BR112020015961A2 - Inibidor de gremlin-1 para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a métodos para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. a invenção divulga o uso efetivo de um anticorpo antigremlin-1 para acelerar a cicatrização e ligação em ponte de tecido ósseo nos defeitos intersticiais segmentares; e demonstra que os inibidores da atividade de gremlin-1 podem prover terapias melhoradas para tratar ou prevenir não união de fratura.

Description

“INIBIDOR DE GREMLIN-1 PARA O TRATAMENTO DE UMA FRATURA ÓSSEA OU DEFEITO ÓSSEO”

[0001] A presente invenção se refere a métodos para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. A invenção divulga o uso efetivo de um anticorpo antigremlin- 1 para acelerar a cicatrização e ponte de tecido ósseo nos defeitos intersticiais segmentares; e demonstra que os inibidores da atividade de gremlin-1 podem prover terapias melhoradas para tratar ou prevenir a não união de fratura.

FUNDAMENTOS

[0002] Uma fratura óssea é uma quebra ou rachadura no tecido ósseo e pode ser o resultado de uma lesão traumática, tal como uma queda ou impacto, mas também pode ocorrer como um resultado de doenças que afetam a integridade óssea.

[0003] Fraturas ósseas não estabilizadas cicatrizam através do processo de ossificação endocondral, que é iniciada através da formação de um coagulo sanguíneo ou hematoma. Isto é acoplado com uma resposta inflamatória que modula células imunes e populações de célula tronco esqueletal circundante. O hematoma é subsequentemente substituído com um calo cartilaginoso mineralizado através da ação de vários fatores de crescimento incluindo o fator de crescimento transformador beta (TGFβ) (Cho et al; 2002), fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) (Schmid et al; 2009) e proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) (Yu et al; 2010). Através das ações de osteoclastos e osteoblastos, o calo mineralizado é substituído pelo osso reticulado. O estágio de remodelagem final envolve a substituição de osso reticulado com osso lamelar. A conclusão deste processo pode levar muitos anos dependendo da idade e situação de doença do paciente.

[0004] As fraturas ósseas são geralmente tratadas clinicamente através da estabilização, via o uso de um suporte tal como uma tala, molde ou atadura. Em casos extremos envolvendo intervenção cirúrgica de fraturas complexas pode ser requerido e envolve o uso de fixadores internos e externos que são fixados diretamente ao osso. Mesmo com estas medidas, em aproximadamente 10% dos pacientes o processo de reparo de tecido é deficiente (Einhorn et al; 2014) resultando em união óssea demorada (insuficiência para atingir união 6 meses após a fratura) ou a não união.

Uma não união é definida como cicatrização incompleta dentro de 9 meses, combinada com uma falta de características radiológicas associadas com a cicatrização de fratura sendo observada em três meses consecutivos (Buza et al; 2016). As técnicas cirúrgicas correntes para reparar fraturas não unidas e defeitos ósseos críticos são frequentemente limitadas em termos de quantidade e qualidade dos materiais disponíveis. Os tratamentos habitualmente usados envolvem os enxertos autólogos ou alogênicos, entretanto estes carreiam o risco adicional de morbidez de sítio doador (Goulet et al; 1997) e infecção (Bostrom et al; 2005), respectivamente.

[0005] Um defeito ósseo é uma perda de osso, devido a trauma ou doença.

[0006] Existe correntemente uma grande necessidade médica não atingida quanto a tratamento melhorado de fraturas ósseas e defeitos ósseos. Consequentemente, é um objetivo da presente invenção prover novos métodos para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo.

[0007] A presente invenção provê inibidores da atividade de gremlin-1 para o uso no tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. A invenção divulga o uso efetivo de um anticorpo antigremlin-1 para acelerar a cicatrização e ponte de tecido ósseo nos defeitos intersticiais segmentares; e demonstra que os inibidores da atividade de gremlin-1 podem prover terapias melhoradas para tratar ou prevenir a não união de fratura.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0008] A menos que de outro modo definido, todos os termos científicos e técnicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade na técnica. Todas as publicações aqui aludidas são incorporadas por referência.

[0009] Será avaliado que qualquer uma das modalidades aqui descritas pode ser combinada.

[0010] A presente invenção provê um inibidor da atividade de gremlin-1 para o uso no tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. A invenção também provê o uso de um inibidor da atividade de gremlin-1 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. A invenção provê ainda um método para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da atividade de gremlin-1.

[0011] Gremlin-1 (também conhecida como Drm e CKTSF1B1) é uma glicoproteína de 184 aminoácidos que forma parte da família DAN de proteínas secretadas do nó de cisteína (junto com Cerberus e Dan entre outros). Gremlin liga e inibe a capacidade das BMP-2, 4 e 7 para sinalizar junto com um papel pró- angiogênico documentada possivelmente através do agonismo de VEGFR2. O papel principal de Gremlin-1 é durante o desenvolvimento, no qual a mesma é vital durante a formação dos rins e durante a formação broto embrionário.

[0012] A sinalização da proteína morfogênica óssea (BMP) é conhecido controlar a formação óssea endocondral, com Gremlin 1 (GREM1) sendo um dos antagonistas naturais deste caminho através da sua ligação à BMP2, BMP4 e BMP7 (Hsu et al; 1998). A deleção condicional de GREM1 nos osteoblastos resulta na sensibilização da sinalização/atividade da BMP e formação óssea realçada in vivo (Gazzerro et al; 2007), enquanto a expressão excessiva condicional no mesmo tipo de célula causa osteopenia e fraturas espontâneas (Gazzerro et al; 2005). Além disso, embora o nocaute global seja letal embrionário em um fundo BL6, 49% dos filhotes sobreviveram mais que 24 horas após o nascimento no fundo genético misto C57BL/6/FVB e embora defeitos esqueletais desenvolvimentais estivessem abundantemente presentes, taxas de formação óssea elevadas seriam observadas (Canalis et al; 2012). A despeito desta função desenvolvimental de GREM1 não há nenhum dado para sugerir que a inibição desta proteína sozinha realçará o reparo ósseo da fratura pós natal. De fato, embora a formação óssea endocondral é o mecanismo principal de esqueletogênese nos estágios embrionários, os mecanismos que regulam o recrutamento celular são processos distintos quando comparados com o reparo de fratura pós-natal (Ferguson et al; 1999). O papel da inflamação foi indicado como um fator chave no reparo ósseo do adulto, assim os fatores desenvolvimentais que controlam os processos de esqueletogênese não podem simplesmente ser extrapolados para os mecanismos de reparo pós-natais.

[0013] O termo Gremlin-1 como usado na presente invenção tipicamente tem a sequência como apresentada na entrada do UniProt O60565 (SEQ ID NO: 1). O termo Gremlin-1 também pode se referir a um polipeptídeo Gremlin-1 que: (a) compreende ou consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 com ou sem o peptídeo de sinal de terminal N, isto é, pode compreender ou consistir da sequência de peptídeo maduro como mostrado na SEQ ID NO: 21; ou (b) é um derivado tendo uma ou mais substituições, modificações, deleções ou inserções de aminoácidos em relação às sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 1 com ou sem o peptídeo de sinal de terminal N (como mostrado na SEQ ID NO: 21), que retém a atividade de Gremlin-1, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. (c) uma variante do mesmo, tais variantes tipicamente retêm pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1 (ou SEQ ID NO: 20 ou 21) (ou mesmo cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade). Em outras palavras, tais variantes podem reter cerca de 60% a cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, adequadamente cerca de 80% a cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, mais adequadamente cerca de 90% a cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 e mais adequadamente de cerca de 95% a cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1. As variantes são adicionalmente descritas abaixo.

[0014] Como debatido adicionalmente abaixo, números de resíduo são tipicamente cotados com base na sequência da SEQ ID NO: 1. Entretanto, a numeração de resíduo facilmente seria extrapolada pela pessoa versada para uma sequência derivada ou variante como debatido acima. Onde números de resíduo são cotados, a invenção também abrange estes resíduos em uma sequência variante ou derivada.

[0015] Os presentes inventores cristalizaram Gremlin-1 humana sozinha e em complexo com um anticorpo denominado Ab 7326 (fragmentos Fab). A cristalização de Gremlin-1 tem permitido que resíduos putativos no sítio de ligação da BMP sejam determinados. Além disso, a cristalização com Ab 7326, que é um anticorpo inibidor alostérico, permitiu que resíduos no epítopo de anticorpo fossem determinados. (WO 2018/115017 A2). Os anticorpos que ligam este epítopo têm potencial como agentes terapêuticos no tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. Inibidores da Atividade de Gremlin-1

[0016] Um inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com a presente invenção é um agente que reduz ou bloqueia a atividade de gremlin-1. Os inibidores de acordo com a presente invenção podem parcial ou completamente inibir a atividade de gremlin-1. Os inibidores de uso na presente invenção incluem sem limitação, inibidores que são capazes de ligação à gremlin-1 ou a uma molécula de ácido nucléico codificando gremlin-1 ou são capazes de inibir a expressão de gremlin-1. Tais inibidores podem ser, sem limitação, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, peptidomiméticos, ácidos nucléicos (por exemplo, DNA, RNA, RNA de antissentido e siRNA), carboidratos, lipídeos e moléculas pequenas.

[0017] Em uma modalidade, o inibidor da atividade de gremlin-1 é um anticorpo antigremlin-1 ou um fragmento funcionalmente ativo, variante ou derivado do mesmo.

[0018] O termo “anticorpo” como aqui aludido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, “porção de ligação de antígeno”) ou cadeias únicas do mesmo. Um anticorpo ou imunoglobulina tipicamente se referem a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto ou uma porção de ligação a antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interagem com um antígeno. As regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR).

[0019] As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos e fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema clássico de complemento.

[0020] Um anticorpo para o uso na presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal e tipicamente será um anticorpo monoclonal. Um anticorpo para o uso na invenção pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um nanocorpo, um anticorpo humano ou humanizado ou uma porção de ligação a antígeno de qualquer um destes.

[0021] Anticorpos policlonais podem ser produzidos pelos métodos de rotina, tais como imunização de um animal adequado com o antígeno de interesse. O sangue pode ser subsequentemente removido do animal e a fração de imunoglobulina purificada.

[0022] Anticorpos contra Gremlin-1 podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração dos polipeptídeos a um animal, por exemplo, um animal não humano, usando protocolos bem conhecidos e de rotina, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, cabras, vacas, camelos, lhamas ou porcos podem ser imunizados. Entretanto, coelhos, camundongos e ratos são geralmente mais adequados.

[0023] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica do hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica do hibridoma do EBV (Cole et al., Monoclonals Antibody and Cancer Therapy, pp 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0024] Os anticorpos para o uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único pela clonagem e expressão dos cDNAs da região variável da imunoglobulina gerada a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por exemplo pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-7848l; WO 92/02551; WO 2004/051268 e WO 2004/106377.

[0025] Os anticorpos para o uso na presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles divulgados por Brinkman et al. (em J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) e WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5.698.426, US

5.223.409, US 5.403.484, US 5.580.717, US 5.427.908, US 5.750.753, US 5.821.047, US 5.571.698, US 5.427.908, US 5.516.637, US 5.780.225, US 5.658.727, US

5.733.743 e US 5.969.108.

[0026] Anticorpos totalmente humanos são aqueles anticorpos no qual as regiões variáveis e as regiões constantes (onde presentes) tanto de cadeia pesada quanto leve são todas de origem humana ou substancialmente idênticas às sequências de origem humana, mas não necessariamente do mesmo anticorpo. Os exemplos de anticorpos totalmente humanos podem incluir anticorpos produzidos, por exemplo pelos métodos de exibição de fago descritos acima e anticorpos produzidos pelos camundongos nos quais os genes da região variável da imunoglobulina de murino e opcionalmente da região constante foram substituídos pelas suas contrapartes humanas por exemplo, como descrito em termos gerais na EP 0546073, US

5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 e EP 0463151.

[0027] Alternativamente, um anticorpo de acordo com a invenção pode ser produzido por um método compreendendo imunizar um mamífero não humano com um imunógeno Gremlin-1; obtendo uma preparação de anticorpo a partir do dito mamífero; derivando destes anticorpos monoclonais que reconhecem Gremlin-1.

[0028] As moléculas de anticorpo para o uso na presente invenção podem compreender uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesada e leve de tamanho completo ou um fragmento ou porção de ligação a antígeno das mesmas. O termo “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade para seletivamente ligar a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo de tamanho completo. Os anticorpos e fragmentos e porções de ligação a antígeno dos mesmos podem ser, mas não são limitados a Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalente, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos acima (ver por exemplo Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209- 217). Os métodos para criar e fabricar estes fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Outros fragmentos de anticorpo para o uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab’ descritos nos Pedidos de patente internacionais WO 2005/003169, WO 2005/003170 e WO 2005/003171 e fragmentos Fab-dAb descritos no Pedido de patente internacional WO 2009/040562. Os anticorpos multivalentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficos (ver por exemplo WO 92/22853 e WO 2005/113605). Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles de habilidade na técnica e os fragmentos podem ser triados quanto a utilidade na mesma maneira como anticorpos intactos.

[0029] Em um exemplo, o fragmento de anticorpo funcionalmente ativos para o uso na presente invenção é um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

[0030] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo para o uso na presente invenção, se presentes, podem ser selecionados considerando-se as funções efetoras que possam ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, domínios da região constante da IgG humana podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando funções efetoras de anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isótipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando funções efetoras de anticorpo não são requeridos. Em um exemplo, o isótipo é IgG4P, como descrito por Angal S. et al, Mol Immunol, Vol 30(1), p105-108, 1993.

[0031] Um anticorpo para o uso na invenção pode ser preparado, expresso, criado ou isolado por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que seja transgênico ou transcromossômico para os genes da imunoglobulina de interesse ou um hibridoma preparado a partir destes, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo de interesse, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolado de uma biblioteca de anticorpo recombinante, combinatória e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolve a união das sequências de gene da imunoglobulina a outras sequências de DNA.

[0032] Um anticorpo para o uso na invenção pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. O termo “anticorpo humano”, como aqui usado, é intencionado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis em que tanto as regiões estrutural e de CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada das sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos para o uso na invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é pretendido incluir anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie mamífera, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências da estrutura humana.

[0033] Um tal anticorpo humano pode ser um anticorpo humano monoclonal. Um tal anticorpo humano monoclonal pode ser produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene da cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundidos a uma célula imortalizada.

[0034] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela imunização in vitro de linfócitos humanos seguidos pela transformação dos linfócitos com vírus de Epstein- Barr.

[0035] O termo “derivado” se refere a qualquer forma modificada do anticorpo, por exemplo um conjugado do anticorpo e um outro agente ou molécula efetora.

[0036] Uma molécula efetora pode compreender uma molécula efetora única ou duas ou mais de tais moléculas ligadas de modo a formar uma porção única que pode ser fixada aos anticorpos para o uso na presente invenção. Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isto pode ser preparado pelos procedimentos químicos ou de DNA recombinante padrão nos quais o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou por intermédio de um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para conjugar tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119- 58 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 2003/031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo a ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na WO 86/01533 e EP 0392745.

[0037] A molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou realçar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial para o sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação de albumina ou compostos de ligação de albumina tais como aqueles descritos na WO 2005/117984.

[0038] O termo “anticorpo humanizado” é intencionado ser referir às moléculas de anticorpo enxertadas à CDR em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie mamífera, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências da estrutura humana. As modificações da região de armação adicionais podem ser feitas dentro das sequências estruturais humanas.

[0039] Como aqui usado, o termo ‘molécula de anticorpo enxertada com CDR’ se refere a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino ou rato) enxertado dentro de uma estrutura da região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, ver Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Em uma modalidade ao invés da CDR inteira sendo transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinantes de especificidade de qualquer uma das CDRs aqui descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Em uma modalidade apenas os resíduos que determinam a especificidade de uma ou mais das CDRs aqui descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano. Em uma outra modalidade apenas os resíduos determinantes de especificidade de cada uma das CDRs aqui descritas acima são transferidas para a estrutura de anticorpo humano.

[0040] Quando as CDRs ou resíduos determinantes de especificidade são enxertados, qualquer sequência da estrutura da região variável aceitadora apropriada pode ser usada levando-se em conta a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, incluindo as regiões estruturais de camundongo, primata e humana. Adequadamente, o anticorpo enxertado com CDR para o uso na presente invenção tem um domínio variável compreendendo regiões estruturais aceitadoras humanas assim como uma ou mais das CDRs ou resíduos determinantes de especificidade descritos acima. Assim, é provido em uma modalidade um anticorpo enxertado na CDR neutralizante em que o domínio variável compreende regiões estruturais aceitadoras humanas e CDRs doadoras não humanas.

[0041] Os exemplos de estruturas humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas tanto para a cadeia pesada quanto a cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humana podem ser usadas; estas estão disponíveis por exemplo em: http://www.vbase2.org/ (ver Retter et al, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suplemento 1), D671-D674).

[0042] Em um anticorpo enxertado na CDR para o uso na presente invenção, as cadeias pesada e leve aceitadoras não precisam necessariamente ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreendem cadeias compósitas tendo regiões estruturais derivadas de cadeias diferentes.

[0043] Também, em um anticorpo enxertado na CDR para o uso na presente invenção, as regiões estruturais não precisam ter exatamente a mesma sequência como aquela do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos não usuais podem ser mudados com resíduos que ocorrem mais frequentemente para esta classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, resíduos selecionados nas regiões estruturais aceitadoras podem ser mudados de modo que eles correspondam ao resíduo encontrados à mesma posição no anticorpo doador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tais mudanças devem ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões estruturais aceitadoras que podem ser necessários ser mudados é apresentado na WO 91/09967.

[0044] Também será entendido por uma pessoa habilitada na técnica que os anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-traducionais. O tipo e grau destas modificações frequentemente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo assim como as condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carbóxi (tal como lisina ou arginina) devido à ação das carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

[0045] Em uma modalidade a cadeia pesada do anticorpo compreende um domínio CH1 e a cadeia leve do anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lambda.

[0046] As moléculas biológicas, tais como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, dando deste modo à molécula uma carga líquida positiva ou negativa. A quantidade de carga global “observada” dependerá das sequências de aminoácidos absolutas da entidade, o ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D e as condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pI) é o pH no qual uma molécula ou superfície particulares carrega nenhuma carga elétrica líquida. Em uma modalidade o anticorpo ou fragmento de acordo com a presente divulgação tem um ponto isoelétrico (pI) de pelo menos 7. Em uma modalidade o anticorpo ou fragmento tem um ponto isoelétrico de pelo menos 8, tal como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 ou 9. Em uma modalidade o pI do anticorpo é 8. Programas tais como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html (ver Walker, The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), 571-607) podem ser usados para prognosticar o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.

[0047] Os anticorpos para o uso na invenção podem compreender pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de CDR de cadeia pesada das SEQ ID NOS: 4 a 6 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente). Estas são as sequências HCDR1/HCDR2/ HCDR3 do anticorpo Ab7326 dos Exemplos como determinadas usando a metodologia de Kabat.

[0048] Os métodos de Kabat e Chothia para determinar as sequências de CDR são bem conhecidos na técnica (assim como outras técnicas). As sequências de CDR podem ser determinadas usando qualquer método apropriado e na presente invenção, embora Kabat seja tipicamente utilizada outras técnicas também poderiam ser usadas. No presente caso, a SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência da HCDR1 de Ab7326 como determinada usando uma definição combinada de Chothia & Kabat.

[0049] Os anticorpos para o uso na invenção podem compreender pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências de CDR de cadeia leve das SEQ ID NOS: 7 a 9 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Estas são as sequências LCDR1/LCDR2/LCDR3 de Ab7326 usando a metodologia de Kabat.

[0050] Em uma modalidade, o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HCDR3 da SEQ ID NO: 6.

[0051] Tipicamente, o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de CDR de cadeia pesada selecionada das SEQ ID NOS: 4 a 6 e pelo menos uma sequência de CDR da cadeia leve selecionada das SEQ ID NOS: 7 a 9. O anticorpo pode compreender pelo menos duas sequências CDR de cadeia pesada selecionadas das SEQ ID NOS: 4 a 6 e pelo menos duas sequências de CDR de cadeia leve selecionadas das SEQ ID NOS: 7 a 9. O anticorpo tipicamente compreende todas as três sequências da CDR de cadeia pesada das SEQ ID NOS: 4 a 6 (HCDR1/HCDR2/HCDR3 respectivamente) e todas as três sequências de CDR de cadeia leve das SEQ ID NOS: 7 a 9 (LCDR1/LCDR2/LCDR3 respectivamente). Os anticorpos podem ser anticorpos quiméricos, humanos ou humanizados.

[0052] O anticorpo pode compreender uma sequência da região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 10 ou 12 (a HCVR de Ab7326 variantes 1 e 2). O anticorpo pode compreender uma sequência da região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 11 ou 13 (a LCVR de Ab7326 variantes 1 e 2). O anticorpo preferivelmente compreende a sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10 ou 12 e a sequência da região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 11 ou 13 (especialmente pares HCVR/LVCR das SEQ ID NOs: 10/11 ou 12/13).

[0053] As variantes Ab7326 1 e 2 diferem por um único aminoácido na região variável de cadeia pesada e por um único aminoácido na região variável de cadeia leve, como segue: • Região variável de cadeia pesada variante 1 tem ácido glutâmico (E) na posição 6. (SEQ ID NO: 10) • Região variável de cadeia pesada variante 2 tem glutamina (Q) na posição 6. (SEQ ID NO: 12) • Região variável da cadeia leve variante 1 tem serina (S) na posição 7. (SEQ ID NO: 11) • Região variável da cadeia leve variante 2 tem treonina (T) na posição 7. (SEQ ID NO: 13)

[0054] Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 10, em que o resíduo de ácido glutâmico na posição 6 é substituído com um resíduo de glutamina (E6Q); em que a numeração do resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 10.

[0055] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 12, em que o resíduo de glutamina na posição 6 é substituído com um resíduo de ácido glutâmico (Q6E); em que a numeração do resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 12.

[0056] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 11, em que o resíduo de serina na posição 7 é substituído com um resíduo de treonina (S7T); em que a numeração de resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 11.

[0057] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 13, em que o resíduo de treonina na posição 7 é substituído com um resíduo de serina (T7S); em que a numeração de resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 13.

[0058] Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 ou 4 para a HCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 5 para a HCDR2, a sequência da SEQ ID NO: 6 para a HCDR3, a sequência da SEQ ID NO: 7 para a LCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 8 para a LCDR2 e a sequência da SEQ ID NO: 9 para a LCDR3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade), com a sequência da SEQ ID NO: 10 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade), com a sequência da SEQ ID NO: 11.

[0059] Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 ou 4 para a HCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 5 para a HCDR2, a sequência da SEQ ID NO: 6 para a HCDR3, a sequência da SEQ ID NO: 7 para a LCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 8 para a LCDR2 e a sequência da SEQ ID NO: 9 para a

LCDR3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade), com a sequência da SEQ ID NO: 12 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade) com a sequência da SEQ ID NO: 13.

[0060] O anticorpo pode compreender uma sequência de cadeia pesada (cadeia H) da

[0061] SEQ ID NO: 14 variante 1 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0062] SEQ ID NO: 28 variante 2 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0063] SEQ ID NO: 30 variante 1 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0064] SEQ ID NO: 16 variante 2 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0065] SEQ ID NO: 22 variante 1 da cadeia pesada de IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0066] SEQ ID NO: 34 variante 2 da cadeia pesada de IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0067] SEQ ID NO: 18 variante 1 da cadeia pesada de Fab ou

[0068] SEQ ID NO: 32 variante 2 da cadeia pesada de Fab.

[0069] O anticorpo pode compreender uma sequência de cadeia leve (cadeia L) da

[0070] SEQ ID NO: 15 variante 1 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0071] SEQ ID NO: 29 variante 2 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0072] SEQ ID NO: 31 variante 1 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0073] SEQ ID NO: 17 variante 2 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de ser humano variante 2 ou

[0074] SEQ ID NO: 23 variante 1 da cadeia leve de IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0075] SEQ ID NO: 35 variante 2 da cadeia leve de IgG4P de tamanho completo de ser humano variante 2 ou

[0076] SEQ ID NO: 19 variante 1 da cadeia leve de Fab variante 1 ou

[0077] SEQ ID NO: 33 variante 2 da cadeia leve de Fab

[0078] Em um exemplo, o anticorpo compreende um par de sequência da cadeia pesada / cadeia leve de

[0079] SEQ ID NOs: 14/15 variante 1 da IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0080] SEQ ID NOs: 28/29 variante 2 da IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0081] SEQ ID NOs: 30/31 variante 1 da IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0082] SEQ ID NOs: 16/17 variante 2 da IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0083] SEQ ID NOs: variante 1 22/23 IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0084] SEQ ID NOs: variante 2 34/35 IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0085] SEQ ID NOs: variante 1 da 18/19 cadeia leve de Fab ou

[0086] SEQ ID NOs: variante 2 da 32/33 cadeia leve de Fab

[0087] As formas variantes de sequências correspondentes podem ser intercambiadas. Por exemplo, o anticorpo pode compreender um par de sequência da cadeia pesada / cadeia leve da

[0088] SEQ ID NOs: 14/29 variante 1 da cadeia pesada/variante 2 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0089] SEQ ID NOs: 28/15 variante 2 da cadeia pesada/variante 1 da cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de camundongo ou

[0090] SEQ ID NOs: 30/17 variante 1 de cadeia pesada/variante 2 de cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0091] SEQ ID NOs: 16/31 variante 2 de cadeia pesada/variante 1 de cadeia leve de IgG1 de tamanho completo de ser humano ou

[0092] SEQ ID NOs: 22/35 variante 1 de cadeia pesada/variante 2 de cadeia leve de IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0093] SEQ ID NOs: 34/23 variante 2 de cadeia pesada/ variante 1 de cadeia leve de IgG4P de tamanho completo de ser humano ou

[0094] SEQ ID NOs: 18/33 variante 1 de cadeia pesada/ variante 2 de cadeia leve de Fab ou

[0095] SEQ ID NOs: 32/19 variante 2 de cadeia pesada/ variante 1 de cadeia leve de Fab.

[0096] Os anticorpos podem ser anticorpos quiméricos, humanos ou humanizados.

[0097] O anticorpo pode alternativamente ser ou pode compreender uma variante de uma das sequências específicas citadas acima. Por exemplo, uma variante pode ser uma variante de substituição, deleção ou adição de qualquer uma das sequências de aminoácidos acima.

[0098] Um anticorpo variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20 ou mais (tipicamente até um máximo de 50) substituições e/ou deleções de aminoácidos das sequências específicas debatidas acima. As variantes de “deleção” podem compreender a deleção de aminoácidos individuais, deleção de grupos pequenos de aminoácidos tal como 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou deleção de regiões de aminoácidos maiores, tal como a deleção de domínios de aminoácidos específicos ou outros traços. As variantes de “substituição” tipicamente envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos com o mesmo número de aminoácidos e realizando substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído com um aminoácido alternativo tendo propriedades similares, por exemplo, um outro aminoácido básico, um outro aminoácido ácido, um outro aminoácido neutro, um outro aminoácidos carregado, um outro aminoácido hidrofílico, um outro aminoácido hidrofóbico, um outro aminoácido polar, um outro aminoácido aromático ou um outro aminoácido alifático. Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usados para selecionar substituintes adequados são como segue: Tabela 1: Propriedades dos aminoácidos.

Ala alifático, hidrofóbico, neutro Met hidrofóbico, neutro Cys polar, hidrofóbico, neutro Asn polar, hidrofílico, neutro Asp polar, hidrofílico, carregado (-) Pro hidrofóbico, neutro Glu polar, hidrofílico, carregado (-) Gln polar, hidrofílico, neutro Phe aromático, hidrofóbico, neutro Arg polar, hidrofílico, carregado (+) Gly alifático, neutro Ser polar, hidrofílico, neutro His aromático, polar, hidrofílico, Thr polar, hidrofílico, neutro carregado (+) Ile alifático, hidrofóbico, neutro Val alifático, hidrofóbico, neutro Lys polar, hidrofílico, carregado(+) Trp aromático, hidrofóbico, neutro Leu alifático, hidrofóbico, neutro Tyr aromático, polar, hidrofóbico

[0099] “Derivados” ou “variantes” geralmente incluem aqueles nos quais ao invés dos aminoácidos que ocorrem naturalmente os aminoácidos que aparecem na sequência são análogos estruturais dos mesmos. Os aminoácidos usados nas sequências também podem ser derivatizados ou modificados, por exemplo, rotulados, provendo a função do anticorpo que não é afetado de modo significantemente adverso.

[0100] Derivados e variantes como descritos acima podem ser preparados durante a síntese do anticorpo ou pela modificação pós-produção ou quando o anticorpo está na forma recombinante usando as técnicas conhecidas de mutagênese loco-dirigida, mutagênese aleatória ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucléicos.

[0101] Os anticorpos variantes podem ter uma sequência de aminoácidos que tenha mais do que cerca de 60% ou mais do que cerca de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, tipicamente mais do que cerca de 85%, por exemplo, mais do que cerca de 90 ou 95% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos aqui divulgada (particularmente as sequências HCVR/LCVR e as sequências de cadeia H e L). Além disso, o anticorpo pode ser uma variante que tenha mais do que cerca de 60% ou mais do que cerca de 70%, por exemplo, 75 ou 80%, tipicamente mais do que cerca de 85%, por exemplo, mais do que cerca de 90 ou 95% de identidade de aminoácidos com as sequências HCVR/LCVR e as sequências de cadeia H e L aqui divulgadas, embora retenham as CDRs exatas divulgadas para estas sequências. As variantes podem reter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências HCVR/LCVR e com as sequências de cadeia H e L aqui divulgadas (em algumas circunstâncias embora retenham as CDRs exatas).

[0102] As variantes tipicamente retêm cerca de 60% a cerca de 99% de identidade, cerca de 80% a cerca de 99% de identidade, cerca de 90% a cerca de 99% de identidade ou cerca de 95% a cerca de 99% de identidade. Estes níveis de identidade de aminoácidos podem ser observados através do comprimento completo da sequência SEQ ID NO relevante ou em uma parte da sequência, tal como através de cerca de 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos, dependendo do tamanho do polipeptídeo de tamanho completo.

[0103] Em conexão com a sequência de aminoácidos, “identidade de sequência” se refere às sequências que têm o valor estabelecido quando avaliadas usando ClustalW (Thompson et al., 1994, supra) com os seguintes parâmetros:

[0104] Parâmetros de alinhamento aos pares - Método: preciso, Matriz: PAM, Penalidade de lacuna de abertura: 10,00, Penalidade de extensão de lacuna: 0,10;

[0105] Parâmetros de alinhamento múltiplo – Matriz: PAM, Penalidade de lacuna de abertura: 10,00, % de identidade para demora: 30, Penalizar lacunas de extremidade: ligado, Distância de separação de lacuna: 0, Matriz negativa: não, Penalidade de extensão de lacuna: 0,20, Penalidades de lacuna específica de resíduo: ligado, Penalidades de lacuna hidrofílica: ligado, Resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR. A identidade de sequência em um resíduo particular é intencionada incluir resíduos idênticos que simplesmente foram derivatizados.

[0106] Anticorpos tendo sequências específicas e derivados e variantes que mantenham a função ou atividade destas cadeias são, portanto, providos para o uso na presente invenção.

[0107] “Derivados” como aqui usado é intencionado incluir derivados reativos, por exemplo grupos reativos seletivos em tiol tais como maleimidas. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador a um polímero. Será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[0108] O polímero pode ser um polímero sintético ou um de ocorrência natural, por exemplo um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituída ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou heteropolissacarídeo.

[0109] Os substituintes opcionais específicos que podem estar presentes em um polímero sintético incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0110] Os exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol) poli(álcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos ou derivados dos mesmos, de modo especialmente opcional poli(etileno glicol) substituído tal como metóxi-poli(etileno glicol) ou derivados dos mesmos.

[0111] Os polímeros específicos de ocorrência natural incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos.

[0112] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, por exemplo de 5000 a 40000 Da tal como de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero em particular pode ser selecionado com base no uso pretendido do produto por exemplo capacidade para localizar em certos tecidos ou meia-vida circulante prolongada (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim,

por exemplo, onde o produto é intencionado deixar a circulação e penetrar tecido, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo com um peso molecular em torno de 5000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.

[0113] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado do mesmo e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

[0114] Em um exemplo os anticorpos para o uso na presente invenção são fixados às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser fixadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácidos disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou pode ser engenheirado dentro do fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo a US 5.219.996, US 5.667.425, WO98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo a molécula de anticorpo é um fragmento de Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade de terminal C da sua cadeia pesada um ou mais aminoácidos para permitir a fixação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína à qual a molécula efetora pode ser fixada. Os sítios múltiplos podem ser usados para fixar duas ou mais moléculas de PEG.

[0115] Os anticorpos podem competir quanto à ligação à Gremlin-1 com ou ligando o mesmo epítopo como, aqueles definidos acima em termos de sequências de cadeia H/cadeia L, HCVR/LCVR ou CDR. Em particular, um anticorpo pode competir quanto à ligação à Gremlin-1 com ou ligando ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende uma combinação de sequência HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 das SEQ ID NOs: 4/5/6/7/8/9. Um anticorpo pode competir quanto à ligação à Gremlin-1 com ou ligando ao mesmo epítopo como, um anticorpo que compreende um par de sequência HCVR e LCVR das SEQ ID NOs: 10/11 ou 12/13 ou cadeias de tamanho completo das SEQ ID Nos: 14/15 ou 16/17.

[0116] Um “epítopo” é uma região de um antígeno que é ligado por um anticorpo. Os epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que diretamente contribuem para a afinidade da interação. Os epítopos também podem ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não lineares. Em certas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila, e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas.

[0117] Pode-se facilmente determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como ou compete quanto à ligação com, um anticorpo referência pelo uso de métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo de referência para o uso na invenção, o anticorpo de referência é deixado ligar a uma proteína ou peptídeo sob condições de saturação. Em seguida, a capacidade de um anticorpo de teste para ligar à proteína ou peptídeo é avaliada. Se o anticorpo de teste é capaz de ligar à proteína ou peptídeo seguindo a ligação de saturação com o anticorpo de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do que o anticorpo de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não é capaz de ligar à proteína ou peptídeo a seguir da ligação de saturação com o anticorpo de referência, depois o anticorpo de teste pode ligar ao mesmo epítopo como o epítopo ligado pelo anticorpo de referência da invenção.

[0118] Para determinar se um anticorpo competes quanto à ligação com um anticorpo de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações. Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado ligar a uma proteína/peptídeo sob condições saturantes seguido pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula de proteína/peptídeo. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado ligar à proteína/peptídeo sob condições saturantes seguido pela avaliação da ligação do anticorpo de referência à proteína/peptídeo. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (saturante) é capaz de ligação à proteína/peptídeo, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência compete quanto à ligação à proteína/peptídeo. Como será avaliado pela pessoa versada, um anticorpo que compete quanto à ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente ligar ao epítopo idêntico como o anticorpo de referência, mas pode estericamente bloquear a ligação do anticorpo de referência pela ligação a um epítopo de sobreposição ou adjacente.

[0119] Dois anticorpos se ligam ao mesmo ou epítopo de sobreposição se cada um inibe (bloqueia) competitivamente a ligação do outro ao antígeno. Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50%, 75%, 90% ou mesmo 99% como medido em um ensaio de ligação competitiva (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res, 1990: 50: 1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzam ou eliminem a ligação de um anticorpo reduzam ou eliminem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos de sobreposição se algumas mutações de aminoácidos que reduzam ou eliminem a ligação de um anticorpo reduzam ou eliminem a ligação do outro.

[0120] A experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análise de ligação) pode depois ser realizada para confirmar se a falta observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devida à ligação ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou um outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, ressonância plasmônica superficial, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.

[0121] O anticorpo antigremlin-1 dos Exemplos, Ab7326, foi descoberto ligar os seguintes resíduos de Gremlin-1: Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151,

Arg169, Lys174 e Gln175; onde Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175 estão presentes em um monômero de Gremlin-1 e Ile131 está presente no segundo monômero de Gremlin-1. A numeração está fundamentada na entrada do UniProt O60565 da SEQ ID NO: 1. Como debatido na seção Exemplos, estes resíduos de epítopo foram identificados usando a análise NCONT em 4 Å do complexo Gremlin-1-Ab7326 Fab.

[0122] Os anticorpos para o uso na invenção podem, portanto, se ligar a um epítopo que compreenda pelo menos um resíduo selecionado de Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175 (com numeração de resíduo fundamentada na SEQ ID NO: 1). Os anticorpos para o uso na invenção podem se ligar a um epítopo que compreenda 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todo os 9 destes resíduos (preferivelmente pelo menos 5 resíduos).

[0123] Os anticorpos para o uso na invenção também podem reconhecer um epítopo onde Ile131 esteja presente em um monômero de Gremlin-1 diferente dos outros resíduos.

[0124] Embora estes resíduos sejam providos para uma sequência particular de Gremlin-1 humana, a pessoa versada extrapolaria as posições destes resíduos para outras sequências de Gremlin correspondentes usando técnicas de rotina. A ligação dos anticorpos aos epítopos compreendendo os resíduos correspondentes dentro destas outras sequências de Gremlin é, portanto, também provida para o uso na invenção.

[0125] Para triar quanto aos anticorpos que se ligam a um epítopo particular, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito em Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) pode ser realizado. Outros métodos incluem mutantes de varredura de alanina, manchas de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) ou análise de clivagem de peptídeo. Além disso, métodos tais como a excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser utilizados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Tais métodos são bem conhecidos na técnica.

[0126] Os epítopos de anticorpo também podem ser determinados pela análise de cristalografia de raio x. Os anticorpos para o uso na presente invenção podem ser, portanto, avaliados através da análise de cristalografia de raio x do anticorpo ligado a Gremlin-1. Os epítopos, em particular, podem ser identificados deste modo determinando-se resíduos na Gremlin-1 dentro de 4Å de um resíduo parátopo de anticorpo.

[0127] Anticorpos podem ser testados quanto à ligação à Gremlin-1, por exemplo, pelo ELISA padrão ou Western blotting. Um ensaio de ELISA também pode ser usado para triar quanto a hibridomas que mostrem reatividade positiva com a proteína alvo. A seletividade de ligação de um anticorpo também pode ser determinada monitorando-se a ligação do anticorpo às células expressando a proteína alvo, por exemplo pela citometria de fluxo. Assim, um método de triagem pode compreender a etapa de identificar um anticorpo que seja capaz de ligar Gremlin-1 realizando-se um ELISA ou Western blot ou pela citometria de fluxo.

[0128] Anticorpos podem seletivamente (ou especificamente) reconhecer Gremlin-

1. Um anticorpo ou outro composto, “seletivamente liga” ou “seletivamente reconhece” uma proteína quando o mesmo se liga com afinidade preferencial ou alta à proteína para a qual o mesmo é seletivo, mas não se liga substancialmente ou liga com baixa afinidade, às outras proteínas. A seletividade de um anticorpo pode ser estudada adicionalmente determinando-se se o anticorpo se liga ou não às outras proteínas relacionadas como debatido acima ou se ele descrimina entre elas. Os anticorpos para o uso na invenção tipicamente reconhecem Gremlin-1 humana.

[0129] Os anticorpos também podem ter reatividade cruzada para proteínas relacionadas ou para Gremlin-1 humana e para Gremlin-1 de outras espécies.

[0130] Por específico (ou seletivo), será entendido que o anticorpo se liga à proteína de interesse sem nenhuma reatividade cruzada significante a qualquer outra molécula. A reatividade cruzada pode ser avaliada por qualquer método adequado aqui descrito. A reatividade cruzada de um anticorpo pode ser considerada significante se o anticorpo se liga à outra molécula pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 100% tão fortemente como o mesmo se liga à proteína de interesse. Um anticorpo que é específico (ou seletivo) pode se ligar a uma outra molécula em menos do que cerca de 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% ou 20% a força que ele se liga à proteína de interesse. O anticorpo pode se ligar à outra molécula em menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10% ou menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% a força que o mesmo se liga à proteína de interesse.

[0131] Assim, anticorpos adequados para o uso na presente invenção podem ter uma alta afinidade de ligação para Gremlin-1 (humana). O anticorpo pode ter uma constante de dissociação (KD) de menos do que <1 nM e preferivelmente <500 pM. Em um exemplo, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) de menos do que 200 pM. Em um exemplo, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) de menos do que 100 pM. Uma variedade de métodos pode ser usada para determinar a afinidade de ligação de um anticorpo ao seu antígeno alvo tal como ensaios de ressonância plasmônica superficial, ensaios de saturação ou imunoensaios tais como ELISA ou RIA, como são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Um método exemplar para determinar a afinidade de ligação é pela análise de ressonância plasmônica superficial em um instrumento BIAcore® 2000 (Biacore AB, Freiburg, Alemanha) usando chips sensores CM5, como descrito por Krinner et al., (2007) Mol. Immunol. Fevereiro; 44 (5): 916-25. (Epub 11 de maio de 2006)).

[0132] O anticorpo antigremlin-1 dos Exemplos, Ab7326, é um inibidor alostérico da atividade de gremlin-1 que se liga a um epítopo distal do sítio de ligação da BMP. (WO 2018/115017 A2) Ab7326 se liga à Gremlin-1 com afinidade excepcionalmente alta com um valor Kd <100 pM e é esperado ser particularmente útil para o uso na presente invenção.

[0133] Um inibidor da atividade de gremlin-1 pode ter um efeito sobre qualquer uma das funções de Gremlin-1, mas tipicamente reduz a ligação de Gremlin-1 à BMP (BMP 2, 4 e/ou 7). Gremlin-1 é um regulador negativo da BMP e assim a ligação reduzida aumenta a sinalização através da BMP.

[0134] A ligação e sinalização da BMP podem ser detectadas por qualquer método conhecido na técnica. Os Exemplos do presente pedido descrevem dois ensaios funcionais para testar se um agente reduz a ligação de gremlin-1 à BMP. O Exemplo 3 descreve um ensaio de gene repórter Id1, onde o gene Id1 é um gene alvo da sinalização da BMP. Um aumento no sinal neste ensaio pode ser usado para determinar se um agente reduz a ligação de Gremlin-1 à BMP. O Exemplo 5 descreve um ensaio de fosforilação de SMAD. SMAD1, 5 e 8 são fosforilados na sinalização da BMP. Um aumento na fosforilação de SMAD podem ser, portanto, usado para determinar se um agente reduz a ligação de Gremlin-1 à BMP.

[0135] Uma vez que um anticorpo adequado foi identificado e selecionado, a sequência de aminoácidos do anticorpo pode ser identificada pelos métodos conhecidos na técnica. Os genes codificando o anticorpo podem ser clonados usando iniciadores degenerados. O anticorpo pode ser recombinantemente produzido pelos métodos de rotina.

[0136] Os exemplos de sequências de DNA codificando cadeias pesadas e cadeias leves de tamanho completo de Ab7326 são providos na listagem de sequências: •SEQ ID NO: 24 (Variante 1 do DNA da cadeia pesada de IgG1 humana) •SEQ ID NO: 25 (Variante 1 do DNA da cadeia leve de IgG1 humana) •SEQ ID NO: 26 (Variante 1 do DNA da cadeia pesada de IgG4P humana) •SEQ ID NO: 27 (Variante 1 do DNA da cadeia leve de IgG4P humana) Composições Farmacêuticas, Dosagens e Regimes de Dosagem

[0137] Um inibidor da atividade de gremlin-1 para o uso na presente invenção pode ser provido em uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica normalmente será estéril e tipicamente incluirá um carreador e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição farmacêutica para o uso na invenção pode adicionalmente compreender um adjuvante e/ou carreador farmaceuticamente aceitáveis.

[0138] As composições farmacêuticas para o uso na invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a um sal que retenha a atividade biológica desejada da molécula precursora e não comunica nenhum efeito toxicológico indesejado. Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base.

[0139] Como aqui usado, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e os semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. O carreador pode ser adequado para as vias parenterais, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo pela injeção ou infusão. Alternativamente, o carreador pode ser adequado para a administração não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucósica de administração. O carreador pode ser adequado para a administração oral. Dependendo da via de administração, o inibidor pode ser revestido em um material para proteger o mesmo da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o inibidor.

[0140] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis compreendem carreadores ou diluentes aquosos. Os exemplos de carreadores aquosos adequados que pode ser utilizado nas composições farmacêuticas para o uso na invenção incluem água, água tamponada e solução salina. Os exemplos de outros carreadores incluem etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.

[0141] As composições farmacêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco.

[0142] As composições farmacêuticas para o uso na invenção podem compreender ingredientes ativos adicionais.

[0143] Também são considerados kits compreendendo um inibidor da atividade de gremlin-1 e instruções para o uso em um método de tratamento de acordo com a invenção.

[0144] Agentes para o uso na invenção ou formulações ou composições dos mesmos podem ser administrados para tratamentos terapêutico e/ou profilático.

[0145] Nas aplicações terapêuticas, agentes são administrados a um sujeito já sofrendo de um distúrbio ou condição, em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou parcialmente reprimir a condição ou um ou mais de seus sintomas. Tal tratamento terapêutico pode resultar em uma diminuição na severidade de sintomas ou um aumento na frequência ou duração de períodos livres de sintomas. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma “quantidade terapeuticamente eficaz”.

[0146] Nas aplicações profiláticas, agentes são administrados a um sujeito em risco de um distúrbio ou condição, em uma quantidade suficiente para prevenir ou reduzir os efeitos subsequentes da condição ou um ou mais dos seus sintomas. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma “quantidade profilaticamente eficaz”. As quantidades eficazes para cada propósito dependerão da severidade da doença ou lesão assim como do peso e estado geral do sujeito.

[0147] Um sujeito para a administração pode ser um animal humano ou não humano. O termo “animal não humano” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, cães, gatos, cavalos, ovelha, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. A administração aos seres humanos é típica.

[0148] Um agente ou composição farmacêutica para o uso na invenção podem ser administrados por intermédio de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será avaliado pelo técnico habilitado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Os exemplos de vias de administração para agentes ou composições farmacêuticas para o uso na invenção incluem as vias parenterais, tais como as vias intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutânea ou espinhal de administração, por exemplo pela injeção ou infusão. Alternativamente, um agente ou composição farmacêutica podem ser administrados por intermédio de uma via não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucósica de administração. O agente ou composição farmacêutica podem ser para a administração oral.

[0149] Uma dosagem adequada de um agente inibidor ou composição farmacêutica para o uso na invenção pode ser determinada por um médico versado. Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas para o uso na presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares utilizadas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular que é utilizado, da duração do tratamento, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que é tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0150] Uma dose adequada pode estar, por exemplo, na faixa de cerca de 0,01 µg/kg a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal, tipicamente de cerca de 0,1 µg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, do paciente a ser tratado. Por exemplo, uma dosagem adequada pode ser de cerca de 1 µg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia ou de cerca de 10 μg/kg a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dia.

[0151] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para prover a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma dose única pode ser administrada, diversas doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pela situação terapêutica. A forma unitária de dosagem como aqui usada se refere a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de agente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido.

[0152] A administração pode ser em doses únicas ou múltiplas. As doses múltiplas podem ser administradas por intermédio das mesmas vias ou diferentes e aos mesmos locais ou diferentes. Alternativamente, as doses podem ser por intermédio de uma formulação de liberação prolongada, caso no qual administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência podem variar dependendo da meia- vida do agente inibidor no paciente e da duração desejada do tratamento.

[0153] Agentes, formulações ou composições farmacêuticas para o uso na invenção podem ser coadministrados com um ou mais outros agentes terapêuticos. A administração combinada de dois ou mais agentes pode ser obtida em vários modos diferentes. Ambos podem ser administrados juntos em uma única composição ou eles podem ser administrados em composições separadas como parte de uma terapia combinada. Por exemplo, um pode ser administrado antes, depois ou concorrentemente com o outro. Indicações terapêuticas

[0154] Inibidores da atividade de gremlin-1 de acordo com a presente invenção são providos para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo. Uma fratura óssea é uma quebra ou rachadura no tecido ósseo e pode ser o resultado de uma lesão traumática, tal como uma queda ou impacto, mas também pode ocorrer como um resultado de doenças que afetam a integridade óssea. Um defeito ósseo é uma perda de osso, devido a trauma ou doença.

[0155] A fratura pode ser uma fratura de qualquer osso no corpo.

[0156] O defeito ósseo pode ser um defeito ósseo em qualquer osso do corpo.

[0157] Em uma modalidade, a fratura óssea é uma fratura de união demorada ou não união. Uma fratura de união demorada é definida como uma fratura que falha em atingir união dentro de 6 meses após a fratura. Uma fratura de não união é definida como cicatrização incompleta dentro de 9 meses, combinada com uma falta de características radiológicas associadas com a cicatrização de fratura que é observada durante três meses consecutivos. (Einhorn et al; 2014; Buza et al; 2016). Os exemplos de fraturas que são propensas ao desenvolvimento de união demorada ou não união incluem tíbia, rádio distal, colo do fêmur e osso escafóide.

[0158] Em uma modalidade, a fratura óssea ou defeito ósseo ocorrem como um resultado de uma doença que afeta a integridade óssea. Os exemplos de doenças que afetam a integridade óssea incluem mas não são limitados à osteoporose, osteogênese imperfeita, diabete, doença de Paget do osso, artrite reumatóide, espondilite anquilosante, mieloma múltiplo, câncer de osso primário (por exemplo, osteossarcoma, sarcoma de Ewing e condrossarcoma), cânceres que metastatizam para o osso (por exemplo, câncer mamário, câncer prostático e câncer pulmonar), hiperostose esqueletal idiopática difusa, osteomielite, doença renal, distrofia muscular de Duchenne e talassemia major.

FIGURAS

[0159] A Figura 1 mostra a restauração percentual de sinal para a imunização derivada de anticorpos no ensaio de gene repórter HEK-ID1.

[0160] A Figura 2 mostra a restauração percentual de sinal para os anticorpos derivados da biblioteca no ensaio de gene repórter HEK-ID1.

[0161] A Figura 3 mostra resultados para o ensaio de gene repórter HEK-ID1 com titulações da Gremlin humana (Figura 3A) e Gremlin de camundongo (Figura 3B) e o efeito do anticorpo 7326 (mostrado como anticorpo PB376) na restauração da sinalização da BMP.

[0162] A Figura 4 mostra um modelo estrutural do complexo Gremlin-Fab, com as regiões de ligação da BMP possíveis e o epítopo Fab salientado.

[0163] A Figura 5 mostra o exame da área destituída de calo/tecido ósseo durante o reparo da fratura em imagens de Raio X adquiridas. A área dentro do defeito, que foi destituída de tecido, foi quantificada usando análise de imagem Definiens® e subsequentemente comparada entre o grupo de controle e o grupo tratado com antigremlin 1. Os resultados são apresentados como a média ± SD de 10 ratos/grupo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 como medido pelo teste U de Mann-Whitney.

[0164] A Figura 6 mostra o exame de LMB (osso mineral baixo; osso recém formado) e HMB (osso mineral alto; osso maduro) dentro de um defeito ósseo femoral de 3 mm. Painel A: análise µCt 3D da região de defeito ósseo femoral para detectar osso recém formado ou osso maduro. A porcentagem de volume ósseo/volume tecidual foi medida e comparada com todos os sujeitos (total) entre controle v.s tratamentos com antigremlin 1. As comparações entre controle versus grupo tratado com antigremlin 1 em animais separados como respondendores baixos (LR- ligação em ponte incompleta) e respondedores altos (HR ligação em ponte completa) também foram realizadas. Os resultados são apresentados como a média ± SD. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 como medido pelo teste U de Mann-Whitney. Painel B: µCt representativo ilustrando a reconstrução por volume ósseo 3D de grupos LR e HR no controle e depois do tratamento com antigremlin 1.

[0165] A Figura 7 mostra análises histomorfométricas de defeito ósseo femoral. A porcentagem de volume ósseo/volume tecidual (BV/TV (%)), número trabecular (Tb.N) e separação trabecular (Tb.Sp) foi comparada entre controle versus grupo tratado com antigremlin 1. Os resultados são apresentados como a média ± SD de 10 ratos/grupo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 como medido pelo teste U de Mann-Whitney.

[0166] A Figura 8 mostra a correlação de análise µCT 3D e análise de histomorfometria 2D de BV/TV% total. As correlações foram realizadas em ambos os grupos no LMB (osso mineral baixo; osso recém formado) e HMB (osso mineral alto; osso maduro) dentro de um defeito ósseo femoral de 3 mm e comparadas com os dados da contagem de histomorfometria 2D (n = 20). A contagem de Pearson indica correlação significante de BV/TV% entre a análise de µCT 3D e a análise de histomorfometria 2D.

[0167] Os seguintes Exemplos ilustram a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1- Expressão, purificação, redobra de proteína e determinação de estrutura.

[0168] Expressão de proteína e preparação de corpo de inclusão

[0169] Uma sequência codificadora de Gremlin-1 humana truncada (SEQ ID NO: 20), otimizada para a expressão na E. coli, foi clonada em um vetor pET32a modificado (Merck Millipore) usando BamHI/XhoI, gerando um vetor codificando a sequência Gremlin com uma etiqueta 6His-TEV de terminal N (pET-hGremlin1).

[0170] Sequência expressa:

[0171] MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKILKRDW

CKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTT MMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD; SEQ ID NO: 2 (com resíduos non- Gremlin da etiqueta 6His-TEV mostrados em itálico). Numeração de sequência com base na UniProt O60565 & SEQ ID NO: 1.

[0172] O DNA plasmídico pET-hGremlin1 foi usado para transformar as células BL21(DE3). Uma colônia resistente à ampicilina única foi escolhida de uma placa de LB/Amp ágar e usada para inocular uma cultura iniciadora de 100 ml de LB/Amp. Depois de agitar (200 rpm) durante 16 horas a 37°C, 25 ml da cultura iniciadora foram usados para inocular 500 mL de meio 2xTY/Amp. A cultura foi agitada (250 rpm) a 37°C até que uma OD600 de 3 fosse obtida. Subsequentemente, a cultura foi suplementada com 20 mL de uma mistura alimentada de MOPS + glicerol (1M de MOPS pH 7,4, 40 % de glicerol, 0,5 % de MgSO4, 0,42 % de MgCl2), induzida com 300 μM de IPTG e incubada adicionalmente a 17°C, 180 rpm durante 16 horas. As células foram colhidas em uma centrífuga (4.000 g durante 20 minutos a 4°C).

[0173] As pelotas de célula foram recolocadas em suspensão em Tampão de Lise (PBS pH 7,4, 0,35 mg/ml de lisozima, 10 μg/ml de DNase e 3 mM de MgCl2) a 4°C e a fração insolúvel foi colhida pela centrifugação a 3.500 g durante 30 minutos a 4°C. Os corpos de inclusão pelotizados foram lavados três vezes recolocando-se em suspensão em tampão de lavagem (50 mM de Tris, 500 mM de NaCl, 0,5 % de Triton X-100, pH 8,0), seguido pela centrifugação a 21.000 g durante 15 minutos. Um adicional de duas lavagens foi realizado usando tampão de lavagem sem Triton X-

100. Solubilização

[0174] Os corpos de inclusão foram recolocados em suspensão em tampão desnaturante (8 M de Ureia, 100 mM de Tris, 1 mM de EDTA, 10 mM de Na2S4O6 e 100 mM de Na2SO3, pH 8,5), agitados durante 16 horas na temperatura ambiente e clarificados pela centrifugação a 21.000 g durante 15 minutos. Purificação de pré-redobra

[0175] Os corpos de inclusão solubilizados foram carregados em uma coluna Sephacril S-200 26/60 (120 mL) equilibrada em 8 M de Ureia, 50 mM de MES, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 6,0. As frações contendo a proteína Gremlin-1 foram diluídas com 6 M de Ureia, 20 mM de MES, pH 6,0 e carregadas em colunas de troca de cátion HiTrap SP HP e eluídos com um gradiente de 1 M de NaCl em 10 volumes de coluna (10 CVs). As frações contendo a proteína hGremlin-1 purificada, desnaturada foram reunidas. Redobra

[0176] A proteína Gremlin-1 purificada desnaturada foi adicionada às gotas ao tampão de redobra (50 mM de Tris, pH 8,5, 150 mM de NaCl, 5 mM de GSH e 5 mM de GSSG, 0,5 mM de Cisteína, 5 mM de EDTA, 0,5 M de Arginina) a uma concentração final de 0,1 mg/ml e incubada a 4°C com agitação constante durante 5 dias. Depois de 5 dias a proteína Gremlin-1 foi dialisada contra 20 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, pH 7,5.

[0177] A seguir da diálise a proteína foi aplicada à coluna HiTrap heparina e eluída usando um gradiente de 0 a 100 % de tampão de elução de heparina (20 mM de HEPES, 1 M de NaCl, pH 7,5) em 20 CV. A proteína corretamente dobrada eluída em 1 M de NaCl ao passo que qualquer proteína mal dobrada eluiu em concentrações de sal mais baixas.

[0178] A elução de proteína a 1 M de NaCl foi concentrada e purificada ainda em uma coluna S75 26/60 equilibrada com 20 mM de Hepes, pH 7,5, 1 M de NaCl.

[0179] A proteína foi caracterizada pela SDS PAGE (mudança em gel), demonstrou ter o peso molecular esperado e arranjo correto de ligações de dissulfeto usando a espectrometria de massa com cromatografia líquida (LC-MS) e ser ativa em um ensaio de célula (ensaio repórter ID1). Determinação da estrutura de Gremlin 1

[0180] Os cristais da proteína Gremlin 1 foram cultivados usando o método da gota suspensa misturando-se uma solução de Gremlin 1 a 6,6 mg/ml e 0,1 M de ácido cítrico no pH 4, 1 M de cloreto de lítio e 27 % de polietileno glicol (PEG) 6000 em uma razão de 1:1. Antes da coleta de dados, os cristais foram crio-protegidos pela adição de 20 % de glicerol ao tampão de cristalização. Os dados de difração foram coletados no Diamond Light Source e foram processados usando XDS (Kabsch, Wolfgang

(2010) Acta Crystallographica Section D 66, 125—132). A estatística dos dados de difração está resumida na tabela abaixo: Tabela 2: Estatística dos dados de difração Estatística de Difração Comprimento de onda 0,97949 (Å) Grupo espacial C2 Dimensões da célula a = 84,55 Å, b = 107,22 Å, c = 77,09 Å; α = 90,00°, β = 120,43°, γ = 90,00° Faixa de Resolução* 26,19-2,72 ( 2,79-2,72) (Å) Integralidade (%) 98,5 (99,0) Multiplicidade 3,4 (3,4) I/sigma 9,6 (2,0) Rmerge 0,095 (0,622) Estatística de Refinamento Faixa de Resolução (Å) 26,19-2,72 Rcrist 0,24 Rlivre 0,29 Ligações R.m.s.d. (Å)** 0,013 Ângulos R.m.s.d. (°) 1,782 *valores em parênteses correspondem à camada de resolução mais alta **r.m.s.d desvio da raiz quadrada média

[0181] A estrutura de Gremlin-1 foi resolvida pela substituição molecular usando Phaser (McCoy et al, J Appl Cryst (2007), 40, 658-674) e um modelo de Gremlin-1 disponível das coordenadas complexas Gremlin-1 / Fab patenteadas. O modelo resultante de Gremlin-1 conteve quatro cópias de monômero Gremlin 1 organizado como dois dímeros. As correções modelos foram feitas com Coot (Emsley et al Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66 (4), 486-501) e as coordenadas foram refinadas usando Refmac (Murshudov et al REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2011; 67(Pt 4): 355-367). As coordenadas finais foram validadas com Molprobity (Chen et al. (2010) MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica D66: 12-21). Um resumo de estatística de refino modelo é mostrado na Tabela 2 acima. Exemplo 2 – Resíduos de Ligação da BMP na Gremlin-1

[0182] Como debatido acima, Gremlin-1 pertence à família de proteína antagonista da proteína morfogênica óssea (BMP) dentro de um subgrupo conhecido como a família DAN. Dentro da família DAN, Gremlin-1 compartilha a maior homologia com Gremlin-2 (PRDC).

[0183] A estrutura da Gremlin-1 humana de 2,7 Å resolvida no Exemplo 1 compartilha muitos traços em comum a estrutura de Gremlin-2 de camundongo publicada (Nolan et al (2013), Structure, 21, 1417–1429). A dobra global é muito similar, com duas cópias de Gremlin-1 formando um dímero antiparalelo, não covalente, arranjado em um arco. Cada monômero adota o arranjo de dedo-pulso- dedo característico com um motivo de nó de cisteína na direção da extremidade do pulso, oposta aos dedos. A identidade de sequência entre as proteínas é 52 % subindo para 67 % dentro da sequência visível nas duas estruturas. A região mais altamente conservada reside na interface dimérica extensiva onde todos os resíduos de contato chave são 100 % conservados.

[0184] Os resíduos envolvidos nas ligações 2, 4 & 7 da BMP à Gremlin-2 de camundongo (PRDC) e DAN (NBL1) foram identificados usando mutagênese (Nolan et al (2013), Structure, 21, 1417–1429 e Nolan et al (2014) J. Biol. Chem. 290, 4759- 4771). O epítopo de ligação da BMP prognosticado abrange um caminho hidrofóbico transpondo através de ambos os monômeros sobre a superfície convexa do dímero. Seis resíduos foram identificados pela mutagênese; Trp72, Phe96, Tyr98, Phe104, Tyr105 & Phe117 e são 100 % conservados na Gremlin-1 humana (numeração com base na sequência de Gremlin-2 de camundongo). O grau de homologia se estende para o posicionamento das cadeias laterais que adotam uma conformação idêntica em ambas as proteínas.

[0185] A numeração de aminoácidos usada no arquivo PDB de Gremlin se iguala à numeração na estrutura de Gremlin-2 de camundongo publicada com base em um alinhamento estrutural. Isto permite a comparação de igual para igual de aminoácidos quando da descrição das estruturas. Entretanto, para clareza os resíduos chave identificados como desempenhando um papel na ligação da BMP são mostrados abaixo com numeração fundamentada no arquivo PDB e arquivo UniProt da SEQ ID NO: 1 em parênteses:

[0186] Trp72(93), Phe96(117), Tyr98(119), Phe104(125), Tyr105(126) & Phe117(138).

[0187] Tanto na Gremlin-2 de camundongo quanto na Gremlin-1 humana o epítopo de ligação da BMP hidrofóbico é parcialmente escondido por uma hélice alfa formada pelos resíduos de terminal N de cada proteína. Um modelo de ligação da BMP foi proposto por meio da qual o terminal N pode flexionar, expondo a interface de ligação da BMP completa (Nolan et al (2013), Structure, 21, 1417–1429). Na presente análise, os resíduos de terminal N foram removidos das estruturas da Gremlin-1 humana e Gremlin-2 de camundongo antes da transformação de uma superfície para revelar a similaridade das faces de ligação da BMP em cada proteína.

[0188] A literatura apenas descreve a mutagênese de seis resíduos que têm um efeito sobre a ligação da BMP. É possível que o epítopo da BMP real abranja uma área de superfície maior, abrangendo aminoácidos vizinhos. Pelo alto nivelamento de todos os resíduos, dentro de 6Å destes mutados, na superfície de Gremlin-1, uma região maior de Gremlin-1 é revelada que potencialmente seria alvejada por um produto terapêutico. Esta região mais extensiva abrange os seguintes aminoácidos da Gremlin-1 humana:

[0189] Asp92-Leu99

[0190] Arg116-His130

[0191] Ser137-Ser142

[0192] Cys176-Cys178

[0193] (Numeração com base na SEQ ID NO: 1)

[0194] Combinando-se a informação publicada com a informação da estrutura cristalina de Gremlin-1 humana, regiões de Gremlin-1 humana que se oferecem elas próprias como uma via potencial para intervenção terapêutica bloqueando a sua interação com BMP’s foram identificadas. Exemplo 3 – Ensaio de gene repórter de Hek Id1 Fundamentos

[0195] O ensaio de gene repórter de Hek Id1 usa as células repórter Hek293-Id1 do Clone 12. Esta linhagem de célula foi estavelmente transfectada com fator de transcrição Id1. Id1 é um fator de transcrição no caminho da sinalização da BMP. Gremlin é conhecida ligar BMPs impede a ligação aos seus receptores reduzindo o sinal da luciferase do gene repórter. Portanto, usando este ensaio repórter, é possível triar anticorpos antiGremlin e ver se há algum que bloqueie a interação de Gremlin com BMPs. Uma restauração do sinal de luciferase é observado nestas células se houver um bloqueio desta interação. Método

[0196] 12 células do clone foram cultivadas em DMEM contendo 10 % de FCS, 1x L-Glutamina & 1x NEAA. As células também são cultivadas na presença de Higromicina B (200 µg/ml) para garantir que as células não percam a expressão do gene Id1. As células foram ensaiadas em DMEM contendo 0,5 % de FCS, 1x L- Glutamina & 1x NEAA. Higromicina B não é necessária durante o curto tempo que as células estão no ensaio.

[0197] As células foram lavadas em PBS, descoladas usando tampão de dissociação de célula, giradas e contadas antes de serem semeadas a 5 x 104/poço em 70 µl (Densidade de 7,14 x 105/ml). As placas usadas foram brancas, estéreis de 96 poços revestidas com Poli-D-Lisina opacas. As células vão no incubador durante cerca de 3 a 4 horas para sedimentarem. Heterodímeros da BMP foram reconstituídos para 200 µg/ml em HCl 4 mM. A BMP foi diluída para 10 µg/ml em meios de ensaio usando um frasco de vidro para dar um novo estoque de trabalho.

[0198] Em uma placa de polipropileno, Gremlin-1 foi diluída 1:2 durante uma curva de resposta de dose de 8 pontos com uma dose final de topo de 1 μg/ml.

[0199] Um volume adicional de 20 µl dos meios foi adicionado por poço e as placas foram incubadas a 37°C durante 45 mins.

[0200] BMP preparada a 100x foi adicionado a todos os poços exceto poços contendo apenas células. Todos os poços são completados até 60 µl com meio de ensaio e incubados durante um adicional de 45 mins a 37°C.

[0201] Após a incubação, 30 µl de amostra foram transferidos por poço de placa de ensaio e incubados durante 20 a 24 horas antes de medir o sinal de luminescência.

[0202] Cell Steady Glo foi descongelado de antemão na temperatura ambiente. As placas de ensaio foram esfriadas até a temperatura ambiente durante cerca de 10 a 15 mins antes de adicionar o reagente. O sinal de luciferase foi detectado pela adição de reagente Cell Steady Glo (100 µl) durante 20 minutos no agitador na temperatura ambiente e medindo a luminescência usando o protocolo Cell Titre Glo no Synergy 2.

[0203] O sinal máximo foi gerado a partir dos poços contendo BMP e o sinal mínimo foi gerado a partir dos poços contendo apenas células. Resultados

[0204] Gremlin-1 de tamanho completo e as formas truncadas foram testadas no ensaio de gene repórter Hek-Id1 para confirmar a atividade de bloqueio contra BMP4/7.

[0205] A porcentagem de inibição dos ensaios de dose resposta foi calculada com base nos sinais máximos e mínimos no ensaio e os dados adaptados usando ajuste logístico de 4 parâmetros. A IC50 foi calculada com base no ponto de inflexão da curva.

[0206] Tabela 3: Resultados de potência para Gremlin-1 de tamanho completo e Gremlin-1 truncada no ensaio de gene repórter de Hek-Id1.

Ensaio de gene 95% de CI (ou repórter de Hek-Id1 N Média geométrica (nM) faixa onde N = <4) Gremlin 1 de tamanho completo 2 1,6 1,3-1,9 Gremlin 1 truncado 2 1,7 1,1-2,5 Conclusão

[0207] Gremlin 1 foi capaz de inibir a sinalização da BMP 4/7 no ensaio de gene repórter de Hek-Id1. Exemplo 4 – Produção de anticorpos antiGremlin-1

[0208] Os anticorpos antiGremlin-1 foram derivados pela imunização usando gremlin-1 purificado como descrito no Exemplo 1 e pela triagem da biblioteca. A biblioteca foi gerada internamente como uma biblioteca humana ingênua com as regiões V amplificadas a partir das doações de sangue.

[0209] A imunização produziu 26 anticorpos distintos ligando Gremlin-1 a partir da primeira rodada de imunização. Estes anticorpos foram ampliados e purificados para testar nos ensaios de triagem.

[0210] 25 anticorpos reativos cruzados ser humano e camundongo da biblioteca foram triados usando Gremlin humana recombinante da R&D Systems. 10 anticorpos foram selecionados para ampliação e purificados como scFvs para testar nos ensaios de triagem. Exemplo 5 – Triagem de anticorpos antiGremlin-1

[0211] Os anticorpos foram triados usando o ensaio de gene repórter Hek-Id1 descrito no Exemplo 3 e medindo-se a fosforilação de SMAD. SMAD1, 5 e 8 são fosforilados na sinalização da BMP. Os inibidores de Gremlin-1 portanto aumentam a fosforilação de SMAD.

[0212] Os ensaios de fosforilação de SMAD foram conduzidos nas células A549 ou nos fibroblastos pulmonares humanos. Os níveis de fosforilação foram determinados usando MSD. Resultados

[0213] No ensaio de gene repórter de Hek-Id1, não houve nenhum acerto evidente com os anticorpos derivados da imunização (com um excesso de 10 vezes de anticorpo testado contra um heterodímero de BMP4/7). Os resultados são mostrados na Figura 1.

[0214] Ao contrário, vários anticorpos derivados de biblioteca foram capazes de restaurar o sinal no ensaio de gene repórter de Hek-Id1 (excesso de 50 vezes de anticorpos com uma dose de gremlin de 50 %) (Figura 2). Destes, Ab2416 e Ab2417 contiveram altos níveis de endotoxina. Ab7326 manteve a capacidade de bloqueio em um excesso de 10 vezes e 80 % de inibição da concentração de Gremlin-1.

[0215] Resultados adicionais são apresentados nas Figuras 3A (gremlin humana) e 3B (Gremlin de camundongo). Estas Figuras mostram titulações de Ab7326 (rotulado como PB376) até 15 nM. Ab7326 foi mostrado restaurar a sinalização da BMP quando bloqueada pela Gremlin humana (IC50 de 1,3 nM) ou camundongo (IC50 de 0,2 nM). O anticorpo funciona como uma IgG1 tanto humana quanto de camundongo.

[0216] As sequências da IgG1 de tamanho completo de camundongo e ser humano são apresentadas abaixo. De modo a sintetizar as proteínas de IgG1 de tamanho completo de camundongo e ser humano, as regiões variáveis de Ab7326 derivadas da biblioteca foram reclonadas em vetores compreendendo os domínios constantes de anticorpo apropriados.

[0217] Porque Ab7326 originou-se de uma biblioteca humana ingênua, onde Abs são clonados como scFvs, de modo a reclonar as 7326 regiões variáveis como Abs ou Fabs de tamanho completo, foi necessário amplificar pela PCR a VH e VK usando agrupamentos de iniciadores/iniciadores degenerados. Os produtos de PCR amplificados foram depois digeridos e clonados simultaneamente nos vetores de camundongo e ser humano. Visto que a VH e VK foram amplificadas pelos agrupamentos de iniciadores/iniciadores degenerados, duas formas variantes dos produtos foram obtidas, diferindo em um único resíduo de aminoácido derivado de iniciadores sutilmente diferentes recozendo durante o processo de PCR.

[0218] As duas formas variantes da região variável de cadeia pesada diferiram em um único aminoácido na posição 6 e as duas formas variantes da região variável da cadeia leve diferiram em um único aminoácido na posição 7, como mostrado abaixo: •A variante 1 da região variável de cadeia pesada tem ácido glutâmico (E) na posição 6. •A variante 2 da região variável de cadeia pesada tem glutamina (Q) na posição 6. •A variante 1 da região variável da cadeia leve tem serina (S) na posição 7. •A variante 2 da região variável da cadeia leve tem treonina (T) na posição

7.

[0219] IgG1 de camundongo de tamanho completo – variante 1 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 14)

[0220] QVQLVESGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DYYMHWVQQA

PGKGLEWMGL VDPEDGETIY AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCATDA RGSGSYYPNH FDYWGQGTLV TVSSAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH EGLHNHHTEK SLSHSPGK

[0221] IgG1 de camundongo de tamanho completo – variante 1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 15)

[0222] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YSSNNKNILA

WYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT INSLQAEDVA VYFCQQYYDT PTFGQGTRLE IKRTDAAPTV SIFPPSSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRNEC

[0223] IgG1 de camundongo de tamanho completo – variante 2 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 28)

[0224] QVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DYYMHWVQQA

PGKGLEWMGL VDPEDGETIY AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCATDA RGSGSYYPNH FDYWGQGTLV TVSSAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH EGLHNHHTEK SLSHSPGK

[0225] IgG1 de camundongo de tamanho completo – variante 2 de cadeia leve (SEQ ID NO: 29)

[0226] DIVMTQTPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YSSNNKNILA

WYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT INSLQAEDVA VYFCQQYYDT PTFGQGTRLE IKRTDAAPTV SIFPPSSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRNEC

[0227] IgG1 humana de tamanho completo – variante 1 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 30)

[0228] QVQLVESGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DYYMHWVQQA PGKGLE

WMGL

[0229] VDPEDGETIY AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCATD

A

[0230] RGSGSYYPNH FDYWGQGTLV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGT

AALG

[0231] CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSS

SL

[0232] GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSV

FLF

[0233] PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTK

PRE

[0234] EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKG

QP

[0235] REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENN

YKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

[0236] SPGK

[0237] IgG1 humana de tamanho completo – variante 1 de cadeia leve (SEQ ID

NO: 31)

[0238] DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YSSNNKNILA WYQQKPGQ

PP

[0239] KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT INSLQAEDVA VYFCQQYY

DT

[0240] PTFGQGTRLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREA

K

[0241] VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVY

ACE

[0242] VTHQGLSSPV TKSFNRGEC

[0243] IgG1 humana de tamanho completo – variante 2 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 16)

[0244] QVQLVQSGAE VKKPGATVKI SCKVSGYTFT DYYMHWVQQA PGKGLE

WMGL

[0245] VDPEDGETIY AEKFQGRVTI TADTSTDTAY MELSSLRSED TAVYYCATD

A

[0246] RGSGSYYPNH FDYWGQGTLV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGT

AALG

[0247] CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSS

SL

[0248] GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSV

FLF

[0249] PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTK

PRE

[0250] EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKG

QP

[0251] REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENN

YKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

[0252] SPGK

[0253] IgG1 humana de tamanho completo – variante 2 de cadeia leve (SEQ ID NO: 17)

[0254] DIVMTQTPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YSSNNKNILA WYQQKPGQ

PP

[0255] KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT INSLQAEDVA VYFCQQYY

DT

[0256] PTFGQGTRLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREA

K

[0257] VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVY

ACE

[0258] VTHQGLSSPV TKSFNRGEC

[0259] As CDRs de anticorpo foram determinadas usando o método de Kabat (salientadas em negrito nas sequências acima). Os resíduos de HCDR1 adicionais usando a definição de Chothia estão em itálico. As sequências da região constante estão sublinhadas.

[0260] A restauração da sinalização de p-SMAD com anticorpos antiGremlin 1 é mostrada na Tabela 4 abaixo. Tabela 4: Restauração da sinalização de p-SMAD 2417 2418 2419 2481 2482 2483 2484 7326 8427 BMP 2 109,1% 58,2% 32,6% 40,4% 35,3% 43,1% 104,0% 107,2% 51,3% 50 +/- 2,8% +/- 1,9% +/- 1,4% +/- 0,6% +/- 0,8% +/- 2,1% +/- 2,7% +/- 3,5% +/- 1,4% ng/ml BMP 4 109,6% 71,3% 31,7% 60,1% 54,4% 72,5% 105,2% 110,0% 78,2% 25 +/- 3,0% +/- 3,1% +/- 1,2% +/- 2,2% +/- 1,3% +/- 2,1% +/- 3,3% +/- 3,8% +/- 2,5% ng/ml BMP 7 111,5% 99,5% 53,8% 64,4% 52,3% 66,2% 105,2% 108,0% 72,6% 200 +/- 3,8% +/- 3,2% +/- 3,4% +/- 1,3% +/- 1,1% +/- 1,2% +/- 4,3% +/- 3,2% +/- 2,5% ng/ml BMP- 119,3% 78,6% 50,8% 53,7% 47,6% 56,1% 120,4% 128,5% 62,8% 2/7 +/- 2,6% +/- 3,6% +/- 2,7% +/- 3,1% +/- 1,5% +/- 2,5% +/- 4,4% +/- 2,9% +/- 2,5% 50 ng/ml

BMP4/7 113,7% 78,0% 61,4% 48,3% 41,7% 50,8% 112,4% 127,0% 63,3% 50 +/- 3,1% +/- 4,0% +/- 4,0% +/- 2,1% +/- 1,7% +/- 1,7% +/- 2,5% +/- 3,1% +/- 2,1% ng/ml

[0261] Os resultados são mostrados como uma porcentagem da fosforilação de SMAD pelo BMP sozinho (BMP de controle). Os experimentos foram realizados usando fibroblastos pulmonares de pacientes com fibrose pulmonar idiopática. Os anticorpos rhGremlin-1 e antiGremlin-1 foram pré-incubados durante 45 minutos na temperatura ambiente. Os anticorpos rhGremlin-1 e antiGremlin-1 foram depois adicionados com BMP às células durante 30 minutos.

[0262] A Tabela 5 mostra então resultados adicionais no ensaio de fosforilação de SMAD, onde o deslocamento de BMP-2 ou BMP4/7 dos complexos de Gremlin 1-BMP pelos anticorpos antiGremlin-1 foi investigado. Os experimentos foram mais uma vez realizados usando fibroblastos pulmonares de pacientes com fibrose pulmonar idiopática. rhBMP-2 ou rhBMP 4/7 foram pré-incubados com rhGremlin-1 durante 1 hora na temperatura ambiente. Os complexos de BMP-2- ou BMP4/7-Gremlin-1 foram incubados com concentrações diferentes dos anticorpos antiGremlin-1 durante a noite a 4°C. As concentrações de anticorpo representam a concentração final na placa. Tabela 5: Deslocamento de BMP-2 ou BMP4/7 dos complexos de Gremlin 1-BMP pelos anticorpos antiGremlin-1 81,3 40,6 20,3 10,2 5,1 2,55 1,27 0,63 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 97,0% 93,5% 79,9% 66,5% BMP 2 100,3% 98,8% 86,4% 54,8% 2484 +/- +/- +/- +/- 50 ng/ml +/- 3,5% +/- 2,7% +/- 2,0% +/- 0,3% 2,9% 2,6% 1,9% 2,8% 121,4% 108,1% 74,7% 65,8% BMP4/7 136,4% 133,2% 86,6% 60,7% 2484 +/- +/- +/- +/- 50 ng/ml +/- 4,2% +/- 1,0% +/- 4,4% +/- 1,5% 1,4% 4,9% 2,2% 0,6% 99,4% 103,8% 103,2% 102,8% BMP 2 103,7% 101,5% 100,3% 97,0% 7326 +/- +/- +/- +/- 50 ng/ml +/- 1,1% +/- 2,4% +/- 2,2% +/- 2,9% 3,8% 2,4% 4,3% 2,8%

130,3% 125,6% 120,9% 111,1% BMP4/7 133,7% 132,3% 121,4% 102,0% 7326 +/- +/- +/- +/- 50 ng/ml +/- 0,8% +/- 1,8% +/- 4,2% +/- 4,5% 4,2% 10,0% 3,3% 2,3%

[0263] Os resultados mostrados na Tabela 5 demonstram que Ab7326 pode deslocar BMP-2 ou BMP4/7 já complexadas dos complexos de Gremlin 1-BMP. Ab7326 pode alcançar este deslocamento em concentrações muito mais baixas do que o anticorpo de comparação 2484. Isto provê evidência de que Ab7326 é um inibidor alostérico, compatível com as nossas descobertas de que o sítio de ligação para Ab7326 é distal das regiões de ligação de BMP conhecidas na gremlin-1. Assim Ab7326 é capaz de acessar o sítio de ligação alostérica mesmo quando BMP está complexado à gremlin-1, resultando em inibição significantemente melhorada da atividade de gremlin. Exemplo 6 – Obtenção da estrutura cristalina de Gremlin-1 em complexo com o 7326 Fab

[0264] A estrutura cristalina de Gremlin-1 humana em complexo com Ab7326 Fab foi resolvida em uma resolução de 2,1 Å. As sequências de Fab são mostradas abaixo:

[0265] Cadeia pesada: SEQ ID NO: 18

[0266] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC

[0267] Cadeia leve: SEQ ID NO: 19

[0268] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0269] O software CCP4 NCONT foi depois usado para identificar todos os contatos em 4 Å entre Gremlin-1 e o Fab. Os seguintes resíduos foram identificados: Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175

(numeração com base na Sequência UniProt da SEQ ID NO: 1 (numerada como Ile110, Lys126, Lys127, Phe128, Thr129, Thr130, Arg148, Lys153 e Gln154 no arquivo da estrutura que se iguala com a numeração da Gremlin-2 de camundongo).

[0270] A Figura 4 mostra modelos estruturais do complexo de Gremlin-Fab, com os resíduos de epítopo Fab mostrados em relação às regiões de ligação de BMP.

[0271] Ab7326 é um anticorpo inibidor que atua alostericamente, isto é, se liga fora das regiões de ligação de BMP. Exemplo 7 – Medições de afinidade quanto à ligação de anticorpo antigremlin-1 Ab7326 à Gremlin-1. Método

[0272] A afinidade de mIgG antiGremlin para a Gremlin 1 humana foi determinada pela análise de interação biomolecular usando a tecnologia de ressonância plasmônica superficial (SPR) em um sistema Biacore T200, GE Healthcare Bio- Sciences AB. mIgG antiGremlin foi capturada por uma superfície de Fc anticamundongo imobilizada e Gremlin 1 foi titulado sobre a mIgG capturada.

[0273] O ligante de captura (fragmento F(ab’)2 affinipure de IgG de cabra anticamundongo, específico de fragmento Fc, 115-006-071, Jackson ImmunoResearch Inc.) foi imobilizado a 50 mg/ml em 10 mM de NaAc, pH 5,0 na célula de fluxo 2 de um Chip Sensor CM4 por intermédio da química de acoplamento de amina, usando injeções de ativação e desativação de 600s, a um nível de ~1600 unidades de resposta (RU). Tampão HBS-EP+ (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % de Tensoativo P20) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 ml/min. Uma superfície de referência foi preparada na célula de fluxo 1 pela ativação e desativação da superfície como para a célula de fluxo 2 mas omitindo o ligante de captura.

[0274] O tampão de ensaio foi HBS-EP+ mais um extra de 150 mM de NaCl para dar uma concentração final de NaCl de 300 mM mais 1% de CMD40. Uma injeção de 60s de mIgG antiGremlin (a 5 mg/ml em tampão de condução) foi passada sobre as células de fluxo 1 e 2 para dar um nível de captura de aproximadamente 100 RU na IgG anticamundongo imobilizada, superfície Fc. A Gremlin 1 humana recombinante foi titulada em tampão de condução de 5 nM (usando diluições de 2 vezes) e injetada nas células de fluxo 1 e 2 em uma taxa de fluxo de 30 ml/min durante 3 min seguido por uma fase de dissociação de 5 min. Um controle apenas de tampão também foi incluído. A superfície foi regenerada em uma taxa de fluxo de 10 ml/min por uma injeção de 60s de HCl 50 mM, uma injeção de 30s de NaOH 5 mM e uma injeção de 30s de HCl 50 mM.

[0275] Os dados cinéticos foram determinados usando o software de avaliação Biacore T200.

[0276] As medições de afinidade foram feitas a 25oC. Resultados

[0277] A afinidade de ligação, tomada como o valor KD médio para 5 determinações, foi descoberto estar abaixo de 100 pM.

[0278] Exemplo 8. Inibição da atividade de gremlin-1 acelera a cicatrização e ligação em ponte em um modelo in vivo de reparo de fratura óssea.

8.1. Materiais e Métodos. Modelo de fratura de rato e administração de fármaco

[0279] Modelos de defeitos segmentais de osso longo foram amplamente usados para a pesquisa de cicatrização e regeneração óssea (Sato et al; 2014). No presente estudo, um defeito tumoral de 3 mm foi criado em ratos machos de 10 semanas de idade e estabilizado usando uma placa PEEK de 8 furos (RIS. 602,105, RISystem, Suíça). A placa foi fixada ao osso com um fórceps no meio da diáfise, antes que o osso fosse perfurado e fixado com parafusos. Uma lacuna de fratura de 3 mm foi criada usando uma serra Gigly de 0,44 mm. O tamanho do defeito/consistência/fixação foram controlados na qualidade pelo imageamento de raio X usando Faxitron (MX-20-DC5, Faxitron Bioptics LLC, USA), este ponto de tempo foi definido como Dia 0.

[0280] A dosagem semanal foi começada no Dia 1 durante um período de 8 semanas como resumido na Tabela 1.

[0281] As imagens de raio X foram subsequentemente adquiridas durante o período de duração do estudo no dia 11, 25, 39 e 57 de modo a avaliar a formação de calo e o progresso da cicatrização. A análise de imagem de Definiens foi utilizada para quantificar a área do defeito que foi destituído de tecido ósseo nas imagens de raio X capturadas. Tabela 6: Grupos de Tratamento. Número do Regime de Grupo Tratamento Dose Tempo Animal Dosagem Veículo: 1 ml, 1 10 Veículo Uma vez/semana s.c. Total de 57 dias 30 mg/kg, 1 ml, 2 10 AntiGremlin-1 Uma vez/semana s.c.

Análise de micro-CT da cicatrização de fratura

[0282] Os fêmures (lado fraturado) foram escaneados a 17,2 μm de resolução usando micro-CT (SkyScan 1076). Uma região de aproximadamente 15 mm do calo com a fratura no centro foi adquirida. As varreduras foram reconstruídas usando o software Skyscan NRECON (1.7.10) e depois as fatias reconstruídas foram segmentadas adicionalmente para excluir os pinos fixadores em uma região definida de 3 mm calculada a partir do ponto central do defeito de fratura femoral. A análise histomorfométrica do calo de fratura em 3D foi realizada pelo software SkyScan (v.

1.13.1). O ponto central dentro dos 3 mm do defeito de fratura femoral foi determinado e fatias de 1,5 mm distal e proximal ao ponto central foram segmentadas para cada membro medido. Subsequentemente, a binarização dos conjuntos de dados reconstruídos e a segmentação foram realizados seguindo dois limiares definidos, um para delinear o calo mineralizado baixo (quantificando assim o osso recém formado) e o outro para definir osso maduro. Segmentação adicional destes dados foi realizada nos fêmures de animais classificados como respondedores baixos com base na satisfação dos critérios de ponte incompleta do defeito femoral ou respondedores altos exibindo ponte do local da fratura. Análise de histomorfometria da fratura

[0283] Os fêmures foram fixados em 10 % de formalina tamponada neutro durante 24 h, desidratados e embutidos em metacrilato de metila (MMA) em temperatura baixa. Seções com 50 μm de espessura foram tingidas com Azul de Toluidina para quantificar os elementos ósseos da cicatrização do defeito intersticiais. Os parâmetros histomorfométricos foram medidos no osso trabecular do sítio de defeito intersticial. As medições foram realizadas através da análise de imagem. Análise estatística

[0284] Os resultados foram apresentados como valores médios ± SD. A análise estatística foi realizada usando um teste U de Mann Whitney de duas caudas com o software GraphPad Prism a menos que de outro modo estabelecido.

8.2 Resultados.

[0285] A análise de Raio X obtida durante a fase do período de duração do estudo indicou que o anticorpo antigremlin-1 acelerou a cicatrização de fratura com o controle e grupos tratados divergindo significantemente depois de 25 dias (P<0,05). Este efeito foi evidente para o resto do estudo (Figura 5).

[0286] A análise de micro-CT de amostras terminais revelou que o tratamento com anticorpo antigremlin-1 (30 mg/kg/uma vez por semana) levou a um aumento no osso recém formado dentro do sítio do calo de fratura (P = 0,06).

[0287] A incidência de não união de fratura neste modelo é de aproximadamente 60% sem nenhuma intervenção (Sato et al; 2014). Para testar se a inibição de gremlin- 1 resultou na incidência do desenvolvimento de não união, os animais foram classificados como respondedores baixos (LR) e respondedores altos (HR). A inibição de Gremlin-1 resultou em um aumento significante na porcentagem de volume ósseo/volume tecidual (BV/TV%) dentro de LMB (osso mineral baixo; osso recém formado) (P<0,01) e HMB (osso mineral alto; osso maduro) (P<0,01) no grupo respondedor baixo comparado aos controles, indicando assim reparo progressivo do grupo provável de formar não união.

[0288] Adicionalmente, houve uma tendência (não significante) para LMB e HMB BV/TV% aumentado no grupo respondedor alto em resposta ao tratamento antigremlin-1 (Figura 6A, as imagens representativas de LR e HR são mostradas na Figura 6B).

[0289] A análise histomorfométrica bidimensional de parâmetros ósseos foi realizada nas seções histológicas do sítio de fratura (Figura 7). O tratamento com anticorpo antigremlin-1 significantemente aumentou a porcentagem de volume ósseo/volume tecidual (BV/TV %) (P< 0,05) comparado ao controle. Antigremlin-1 significantemente aumentou o número trabecular (Tb.N) (P<0,001) e significantemente diminuiu a separação trabecular (Tb.Sp) (P<0,01) indicando osso trabecular aumentado devido ao tratamento com antigremlin-1.

[0290] As correlações foram realizadas entre a análise histomorfométrica bidimensional e a análise µCT tridimensional pela comparação dos grupos LMB e HMB segmentados na análise de µCt e a análise histomorfométrica bidimensional de seções de fratura (Figura 8). As comparações medidas pela correlação de Pearson revelaram uma correlação positiva e significante entre histomorfometria e análise µCT nos grupos LMB (P<0,0001) e HMB (P<0,0001) validando assim os dados de cada conjunto de dados.

8.3. Conclusão.

[0291] A inibição da atividade de gremlin-1 usando um anticorpo neutralizante antigremlin-1 resultou em reparo de fratura acelerado, com diferenças significantes entre o controle e grupos tratados evidentes depois de 25 dias (3 doses de anticorpo). Adicionalmente, a análise de terminal do sítio de fratura indicou a formação realçada de tecido ósseo nos animais respondedores baixos, que de outro modo provavelmente formariam não união. Portanto, a inibição da atividade de gremlin-1 é uma terapia promissora para a prevenção ou tratamento de fraturas de não união e pode ser de valor particular para o tratamento de fraturas que sejam propensas ao desenvolvimento de não união, por exemplo, tíbia, rádio distal, colo do fêmur e osso escafóide.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0292] SEQ ID NO: 1 (Gremlin-1 Humana; Uniprot ID: O60565)

[0293] MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQS

PQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKILKRDWCKTQPLKQTIH EEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPEL QPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD

[0294] SEQ ID NO: 2 (Gremlin-1 truncada humana usada na cristalografia com etiqueta de terminal N)

[0295] MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKILKRDW

CKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTT MMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD

[0296] SEQ ID NO: 3 (Ab7326 HCDR1 combinado Kabat & Chothia)

[0297] GYTFTDYYMH

[0298] SEQ ID NO: 4 (Ab7326 HCDR1 Kabat)

[0299] DYYMH

[0300] SEQ ID NO: 5 (Ab7326 HCDR2 Kabat)

[0301] LVDPEDGETIYAEKFQG

[0302] SEQ ID NO: 6 (Ab7326 HCDR3 Kabat)

[0303] DARGSGSYYPNHFDY

[0304] SEQ ID NO: 7 (Ab7326 LCDR1 Kabat)

[0305] KSSQSVLYSSNNKNILA

[0306] SEQ ID NO: 8 (Ab7326 LCDR2 Kabat)

[0307] WASTRES

[0308] SEQ ID NO: 9 (Ab7326 LCDR3 Kabat)

[0309] QQYYDTPT

[0310] SEQ ID NO: 10 (Ab7326 Variante 1 da região variável de cadeia pesada)

[0311] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSS

[0312] SEQ ID NO: 11 (Ab7326 Variante 1 da região variável de cadeia leve)

[0313] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIK

[0314] SEQ ID NO: 12 (Ab7326 Variante 2 da região variável de cadeia pesada)

[0315] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSS

[0316] SEQ ID NO: 13 (Ab7326 Variante 2 da região variável de cadeia leve)

[0317] DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIK

[0318] SEQ ID NO: 14 (Variante 1 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de camundongo)

[0319] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASST KVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEV QFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAF PAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKS LSHSPGK

[0320] SEQ ID NO: 15 (variante 1 da cadeia leve da IgG1 de camundongo de tamanho completo)

[0321] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

[0322] SEQ ID NO: 16 (Variante 2 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de ser humano)

[0323] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

[0324] SEQ ID NO: 17 (variante 2 da cadeia leve da IgG1 humana de tamanho completo)

[0325] DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0326] SEQ ID NO: 18 (variante 1 da cadeia pesada de Fab)

[0327] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC

[0328] SEQ ID NO: 19 (variante 1 da cadeia leve de Fab)

[0329] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0330] SEQ ID NO: 20 (Gremlin-1 truncada humana usada na cristalografia sem etiqueta de terminal N)

[0331] AMPGEEVLESSQEALHVTERKILKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINR

FCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTR VKQCRCISIDLD

[0332] SEQ ID NO: 21 (Sequência da Gremlin-1 madura da SEQ ID NO: 1 carecendo do peptídeo de sinal de aminoácidos 1-21)

[0333] KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPG

EEVLESSQEALHVTERKILKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIP RHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD

[0334] SEQ ID NO: 22 (variante 1 da cadeia pesada de IgG4P humana)

[0335] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK

[0336] SEQ ID NO: 23 (variante 1 da cadeia leve da IgG4P humana)

[0337] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0338] SEQ ID NO: 24 (variante 1 de DNA da cadeia pesada da IgG1 humana)

[0339] caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgc aaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatg ggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgaca cttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggat gctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcg cttctacaaagggcccctccgtgttcccgctcgctccatcatcgaagtctaccagcggaggcactgcggctctcggttg cctcgtgaaggactacttcccggagccggtgaccgtgtcgtggaacagcggagccctgaccagcggggtgcacac ctttccggccgtcttgcagtcaagcggcctttactccctgtcatcagtggtgactgtcccgtccagctcattgggaaccca aacctacatctgcaatgtgaatcacaaacctagcaacaccaaggttgacaagaaagtcgagcccaaatcgtgtgac aagactcacacttgtccgccgtgcccggcacccgaactgctgggaggtcccagcgtctttctgttccctccaaagccg aaagacacgctgatgatctcccgcaccccggaggtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcacatgaggacccagaggt gaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaagtccacaatgccaaaactaagcccagagaagaacagtacaattcg acctaccgcgtcgtgtccgtgctcacggtgttgcatcaggattggctgaacgggaaggaatacaagtgcaaagtgtcc aacaaggcgctgccggcaccgatcgagaaaactatctccaaagcgaagggacagcctagggaacctcaagtcta cacgctgccaccatcacgggatgaactgactaagaatcaagtctcactgacttgtctggtgaaggggttttaccctagc gacattgccgtggagtgggaatccaacggccagccagagaacaactacaagactacccctccagtgctcgactcg gatggatcgttcttcctttactcgaagctcaccgtggataagtcccggtggcagcagggaaacgtgttctcctgctcggtg atgcatgaagccctccataaccactatacccaaaagtcgctgtccctgtcgccgggaaag

[0340] SEQ ID NO: 25 (variante 1 de DNA da cadeia leve da IgG1 humana)

[0341] gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgc aagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcct cccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcact gacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccga cctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacga gcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtgga aggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctact ccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccacca gggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc

[0342] SEQ ID NO: 26 (variante 1 de DNA da cadeia pesada da IgG4P humana)

[0343] caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgc aaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatg ggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgaca cttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggat gctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcg cttctacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcc tggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccc tgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacct acacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccct gccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatg atctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtac gtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggt gtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcct gccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgcccc ctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgcc gtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctc cttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtcttctcctgctccgtgatgcacg aggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaag

[0344] SEQ ID NO: 27 (variante 1 de DNA da cadeia leve da IgG4P humana)

[0345] gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgc aagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcct cccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcact gacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccga cctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacga gcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtgga aggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctact ccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccacca gggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc

[0346] SEQ ID NO: 28 (Variante 2 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de camundongo)

[0347] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASST KVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEV QFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAF PAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKS LSHSPGK

[0348] SEQ ID NO: 29 (Variante 2 da cadeia leve da IgG1 de camundongo de tamanho completo)

[0349] DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

[0350] SEQ ID NO: 30 (Variante 1 da cadeia pesada de IgG1 de tamanho completo de ser humano)

[0351] QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK

[0352] SEQ ID NO: 31 (Variante 1 da cadeia leve da IgG1 humana de tamanho completo)

[0353] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0354] SEQ ID NO: 32 (Variante 2 da cadeia pesada de Fab)

[0355] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC

[0356] SEQ ID NO: 33 (Variante 2 da cadeia leve de Fab)

[0357] DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0358] SEQ ID NO: 34 (Variante 2 da cadeia pesada de IgG4P humana)

[0359] QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEW

MGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSG SYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK

[0360] SEQ ID NO: 35 (Variante 2 da cadeia leve da IgG4P humana)

[0361] DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNILAWYQQKPGQPP

KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGT RLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC REFERÊNCIAS

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Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Inibidor da atividade de gremlin-1 caracterizado pelo fato de ser para o uso no tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo.

2. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um anticorpo antigremlin-1 ou fragmento funcionalmente ativo, variante ou derivado do mesmo.

3. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpos funcionalmente ativos é um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

4. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HCDR selecionada das SEQ ID NOs: 3, 4, 5 e 6 e/ou pelo menos uma sequência de LCDR selecionada das SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

5. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 10 e/ou uma região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 11.

6. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 ou 4 para a HCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 5 para a HCDR2, a sequência da SEQ ID NO: 6 para a HCDR3, a sequência da SEQ ID NO: 7 para a LCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 8 para a LCDR2 e a sequência da SEQ ID NO: 9 para a LCDR3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 10 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 11.

7. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na gremlin-1 compreendendo pelo menos um resíduo selecionado de Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175, em que a numeração de resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 1.

8. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo é uma fratura de união demorada ou não união.

9. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo estão associados com uma doença que afete a integridade óssea.

10. Inibidor da atividade de gremlin-1 de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta a integridade óssea é osteoporose, osteogênese imperfeita, diabete, doença de Paget do osso, artrite reumatóide, espondilite anquilosante, mieloma múltiplo, câncer ósseo primário, câncer que metastatizou para o osso, hiperostose esqueletal idiopática difusa, osteomielite, doença renal, distrofia muscular de Duchenne ou talassemia maior.

11. Uso de um inibidor da atividade de gremlin-1 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um anticorpo antigremlin-1 ou fragmento funcionalmente ativo, variante ou derivado do mesmo.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de anticorpo funcionalmente ativos são um de Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HCDR selecionada das SEQ ID NOs: 3, 4, 5 e 6 e/ou pelo menos uma sequência de LCDR selecionada da SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 10 e/ou uma região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 11.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14,

caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 ou 4 para a HCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 5 para a HCDR2, a sequência da SEQ ID NO: 6 para a HCDR3, a sequência da SEQ ID NO: 7 para a LCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 8 para a LCDR2 e a sequência da SEQ ID NO: 9 para a LCDR3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 10 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 11.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na gremlin-1 compreendendo pelo menos um resíduo selecionado de Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175, em que a numeração de resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 1.

18. Uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo é uma fratura de união demorada ou de não união.

19. Uso de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo está associado com uma doença que afete a integridade óssea.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta a integridade óssea é a osteoporose, osteogênese imperfeita, diabete, doença de Paget do osso, artrite reumatóide, espondilite anquilosante, mieloma múltiplo, câncer ósseo primário, câncer que metastatizou para o osso, hiperostose esqueletal idiopática difusa, osteomielite, doença renal, distrofia muscular de Duchenne ou talassemia maior.

21. Método para o tratamento de uma fratura óssea ou defeito ósseo caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor da atividade de gremlin-1.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor é um anticorpo antigremlin-1 ou fragmento funcionalmente ativo,

variante ou derivado do mesmo.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de anticorpo funcionalmente ativos são um de Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma sequência de HCDR selecionada das SEQ ID NOs: 3, 4, 5 e 6 e/ou pelo menos uma sequência de LCDR selecionada das SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 10 e/ou uma região variável de cadeia pesada (LCVR) da SEQ ID NO: 11.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende a sequência da SEQ ID NO: 3 ou 4 para a HCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 5 para a HCDR2, a sequência da SEQ ID NO: 6 para a HCDR3, a sequência da SEQ ID NO: 7 para a LCDR1, a sequência da SEQ ID NO: 8 para a LCDR2 e a sequência da SEQ ID NO: 9 para a LCDR3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 10 e a região variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 11.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo na gremlin-1 compreendendo pelo menos um resíduo selecionado de Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 e Gln175, em que a numeração de resíduo está de acordo com a SEQ ID NO: 1.

28. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo é uma fratura de união demorada ou não união.

29. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente,

caracterizado pelo fato de que a fratura óssea ou defeito ósseo está associado com uma doença que afete a integridade óssea.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a doença que afeta a integridade óssea é osteoporose, osteogênese imperfeita, diabete, doença de Paget do osso, artrite reumatóide, espondilite anquilosante, mieloma múltiplo, câncer ósseo primário, câncer que metastatizou para o osso, hiperostose esqueletal idiopática difusa, osteomielite, doença renal, distrofia muscular de Duchenne ou talassemia maior.