CN113874077A - 精神障碍的治疗和诊断 - Google Patents

精神障碍的治疗和诊断 Download PDF

Info

Publication number
CN113874077A
CN113874077A CN202080038551.0A CN202080038551A CN113874077A CN 113874077 A CN113874077 A CN 113874077A CN 202080038551 A CN202080038551 A CN 202080038551A CN 113874077 A CN113874077 A CN 113874077A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tdrp
seq
variant
individual
antagonist
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080038551.0A
Other languages
English (en)
Inventor
富尔维奥·达奎斯托
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Queen Mary University of London
Original Assignee
Queen Mary University of London
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Queen Mary University of London filed Critical Queen Mary University of London
Publication of CN113874077A publication Critical patent/CN113874077A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及以下发现：睾丸发育相关蛋白(TDRP；本文也被称为Immunomoodulin或Imood)是一种循环基因焦虑因子，其通过调控免疫系统而调节哺乳动物模型中的焦虑样行为。提供给了治疗精神障碍诸如焦虑症的方法，以及用于此类方法中的TDRP拮抗剂。提供了通过确定样品中TDRP水平来诊断或监测个体精神障碍的方法，以及筛选降低TDRP水平的化合物的方法。

Description

精神障碍的治疗和诊断
领域
本发明涉及用于治疗和诊断精神障碍(如焦虑性障碍)的方法和化合物。
背景
被诊断患有自身免疫性疾病的患者的挑战性生活往往因作为主要合并症的精神障碍的出现而变得更加贫困1,2。例如，～40％的患有多发性硬化症的患者曾尝试过自杀3,4，而超过30％的受自身免疫性肝炎影响的患者患有精神分裂症5,6。最引人注目的是，用于治疗自身免疫性病况的免疫调节疗法可能会加剧这些问题的出现7，从而使临床医生和患者陷入矛盾的困境：自身免疫的身体症状可能会以情绪状态和健康状况恶化为代价得到有效改善。例如，干扰素β(IFN-β)的情况即是如此，其目前被用作多发性硬化症的有效治疗方法，但其使用受到很大比例患者的增加的自杀念头发生率的限制8。尽管一些研究已经调查大脑与免疫系统之间的功能性串扰9,10，但目前仍不清楚一个系统如何影响另一个系统，以及自身免疫性病况中精神障碍的出现是否存在共同的根源或决定性因素。
膜联蛋白-A1(AnxA1)是范围从炎症11-14到自身免疫15,16以及癌症17-20的多种生理和病理过程的内源性调节剂。与许多其他多功能调节剂一样，AnxA1在免疫系统中起着稳态作用，因为它可以根据环境发挥积极和消极功能。在T细胞的背景下，研究确实提供了形成鲜明对比的和相反的结果，其表明它可以作为T细胞激活的正21-30和负调节剂30-33。所有这些研究都是使用外源性施用的重组AnxA1(或其模拟物)或AnxA1缺陷小鼠完成的，其中每个免疫细胞中都不存在蛋白。
概述
本申请发明人已经认识到睾丸发育相关蛋白(TDRP)是一种循环基因焦虑因子，其调节哺乳动物模型中的焦虑样行为。TDRP(本文中也被称为Immuno-moodulin或Imood)可能是有用的，例如，作为精神障碍治疗的治疗靶标，或作为精神障碍诊断、预后、监测或评估的生物标志物。
本发明的第一方面提供了治疗精神障碍的方法，其包括向有需要的个体施用TDRP拮抗剂。
本发明的第二方面提供了用于第一方面所述方法的TDRP拮抗剂。
本发明的第三方面提供了TDRP拮抗剂在制备用于第一方面所述方法的药物中的用途。
本发明的第四方面提供了药物组合物，其包含治疗有效量的TDRP拮抗剂和药学上可接受的赋形剂。
本发明的第四方面的所述药物组合物可用于本发明的第一、第二和第三方面。
用于第一至第四方面的合适的TDRP拮抗剂包括抗体分子，并且在本文其他地方有描述。
本发明的第五方面提供了确定个体焦虑症的方法，其包括；
确定获自个体的样品中TDRP的水平或量。
本发明的第六方面提供了诊断个体精神障碍、或鉴定患精神障碍风险增加的个体的方法，所述方法包括：
确定获自个体的样品中TDRP的水平或量。
本发明的第七方面提供了监测接受治疗的个体的方法，其包括；
确定获自接受治疗的个体的样品中TDRP的水平或量。
所述个体可能例如正接受针对免疫性病况或精神障碍的治疗。
本发明的第八方面提供了筛选对精神障碍具有治疗活性的化合物的方法，其包括；
确定测试化合物对非人哺乳动物中TDRP的水平或量的影响，
TDRP水平或量的降低指示所述化合物对精神障碍具有治疗活性。
对精神障碍的治疗活性可以包括抗焦虑活性。
本发明的第九方面提供了确定个体中T细胞激活的方法，其包括；
确定获自所述个体的T细胞样品中TDRP的表达。
本发明的其他方面和实施方案在下文中有更详细描述。
附图简述
图1显示了T细胞特异性AnxA1tg小鼠的自身免疫倾向表型。(1A)将来自对照和AnxA1tg小鼠的T细胞用指示浓度的板结合的抗CD3加抗CD28刺激16-18hr，然后用抗CD69和抗CD25染色，并通过FACS分析。图中的数字显示了CD69和CD25双阳性群体的百分比。结果来自单次实验并且代表具有相似结果的n＝12-18个实验。(1B)将来自对照和AnxA1tg小鼠的T细胞用指示浓度的板结合的抗CD3加抗CD28刺激24-30hr，并将上清液用于测量IL-2的水平。条形图显示了来自单次实验的平均值±SEM，其中T细胞获自n＝6只单独的小鼠，并且代表了具有相似结果的n＝4-5个实验。**p<0.01；***p<0.001。(1C)将对照和AnxA1tg小鼠用MOG35-55和CFA进行免疫，并且每天监测EAE的临床病征(左上图)或体重增加/减轻(右上图)，持续23天。结果显示了来自每组n＝10只小鼠的单次实验的平均值±SEM，并且代表了具有相似结果的n＝7-8个实验。*p<0.05；***p<0.001。左下图中显示的脊髓切片是在第18天获得的，并按材料和方法中所述的用苏木精和伊红染色。右下角的表格显示了在EAE发展过程中的不同时间显示评分为2的小鼠的数量。(1D)对照和AnxA1tg小鼠接受了腹膜内注射姥鲛烷，以诱发狼疮样疾病，并每天监测存活率(左图)或体重增加/减轻(右图)，持续35天。结果来自每组n＝10只小鼠的单次实验，并且代表具有相似结果的n＝3个实验。***p<0.001。
图2显示了T细胞特异性AnxA1tg小鼠中焦虑样行为的病征增加。(2A)条形图显示了10分钟试验期间埋藏的弹珠总数、挖掘的总持续时间(秒)和到第一次挖掘发作的延迟(秒)。数值表示为n＝6只小鼠的两次单独实验的平均值±SEM，并且代表涉及每组6只小鼠的四个不同实验。(2B)条形图显示5分钟试验期间在照明区域中花费的总时间(秒)、到首次穿越到暗室的延迟(秒)，以及转换的总数。数值表示为n＝6只小鼠的两次单独实验的平均值±SEM，并且代表涉及每组6只小鼠的四个不同实验。(2C)条形图显示了5分钟试验期间攀爬事件的数量和花费在攀爬网格上的总时间(秒)。数值表示为n＝6只小鼠的两次单独实验的平均值±SEM，并且代表涉及每组6只小鼠的四个不同实验。(2D)条形图和图像显示了5分钟时间段内穿越方格、直立和中央穿越的总数。数值表示为n＝6只小鼠的两次单独实验的平均值±SEM，并且代表涉及每组6只小鼠的四个不同实验。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001表示与野生型对照小鼠相比的显著值(Mann–WhitneyU检验)。
图3显示了AnxA1tg小鼠中Imood的表达。(3A)来自野生型和AnxA1tg小鼠的纯化的CD4+T细胞中Imood表达的RT-PCR。数值表示为n＝6只小鼠的单次实验的平均值±SEM。**p<0.01表示与野生型对照小鼠相比的显著值。(3B)用多克隆抗Imood抗体或IgG对照对来自野生型或AnxA1tg小鼠的T细胞进行FACS细胞内染色。左侧的图显示了获自单只小鼠的典型的直方图。右侧的条形图显示了来自n＝6只小鼠的平均荧光强度(MFI)值。***p<0.01表示与野生型对照小鼠相比的显著值。数据代表具有相似结果的n＝3个单独的实验。(3C)来自野生型和AnxA1tg小鼠的指定数量的CD4+T细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹。用多克隆抗Imood抗体对膜进行免疫印迹，并使用重组Imood(r-Imood)作为对照。(3D)给C57BL/6小鼠注射PBS或r-Imood或变性r-Imood(d-Imood)(500ng，i.p.)，并在注射后第7天进行测试。条形图显示在5分钟试验期间在照亮区域中花费的总时间(秒)和转换总数。数值表示为n＝6只小鼠(C57BL/6)小鼠的两次单独实验的平均值±SEM。**p<0.01表示与注射PBS的对照小鼠相比显著的值。§§p<0.01；§§§p<0.001表示与注射d-Imood的对照小鼠相比显著的值。(Mann–WhitneyU检验)。
图4显示了抗Immuno-moodulin抗体的抗焦虑作用。(4A)AnxA1tg(白条)或C57BL/6(灰条)小鼠接受了抗Imood抗体1C4和1B10的腹膜内注射(100ng/只小鼠)，然后在第7天在明暗穿梭箱测试中进行测试。条形图显示在5分钟试验期间在照亮区域中花费的总时间(秒)和转换总数。数值表示为n＝6只小鼠(AnxA1tg)或n＝9只(C57BL/6)小鼠的两次单独实验的平均值±SEM。(4B)按材料和方法中所述的，对诊断为OCD的患者的外周血液单个核细胞中的Imood进行实时PCR分析。数值表示为20名患者的单个数据点±SEM。*p<0.05(t检验)。(4C)研究的示意图总结显示了AnxA1和Imood的生理水平如何发挥调节宿主免疫反应和情绪健康的稳态作用。T细胞激活导致AnxA1的释放及其受体FPR的外化。该信号传导通路与TCR整合，且有助于调节控TCR信号传导强度和T细胞激活水平。激活的T细胞表达更高水平的Imood。T细胞释放这种蛋白会导致情绪低落的生理状态，其类似于感染后观察到的疾病行为。在患有自身免疫性疾病的患者中观察到的T细胞中AnxA1表达水平的增加是T细胞激活阈值较低和Imood表达增加的原因。这种蛋白在循环中释放的增加导致更高的焦虑和抑郁状态，这在患有自身免疫性病况的患者中经常观察到。
图5显示了抗Imood多克隆抗体对C57BL/6和AnxA1tg小鼠的焦虑样行为的影响。C57BL/6和AnxA1tg小鼠接受了i.p.注射多克隆抗Imood或IgG对照抗体(500ng，i.p.)，然后在第21天进行测试。条形图显示了在5分钟试验期间在照亮区域花费的总时间(秒)和转换总数。数值表示为n＝6只小鼠的两次单独实验的平均值±SEM。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001表示与注射IgG的对照小鼠相比显著的值(Mann–WhitneyU检验)。
图6显示了1B10和1C4单克隆抗Imood抗体的筛选和鉴定。(6A)如材料和方法中详细描述的，将重组Imood的等分试样(50ng)加载到SDS-page凝胶上，然后转移到PVDF膜上。用来自不同杂交瘤培养物的上清液对膜进行免疫印迹(代码名称显示在上图的顶部)。此后，将相同的膜剥离并用市售的抗Imood抗体(下图)进行免疫印迹。(6B)如材料和方法中详细描述的，将重组Imood的等分试样(50ng)用杂交瘤上清液进行免疫沉淀，然后加载到SDS-page凝胶上。用市售的抗Imood抗体对膜进行免疫印迹。
图7显示了(7A)来自在完全培养基(对照)中培养过夜或用1μg/ml板结合的抗CD3或抗CD3/CD28刺激的C57BL/6小鼠的CD4+T细胞的Imood细胞内染色。门中的数字代表Imood高表达细胞的百分比。直方图显示了用单只小鼠获得的结果，并且代表具有相似结果的n＝6-8只动物。(7B)来自在完全培养基(对照)中过夜培养或用1μg/ml抗CD3/CD28刺激的野生型或AnxA1tg小鼠的CD4+T的Imood细胞内染色。图中的数字显示了Imood高表达细胞的百分比(括号中)和门控区域的中值荧光强度。直方图显示了用单只小鼠获得的结果，并且代表具有相似结果的n＝6只动物。(7C)在完全培养基(对照)中培养过夜或用1μg/ml板结合的抗CD3或抗CD3/CD28刺激的来自野生型和AnxA1tg小鼠的CD4+T细胞中Imood表达的RT-PCR。数值表示为n＝6只小鼠的平均值±SEM。**p<0.01；***p<0.001表示与野生型对照小鼠相比的显著值(学生t检验)。(7D)图显示了在完全培养基(对照)中培养过夜或用1μg/ml板结合的抗CD3或抗CD3/CD28刺激的来自野生型和AnxA1tg小鼠的CD4+T细胞的细胞培养基免疫沉淀的Imood的水平。用多克隆抗Imood抗体对膜进行免疫印迹，并使用重组Imood(r-Imood)作为对照。显示的结果来自单只小鼠，且代表具有相似结果的六只小鼠。
详述
本发明涉及认识到TDRP是一种由T细胞释放的基因焦虑因子，其在哺乳动物中调节情绪和焦虑行为。TDRP可能是有用的，例如作为精神障碍的诊断和预后的生物标志物以及精神障碍治疗中用于干预的靶标。
睾丸发育相关蛋白(TDRP)(基因ID编号：157695；2610019F03Rik；也被称为Inm01；TDRP1；TDRP2；和C8orf42，并且本文被称为“免疫-moodulin”或“Imood”)可以是小鼠TDRP或更优选地人TDRP。
人TDRP可以具有数据库登陆号NP_001243042.1(SEQ ID NO:1)、NP_778250.2(SEQID NO:2)或这些中的任一种的变体的氨基酸序列。TDRP可以由数据库登录号NM_001256113.1、NM_175075.4或这些中的任一种的变体(如同种型或等位基因变体)的核苷酸序列编码。
小鼠TDRP可以具有数据库登录号AAI45287.1(SEQ ID NO:17)或其变体的氨基酸序列。小鼠TDRP可以由数据库登录号NM_001361625.1或其变体(如同种型或等位基因变体)的核苷酸序列编码。
参考TDRP氨基酸或核苷酸序列的变体可以具有与参考氨基酸或核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的序列。序列同一性通常参考算法GAP(GCG Wisconsin PackageTM,Accelrys,San Diego CA)定义。GAP使用Needleman&Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))来比对两个完整的序列，其最大化匹配数并最小化缺口数。通常，使用默认参数，缺口产生罚分＝12，且缺口延伸罚分＝4。GAP的使用可以是优选的，但可以使用其他算法，例如BLAST或TBLASTN(其使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNASUSA 85:2444-2448的方法)，或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.MolBiol.147:195-197)，通常采用默认参数。
特定氨基酸序列变体可以通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20或20-30个氨基酸而不同于给定的序列。在一些实施方案中，变体序列可以包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个插入、缺失或取代的残基的参考序列。例如，最多15个、最多20个、最多30个、最多40个、最多50个或最多60个残基可以被插入、缺失或取代。
在一些实施方案中，TDRP可以用作用于精神障碍的诊断或预后的生物标志物。例如，获自个体样品中TDRP蛋白或编码核酸的水平或量可以提供关于个体精神障碍的诊断或预后信息，或者可以指示或预测个体的情绪或焦虑状态。
在一些实施方案中，来自个体的样品中TDRP的水平或量可以指示个体精神障碍的严重程度。例如，TDRP增加的水平或量可能指示严重程度增加。例如，1-5ng/ml TDRP的血浆浓度可以指示轻度精神障碍，并且50-80ng/ml TDRP的血浆浓度可以指示严重精神障碍。
在其他实施方案中，来自个体样品中TDRP的水平或量可以指示或诊断个体精神障碍的类型。
(i)诊断或预测个体精神障碍，(ii)鉴定患精神障碍风险增加的个体，或(iii)确定个体焦虑水平的方法可以包括；
确定获自个体样品中TDRP的存在、水平或量。
在一些实施方案中，可以将获自个体样品中TDRP的水平或量与对照或阈值进行比较。合适的对照可以包括获自一组未患精神障碍的健康个体的对照样品中TDRP的水平或量，或一组对照样品中TDRP的平均水平或量。合适的对照样品可以获自未患精神障碍(即没有被诊断为精神障碍)的健康年龄匹配和性别匹配的志愿者。
获自个体样品中TDRP相对于对照的水平或量增加，可能指示个体患有精神障碍或患精神障碍风险增加，或者焦虑水平升高。
在其他实施方案中，可以确定经一段时间(例如1天、1周或1个月)获自个体样品中TDRP的水平或量。随时间TDRP水平或量的增加(例如获自个体样品中TDRP水平或量在第二时间点相对于第一时间点的增加)，可能指示个体患有精神障碍或患精神障碍风险增加，或焦虑水平升高。
适合根据本申请方法使用的样品可以包括血清、血浆、淋巴、白血细胞、血液、血液级分、尿液、滑液、脊髓液、唾液、粘液、眼泪和汗液的样品。在一些实施方案中，血浆、血清、唾液或尿液可以是优选的。
在一些实施方案中，样品可以包括来自个体的血细胞，如外周血单个核细胞(PBMC)。
样品中TDRP的存在、水平或量可以通过任何方便的方式确定，并且许多合适的技术是本领域已知的。
确定结合的方式不是本发明的特征，并且本领域技术人员能够根据他们的偏好和常识选择合适的方式。如上所述用于确定TDRP的存在或量的合适方法包括基于蛋白的方法，诸如蛋白质印迹、免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱(MS)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、荧光激活的细胞分选(FACS)、流式细胞荧光法(FC)、质谱流式细胞术(CyTOF)和免疫酶测定(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定，以及基于核酸的方法，诸如Northern印迹、RT-PCR和微阵列分析。所有这些方法都是本领域公知的。在一些优选的实施方案中，可以使用ELISA、FACS或RT-PCR。
在一些实施方案中，获自个体的样品可以与识别剂(如抗体分子)接触。然后可以确定样品中TDRP与识别剂的结合。
可以使用任何合适的方法来确定识别剂的结合。用单个报告分子标记是一种可能性。报告分子可以直接或间接产生可检测的，并且优选地可测量的信号。报告分子的连接可以是直接的或间接的、共价的(例如经由肽键)或非共价的。经由肽键的连接可以是编码抗体和报告分子的基因融合重组表达的结果。例如，识别剂(如抗体)可以用荧光团(如FITC或罗丹明)、放射性同位素或非同位素标记试剂(如生物素或地高辛)进行标记；可以使用与任何所期望标记物(如荧光染料)缀合的“检测试剂”(如抗生物素蛋白)来检测含有生物素的识别剂。另一种可能性是使用第二识别剂检测识别剂与TDRP的结合，例如在免疫测定系统中。取决于所采用的测定形式，第二识别剂可以被固定或用可检测标记物标记。
优选地，识别剂是抗体分子。样品中TDRP的存在或量可以例如通过测量样品中抗体分子与TDRP之间的免疫复合物形成来确定。结合的存在或程度可以例如通过凝集反应，或通过诸如颜色变化或荧光的可见变化(例如免疫染色)，或通过定量方法(如使用放射免疫方法或酶联抗体方法)来指示。
在一些优选实施方案中，免疫测定可以被用于确定样品中TDRP的存在、量或浓度。免疫测定的实例是抗体捕获测定、双抗体夹心测定、ELISA测定和抗原捕获测定。在夹心免疫测定中，通常使用能够结合TDRP的两种抗体，例如一种固定在固体支撑物上，且一种游离在溶液中并用可检测的化学化合物标记。可用于第二抗体的化学标记物的实例包括放射性同位素、荧光化合物、自旋标记物、有色颗粒(如胶体金)和有色乳胶，以及酶或当暴露于反应物或酶底物时会产生有色或电化学活性产物的其他分子。当包含TDRP的样品被放置在该系统中时，TDRP与固定的抗体和标记的抗体结合，在支撑物的表面形成“夹心”免疫复合物。通过洗去未结合的样品成分和多余的标记抗体，并测量与支撑物表面上的蛋白复合的标记抗体的量来检测复合蛋白。可替代地，可以用化学部分(例如半抗原)标记的溶液中游离的抗体可以通过用可检测部分标记的第三种抗体检测，所述可检测部分结合游离抗体或例如偶联于所述游离抗体的半抗原。优选地，免疫测定是基于固体支撑物的免疫测定。可替代地，免疫测定可以是本领域已知的免疫沉淀技术之一，诸如例如比浊免疫测定或浊度免疫测定。当使用蛋白质印迹分析或免疫测定时，优选地它包括缀合酶标记技术。
尽管识别剂将方便地是抗体，但其他识别剂是已知的或可能变得可用，并且可用于本发明。例如，可以使用抗体的抗原结合结构域片段(如Fab片段)。而且，可以使用所谓的RNA适配体。因此，除非上下文另外特别指明，否则本文所用的术语“抗体”旨在包括其他识别剂。当使用抗体时，它们可以是多克隆的或单克隆的。任选地，可以通过一种方法产生抗体，从而识别来自TDRP的预选表位。
在其他实施方案中，可以确定样品中编码TDRP的核酸的存在或量。合适的方法是本领域公知的。
在一些实施方案中，个体可能患有疾病病况，诸如免疫性病况、免疫相关病况或精神障碍。
个体可能正在接受针对疾病病况的治疗。例如，本文所述的方法可用于确定接受治疗的患者的精神障碍的发作或发作风险。对正在接受治疗的个体进行监测的方法可以包括：
确定获自接受治疗个体的样品中TDRP的水平或量。
个体可能正在接受针对免疫性病况(如自身免疫性病症)的治疗。例如，个体可能正在接受免疫调节药物(如非甾体抗炎药(NSAID))或免疫抑制剂(如IFN-β、皮质类固醇、mTOR抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、Janus激酶抑制剂、IMDH抑制剂、抗CD3抗体、抗CD25抗体、抗TNF抗体(如阿达木单抗)和抗TNF受体(如英夫利昔单抗))治疗。
自身免疫性病症(例如T细胞依赖性自身免疫性疾病)可以包括多发性硬化症、自身免疫性肝炎、I型糖尿病、乳糜泻、格雷夫斯病、炎性肠病(IBD)、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、强直性脊柱炎和抗磷脂综合征。例如，个体可能正在接受用IFN-β治疗多发性硬化症。
个体可能正在接受针对免疫相关病况的治疗。免疫相关病况可以包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和帕金森病。
个体可能正在接受针对精神障碍(如焦虑性障碍)的治疗。个体可能正在接受针对精神障碍的治疗。例如，个体可能正在接受抗精神病药、抗焦虑药、镇静剂、情绪稳定剂或抗抑郁药的治疗或非药物疗法(如谈话疗法、认知行为疗法(CBT)或放松技术)的治疗。
在一些实施方案中，获自患有自身免疫性病症个体样品中TDRP相对于对照的水平或量的升高的存在可能指示个体患有精神障碍以及自身免疫性病症。除了针对自身免疫性病症的治疗之外，个体可以针对精神障碍进行治疗，例如用上面列出的治疗或用本文所述的TDRP拮抗剂(例如抗TDRP抗体，如1B10或1C4)。获自患有自身免疫性病症个体样品中TDRP相对于对照的水平或量升高的不存在可能指示个体未患有精神障碍。个体可以针对自身免疫性病症进行治疗，例如用上面列出的治疗。
将TDRP鉴定为指示精神障碍的生物标志物还为监测精神障碍的进展或衰退提供了可容易测量的代用物。因此，旨在减轻或消除精神障碍或其症状的治疗也应减轻或消除TDRP。
因此，评估药物治疗个体精神障碍的功效的方法可以包括评估药物对TDRP的表达、水平、量或浓度的影响。例如，可以在药物施用前和药物施用后确定获自个体样品中TDRP的表达、水平、量或浓度。TDRP表达、水平、量或浓度的降低指示药物治疗精神障碍的功效。
如本文所述的TDRP表达、水平、量或浓度的增加或减少可以是TDRP的显著增加或减少。例如，可以使用t检验(如学生t测试或Welch t检验)来测量显著性，其中显著性水平为p<0.001表明显著增加或减少。在其他实施方案中，p<0.05的显著性水平(如p<0.01或p<0.005)可以指示显著增加或减少。
在一些实施方案中，如果测试样品中TDRP表达、水平、量或浓度为参考或对照样品中TDRP表达、水平、量或浓度的至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％或至少200％，则TDRP表达、水平、量或浓度的增加或减少可能是显著的。
本文所述的精神障碍是指具有临床意义的行为或心理病况，其特征是忧虑、无能或死亡、疼痛、无能或失去自由的风险增加。
精神障碍可以包括焦虑性障碍、抑郁症、自杀意念和精神分裂症。焦虑性障碍的特征在于明显的焦虑和恐惧感。焦虑性障碍可以包括强迫症(OCD)、广义的焦虑性障碍、广场恐惧症、恐慌症、恐惧症、创伤后应激障碍和社交焦虑性障碍。在一些实施方案中，如本文所述的精神障碍可以不包括注意缺陷多动障碍(ADHD)。在一些实施方案中，如本文所述的精神障碍可以不包括精神分裂症。
精神障碍(包括焦虑性障碍)的诊断标准示出于《精神障碍诊断和统计手册》(TheDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)第5版(美国精神病学协会(American Psychiatric Association)；也被称为DSM-5)。
在其他实施方案中，TDRP可以是治疗精神障碍的治疗靶标。例如，治疗有需要个体精神障碍的方法可以包括向个体施用TDRP拮抗剂。相关方面提供了用于此类治疗方法中的TDRP拮抗剂和TDRP拮抗剂在制备用于此类治疗方法的药物中的用途。
TDRP拮抗剂是降低个体中TDRP的表达、活性、水平、量和/或浓度(特别是个体血浆或血清中TDRP的表达、活性、水平、量和/或浓度)的试剂或化合物。
TDRP拮抗剂可以抑制、阻断或干扰TDRP与受体、配体或结合伴侣体的相互作用，或者可以减少或抑制TDRP分泌到个体的血浆或血清中。
TDRP拮抗剂可以降低个体(例如个体血细胞，如PBMC)中TDRP的表达，或者可以降低或减少个体血液或血清中TDRP的水平、量、浓度或活性。如本文所述的TDRP拮抗剂可以是TDRP的反向激动剂。
合适的TDRP拮抗剂包括有机小分子、受体、抗体分子、适配体、靶向基因编辑系统(如CRISPR/Cas9)和抑制核酸(如RNAi和反义)。
在一些优选的实施方案中，TDRP拮抗剂可以是特异性结合TDRP的抗体分子。
抗体分子是一种免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还涉及包含抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白。抗体可以已经通过从天然来源纯化而分离或获得，或者通过基因重组或化学合成获得，并且它们可能含有非天然的氨基酸。
抗原结合位点是分子中识别并结合全部或部分靶抗原的部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合位点或互补位，并且包括识别并结合全部或部分靶抗原的抗体部分。当抗原很大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。一个或多个抗体可变结构域可以提供抗体抗原结合位点。抗体抗原结合位点优选包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
抗原结合位点可以通过互补决定区(CDR)的排列的方式来提供。用于携带CDR或一组CDR的结构将通常是抗体重链或轻链序列或其实质性部分，其中CDR或CDR组位于对应于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以通过参考Kabat等人(1987)(Sequences ofProteins of Immunological Interest.第4版.美国卫生与公共服务部(US Departmentof Health and Human Services))及其更新确定，现在可在因特网(immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找“Kabat”)上获得。
通过CDR区或CDR，旨在表示免疫球蛋白重链和轻链的高变区，如Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,美国卫生与公共服务部(Kabat等人,(1991a),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生与公共服务部,Public Service,NIH,华盛顿，及后期版本)所定义的。抗体通常包含3个重链CDR和3个轻链CDR。根据情况，术语“CDR”可以表示这些区域中的一个或几个，或甚至这些区域的全部，这些区域包含通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和力负责结合的氨基酸残基的大部分。
在六个短的CDR序列中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的大小可变性(更大的多样性本质上是由于产生它的基因的排列机制)。尽管已知最长的长度是26，但它可以短至2个氨基酸。从功能上讲，HCDR3在确定抗体的特异性方面发挥了部分作用(Segal等人,(1974),PNAS,71:4298-4302；Amit等人,(1986),Science,233:747-753；Chothia等人,(1987),J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia等人,(1989),Nature,342:877-883；Caton等人,(1990),J.Immunol.,144:1965-1968；Sharon等人,(1990a),PNAS,87:4814-4817；Sharon等人,(1990b),J.Immunol.,144:4863-4869；Kabat等人,(1991b),J.Immunol.,147:1709-1719)。
由于抗体可以通过多种方式进行修饰，因此术语“抗体”应被解释为涵盖具有所需特异性和/或结合(例如针对TDRP)的抗体抗原结合位点的任何特定的结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段(特别是抗原结合片段)和衍生物(包括包含抗体抗原结合位点的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的)。因此包括包含融合至另一多肽(例如，属于另一抗体类别或子类)的抗体抗原结合位点，或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023，以及大量的后续文献中。
如上所述，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341,544-546；McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554；Holt等人(2003)Trends in Biotechnology21,484-490)，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合形成抗原结合位点的肽连接子连接(Bird等人(1988)Science,242,423-426；Huston等人(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚物(PCT/US92/09965)；(ix)“双体抗体”，其为通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等人(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)，以及(x)单链双体抗体形式，其中一组中的VH和VL结构域中的每个通过短的或‘非柔性的’肽连接子连接。Fv、scFv或双体抗体分子可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥而稳定(Reiter等人(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。单链Fv(scFv)可以包含在微型免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)中，例如，如(Li等人(1997),Protein Engineering,10:731-736)中所述。SIP可以包含融合至人IgE分泌型同种型IgE-S2的CH4结构域的scFv分子(εS2-CH4；Batista等人,(1996),J.Exp.Med.,184:2197-205)，形成同型二聚体微型免疫球蛋白抗体分子。还可以制备包含连接到CH3结构域的scFv的微型抗体(Minibodies)(Hu等人(1996),Cancer Res.,56(13):3055-61)。结合片段的其他实例是Fab'，其与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加了几个残基(其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)，以及Fab'-SH(其是一个Fab'片段)，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有一个游离的硫醇基团。优选的抗体分子可以包括人类或人源化的抗体分子。
合适的抗体分子可以与TDRP特异性结合(例如在免疫沉淀实验中)，并且可以例如减少鼠模型中的焦虑样行为。
与TDRP特异性结合的抗体分子可以使用常规技术产生，其包括例如基因免疫法(参见例如Bates等人Biotechniques(2006)40(2)199-208)。用于免疫法以产生特异性结合TDRP的抗体分子的合适蛋白序列可以包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17。
如本文所述使用的合适的抗体分子包括如本文所述的单克隆抗体，诸如1B10和1C4。
在一些实施方案中，1B10抗体分子可以包含VH结构域和VL结构域；其中VH结构域包含SEQ ID NO:3的VHCDR1或其变体、SEQ ID NO:4的VHCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:5的VHCDR3或其变体；并且VL结构域包含SEQ ID NO:6的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:8的VLCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:10的VLCDR3或其变体。在其他实施方案中，1B10抗体的VL结构域可以包含SEQ ID NO:7的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:9的VLCDR2或其变体，以及SEQID NO:10的VLCDR3或其变体。
抗体分子可以特异性结合TDRP。
本文所述的1B10抗体分子的VH结构域可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其变体；或者SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其在框架区中独立地具有1个或多个(例如2、3或4或更多个)氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守性取代。VH结构域可以由SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其变体编码。
本文所述的1B10抗体分子的VL结构域可以包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列或这些中任一种的变体；或者SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其在框架区中独立地具有1个或多个(例如2、3或4个或更多个)氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守性取代。VL结构域可以由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核苷酸序列或这些中的任一种的变体编码。
1C4抗体分子可以包含VH结构域和VL结构域；其中VH结构域包含SEQ ID NO:18的VHCDR1或其变体、SEQ ID NO:19的VHCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:20的VHCDR3或其变体；并且VL结构域包含SEQ ID NO:21的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:22的VLCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:23的VLCDR3或其变体。
抗体分子可以特异性结合TDRP。
本文所述的1C4抗体分子的VH结构域可以包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其变体；或SEQ ID NO:24的氨基酸序列，其在框架区中独立地具有1个或多个(例如2、3或4个或更多个)氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守性取代。VH结构域可以由SEQ ID NO:25的核苷酸序列或其变体编码。
本文所述的1C4抗体分子的VL结构域可以包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或其变体；或SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其在框架区中独立地具有1个或多个(例如2、3或4个或更多个)氨基酸取代、缺失或插入。取代可以是保守性取代。VL结构域可以由SEQ ID NO:27的核苷酸序列或其变体编码。
作为参考序列的变体的本文所述的蛋白(如本文所述的CDR、VH或VL结构域序列)可以具有相对于参考序列改变的1个或多个氨基酸残基或核苷酸。例如，相对于参考序列可以改变20个或更少的氨基酸残基或核苷酸，优选地，15个或更少、10个或更少、5个或更少，或3个或更少、2个或1个。例如，本文所述的变体可以包含具有20个或更少、15个或更少、10个或更少、5个或更少、3个或更少、2个或1个突变的氨基酸残基或核苷酸的参考序列的序列。例如，本文所述的变体可以包含相对于SEQ ID NO:1至9、11、14-20和22中的任一个具有20个或更少、15个或更少、10个或更少、5个或更少、3个或更少、2个或1个改变的氨基酸残基的氨基酸序列。一个或多个改变的残基优选在本文所述的VH或VL结构域序列的框架区中。例如，本文所述的VH或VL结构域序列的变体可以包含本文所公开的一组VHCDR 1-3和VLCDR1-3。本文所述的VH或VL结构域序列的变体可以例如在框架区中包含1、2、3或4个氨基酸取代。
参考序列中的氨基酸残基可以通过插入、缺失或取代来改变或突变，优选取代为不同的氨基酸残基。此类改变可由编码核酸中一个或多个核苷酸的添加、插入、缺失或取代中的一种或多种引起。
作为参考序列变体的如本文所述的蛋白或多核苷酸(如本文所述的VH或VL结构域序列)可以与参考氨基酸或多核苷酸序列共有至少50％序列同一性、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少约80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。例如，本文所述蛋白的变体可以包含与参考氨基酸序列具有至少50％序列同一性、与参考氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1至9或11中任一个)具有至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少约80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，VH或VL结构域序列的变体包含本文所公开的一组VHCDR 1-3和VLCDR 1-3：即，相对于参考序列的序列变异优选地发生在CDR外、在可变结构域的框架区中。
序列同一性通常参考算法GAP(Wisconsin GCG包,Accelerys Inc，圣地亚哥，USA)定义。GAP使用Needleman和Wunsch算法来比对两个完整序列，其将匹配数最大化，并将缺口数最小化。通常，使用默认参数，缺口产生罚分＝12，且缺口延伸罚分＝4。使用GAP可以是优选的，但可以使用其他算法，例如BLAST(其使用Altschul等人(1990)(Altschul等人，1990)的方法、FASTA(其使用Pearson和Lipman(Pearson和Lipman,1988)的方法)，或者Smith-Waterman算法(Smith和Waterman,1981)，或者TBLASTN程序(Altschul等人,1990)，同上，通常采用默认参数。特别地，可以使用psi-Blast算法(Altschul等人,1997)。还可以使用GenomequestTM软件(Gene-IT，马萨诸塞州伍斯特，USA)确定序列同一性和相似性。
优选在本文所述相关序列的全长上进行序列比较。
术语“免疫球蛋白”、“抗体分子”和“抗体”可互换使用，指包含具有特异性结合TDRP能力的抗体抗原结合位点的任何蛋白。
合适的抗TDRP抗体可以包括由Fulvio D'Acquisto教授根据布达佩斯条约(theBudapest Treaty)保藏于欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection ofAuthenticated Cell Cultures，ECACC)，且被称为BLP-1B10-G2的杂交瘤产生的抗体，或由Fulvio D'Acquisto教授保藏于ECACC，且被称为BLP-1C4-B7/F6-D3的杂交瘤产生的抗体。
适合于上述治疗的个体可以是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。
在一些优选实施方案中，个体是人。在其他优选的实施方案中，可以采用非人哺乳动物，特别是通常用作证明人类中治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠科动物、灵长类动物、猪、犬科动物或兔科动物)。
患有精神障碍的个体可以显示足以根据本领域已知的临床标准诊断精神障碍的至少一种可识别病征、症状或实验室发现。此类临床标准的实例可以在医学教科书中找到，诸如精神障碍的诊断和统计手册(The Diagnostic and Statistical Manual of MentalDisorders),第5版。在一些实施方案中，个体可能先前已经被鉴定或诊断为患有精神障碍，或者本发明的方法可以包括鉴定或诊断个体存在精神障碍、预测精神障碍或评估发生精神障碍的风险，例如通过如本文所述确定获自个体样品中TDRP的水平或量。
治疗可以是任何治疗或疗法，无论是对人还是动物(例如在兽医应用中)，其中实现了一些所期望的治疗效果，例如，抑制或延迟精神障碍的进展，并且包括降低进展速率、停止精神障碍速率、改善精神障碍或其一种或多种症状、治愈或缓解(部分或全部)精神障碍，或预防、延迟、减少或抑制精神障碍的一种或多种症状和/或病征。
治疗可以包括预防性治疗(即预防)，即被治疗的个体在治疗时可能没患有或可能没有被诊断为患有精神障碍。例如，对精神障碍易感或有发生或再次发生精神障碍风险的个体可以按本文所述进行治疗。此类治疗可以预防或延迟个体精神障碍的发生或再次发生，或在发生或再次发生后减轻其症状或严重程度。在一些实施方案中，个体可能先前已被鉴定为与一般群体相比具有增加的精神障碍易感性或风险，或者方法可以包括鉴定具有增加的精神障碍易感性或风险的个体。在一些实施方案中，预防性(Prophylactic/preventative)治疗可能以是优选的。
虽然TDRP拮抗剂可以单独施用，但优选将其作为药物组合物(例如制剂)呈现，其包含TDRP拮抗剂以及一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他物质，以及任选的其他治疗剂或预防剂。此类物质应该是无毒的，并且应该不会干扰活性化合物的功效。如下所述，载体或其他物质的确切性质将取决于施用途径，其可以是通过团注、输注、注射或任何其他合适的途径。合适的物质将是无菌和无热原的，具有合适的等渗性和稳定性。实例包括无菌盐水(例如0.9％NaCl)、水、右旋糖、甘油、乙醇等，或以上的组合。该组合物还可以包含辅助物质，诸如润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂等。
因此，本发明的方法可以包括将本文所述的TDRP拮抗剂与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起配制的步骤。在一些实施方案中，TDRP拮抗剂可以是药物组合物中的唯一活性成分。
如本文所用，术语“药学上可接受的”涉及化合物、物质、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适用于与对象(例如，人)的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。载体或其他物质的确切性质将取决于施用途径，其可以是任何非经口途径，例如通过注射，例如皮肤、皮下或静脉内的注射。
TDRP拮抗剂可以通过任何方便的施用途径施用对象，无论是全身/外周施用，包括但不限于肠胃外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内注射，优选皮下注射；通过例如皮内、皮下或肌内植入储库。优选地，静脉内(IV)、肌内(IM)或皮内(ID)施用TDRP拮抗剂。TDRP拮抗剂可以作为储库(例如皮内储库)注射施用。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位注射，TDRP拮抗剂将以胃肠外可接受的水溶液形式，所述水溶液无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物(如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸林格注射液)制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，其包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，其包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。可以在标准药物教科书(例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990)中找到合适的载体、赋形剂等。
药物组合物和制剂可以方便地以单位剂量形式呈现，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。此类方法包括使TDRP拮抗剂与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，通过使活性化合物与液体载体均匀且紧密地缔合来制备组合物。制剂可以例如是液体或溶液形式。
TDRP拮抗剂可以以治疗有效量如本文所述施用。“治疗有效量”是活性化合物或包含活性化合物的组合、物质、组合物或剂型的量，其有效产生一些所期望的治疗效果，与合理的益处/风险比相称。活性化合物的适当剂量可以因个体而异。确定最佳剂量将通常涉及治疗益处的水平对施用的任何风险或有害副作用的平衡。所选剂量水平将取决于多种因素，其包括但不限于施用途径、，施用时间，活性化合物的排泄速率，组合使用的其他药物、化合物和/或物质，以及个体的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史。活性化合物的量和施用途径最终由医生决定，尽管通常剂量将达到活性化合物的治疗性血浆浓度，而不会引起实质性的有害或有毒副作用。
一般而言，TDRP拮抗剂的合适剂量范围为每天对象每千克体重约100μg至约400mg，优选每天对象每千克体重200μg至约200mg，例如5-10mg/kg/天。当活性化合物是盐、酯、前药等时，施用量是基于母体化合物计算的，因此要使用的实际重量按比例增加。
包含活性化合物的药物组合物可以配制成适合预期施用途径的剂量单位制剂。
体内施用可以以一剂、连续或间歇(例如，以适当的间隔分开的剂量)进行。
确定最有效施用方式和剂量的方法是本领域公知的，并且会随着用于治疗的制剂、治疗目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以利用医生所选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
可以施用多剂量的TDRP抗抗剂，例如可以施用2、3、4、5剂或多于5剂剂量。TDRP抗抗剂的施用可以持续一段持续的时间。例如，用TDRP抗剂剂治疗可以持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或至少2个月。只要需要减轻精神障碍症状或实现完全缓解，就可以继续使用TDRP抗抗剂治疗。
TDRP拮抗剂可以单独施用或与其他治疗组合施用，根据个体情况同时或依次施用。例如，TDRP拮抗剂可以与一种或多种另外的活性化合物(例如免疫调节剂，如免疫抑制剂、抗精神病药物)或其他治疗剂组合施用。
在其他实施方案中，TDRP可用于筛选对精神障碍有治疗活性(例如抗焦虑活性)的化合物。通过筛选鉴定的化合物可用于开发治疗精神障碍的疗法。
筛选具有治疗(例如抗焦虑)活性的化合物的方法可以包括使测试化合物与分离的TDRP接触，并确定测试化合物与分离的TDRP的结合和/或测试化合物对分离的TDRP的中和，所述结合和/或中和指示测试化合物对精神障碍具有治疗活性。
在其他实施方案中，筛选对精神障碍有治疗活性(例如抗焦虑活性)的化合物的方法可以包括；
确定测试化合物对非人哺乳动物中TDRP表达、水平、量或浓度的影响，
TDRP表达、水平、量或浓度的降低指示该化合物具有抗焦虑活性。
鉴定为具有抗焦虑活性的测试化合物可用于开发精神障碍的疗法。
可以使用本文所述的方法筛选的测试化合物可以是用于药物筛选程序的天然或合成化学化合物。合适的化合物包括TDRP拮抗剂及其变体或衍生物。
使用一项或多项初始筛选鉴定为具有结合或中和TDRP能力的测试化合物可以使用一项或多项二级筛选进一步评估。二次筛选可能涉及体外和/或体内生物功能或活性的测试，例如，在动物模型中。例如，可以确定测试化合物在啮齿动物模型中减少焦虑相关行为的能力。
在鉴定结合或中和TDRP的测试化合物之后，化合物可以是分离的和/或纯化的，或者可替代地它可以使用化学合成的常规技术合成。可以对化合物进行修饰以优化其药物特性。这可以使用本领域公知的建模技术来完成。此外，它可以制造和/或用于制备，即制造或配制组合物。这可能在开发治疗精神障碍的疗法中用作TDRP拮抗剂。
本文的数据还显示，TDRP表达在T细胞激活过程中被上调。因此，TDRP可能是T细胞激活的有用生物标志物。确定样品中T细胞激活的方法可以包括；
确定样品中T细胞中TDRP的表达。
T细胞中TDRP相对于对照表达的增加可以指示T细胞被激活。
样品可以是T细胞(例如CD4+T细胞或CD8+T细胞)样品。
在一些实施方案中，可以确定获自个体T细胞样品中TDRP的表达。相对于未激活或静止的T细胞，T细胞样品中TDRP的表达增加可能指示来自个体的样品中存在激活的T细胞。
在其他实施方案中，可以确定表达高水平TDRP的T细胞样品中T细胞的量或比例。TDRP表达的高水平可以是不超过静息或非激活T细胞群中T细胞的20％的TDRP表达水平。表达高水平TDRP的样品中T细胞的量或比例增加可能指示样品中的T细胞被激活。
TDRP的表达可以使用标准技术确定。在一些实施方案中，TDRP的表达可以使用免疫学技术在蛋白水平确定，例如通过使样品与抗TDRP抗体接触。在其他实施方案中，可以使用Northern印迹或RT-qPCT技术在mRNA水平确定TDRP的表达。
如本文所述使用TDRP确定T细胞激活可用于例如评估个体中免疫系统激活的水平，例如用于诊断疾病病况。
本发明的其他方面和实施方案提供了术语“包含(comprising)”被术语“由……组成(consisting of)”代替的上文所述的方面和实施方案，以及术语“包含(comprising)”被术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”代替的上文所述的方面和实施方案。
应当理解，除非上下文另有要求，否则本申请公开了上述任何方面和上述实施方案彼此的所有组合。类似地，除非上下文另有要求，否则本申请单独或与任何其他方面一起公开了优选和/或任选特征的所有组合。
通过阅读本公开内容，上述实施方案的修改、其他实施方案及其修改对技术人员将变得显而易见，因此，这些都在本发明的范围内。
本说明书中提及的所有文件和序列数据库条目都通过引用整体并入本文中，用于所有目的。
本文所使用的“和/或”将被视为两个特定特征或组分中的每一个的具体公开，无论有或没有另一个。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就好像每一个在本文中被单独陈述一样。
实验
材料和方法
动物与饲养
在无特定病原体的条件下，每只笼子里将小鼠分成6只一组，并且可以自由获取食物和水。在测试前将小鼠圈养至少7天。从Charles River购买野生型C57BL/6小鼠。所有实验均在明暗循环的光照阶段进行，并且每天进行的测试不超过2次。所有测试均获得内政部(the Home Office)许可并根据1986年英国动物(科学程序)法(the UK Animals(Scientific Procedures)Act)进行。
为了监测转基因集落，使用REDExtract N-AMP–XNAT试剂盒(Sigma,UK)从耳夹中提取基因组DNA，并使用以下针对AnxA1tg的特异性引物通过PCR进行分析：正向引物5’-GTATGGAATCTCTCTTTGCCAAGC-3’；反向引物为5’-ACHGATATGCACATCAGGAGGG-3’(ThermoScientific,UK)。PCR反应的参数是：94℃初始变性3min，然后是30个循环的94℃变性45秒、60℃退火45秒和72℃延伸15秒时间，然后最后一步72℃延伸7min。
流式细胞术分析
将胸腺细胞和淋巴细胞在100μl FACS缓冲液(含5％胎牛血清和0.02％NaN2的磷酸盐缓冲盐水)中染色。使用的抗体是抗CD3藻红蛋白(克隆145-2C11)、抗CD4异硫氰酸荧光素(克隆GK 1.5)、抗CD8 Cy5(克隆53-6.7)(均来自eBioscience,圣地亚哥，CA,USA)。如先前所述，将细胞用适当浓度的缀合抗体在4℃标记1h。标记后，洗涤细胞并使用FACScalibur流式细胞仪进行分析。使用FlowJoTM软件(Tree Star,Ashland,OR,USA,OregonCorporation)分析结果。
T细胞激活测定
将淋巴结T细胞(1x105个细胞//200μl)在96孔板中单独用培养基孵育或通过板结合的抗CD3和抗CD28刺激24小时。如图中所示的，对于CD25和CD69的上调，将淋巴结T细胞用板结合的抗CD3和抗CD28刺激。16小时后，将细胞用在FACS缓冲液(含1％FCS和0.02％NaN2的PBS)中稀释的PE缀合的抗CD69(克隆H1.2F3)和FITC缀合的抗CD25(克隆PC61.5)染色。通过使用前向和侧向散射对完整细胞进行门控，并使用FlowJoTM软件(Tree Star,Ashland,OR,USA,Oregon Corporation)进行分析。使用标准ELISA试剂盒并根据制造商的说明书(eBioscience)，在刺激24或48小时后测量IL-2的产生。
细胞内染色和细胞计数珠测定
通过细胞内染色研究Th细胞表型。淋巴细胞是从来自外周淋巴器官和脊髓的MOG35-55免疫小鼠中分离出来的。来自淋巴结和脾脏的淋巴细胞(10x106个细胞/ml)用单独的培养基(CTRL)或抗CD3和抗CD28抗体(1μg/ml；板结合的)或特异性抗原MOG35-55(100μg/ml)培养72小时。第三天，将细胞沉淀，并将上清液储存在-20℃。随后，在存在蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素A(1:1000；eBioscience)的情况下，将细胞用伴刀豆球蛋白A(ConA,5μg/ml；Sigma)重新挑战4小时。相反，将从脊髓分离的单核细胞在收集后直接用ConA和布雷菲德菌素A触发。
将细胞沉淀，然后对CD4(1:500)染色半小时，并用1％PFA固定10分钟。此后，将细胞在透化缓冲液(由PBS中的0.1％皂苷和009％叠氮化钠组成，eBioscience)中透化和染色30min，所述透化缓冲液含有细胞因子(如IFNγ、IL-17、GM-CSF和IL-10)的缀合抗体(稀释：1:250)(详见表6)。最后，将细胞洗涤并悬浮在FACS缓冲液中用于流式细胞仪分析。
细胞计数珠测定
通过流式细胞术中基于珠子的分析测定测量细胞因子的产生。我们使用了小鼠Th1/Th2 10plex和定制设计的小鼠Th1/Th2/Th17/Th22 13plex试剂盒(eBioscience)。前者包含针对GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17和TNFα的抗体结合珠，而后者包含针对IFNγ、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、Il-27和TNFα的抗体结合珠，并且其补充有针对GM-SCF和IL-23的抗体结合珠。将每个样品(25μl细胞培养上清液)与50μl珠子混合物和50μl与生物素缀合的抗体混合物一起孵育2h。两次洗涤后，加入链霉亲和素PE缀合的抗体(图2.11)，并将样品在黑暗中振荡1小时。最后，将样品洗涤并在4℃下储存过夜。同时制备和处理连续稀释7倍的标准品。表2.3显示了用于BD LSR Fortessa分析的参数。
过继转移
按照制造商的说明书(Dynabeads未接触的小鼠CD3细胞和Dynabeads未接触的小鼠CD4细胞；Invitrogen,Invitrogen Life Technologies Ltd,Paisley,UK)，通过阴性选择从雄性野生型或AnxA1tg小鼠(6周龄)获得纯化的CD4+T细胞。通过荧光激活的细胞分选仪测试纯度，并且为>98％。通过在麻醉下进行的心内穿刺收集来自相同动物的血液。通过离心(8000rpm，5分钟)从凝结的血液中获得血浆，并在4℃下储存直至注射。将新鲜分离的血浆和重悬在磷酸盐缓冲盐水(2x106/300l)中的细胞通过腹膜内注射转移到受体雄性C57BL/6小鼠(6周龄)中。
组织学
将完整的脊髓首先在4％多聚甲醛中固定72h，然后在石蜡包埋前用含有EDTA(0.1mM，于PBS中)的脱钙溶液孵育14天。将组织切片(5μm)用二甲苯脱蜡，并通过我们的内部组织学设施用苏木精和伊红(H&E)染色。根据疾病严重程度，对在不同时间点采集的石蜡包埋切片进行组织学评估。在所有情况下，每只动物至少评估三个切片。使用Image Image-Pro(Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)分析软件包采集相衬数字图像。
MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎
如先前报道的，雄性C57BL/6小鼠在第0天和第2天接受皮内注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的MOG35-55(300g)和两剂百日咳毒素(PTX)。疾病的严重程度按0到6的等级评分，0＝没有神经系统病征，1＝尾巴无力，2＝尾巴麻痹，3＝失去翻正反射(在以其背部放置后，小鼠再也不能自己翻身)，4＝后腿麻痹，5＝四肢瘫痪和6＝死亡。
从中枢神经系统分离白细胞
从腰椎到颈椎区解剖脊柱，并在PBS中洗涤数次以去除血液痕迹。通过使用2ml注射器和19号针头通过椎管内的水压提取脊髓。随后，在无菌PBS中通过机械压力通过70μm网状细胞过滤器(Falcon)撕开组织。在Percoll(GE Healthcare)中通过密度梯度离心分离单核细胞和淋巴细胞。详细地，将细胞以400xg沉淀5min并悬浮在30％Percoll溶液中。将30％Percoll溶液以1:2的比例小心地铺在70％Percoll溶液上，并以500xg离心30min。以该密度梯度，单核细胞沉积在30％和70％Percoll层之间的界面处。小心去除离心管顶部的脂肪层后，大约收集到2-3ml的界面溶液。将纯化的单核细胞在补充有100U/ml青霉素和链霉素以及10％FCS(Invitrogen)的RPMI中洗涤两次。
姥鲛烷诱导的狼疮
野生型或AnxA1tg雄性小鼠接受单次0.5ml i.p.注射无菌姥鲛烷(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)。每隔一天或每3天记录一次体重，持续超过5周。在一些实验中，小鼠在2周后被淘汰，并用PBS/EDTA收集腹膜灌洗液，以测量炎性细胞因子的水平，并如先前所述分析募集的激活T细胞的表型。
挖掘和弹珠掩埋测试
如先前所述进行弹珠掩埋和挖掘测试，但进行了一些修改。简而言之，将小鼠单独放置在装有约5-cm深的木屑垫料的透明塑料盒(14cm×10cm×11cm)中，轻轻按压以提供平坦表面。对所有小鼠使用相同的垫料物质并在每次测试后压平。将15颗玻璃弹珠以五排的每排三个弹珠的形式放置在表面上。在15-min的测试过程中记录了开始挖掘的延迟、挖掘回合数和埋藏的弹珠的数量(至其深度的2/3)。进行了两次试验，第二次试验在第一次试验后24小时进行。
攀爬活性测试
攀爬测试用于评估垂直活动和探索性行为。如先前所述进行测试，但进行了一些修改。简而言之，将小鼠一次一只放在实验室工作台上的一层薄薄的新鲜木屑垫料上，并用圆柱形攀爬网(60cm630 cm底部直径)覆盖。它们中的每只都被观察并记录了5分钟。评估攀爬事件数和攀爬活动的总持续时间。攀爬的标准是一只老鼠的所有4只脚都在金属丝网上，而只要一只脚接触到工作台，攀爬就终止了。这项测试是在下午晚些时候进行的，已知此时小鼠更活跃。
光暗穿梭箱
在该测试中，探索活动反映了危害和风险规避的结合[44]。该装置由一个45cm620cm621cm盒子组成，分为两个不同的隔室：三分之一(15cm长)漆成黑色，顶部有一个黑色盖子，其余三分之二漆成白色且未覆盖。一个2.5cm62.5cm的开口连接了两个隔室。明亮盒子的一侧是透明的，以能够进行行为评估，并且通过放置在盒子地板中心上方45cm处的50W灯提供的额外照明，增加了这个隔室的厌恶感。测试是根据先前公布的方案进行的。每只小鼠都被放置在明亮的隔室中，背对开口并允许探索盒子5分钟。因变量包括在光照区花费的时间、穿越到暗区的延迟(所有四个爪子都在)以及隔室之间的转换总数。每次试验后清洁设备。
旷场活动测试
如前所述进行了旷场测试，但进行了一些修改。旷场由白色PVC场地(50cm×30cm)组成，分成10cm×10cm的方格。测试前15min将小鼠带入实验室。将每只小鼠置于一个面向墙壁的角方格中，观察并记录5min。记录穿越的方格总数、到第一只后腿直立的延迟和后腿直立的总数。每次测试后，都会用水清洗场地以减弱和均质化嗅觉痕迹。进行了两次试验，第二次试验在第一次试验完成后24h进行。
微阵列分析
使用RNeasy微阵列组织微型试剂盒(Qiagen,West Sussex,UK)从野生型和AnxA1tg小鼠的大脑中提取总RNA，而对于纯化的CD4+T细胞，我们使用来自同一制造商的RNeasy微型试剂盒。使用基因芯片射流工作站450(GeneChip Fluidics Station 450)，使用标准Affymetrix方案，将总RNA与UCL Genomics(London,UK)的Affymetrix小鼠基因1.0ST阵列芯片杂交，并使用Affymetrix基因芯片扫描仪(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)进行扫描。数据通过Bioconductor包affy的rma进行标准化。考虑到错误发现率(调整后的P值为o0.05)，通过Bioconductor包limma鉴定差异表达的基因。通过典范对应分析法制作基因和样品评分系统。典范对应分析是对应分析的变型，其中将主要数据线性回归到解释变量(环境变量)上，然后通过对应分析对回归数据进行分析。在这项研究中，我们将整个数据集回归到一个解释变量上，该变量被定义为“平均”野生型和“平均”AnxA1tg之间的差异。详细的方法学在别处描述。通过比较野生型和AnxA1tg，使用Bioconductor包SPIA进行信号传导通路影响分析。
实时聚合酶链式反应
根据制造商的方案，利用RNeasy微阵列组织微型试剂盒(Qiagen)从全脑中提取总RNA(每个小鼠品系n 1/4 6)，并使用2mg寡聚(dT)15引物、10U AMV逆转录酶、40U RNA酶抑制剂(均来自Promega Corporation,Madison,WI，USA)和1.25mM每种dNTP(Bioline,伦敦，UK)，在42 1C下逆转录45min。通过使用ABsoluteTM QPCR ROX混合物(Thermo Scientific,Epsom,UK)和荧光QuantiTect引物进行实时聚合酶链式反应。循环条件根据制造商的说明书设定。通过7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems,Warrington,Cheshire,UK)检测序列特异性荧光信号。将mRNA数据相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶标准化，然后用于计算表达水平。我们使用比较Ct方法来测量样品中的基因转录。结果表示为基于2DDCt计算的相对单位，其给出了标准化为内源对照(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的基因的相对量，并且具有最低表达的样品设定为1。
根据Chomczynski和Sacchi(1987)的方法，还从OCD对象和健康对照的PBMC中分离了总RNA。使用RevertAid H第一负链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行RT-PCR反应。在DNA Engine Opticon 2连续荧光检测系统(MJ Research,沃尔瑟姆,MA,USA)上使用iQ SYBR Green Supermix(Hercules,CA,USA)通过RT-qPCR评估相对丰度。为了提供每个PCR反应中初始靶标的精确定量，检查了扩增图，并通过指定高于背景的荧光阈值来定义产物积累的早期对数期点，定义为阈值循环数或Ct。阈值循环数的差异被用于量化每个管内包含的PCR靶标的相对量。PCR后，在60-95℃范围内构建解离曲线(熔解曲线)以评估扩增产物的特异性。不同扩增子的相对表达量通过ΔΔCt方法计算，并转换为相对表达量比(2-ΔΔCt)，以进行统计分析。所有人类数据均标准化为组合的内源性参考基因β-肌动蛋白和GAPDH。
蛋白质印迹分析
如图所示刺激淋巴结和脾脏T细胞或纯化的CD4+T细胞。在37℃下孵育后，将细胞在冰冷的裂解缓冲液(1％NP-40、20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.5mM PMSF、1μM抑酞酶、1μM亮抑酶肽、1μM胃酶抑素、50mM NaF、1mM NaVO4、1mMμ-甘油磷酸盐)中裂解，同时收集上清液并储存在-20℃。为了免疫沉淀细胞外释放的Immuno-moodulin，将5μl兔多克隆抗2610019F03Rik抗体(Origene,USA)和35μl蛋白A/G琼脂糖珠加入到500μl获自用板结合的抗CD3/CD28(0.5μg/ml)刺激24或48hr的1x107/ml T细胞的培养上清液中。将样品在4℃、连续旋转下孵育过夜，然后用PBS洗涤。将裂解物和免疫沉淀物用热的6X样品缓冲液变性，并在SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶(Novagen)上进行电泳。随后转移到PVDF膜上后，将它们与在含有吐温-20和5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水溶液(TTBS：130mMNaCl；2.68mM KCl；19mM Tris-HCl；0.001％v/v吐温-20，pH 7.4)中稀释的抗体一起在4℃下孵育过夜。根据制造商的说明书，通过增强化学发光(ECL；Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)对蛋白进行免疫印迹和可视化。
T细胞特异性AnxA1tg小鼠的产生
为了产生VACD2 Anx-A1 FLAG转基因小鼠，提取、扩增鼠Anx-A1基因并用FLAG表位标记。将基因克隆到TOPO pcDNA3.1载体中以验证其体外表达，并最后亚克隆到VACD2载体中用于小鼠中的T细胞特异性表达。最后，对VACD2 Anx-A1 FLAG构建体进行了修饰和纯化，以用于原核显微注射到小鼠基因组中。
对象
该研究包括在米兰大学精神病学系(the University Department ofPsychiatry of Milan)、Policlinico医院的OCD三级门诊诊所接受治疗和随访的20名任何性别和任何年龄的OCD门诊患者。通过基于DSM-5标准(SCID 5研究版本，RV)施用的半结构化访谈评估诊断。在精神共病的情况下，OCD必须是原发病症，其导致最严重的忧虑和功能障碍，并提供寻求治疗的主要动机。如果患者最近或目前有酗酒或药物滥用(过去3个月)，以及包括自身免疫性疾病在内的医疗病况，由于它们对基因表达的潜在影响，这些患者被排除在研究之外。出于同样的原因，终生创伤史(根据DSM-5)以及相关心理压力的当前存在被视为排除标准。临床评估包括收集以下人口统计数据和临床变量：性别、年龄、发病年龄和当前的药物治疗。另外，疾病严重程度是通过耶鲁-布朗强迫症量表来衡量的。患者已将其药物治疗保持稳定至少一个月，以便参加研究。对照对象(n＝20)是性别、年龄和种族匹配的志愿者，没有通过SCID 5确定的精神病诊断，并且一级亲属中没有重大精神疾病的阳性家族史(如通过遗传学研究的家庭访谈评估)。所有对象均已书面知情同意参与该研究，其中包括使用个人和临床数据以及用于基因分型和甲基化分析的抽血。该研究方案先前已获得当地伦理委员会的批准。
结果
T细胞特异性AnxA1tg小鼠的产生和表型表征
我们通过在129只FVB小鼠中原核注射VACD2 Anx-A1 FLAG构建体产生了T细胞特异性转基因小鼠。两位创始者和它们的幼崽都没有明显的疾病病征。在回交到C57BL/6背景上并杂交以产生在两个等位基因上都具有转基因的小鼠后，我们注意到来自两个转基因创始者之一的雌性幼崽表现出异常高的母系同类相食发生率(近80％)。这通过在怀孕期间施用奋乃静成功控制，因为之前已经报道了其他易发生自身免疫和高度焦虑的小鼠品系，诸如DBA/2J34。该品系的新生幼崽由寄养C57BL/6母亲抚养，以避免失去群体。尽管做出了这些努力，我们仍然难以维持这个群体，并因此将它终止了。对来自另一创始者的AnxA1tg小鼠免疫库的分析表明，所有淋巴器官中对CD4+或CD8+细胞的谱系投入没有显著差异。相反，与对照相比，总细胞数显示，AnxA1tg小鼠淋巴结中的总细胞计数选择性增加(约60％)，但脾脏和胸腺没有。
AnxA1tg小鼠中增加的T细胞激活和自身免疫性
与我们之前的报告一致22,23,25,26，如通过CD25和CD69上调的较低阈值(图1A)和抗CD3加CD28刺激后IL-2的产生增加所证明的(图1B)，AnxA1tg T细胞显示出明显的促炎表型。如与野生型相比，通过临床评分的严重程度加剧和疾病发作后(第12天)体重减轻增加以及AnxA1tg小鼠脊髓更大的炎症浸润所证明的，在体内，AnxA1tg小鼠在MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中表现出加重的炎症反应(图1C)。在对照和AnxA1tg小鼠之间的疾病发生率方面没有观察到差异(图1C中的表)。为了在另一种自身免疫性炎症模型中扩展和证实这些发现，我们对AnxA1tg小鼠进行了系统性红斑狼疮的实验模型35。如图1D(右图)所示，在35天的时间内，向AnxA1tg小鼠注射姥鲛烷引起了显著的体重减轻，而对照小鼠在同一时期增加了其初始体重的约30％。与这些结果一致，～30％的AnxA1tg小鼠在35天处理期间死亡，而对照动物则显示100％存活(图D；左图)。
AnxA1tg小鼠炎症组织中Th1/Th17双阳性细胞的选择性积累
为了进一步检查EAE小鼠中AnxA1tg T细胞的激活状态，我们研究了这些细胞在第9天(疾病发作)和第16天(疾病高峰)的效应表型。这使我们能够区分AnxA1在第9天在引流淋巴结中发生的启动阶段或第16天在脊髓内发生的分化阶段期间AnxA1过表达的影响36。对照和AnxA1tg小鼠引流淋巴结的第9天比较表明，后一组中CD4+T细胞数量显著增加(约85％)，但IL-17+/IFN-γ+或IL-17+/GM-CSF+双阳性或单阳性T细胞的百分比无差异。在第16天，与对照相比，AnxA1tg中从脊髓中回收的CD4+T细胞数量高～3倍，但在这种情况下，我们观察到与后者相比，前者中IFN-γ+/IL-17+或GM-CSF+/IL-17+致病性37双阳性T细胞增加。在这种自身免疫性炎症模型中对Th17细胞进行的命运映射报告研究已表明，这些双阳性细胞代表了在炎症部位IL-17单阳性‘转变’为IFN-γ或GM-CSF双阳性T细胞期间的过渡阶段38。与这些发现一致，AnxA1tg小鼠显示出更高的IL-17+细胞百分比和相应降低的IFN-γ(AnxA1tg中约10％相对于对照中18％)和GM-CSF(AnxA1tg中约16％相对于对照中20％)单阳性细胞百分比。
AnxA1tg小鼠中增加的基础焦虑样行为
直接观察它们笼子里的AnxA1tg小鼠揭示了行为改变，其特征是强迫挖掘的倾向增加(比较影片1，野生型小鼠和影片2，AnxA1tg小鼠)。为了彻底测量这种高度焦虑的行为，我们使用了一系列经典的焦虑行为测试。弹珠埋藏测试被用于测量挖掘39，并且当应用于AnxA1tg时，我们量化了小鼠埋藏弹珠数量的显著增加，其花费的时间大约是其活动的两倍(图2A)。在明暗穿梭箱测试40中，相比野生型配对物，AnxA1tg小鼠在亮照区域中花在两个隔室之间的穿越数量明显减少(图2B)。在攀爬测试41中也观察到显著的行为差异：AnxA1tg小鼠显示出第一次攀爬的延迟增加，并且在此行动上花费的时间显著减少(图2C)。所有这些变化都不是自发活动普遍受损的继发性，因为与野生型动物相比时，AnxA1tg小鼠如在旷场测试42中定量的在i)方格穿越或ii)后腿直立的数量上没有差异(图2D)。
AnxA1tg全脑的基因指纹图谱揭示焦虑相关基因表达增加
CD4+T细胞通过多种机制(包括对大脑内基因的直接影响45)，对焦虑样行为施加稳态控制43,44。我们质疑AnxA1tg小鼠是否也是这种情况，并使用微阵列分析对全脑的基因表达谱进行比较分析。结果显示，与WT小鼠的那些相比，AnxA1tg小鼠全脑中15个基因的表达水平存在显著差异，其中8个未受调节，且7个被下调。其中，几种与情绪障碍(包括酗酒和焦虑症)有关，诸如红细胞分化调控因子(Erdr1)46和γ-氨基丁酸受体亚基α-2(Gabra2)47。在大量样品上的这些基因的RT-PCR分析证实了这些结果，Erdr1下调约78％，且Gabra 2上调～3倍。因此，转基因T细胞可以对大脑中的一组离散基因施加强直调控，即使在没有任何实验操作的情况下。
C57BL/6小鼠中AnxA1tg CD4+T细胞的过继转移增加了它们的焦虑样行为
为了确定CD4+T细胞中AnxA1过表达与焦虑表型之间的因果关系，我们产生了嵌合小鼠，其中对照C57BL/6或AnxA1tg CD4+T细胞被过继转移到C57BL/6宿主中。只有接受AnxA1tg CD4+T细胞的小鼠，而不是那些接受对照C57BL/6CD4+T细胞的小鼠，表现出焦虑样行为的时间依赖性增加。最有趣的是，行为的早期变化在转移后第1周是可测量的(数据未显示)，但在第3周变得显著，这表明循环中这些细胞的持续存在，或它们可能产生的持续释放因子，可能是焦虑增加的原因。
为了解决这个问题，我们通过微阵列比较了纯化的CD4+T细胞的基因表达谱。在静息条件下，AnxA1tg和对照CD4+T细胞之间没有观察到统计学差异(数据未显示)。然而，在抗CD3加抗CD28刺激的细胞中，鉴定出8个基因受到显著调节。在那些上调基因中，AnxA1、干扰素可诱导的203和2610019F03Rik(也被称为睾丸发育相关蛋白，Tdrp)。我们对最后一种很感兴趣，因为它编码了一种约21kDa的小蛋白(像大多数细胞因子一样)，这种蛋白被分泌并存在于循环中，因此决定研究它的功能。当我们在T细胞中鉴定出该基因并假设它是引起AnxA1tg小鼠的焦虑行为表型的原因时，我们将其命名为Immuno-moodulin(Imood)。
AnxA1tg CD4+T细胞表达高水平的被称为Immuno-moodulin的新的基因焦虑因子
接下来，我们首先使用市售的针对Imood的多克隆抗体，使用CD4+T细胞的免疫印迹和FACS细胞内染色验证微阵列结果。结果一致显示，与野生型相比，AnxA1tg中Imood mRNA和蛋白的表达显著增加(分别为图3A、B和C)。
我们首先研究了来自非转基因C57BL/6小鼠的静息或激活T细胞中的Imood表达。在基础条件下，约20％的细胞表达高水平的Imood。在触发信号1(抗CD3)和信号2(抗CD28)两者后，CD4+T细胞经由TCR激活导致这些细胞数量明显增加，其数量加倍(44％)(图7A)。当我们比较静息野生型和AnxA1tg CD4+T细胞中Imood的表达时(图7B)，可能看到与野生型相比，AnxA1tg小鼠中Imood高细胞的百分比(AnxA1tg中的约55％相对于野生型中的35％)和它们的中值荧光强度(AnxA1tg中的约15相对于野生型中的7)增加。这些差异逐渐减弱，但在用抗CD3/CD28激活后仍然可见：约80％的AnxA1tg细胞表达Imood，中值荧光强度为26，而约70％的野生型细胞显示18的中值。这些结果在mRNA水平得到证实，其中可以观察到用抗CD3/CD28激活T细胞后Imood mRNA上调，以及与野生型相比，在静息和刺激条件下AnxA1tg表达增加(图7C)。我们通过蛋白质印迹证实了这些发现。与对照相比，静息AnxA1tg CD4+ T细胞显示出细胞内Imood水平增加(图3C)。另外，来自静息和激活条件下的野生型和AnxA1tg T细胞的细胞上清液的Imood的免疫沉淀显示AnxA1tg T细胞中这种蛋白的分泌增加(图7D)。
为了探索Imood在调控焦虑行为中的可能作用，我们将该基因的重组产物施用到野生型C57BL/6小鼠中。在随后的所有实验中，我们使用明暗穿梭箱作为方便的筛选测试，因为这表明AnxA1tg与WT小鼠之间的差异最大。如图3D中所示，注射完整蛋白(r-Imood)而非变性蛋白(95℃，5min)(d-Imood)或PBS的小鼠表现出焦虑样行为的显著增加。与过继转移实验中观察到的类似，这种变化不会在施用后数小时内发生，但在注射后第3天开始变得明显，并在第7天变得非常显著。为了证实Imood确实是导致AnxA1tg小鼠焦虑样行为增加的原因，我们向这些小鼠施用了商业多克隆抗体和对照血清。我们还向野生型C57BL/6施用了相同剂量的抗体和对照血清，以测试其在对照组小鼠中的效果。如图5所示，只有接受多克隆抗Imood抗体的AnxA1tg小鼠，而不是那些接受对照血清的小鼠，显示出在光照下的时间(～249％；p<0.001)和穿越次数(～194％；p<0.001)的显著增加。有趣的是，在野生型C57BL/6小鼠中施用相同的抗体也会导致光照下时间(～24％；p<0.05)和穿越次数(～76％；p<0.01)的显著增加，这表明可能存在内源性的Imood水平，其可以调控小鼠的基础焦虑行为。
为了进一步验证我们的假设并提高作用的特异性，我们使用基因免疫48生成了针对Imood的单克隆抗体(图6)。与之前的数据一致，与IgG对照相比，向AnxA1tg施用高度选择性纯化的单克隆抗Imood抗体1B10或1C4显著增加了穿越次数(对于1C4，～123％，p<0.01；对于1B10，～178％，p<0.001)和光照下时间(对于1C4，～208％，p<0.01；对于1B10，～396％，p<0.001)。因此，抗Immod疗法将AnxA1tg的表型拯救回野生型小鼠的表型。
与我们观察到的多克隆抗体相似，施用1B10和1C4的C57BL6对照小鼠显示在光照下的时间(对于1C4，～75％，p<0.01；对于1B10，～86％，p<0.001)和穿越次数(对于1C4，～41％，p<0.05；对于1B10，～68％，p<0.001)的显著增加。总的来说，这些数据揭示了Imood作为治疗小鼠焦虑行为的治疗策略的创新靶标(图4A)。
OCD患者中Imood表达增加
最后，我们搜索了人类中的Imood表达。为此，我们对获自获自被诊断患有强迫症的20名患者和20名健康对照的PBMC的cDNA样品进行了初步回顾性筛选。如图4B中所示的，Imood表达明显高于对照(大约6倍)。
越来越多的研究支持这种假设，即情绪障碍可由植根于免疫系统中的细胞和生化事件驱动10,49,50。缺乏治疗心理健康问题的新治疗机会是非常热门的话题，并且我们推断详细研究将免疫系统与行为反应联系起来的机制可以指导新疗法的开发。因此，本研究为神经免疫轴上存在复杂的串扰网络提供了进一步的证据，并表明由T细胞产生的新的因子对焦虑样行为具有强大的调节作用。
我们推断存在新的机制和可能未鉴定的因子，同时注意到小鼠的行为表型，其中单一异常是T细胞中AnxA1的更高表达。这种转基因工具的产生是为了进一步研究这种中介物对适应性免疫反应的特定性质16,25,26。回顾起来，我们的新的观察结果与AnxA1可以调控精神障碍的新观点一致。AnxA1的全基因组关联研究搜索(GWAS中心，www.gwascentral.org)报告了约62项关于这种蛋白的研究，其中其中许多研究与精神障碍有关。事实上，报告显示AnxA1基因重复与自闭症51或AnxA1基因中的单核苷酸多态性以及精神分裂症52、躁郁症或抑郁症53之间存在显著关联。最有趣的是，所有这些病况通常都与免疫功能障碍或炎症有关54-56。
此外，AnxA1是甲酰肽受体(FPR)的配体57-60。这些先天免疫系统的原型传感器最初被鉴定为用于捕获细菌病原体释放的甲酰肽的细胞天线61-64。有趣的是，研究表明，这些受体有不止一种方式来帮助宿主感知危险。它们在嗅觉系统中的表达使小鼠能够“感知”感染相关嗅觉线索的存在，从而使动物远离感染源65-67。其他证据线支持FPR在调控行为方面的作用。对FPR1和FPR2/ALX受体的基因敲除小鼠的研究显示显著的焦虑减少68,69，例如，AnxA1tg小鼠的相反表型。总之，FPR可能代表信号分子的原型，它在细胞和物理水平上影响宿主的行为，其最终目标是保护宿主免受外部环境的挑战70。
过继转移实验表明受体小鼠显示焦虑样行为显著增加的延迟。利用重组Imood也观察到类似的延迟反应，这表明在这两种情况下，与焦虑相关的基因表达的下游调控，而不是直接影响大脑中神经递质的作用。
利用AnxA1tg细胞或在施用Imood后，对焦虑的调节作用出现的时间滞后效应，与用于治疗抑郁症和焦虑症的经典药物对于其临床功效变得明显呈现5-7天的发作延迟71的观点产生了很好的共鸣。最近的研究提出延迟发作可能与免疫系统响应和/或适应这些药物的施用所需的时间有关的观点72，加强了免疫系统经由对情绪具有直接影响基因表达的稳态控制来调控情绪状态的假设。
作为精神障碍的新型调谐器，Imood可能是一种具有预后和诊断价值的新型生物标志物，使患者能够对正确的精神障碍(例如与免疫成分相关的精神障碍)进行分层，或鉴定正确的患者亚组以进行特定的药物治疗。因此，对于那些Imood表达量较高的人来说，利用免疫调节剂和Imood中和抗体(如1B10)的组合疗法可能会提供独特的机会来实现“身心健康”。沿着这些思路，鉴定情绪行为的蛋白调节因子和调节其水平的生物疗法的可用性将代表精神障碍治疗向前迈出的重要一步。事实上，用于治疗精神障碍的生物制剂将绕过与精神障碍日常施用的标准治疗相关的几种副作用73-75，因为它会专门作用于免疫系统的水平而不是CNS。
参考文献
1.Khandaker GM,Dantzer R,Jones PB.Psychol Med 2017；47(13):2229-2237.
2.Coutinho E,Vincent A.Handb Clin Neurol 2016；133:269-282.
3.Feinstein A,Pavisian B.Mult Scler 2017；23(7):923-927.
4.Pompili M et al..J Psychosom Res 2012；73(6):411-417.
5.Butt AA,Evans R,Skanderson M,Shakil AO.J Hepatol 2006；44(5):864-868.
6.Cournos F,McKinnon K,Sullivan G.J Clin Psychiatry 2005；66Suppl 6:27-33.
7.Bosche K,et al..Neuropharmacology 2015；96(Pt A):83-93.
8.Goeb JL,Even C,Nicolas G,Gohier B,Dubas F,Garre JB.Eur Psychiatry2006；21(3):186-193.
9.Marin IA,Kipnis J.Neuropsychopharmacology 2017；42(1):28-35.
10.Dantzer R.Physiol Rev 2018；98(1):477-504.
11.Sheikh MH,Solito E.Annexin A1:Int J Mol Sci 2018；19(4).
12.Leoni G,Nusrat A Biol Chem 2016；397(10):971-979.
13.Qin C,Yang YH,May L,Gao X,Stewart AG,Tu Y et al..Pharmacol Ther2015；148:47-65.
14.Perretti M,D'Acquisto F.Nat Rev Immunol 2009；9(1):62-70.
15.Bruschi M,Petretto A,Vaglio A,Santucci L,Candiano G,GhiggeriGM.Int J Mol Sci 2018；19(5).
16.D'Acquisto F.Curr Opin Pharmacol 2009；9(4):521-528.
17.Moraes LA,Ampomah PB,Lim LHK.Cell Adh Migr 2018:1-7.
18.Boudhraa Z,Bouchon B,Viallard C,D'Incan M,Degoul F.Clin Sci(Lond)2016；130(4):205-220.
19.Biaoxue R,Xiguang C,Shuanying Y.Int J Biol Markers 2014；29(1):e8-20.
20.Guo C,Liu S,Sun MZ.Future Oncol 2013；9(11):1773-1793.
21.D'Acquisto F,Piras G,Rattazzi L.Biochem Pharmacol 2013；85(9):1213-1218.
22.Paschalidis N,et al.R.Cell Cycle 2010；9(4):784-793.
23.Paschalidis N.J Neuroinflammation 2009；6:33.
24.Huggins A et al FASEB J 2009；23(4):985-996.
25.D'Acquisto F,et al Eur J Immunol 2007；37(11):3131-3142.
26.D'Acquisto F et al Blood 2007；109(3):1095-1102.
27.Huang P,Zhou Y,Liu Z,Zhang P.Mediators Inflamm 2016；2016:1701059.
28.Mihaylova N,et al.Autoimmunity 2017；50(4):257-268.
29.Tzelepis F et al J Clin Invest 2015；125(2):752-768.
30.Sena AA et al Sci Rep 2016；6:31157.
31.Odobasic D et al Int Immunopharmacol 2018；61:140-149.
32.Yazid S et al J Autoimmun 2015；58:1-11.
33.Yang YH et al J Immunol 2013；190(3):997-1007.
34.Carter DB,Kennett MJ,Franklin CL.Comp Med 2002；52(5):452-455.
35.Reeves WH et al Trends Immunol 2009；30(9):455-464.
36.Rossi B,Front Immunol 2016；7:506.
37.DuPage M,Bluestone JA.Nat Rev Immunol 2016；16(3):149-163.
38.Hirota K et al Nat Immunol 2011；12(3):255-263.
39.Taylor GT et al mice.Acta Neurobiol Exp(Wars)2017；77(3):254-260.
40.Bourin M,Hascoet M.Eur J Pharmacol 2003；463(1-3):55-65.
41.Deacon RM,Rawlins JN.Behav Brain Res 2005；156(2):241-249.
42.Brooks SP,Dunnett SB.Nat Rev Neurosci 2009；10(7):519-529.
43.Filiano AJ,et al Nature 2016；535(7612):425-429.
44.Brachman RA,et al J Neurosci 2015；35(4):1530-1538.
45.Rattazzi L et al Transl Psychiatry 2013；3:e280.
46.Hovatta I et al.Nature 2005；438(7068):662-666.
47.Engin E et al Pharmacol Ther 2012；136(2):142-152.
48.Bates MK et al Biotechniques 2006；40(2):199-208.
49.Miller AH,Haroon E,Felger JC Neuropsychopharmacology 2017；42(1):334-359.
50.Haroon E,Raison CL,Miller AH.Neuropsychopharmacology 2012；37(1):137-162.
51.Correia CT et al Mol Autism 2014；5(1):28.
52.Clark D et al Mol Psychiatry 2006；11(5):459-470,423.
53.Huang J et al.Am J Psychiatry 2010；167(10):1254-1263.
54.Severance EG et al Pharmacol Ther 2018；189:184-198.
55.Prata J et al J Neuroinflammation 2017；14(1):179.
56.Muller N.Dialogues Clin Neurosci 2017；19(1):55-63.
57.Cooray SN et al Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110(45):18232-18237.
58.Bena S et al J Biol Chem 2012；287(29):24690-24697.
59.Pederzoli-Ribeil M et al Blood 2010；116(20):4288-4296.
60.Gastardelo TS et al.Am J Pathol 2009；174(1):177-183.
61.Winther M et al Basic Clin Pharmacol Toxicol 2018；122(2):191-198.
62.Chen K et al J Autoimmun 2017；85:64-77.
63.Lee HY et al J Cell Biochem 2017；118(6):1300-1307.
64.Migeotte I et al Cytokine Growth Factor Rev 2006；17(6):501-519.
65.Bufe B et al J Biol Chem 2012；287(40):33644-33655.
66.Ackels T et al.Front Neuroanat 2014；8:134.
67.Stempel H et al J Biol Chem 2016；291(18):9762-9775.
68.Gao JL et al.Behav Genet 2011；41(5):724-733.
69.Gallo I et al.PLoS One 2014；9(12):e114626.
70.Dietschi Q et al Proc Natl Acad Sci U S A 2017；114(28):7397-7402.
71.Lam RW.Eur Neuropsychopharmacol 2012；22Suppl 3:S492-498.
72.Kiecolt-Glaser JK et al Annu Rev Psychol 2002；53:83-107.
73.Serretti A,Chiesa A.Clin Pharmacol Ther 2011；89(1):142-147.
74.Uzun S et al Psychiatr Danub 2010；22(1):90-93.
75.Babic D et al Psychiatr Danub 2010；22(1):75-78.
序列
001 mwklgrgrvl ldeppeeedg lrggpppaaa aaaqaqvqga sfrgwkevts lfnkddeqhl
061 lerckspksk gtnlrlkeel kaekksgfwd nlvlkqniqs kkpdeiegwe ppklaledis
121 adpedtvggh pswsgwedda kgstkytsla ssanssrwsl raagrlikev winfsqliis
181 frkhclahyr elrlciky
SEQ ID NO:1
001 mwklgrgrvl ldeppeeedg lrggpppaaa aaaqaqvqga sfrgwkevts lfnkddeqhl
061 lerckspksk gtnlrlkeel kaekksgfwd nlvlkqniqs kkpdeiegwe ppklaledis
121 adpedtvggh pswsgwedda kgstkytsla ssanssrwsl raagrlvsir rqskghltds
181 peeae
SEQ ID NO:2
NVAMY
SEQ ID NO:3(1B10 VHCDR1)
RIRSKANNYATYYADSVKG
SEQ ID NO:4(1B10 VHCDR2)
WVIVPLYFDY
SEQ ID NO:5(1B10 VHCDR3)
RSSKSLLSSKGITSLY
SEQ ID NO:6(1B10 VLCDR1)
KSLLSSKGITS
SEQ ID NO:7(1B10 VLCDR1)
XMSNLAS
其中X独立地为任何氨基酸。
SEQ ID NO:8(1B10 VLCDR2)
QMS
SEQ ID NO:9(1B10 VLCDR2)
GHRLQTPFT
SEQ ID NO:10(1B10 VLCDR3)
AVQLVESGGGLVQPEESLKISCAASGITFSNVAMYWVRQAPGKGLEWVARIRSKANNYATYYADSVKGRFTISRDDSKSMVYLQMDNLKTEDTAMYYCSAWVIVPLYFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NO:11(1B10 VH)
001 gcggtgcagc tggttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctgaggagtc attgaaaatc
061 tcatgtgcag cttctggaat caccttcagt aatgttgcca tgtactgggt ccgccaggct
121 ccaggaaagg gtctggaatg ggttgctcgc ataagaagta aagctaataa ttatgcaaca
181 tattatgctg attcagtgaa aggcagattc accatctcca gagatgattc aaaaagcatg
241 gtctacctac aaatggataa cttgaaaact gaggacacag ccatgtacta ttgttcagca
301 tgggttatag tgcccctata ttttgattac tggggccaag gagtcatggt cacagtctcc
361 tca
SEQ ID NO:12(1B10 VH编码)
DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLSSKGITSLYWYLQRPGKSPQLLIYX1 MSNLASGVPDRFSX2SGSETDFTLKISX3VEAEDVGVYYCGHRLQTPFTFGSGTKLEIK
其中X1至X3独立地为任何氨基酸；优选地X1是Q，X2是S，且X3是K。
SEQ ID NO:13(1B10 VL)
DIVMTQAPLSVSVTPGESASISCRSSKSLLSSKGITSLYWYLQRPGKSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSETDFTLKISKVEAEDVGVYYCGHRLQTPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:14(1B10 VL)
001 gatattgtga tgactcaagc tccactctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagcttcc
061 atctcctgca grtctagtaa gagtctgcta agtagtaagg gcatcacttc cttgtattgg
121 taccttcaga ggccaggaaa gtctcctcag ctcctgatat atcrgatgtc caaccttgcc
181 tcaggagttc cagacaggtt tagtrgcagt gggtcagaaa ccgattttac actgaaaatc
241 agtarggtgg aggctgagga tgttggtgtt tattactgtg gacatcgtct acaaactcca
301 ttcacgttcg gctcagggac gaaattggaa ataaaa
其中r独立地为任何核苷酸。
SEQ ID NO:15(1B10 VL编码)
001 gatattgtga tgactcaagc tccactctct gtatctgtca ctcctggaga gtcagcttcc
061 atctcctgca ggtctagtAA GAGTCTGCTA AGTAGTAAGG GCATCACTTC Cttgtattgg
121 taccttcaga ggccaggaaa gtctcctcag ctcctgatat atCAGATGTC Caaccttgcc
181 tcaggagttc cagacaggtt tagtagcagt gggtcagaaa ccgattttac actgaaaatc
241 agtaaggtgg aggctgagga tgttggtgtt tattactgtG GACATCGTCT ACAAACTCCA
301 TTCACGttcg gctcagggac gaaattggaa ataaaa
SEQ ID NO:16(1B10 VL编码；CDR有下划线)
WKLSRSRVLLDEPPEEEDVLRGAPPASAAAPASVRARVGAQGASLRGWKEATSLFNKDDEEHLLETSRSPKSKGTNQRLREELKAEKKSGFWDALVLKQNAQPKKPDQIEGWEPPKLTAEDVVADHTEDDRSGCPPWSAWEDDTKGSTKYTSLANSASSSRWSLRSAGKLVSIRRQSKGHLTETCEEGE
SEQ ID NO:17(2610019F03Rik(aa 2-190))
GFTFSDYN
SEQ ID NO:18(1C4 VHCDR1)
IIYDGDRT
SEQ ID NO:19(1C4 VHCDR2)
ATGLAY
SEQ ID NO:20(1C4 VHCDR3)
QSLLYSENKKNY
SEQ ID NO:21(11C4 VLCDR1)
WAS
SEQ ID NO:22(1C4 VLCDR2)
QQYYNFPST
SEQ ID NO:23(1C4 VLCDR3)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYNMAWVRQAPKRGLEWVATIIYDGDRTYYRDSVKGRFTISRDKAKTTLYLQMDSLRSEDTATYYCATGLAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:24(1C4 VH；CDR有下划线)
001 atggacatca ggctcagctt ggttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag
061 gtgcagctgg tggagtctgg cggaggctta gtacagcctg gaaggtccct gaaactctcc
121 tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac tataacatgg cctgggtccg ccaggctcca
181 aagaggggtc tggagtgggt cgcaaccatt atttatgatg gtgataggac ttactatcga
241 gactccgtga agggccgatt cactatctcc agagataaag caaaaaccac cctatatttg
301 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac agggcttgct
361 tactggggcc aaggcactct ggtcactgtc tcttcag
SEQ ID NO:25(1C4 VH编码；CDR有下划线)
DIVMTQTPSSQAVSPGEKVTMSCKSSQSLLYSENKKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYNFPSTFGTGTTLELK
SEQ ID NO:26(1C4 VL CDR有下划线)
001 atggaatcac agacccaggt cctcatgtcc ctgctgctct gggtatctgg tacctgtggg
061 gacattgtga tgacccagac tccatcctcc caggctgtgt caccagggga gaaggtcact
121 atgagctgca agtccagtca gagtctttta tacagtgaaa acaaaaagaa ctacttggcc
181 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg
241 gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctgacc
301 atcagcagtg tgcaggcaga agacctggct gtttattact gccagcaata ctataacttt
361 ccgagcacgt ttggaactgg gaccacgctg gagctgaaac
SEQ ID NO:27(1C4 VL编码；CDR有下划线)。

Claims (40)

1.治疗精神障碍的方法，其包括向有需要的个体施用睾丸发育相关蛋白(TDRP)拮抗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述精神障碍的特征在于与焦虑相关的行为。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述精神障碍是焦虑性障碍。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述精神障碍是强迫症(OCD)。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有免疫性病况。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述个体正接受针对免疫性病况的治疗。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述免疫性病况是自身免疫性病症。
8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述个体正接受免疫抑制剂治疗。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TDRP拮抗剂降低所述个体循环系统中TDRP的表达、水平、量或浓度。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TDRP拮抗剂是特异性结合TDRP的抗体分子。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体分子是1B10或1C4。
12.特异性结合TDRP的抗体分子，所述抗体分子包括包含VH结构域和VL结构域的抗原结合位点，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:3的VHCDR1或其变体、SEQ ID NO:4的VHCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:5的VHCDR3或其变体。
13.如权利要求12所述的抗体，其中；
所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:8的VLCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:10的VLCDR3或其变体；或者
所述VL结构域包含SEQ ID NO:7的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:9的VLCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:10的VLCDR3或其变体。
14.如权利要求12或权利要求13所述的抗体分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其变体。
15.如权利要求12至14中任一项所述的抗体分子，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其变体。
16.特异性结合TDRP的抗体分子，所述抗体分子包括包含VH结构域和VL结构域的抗原结合位点，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:18的VHCDR1或其变体、SEQ ID NO:19的VHCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:20的VHCDR3或其变体；并且所述VL结构域包含SEQ IDNO:21的VLCDR1或其变体、SEQ ID NO:22的VLCDR2或其变体，以及SEQ ID NO:23的VLCDR3或其变体。
17.如权利要求16所述的抗体分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其变体。
18.如权利要求16或权利要求17所述的抗体分子，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或其变体。
19.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述TDRP拮抗剂是权利要求12至18中任一项所述的抗体分子。
20.TDRP拮抗剂，其用于治疗精神障碍的方法中。
21.如权利要求20所述用途的TDRP拮抗剂，其中所述方法是权利要求1至11中任一项所述的方法。
22.如权利要求20或权利要求21所述用途的TDRP拮抗剂，其中所述TDRP拮抗剂是权利要求12至18中任一项所述的抗体分子。
23.TDRP拮抗剂在制备用于治疗精神障碍的方法中的药物中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述方法是权利要求1至11中任一项所述的方法。
25.如权利要求23或权利要求24所述的用途，其中所述TDRP拮抗剂是权利要求12至18中任一项所述的抗体分子。
26.药物组合物，其包含治疗有效量的TDRP拮抗剂和药学上可接受的赋形剂。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述TDRP拮抗剂是权利要求12至18中任一项所述的抗体分子。
28.如权利要求26或权利要求27所述的药物组合物，其用于权利要求1至11中任一项所述的方法中的用途。
29.诊断个体精神障碍、鉴定患精神障碍风险增加的个体、或确定个体的焦虑症的方法，所述方法包括；
确定获自个体的样品中TDRP的表达、水平、量或浓度。
30.监测接受治疗的个体的方法，包括；
确定获自接受治疗的个体的样品中TDRP的表达、水平、量或浓度。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述个体正接受针对免疫性病况的治疗。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述个体正接受针对精神障碍的治疗。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆样品。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述样品包含PBMC。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述方法包括确定获自所述个体的PBMC样品中TDRP的表达。
36.筛选对精神障碍具有治疗活性的化合物的方法，其包括；
确定测试化合物与分离的TDRP的结合，
与TDRP结合指示所述化合物对精神障碍具有治疗活性。
37.筛选对精神障碍具有治疗活性的化合物的方法，其包括；
确定测试化合物对非人的哺乳动物中TDRP的表达、水平、量或浓度的影响，
TDRP的表达、水平、量或浓度的降低指示所述化合物对精神障碍具有治疗活性。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述活性是抗焦虑活性。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其还包括确定主题化合物对非人的哺乳动物中焦虑相关行为的影响。
40.确定个体中T细胞激活的方法，其包括；
确定获自所述个体的T细胞样品中TDRP的表达。
CN202080038551.0A 2019-04-03 2020-04-02 精神障碍的治疗和诊断 Pending CN113874077A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1904717.4A GB201904717D0 (en) 2019-04-03 2019-04-03 Treatment and diagnosis of mental disorders
GB1904717.4 2019-04-03
PCT/EP2020/059466 WO2020201462A1 (en) 2019-04-03 2020-04-02 Treatment and diagnosis of mental disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113874077A true CN113874077A (zh) 2021-12-31

Family

ID=66443117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080038551.0A Pending CN113874077A (zh) 2019-04-03 2020-04-02 精神障碍的治疗和诊断

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220396613A1 (zh)
EP (1) EP3946602A1 (zh)
JP (1) JP2022527625A (zh)
CN (1) CN113874077A (zh)
CA (1) CA3135544A1 (zh)
GB (1) GB201904717D0 (zh)
WO (1) WO2020201462A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
CN102127163A (zh) * 2010-01-20 2011-07-20 复旦大学附属华山医院 核因子tdrp1的克隆、蛋白表达、多抗制备以及应用
GB201121564D0 (en) * 2011-12-14 2012-01-25 Queen Mary & Westfield College Use of antibody
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Also Published As

Publication number Publication date
CA3135544A1 (en) 2020-10-08
US20220396613A1 (en) 2022-12-15
GB201904717D0 (en) 2019-05-15
EP3946602A1 (en) 2022-02-09
WO2020201462A1 (en) 2020-10-08
JP2022527625A (ja) 2022-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Frid et al. Immunoglobulin-driven complement activation regulates proinflammatory remodeling in pulmonary hypertension
TWI784988B (zh) 治療發炎症狀的方法
JP2020055881A (ja) 脱髄障害の治療のための併用療法および使用
US9751938B2 (en) Method of inhibiting activation of a T cell by administering an anti-RGM antibody or an RGM siRNA
KR20160130780A (ko) 염증성 장 질환의 진단 및 치료 방법
JP2023159169A (ja) 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体でループスを治療する安全かつ有効な方法
CN115667308A (zh) 抗trem2抗体的使用方法
Figueiredo et al. Optimal attenuation of experimental autoimmune encephalomyelitis by intravenous immunoglobulin requires an intact interleukin-11 receptor
CN112451661A (zh) α-烯醇化酶特异性抗体及其在免疫疾病治疗中的使用方法
Igaki et al. Pharmacological effects of TAK-828F: an orally available RORγt inverse agonist, in mouse colitis model and human blood cells of inflammatory bowel disease
WO2020008066A1 (en) Human immune system mouse model
CN113874077A (zh) 精神障碍的治疗和诊断
US20240245770A1 (en) Compositions and methods for treating neuromuscular disorders
JP7475011B2 (ja) Ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ）治療又は予防剤、及びｈａｍの治療方法
EP3916015A1 (en) Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
TWI857389B (zh) 治療發炎症狀的方法
Lee B Cell Responses in an Animal Model of Neuroinflammation: Implications for Multiple Sclerosis
Ludwig et al. Skin Blistering Diseases
WO2024115905A2 (en) Antibodies
Au et al. 047Auto-Immunity & Inflammation Psoriasis drug failure rates of biologics compared to conventional systemic therapies
Pikor Elucidating Disease Modifying Roles of Radio-Resistant, CNS Resident Cells in a Rodent Model of Multiple Sclerosis
Koning Characterization and regulation of Protocadherin-1: a novel gene for asthma
Forman Functional analysis of the role of interferon gamma through the characterisation of conditional interferon gamma receptor two mouse mutants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination