, armazenadas e expedidas de acordo com o protocolo fornecido pela Geneuro no Manual de Laboratório GNC002.
[00138] PBMC congeladas de 10 pacientes com MS foram fornecidas pelos 2 centros de recrutamento envolvidos no estudo GNC002. MATERIAIS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS
PROGRAMAS DE COMPUTAÇÃO
[00139] Biorad CFX Manager 2.0: Execução e análises de PCR.
[00140] Genex 5: dados brutos de suavização de PCR.
[00141] Graph Pad Prism: gráficos.
[00142] SigmaStat: análise estatística.
[00143] O teste de Normalidade usado é o teste de Kolmogorov- Smirnov. As correlações foram determinadas com a análise de Pearson Product Moment, se os dados fossem paramétricos, ou a análise de Spearman Rank se os dados não fossem paramétricos.
PROTOCOLOS
[00144] Resumidamente, a primeira etapa consistiu na extração de RNA total de amostras de PBMC. As amostras de PBMC foram isoladas do sangue coletado em tubos CPT e congeladas em 0,5 mL de DMSO 10% em Soro Fetal de Bezerro. Após descongelamento, as amostras de PBMC foram lavadas com PBS gelado e os RNAs totais foram extraídos com Mini Kit QIAamp RNeasy. Em seguida, os cDNAs foram preparados pela retro transcrição de todo mRNA contido nos RNAs totais previamente extraídos. PCRs quantitativas foram realizadas com esses cDNAs, com adição de um padrão interno usado como calibrador interplaca (permitindo a padronização dos valores ao longo do experimento com múltiplas placas). Os resultados foram expressos como a expressão relativa do RNA direcionado (MSRV/HERV-W), por uma razão para a expressão de GUS B RNA, um gene housekeeping de referência com um nível de expressão estável na população com MS.
SEQUÊNCIAS DE PRIMERS E SONDAS
[00145] O conjunto de primers/sondas comercial para detecção do gene housekeeping, GUS B, é o Taqman Gene Expression Assay GusB (Applied biosystem 4448485). O marcador com corante fluorescente é o VIC®, que é detectado na extremidade 5’ da sonda GusB.
[00146] Os primers esondas MSRV-envsão projetados para detectar especificamente a sequência que codifica a proteína MSRV-Env e não Sincitina. Inversamente, os primers Sincitina permitem a amplificação específica da sequência que codifica Sincitina, mas não MSRV-env. A fluorescência do marcador com corante FAM™ é medida em MSRV env e sonda de Sincitina.
[00147] Os primersUNO2são projetados por Geneuro para reconhecer a sequência de MSRV-Env que, supostamente tem uma potencial função imunossupressora, por analogia com a região correspondente em sequências de outros retrovírus endógenos; contudo esta terminologia (peptídeo/sequência imunossupressora) é usada no presente pedido para localizar um domínio definido em proteínas do envelope retroviral, que podem não ser imunossupressoras em todos os retrovírus. Esses primerstambém podem hibridizar à sequência codificadora de Sincitina.
[00148] UNO, projetado por sequências de ligação Geneuro que codificam MSRV-Env e Sincitina. Nenhuma sonda é projetada para as sequências amplificadas pelos primers UNO e UNO2, dessa forma a fluorescência do SYBR verde permite a quantificação da amplificação dessas sequências.
[00149] Os primers e sondas MSRV-polforam projetados por Geneuro e reconhecem a sequência que codifica a transcriptase reversa de MSRV. A detecção da hibridização da sonda MSRV-pol é quantificada com repórter fluorescente FAM™. TABELA 4 SEQUÊNCIA DE TODOS OS PRIMERSE SONDAS USADOS NESSE ESTUDO DE BIOMARCADOR
[00150] O fluoróforo detectado por termociclador CFX está em 5’ da sonda. Para o conjunto de primers sem sonda, a detecção é realizada intercalando corante verde SYBR.
ANÁLISE DE RESULTADOS OS CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO PARA AMOSTRAS QUE PREVINEM VIÉS NAS ANÁLISES SÃO OS SEGUINTES
[00151] Concentração de RNA da amostra abaixo de 10 ng/µL, após extração e tratamento com DNase
[00152] Desvio padrão da triplicata de PCR acima de 0,2 Cq, para uma amostra
[00153] Cq (Ciclo de Quantificação) de GUS B acima do limite de degradação, o que indica que o RNA não está atingindo o nível de qualidade esperado no estudo. O limite de degradação é calculado da seguinte forma: Média + 2 x Desvio padrão de todos os valores individuais Cq de GUS B
[00154] Todos os Cq individuais para os genes MSRV/HERV-W env e GUS B são padronizados de acordo com os seus próprios padrões internos, adicionados em cada placa experimental com o programa de computação Genex® (MultiD analyses AB, Suécia).
[00155] A expressão relativa de cada RNA direcionado dentro de cada amostra é calculada da seguinte forma:
[00156] Expressão Relativa do RNA direcionado para GUS B = 2(Cq GUS B - Cq RNA direcionado)
RENDIMENTO DA EXTRAÇÃO E EXCLUSÃO DE AMOSTRAS
[00157] Após a extração, a concentração total de RNA para cada amostra é determinada com um aparelho Nanodrop®. Todas as amostras com concentração de RNA total inferior a 10 ng/µL foram excluídas. Antes da quantificação total de RNA, o RNA total foi submetido a um tratamento com DNase para eliminar o DNA genômico contaminante que permaneceu eventualmente na preparação de RNA total. Após esta etapa de DNase, a ausência de DNA genômico contaminante para cada amostra foi controlada por uma PCR sem retrotranscrição (NoRT Ctrl n° 1). Se o DNA genômico fosse detectado durante essa etapa, as amostras correspondentes foram submetidas a uma segunda etapa de DNase e uma segunda quantificação de RNA, bem como um segundo controle de NoRT (NoRT Ctrl n° 2). As amostras foram finalmente excluídas se o DNA genômico ainda estivesse presente na preparação, ou se o RNA total fosse inferior a 10 ng/µL após esse tratamento adicional com DNase.
PADRONIZAÇÃO DE DADOS BRUTOS COM GENEX® E EXCLUSÃO DE AMOSTRAS
[00158] Para harmonizar dados brutos recolhidos através de microplacas de PCR múltiplas, todos os dados brutos foram padronizados de acordo com o padrão interno presente em cada microplaca com o programa de computação Genex. As amostras para as quais o desvio padrão da triplicata de PCR estava acima de 0,2 Cq foram excluídas do estudo. A qualidade de uma amostra é refletida pelo seu nível de expressão de GUS B. Todas as amostras acima do limite de degradação foram excluídas do estudo.
RESULTADOS NÍVEIS DE TRANSCRITOS RELACIONADOS COM HERV-W NA INCLUSÃO
[00159] No primeiro momento do estudo, as PBMC foram isoladas do sangue de todos os indivíduos antes da primeira administração de GNbAC1 ou placebo. Dessa forma, os resultados apresentados na Tabela 5 e na Figura 1 correspondem ao nível basal de transcritos relacionados com HERV-W de interesse para cada paciente no momento da inclusão no estudo. TABELA 5 NÍVEIS DE TRANSCRITOS RELACIONADOS COM HERV-W NA INCLUSÃO
[00160] A distribuição dos resultados de todos os pacientes é homogênea com os protocolos de qPCR “qnc” e “syn”, mas as diferenças na distribuição podem ser observadas com os protocolos UNO e UNO2 apesar da expressão relativa mais baixa detectada para o RNA especificamente direcionado com “UNO2”.
[00161] Não foi observada diferença na distribuição dos níveis de transcrições de HERV-W na inclusão entre os pacientes que estavam cadastrados nos coortes de 2 mg/kg e 6 mg/kg e entre os dois centros de recrutamento envolvidos no estudo.
COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE TRANSCRITOS DE ENV E POL DE HERV-W COM DADOS CLÍNICOS NA INCLUSÃO
[00162] A correlação dos parâmetros clínicos com os níveis de transcritos relacionados com HERV-W na inclusão foi avaliada de acordo com as informações resumidas na Tabela 6. TABELA 6: NÍVEIS DE TRANSCRITOS RELACIONADOS COM HERV-W E INFORMAÇÃO CLÍNICA NA INCLUSÃO
[00163] Primeiramente, esses resultados evidenciaram o fato de que, independentemente dos primers e sondas usados para os diferentes protocolos de qPCR e quaisquer que sejam os genes de HERV-W (env ou pol), os níveis mais altos de RNA de HERV-W foram encontrados em pacientes com PPMS e os menores em pacientes com SPMS (Figura 2). Essa nova informação claramente fornecida é de interesse sobre o nível de expressão transcricional diferencial de HERV-W em pacientes com duas formas diferentes de MS progressiva (PPM e SPMS). Isso também pode ser de interesse para a RRMS, mas apenas um desses casos é aqui representado com expressão relativa intermediária.
[00164] Isso mostra que a quantificação do nível de transcrição de HERV-W em pacientes com MS pode ter um valor de diagnóstico e pode, por exemplo, ser usado com o objetivo de suportar um diagnóstico diferencial entre casos de SPMS e PPMS. Isso também pode ser útil para estratificar os limiares de qPCR para prognóstico ou monitoramento terapêutico em PPMS, SPMS e, eventualmente, também em RRMS.
[00165] Em segundo lugar, apesar dos números atualmente baixos, foram encontradas correlações estatisticamente significativas entre os níveis transcricionais do RNA de env e pol de HERV-W e a duração da doença e/ou o índice de progressão, com o uso dos protocolos “Syn” e “pol”. Os outros protocolos com o uso de diferentes primers e sondas não apresentaram correlações significativas com os parâmetros clínicos, o que destaca o valor do protocolo selecionado, conforme mostrado na Figura 3.
[00166] Isso mostra que uma seleção de protocolos para a quantificação do nível transcricional do gene env de HERV-W que codifica o subtipo Sincitina (protocolo “Syn”, com SEQ ID N°: 14, 15 e 16) ou o gene pol em geral (protocolo “pol”, com SEQ ID N°: 23, 24 e 25) também podem ter um valor diagnóstico específico em MS. No presente pedido, os protocolos qPCR “syn” e “pol” podem ser usados como um biomarcadores da atividade da doença relacionada com HERV-W (evolutividade da progressão da doença) para estratificação clínica, acompanhamento e monitoramento terapêutico. Isso também pode ser útil para estratificar a doença “duração versus atividade” em MS progressiva com qPCR “Syn”, levantando perspectivas para as diferenças nas estratégias terapêuticas a serem aplicadas de acordo com o nível transcricional de Sincitina de env de HERV-W em pacientes com evolução progressiva ao longo de vários anos (SPMS, em particular).
NÍVEIS DE TRANSCRITOS RELACIONADOS COM HERV-W AO LONGO DE SEIS MESES
[00167] Para cada doente incluído no estudo, as PBMC foram isoladas a partir da amostra de sangue no Dia 1 (inclusão), Dia 2, Dia 8, Dia 15 e Dia 29. Depois, os pacientes receberam cinco administrações mensais adicionais de GNbAC1 e as PBMCs foram isoladas de uma amostra de sangue antes de cada infusão de anticorpo. Dessa forma, os resultados seguintes representam a variação de cada transcrição relacionada com HERV-W durante os primeiros 6 meses do estudo GNC002.
[00168] A segunda administração de GNbAC1 ocorreu em momentos diferentes a partir do Dia 1, dependendo dos pacientes. Dessa forma, a variação média dos transcritos relacionados com HERV-W foi avaliada com amostras de sangue coletadas apenas antes de cada administração de GNbAC1.
[00169] No coorte de 2 mg/kg, uma diminuição de todos os níveis de transcritos de HERV-W foi observada na 6a administração de GNbACI, em comparação com os valores basais na inclusão (Figura 4). Isso é confirmado na coorte de 6 mg/kg (Figura 4). Quando todos os pacientes (coortes de 2 mg/kg e 6 mg/kg) são agrupados, a diminuição é melhor evidenciada pelos protocolos HERV- W UNO, UNO2 e pol qPCR ao longo do estudo GNC002 (Figura 4). Isso também é ilustrado com a distribuição estatística dos valores medidos antes da primeira, terceira e sexta injeção de GNbAC1 em todos os pacientes (Figura 5).
[00170] Muito inesperadamente, a diminuição é também marcada para o mRNA de pol. Esse efeito não é o que se espera para um anticorpo, que se liga especificamente à proteína HERV-W Env, produzir depois de ser injetado uma vez ao mês durante seis meses em pacientes com uma doença associada à expressão de HERV-W. Esse efeito nos mRNAs que codificam as enzimas transcriptase reversa, protease e integrase parece, portanto, único e novo para um anticorpo anti-Env, como GNbAC1. Isso, portanto, evidencia um efeito na expressão global de HERV-W propriamente dita e, através dos seus produtos codificados por pol, na sua atividade retroviral replicativa. Portanto, apresenta um efeito antirretroviral, em particular um efeito de retrovírus anti-endógeno direcionado à família HERV-W.
[00171] Na Figura 5, a seleção dos primers e sondas mais precisos para protocolos de qPCR para um monitoramento terapêutico de grupos de pacientes tratados com GNbAC1 ou com qualquer droga que interfira na expressão de HERV- W é “UNO2” para HERV-W env e “pol” para o gene que codifica as enzimas HERV- W. No entanto, o cálculo das razões com as figuras obtidas por outros protocolos qPCR também pode se revelar de interesse de diagnóstico ou prognóstico.
[00172] Nesse experimento, os níveis de transcritos relacionados com HERV-W em pacientes com MS incluídos no estudo GNC002 foram avaliados por PCR quantitativa em tempo real, com o uso de diferentes conjuntos de primers que amplificam diferentes sequências representativas do gene env de HERV-W e um conjunto de primers amplificando o HERV -W pol (dentro da região codificadora da transcriptase reversa). Os transcritos de HERV-W investigados no presente pedido são denominados MSRV-env, HERV-W-UNO, HERV-W-UNO2, HERV-W-Syn e MSRV-pol.
[00173] Os resultados indicam claramente que esses biomarcadores podem fornecer dados bio clínicos sensíveis de interesse para o diagnóstico de MS e para o monitoramento terapêutico de doenças associadas ao HERV-W.
[00174] Além disso, os níveis de transcritos relacionados com HERV- W parecem ser mais elevados em PPMS do que em pacientes com SPMS, o que confirma o valor dos ensaios de PCR quantitativas atuais com os diferentes conjuntos de primers para avaliação bioclínica de pacientes e, além disso, para formas progressivas de MS (SPMS e PPMS).
[00175] Uma vez que todos os níveis de transcritos relacionados com HERV-W diminuíram durante os primeiros seis meses de GNC002 em coortes de 2 mg/kg e 6 mg/kg, isso confirma o valor bioclínico dos atuais conjuntos de primers e protocolos de qPCR para o monitoramento terapêutico dos pacientes e para uma avaliação bioclínica da eficiência terapêutica.
[00176] Finalmente, isso também fornece evidência biológica de que o tratamento com anticorpo anti-HERV-W Env (como GNbAC1) em pacientes com MS tem um efeito inibidor na expressão de HERV-W, o que não era esperado para o nível de mRNA de env, mas ainda menos para o mRNA de pol. Isso indica claramente uma eficácia desse tratamento com anticorpo anti-Env contra um retrovírus endógeno associado a uma doença humana, visto que nunca foi descrito com retrovírus exógenos humanos.
EXEMPLO 2 INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CODIFICADA PELO RETROVRUS ENDÓGENO HUMANO TIPO W (TRANSCRIPTASE REVERSA) É SINERGICAMENTE MELHORADA POR UM TRATAMENTO COMBINADO COM ANTICORPO GNBAC1 E AZT A. CARACTERIZAÇÃO ANTIGÊNICA DE UMA CULTURA CELULAR QUE EXPRESSA ESPONTANEAMENTE AS PROTEÍNAS GAG, POL E ENV DE HERV-W MATERIAIS E MÉTODOS CULTURA CELULAR QUE EXPRESSA ESPONTANEAMENTE AS PROTEÍNAS GAG, POL E ENV DE HERV-W
[00177] As células CH2 humanas foram mantidas em meio IMDM (12440053, Lifetech) suplementado com soro fetal bovino 10% (10270106, Invitrogen), penicilina/estreptomicina 1% (P4333; Sigma) a 37°C com 5% de CO2. Extração de Proteínas
EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
[00178] As células CH2 foram ressuspensas em 500 µL de tampão RIPA (R0278, SIGMA) contendo coquetel inibidor de anti-fosfatase cOmplete® (04 693 132001; Roche) e LPG 0,05% (326495-22-1, Avanti Polar) a 4°C, incubadas por 2 horas a 26°C em uma plataforma rotativa e centrifugadas a 10000 g por 20 minutos a 26°C. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -20°C.
WESTERN BLOTTING
[00179] Os extratos de proteína foram diluídos em tampão Laemmli 2X (Biorad) e aquecidos por 5 minutos a 100°C antes do carregamento. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio 7,5% (TGX, Biorad). Os géis correram por um período de tempo de 15 minutos a 120 mA em tampão de corrida (Life Technologies). Após a transferência da proteína para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm (Biorad), a membrana foi lavada duas vezes com PBS 1x (Biomérieux) contendo tampão Tween20 0,05% (Sigma) e foi bloqueada por 1 hora com Bloco de Partida (Thermo) em uma plataforma rotativa à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram usados de acordo com a Tabela 1 em PBS 1x por 1 hora. A membrana foi então lavada três vezes e incubada por 30 minutos com o anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com HRP (G21234; lifetech, 1/1000 em PBS 1x) ou de camundongo (115-035-146, jackson, 1/1000 em PBS 1x)). A proteína de interesse foi detectada com uma reação colorimétrica (Opti 4-CN, Biorad), de acordo com o protocolo fornecido.
[00180] Anticorpos com Antígeno Alvo e diluição de Anticorpos: 1) Policlonal pAb1 de coelho (SQ09AK001, Squarix), MSRV-Env, 0,5 µg/mL; 2) Policlonal de coelho 330110 J77 Soro (330110 J77, InCellArt), poliproteína MSRV-Pol, 1/500; Monoclonal murino 38E12 (250510, Squarix); poliproteína MSRV-Gag, 1 µg/mL.
RESULTADOS
[00181] Como pode ser visto a partir da Figura 6, estas células expressam todas as proteínas estruturais de HERV-W, como detectadas por anticorpos específicos direcionados contra proteínas codificadas por gag, pol e env.
[00182] O anticorpo anti-gag detecta a poliproteína codificada por gag de HERV-W e diferentes proteínas clivadas, incluindo uma forte detecção da banda da proteína similar a P30 do capsídeo. O padrão detectado pelo anticorpo anti-Env parece mais complexo com a detecção de monômeros, dímeros e trímeros glicosilados e não glicosilados codificados por env de HERV- W, bem como unidade SU ou TM clivada ao redor de 45 e 35 KDa. O anticorpo anti-pol detecta principalmente a enzima transcriptase reversa clivada, embora uma banda de alto peso molecular possa ser vista na parte superior do gel (não marcada com estimativa de KDa), o que corresponderia à poliproteína não clivada codificada por pol de HERV-W. B. PROTEÍNA CODIFICADA PELO GENE POL DE RETROVÍRUS ENDÓGENO HUMANO TIPO W (TRANSCRIPTASE REVERSA) NÃO PODE MAIS SER DETECTADA EM CÉLULAS EXPOSTAS A UM TRATAMENTO COMBINADO COM ANTICORPO GNBACI E AZT MATERIAIS
E MÉTODOS CULTURA CELULAR DE CORDOMAS
[00183] As células humanas CH1 e CH2 (1:1) foram cocultivadas para otimização do crescimento de células CH2 e mantidas em placas de 6 poços (CC7672-7506; CytoOne) a uma densidade de 1 x 106 células/poço em meio IMDM (12440053; Lifetech) suplementado com soro fetal bovino 10% (10270106; Invitrogen), penicilina/estreptomicina 1% (P4333; Sigma) a 37°C com 5% de CO2. As células foram tratadas com i) AZT (1 µg/mL, A21-69; Sigma), ii) GNbAC1 (300µg/mL, T950111-A; Polymun), iii) AZT + GNbAC1 ou controles correspondentes com tampão GNbAC1 [His 20mM, sacarose 5% (p/v), Tween 20 0,01% (p/v)].
EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
[00184] As células CH2 foram ressuspensas em 200 µL de tampão RIPA (R0278, SIGMA) contendo coquetel inibidor de anti-fosfatase cOmplete® (04 693 132001; Roche) e LPG 0,05% (326495-22-1, Avanti Polar) a 4°C, incubadas por 2 horas a 26°C em uma plataforma rotativa e centrifugadas a 10000 g por 20 minutos a 26°C. O sobrenadante foi coletado e armazenado a - 20°C.
WESTERN BLOTTING
[00185] As proteínas extraídas foram diluídas (2:1) em tampão Laemmli 2X (Biorad) e aquecidas por 5 minutos a 100°C antes do carregamento. As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio 7,5% (TGX, Biorad). Os géis correram por um período de tempo de 15 minutos a 120 mA em tampão de corrida (Life Technologies). Após a transferência da proteína para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm (Biorad), a membrana foi lavada duas vezes com PBS 1x (Biomérieux) contendo tampão Tween20 0,05% (Sigma) e foi bloqueada por 1 hora com Bloco de Partida (Thermo) em uma plataforma rotativa à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram usados de acordo com a Tabela 1 em PBS 1x por 1 hora. A membrana foi então lavada três vezes e incubada por 30 minutos com o anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com HRP (G21234; lifetech, 1/400 em PBS 1x) ou de camundongo (115-035-146, jackson, 1/1000 em PBS 1x)). A proteína de interesse foi detectada com uma reação colorimétrica (Opti 4-CN, Biorad), de acordo com o protocolo fornecido. Anticorpo: Policlonal de coelho 330110 J77 Soro (330110 J77, InCellArt), cultivado contra poliproteína MSRV- Pol e diluído 1/500.
[00186] Como pode ser observado a partir dos resultados deste experimento, que são ilustrados na Figura 7, as células cultivadas na presença da combinação tanto de GNbAC1 como de AZT (Faixa n°1) não expressaram níveis detectáveis de transcriptase reversa HERV-W (RT). Quando expostas somente ao AZT (Faixa n°2) uma redução clara na expressão de HERV-W RT é mostrada pela redução de sinal correspondente marcada com o anticorpo anti- HERV-W RT; no entanto, isso se mantém como um efeito parcial. Na faixa n°3, a exposição somente ao GNbAC1 parece ter efeitos menores na proteína transcriptase reversa codificada por HERV-W pol, conforme detectado nas presentes condições in vitro. Como um controle positivo paralelo, a expressão da proteína HERV-W RT a partir de células expostas somente ao diluente de GNbAC1 (tampão de diluição) como um tratamento simulado, mostra a presença normal desta banda RT expressa nessas células na faixa n°4.
[00187] Dessa forma, é mostrado no presente pedido que somente a combinação tanto de anticorpo GNbAC1 anti HERV-W Env como de Azidotimidina (AZT) teve efeito suficiente para inibir completamente a produção de HERV-W RT nessa cultura de células humanas que expressam os genes gag, pol e env de HERV-W de modo geral, enquanto que, cada molécula terapêutica sozinha teve somente um efeito parcial ou muito baixo nessa expressão de HERV-W. Mesmo se isso for relacionado com as condições da cultura celular in vitro, isso, apesar de tudo, evidencia uma diminuição óbvia e um efeito sinergético principal na eficácia da inibição da expressão de HERV-W RT por essa única combinação de um anticorpo que neutraliza a proteína HERV-W Env e de uma droga antirretroviral de transcriptase reversa. Essas moléculas terapêuticas não têm efeito sinérgico esperado na expressão de RT de um retrovírus endógeno como FHERV-W, ainda mais porque (i) eles são direcionados especificamente para moléculas e estruturas proteicas completamente diferentes, (ii) eles têm modo de ação completamente diferentes (neutralização de Env pelo direcionamento a um epítopo específico e inibição da atividade da enzima RT) e (iii) um é um anticorpo, enquanto que o outro é uma molécula química pequena.
EXEMPLO 3 FORMULAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO TAMPÃO PARA UMA PREPARAÇÃO DE ANTICORPO GNBACI ADEQUADA PARA INJEÇÃO INTRAVENOSA EM HUMANOS
[00188] Conforme mencionado no Exemplo 1, GNbAc1 é um anticorpo monoclonal IgG4 direcionado para a proteína do envelope do retrovírus associado à esclerose múltipla (MSRV-Env), um membro da família do HERV-W de elementos retrovirais endógenos, portanto, também citada como HERV-W Env. GNbAC1 mostrou um perfil de segurança favorável e farmacocinética linear em ensaio clínico de Fase I realizado em voluntários saudáveis. O ensaio clínico GNC002 Fase IIa foi realizado para avaliar o perfil de segurança e a farmacocinética de GNbAC1 a 2 e 6mg/kg em 10 pacientes com MS. GNC002 consistiu em um estudo longitudinal de 12 meses, em que GNbAC1 é administrado mensalmente.
[00189] Para o propósito da administração intravenosa (iv) do anticorpo GNbAC1, a formulação especificamente adequada do tampão no qual ele foi solubilizado, armazenado e injetado nos pacientes, é a seguinte: histidina 20mM, sacarose 5%, polissorbato 20 a 0,01%, pH 6.0.

Claims (6)

1. USO DE UM ANTICORPO, direcionado contra a proteína do Envelope de HERV-W (HERV-W Env) ou de um fragmento do mesmo selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, um diacorpo e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos, e de uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento, que é para uso como uma droga antirretroviral de direcionamento de um vírus pertencente aos retrovírus endógenos humanos tipo W (HERV-W), para prevenir e/ou tratar uma doença associada com HERV-W selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que dito anticorpo ou fragmento do mesmo compreende cada uma das 6 CDRs, conforme representadas na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dita droga inibitória de transcriptase reversa antirretroviral ser azidotimidina (AZT).
3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo ser um anticorpo humanizado monoclonal.
4. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo ou fragmento do mesmo compreender: - uma cadeia pesada (HC) que possui uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e - uma cadeia leve (LC) que possui uma sequência de aminoácidos conforme apresentada na SEQ ID NO:10.
5. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para tratar uma doença associada com HERV-W selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo e a dita droga inibitória de transcriptase reversa retroviral são administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
6. USO, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por ser em uma preparação combinada com uma droga inibitória de transcriptase reversa retroviral para tratar uma doença associada com HERV-W selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla (MS), esquizofrenia (SZ), disfunção bipolar (BP), depressão unipolar ou psicótica, síndrome clinicamente isolada (CIS, com sintoma neurológico), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, psoríase, câncer, pancreatite inflamatória e diabetes como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo e a dita droga inibitória de transcriptase reversa retroviral são administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
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